Uudsed rekombinantse Newcastle'i tõve viirusel põhinevad Ovo vaktsiinid jätavad ema immuunsusest mööda, et pakkuda täielikku kaitset varajase virulentse väljakutse eest, 1. osa

Abstraktne:

Newcastle'i haigus (ND) on üks majanduslikult tähtsamaid linnuhaigusi. Vaatamata intensiivsetele jõupingutustele praeguste vaktsineerimisprogrammidega, esineb seda haigust endiselt kogu maailmas, põhjustades märkimisväärset suremust isegi vaktsineeritud karjades. Seda on osaliselt seostatud immuunsuse lüngaga koorumisjärgsel perioodil, mis on tingitud ema antikehade olemasolust, mis mõjutavad negatiivselt tavaliselt kasutatavate elusvaktsiinide replikatsiooni. In ovo vaktsiinidel on mitmeid eeliseid ja need annavad võimaluse selle probleemi lahendamiseks.

Praegu kasutatakse ovo ND vaktsiinides rekombinantse kalkunite herpesviiruse (HVT) vektoriga vaktsiine, mis ekspresseerivad Newcastle'i haiguse viiruse (NDV) antigeene. Kuigi need vaktsiinid on osutunud tõhusaks, on neil mõningaid piiranguid, näiteks viivitatud immunogeensus ja võimetus manustada teist HVT vaktsiini pärast koorumist. ND elusvaktsiinide kasutamine in-ovo vaktsineerimiseks ei ole praegu kohaldatav, kuna neid seostatakse kõrge embrüosuremusega. Selles uuringus manustati rekombinantseid NDV-vektoriga eksperimentaalseid vaktsiine, mis sisaldasid lindude interleukiin 4 (IL4R) antisenss-järjestust ja nende karkassi, in ovo erinevates annustes 18-päevastele kaubanduslikele munadele, millel oli kõrge ema antikehade tiiter. Koorunud linde nakatati virulentse NDV-ga 2 nädala vanuselt. Koorumijärgset vaktsiini levikut, nakatamisjärgset ellujäämist, nakatamisjärgset viiruse levikut ja humoraalset immuunvastust hinnati mitmel ajahetkel. Rekombinantse NDV (rNDV) vaktsineeritud lindude koorumisjärgne suremus vähenes märkimisväärselt võrreldes metsiktüüpi LaSota vaktsiiniga.

Kõik rNDV vaktsiinid suutsid tungida läbi ema immuunsuse ja kutsuda esile tugeva varajase humoraalse immuunvastuse. Lisaks kaitsesid rNDV vaktsiinid kliiniliste haiguste eest ja vähendasid oluliselt viiruse levikut pärast varajast virulentset NDV-nakkust kaks nädalat pärast koorumist. Pärast nakatamist hemaglutinatsiooni inhibeerimise antikehade tiitrid vaktsineeritud rühmades jäid võrreldavaks nakatamiseelsete tiitritega, mis viitab uuritud vaktsiinide võimele takistada nakatava viiruse tõhusat replikatsiooni. Koorumisjärgne elulemus pärast rNDV-IL4R vaktsiinidega vaktsineerimist oli annusest sõltuv ning elulemus suurenes annuse vähenedes. Need paranenud elulemus ja annusest sõltuvad andmed näitavad, et uudsed nõrgestatud in ovo rNDV-põhised vaktsiinid, mis võivad tungida läbi ema immuunsuse, kutsudes esile tugeva immuunvastuse juba 14 päeva pärast koorumist, mille tulemuseks on kõrge või täielik kaitse virulentse nakatamise eest. lubadus aidata kaasa Newcastle'i haiguse tõrjele.

Lisaks inimeste vaktsineerimisele võivad inimesed võtta ka toitu ja toidulisandeid. Cistanche sisaldab mitmesuguseid keemilisi aineid, nagu polüsahhariide, steroide, alkaloide, flavonoide jne. Nendel ainetel on oluline roll immuunsüsteemi reguleerimisel. Nende hulgas võivad polüsahhariidid soodustada immuunrakkude aktiveerumist ja vohamist ning suurendada organismi immuunsust; steroidid võivad reguleerida immuunrakkude funktsiooni ja tugevdada immuunvastust; alkaloidid ja flavonoidid võivad oksüdatsioonile vastu seista, põletikuvastased, antibakteriaalsed ja tugevdavad veelgi immuunsust. Seetõttu on Cistanche'il märkimisväärne immuunsüsteemi reguleeriv toime ning seda saab kasutada tervisliku toiduna ja ravimina immuunsuse parandamiseks.

Klõpsake Cistanche'i kasulikkust tervisele

1. Sissejuhatus

Newcastle'i tõbi (ND), laastav kodulindude haigus, mis võib naiivsetel lindudel ulatuda 100-protsendilise suremuseni, on põhjustatud Newcastle'i haiguse viiruse (NDV) virulentsetest tüvedest [1]. See viirusliik nimetati hiljuti ümber Avian orthoavulavirus 1-ks ja kuulub perekonda Paramyxoviridae [2,3]. Newcastle'i haiguse viirustel on üheahelaline, segmenteerimata, negatiivse meelega RNA genoom, mis kodeerib vähemalt kuut struktuurvalku (30 – nukleoproteiin [NP] – fosfoproteiin [P] – maatriksvalk [M] – liitvalk [F] – hemaglutiniini-neuraminidaas [HN] ja suur RNA-polümeraas [L]-50 ) ja sisaldab ühte kolmest genoomi suurusest (15 186, 15 192 ja 15 198 nukleotiidi) [4, 5]. Newcastle'i haigust peetakse maailmas tähtsuselt kolmandaks kodulindude haiguseks [6] ja see on endiselt endeemiline paljudes Aasia, Aafrika ja Ameerika riikides [7].

ND kontroll hõlmab ranget bioohutust, et vältida virulentsete NDV (vNDV) sattumist linnufarmidesse [8,9] ja vaktsiinide nõuetekohast manustamist [10]. Kuid mitmed kogu maailmas esinevad ND puhangud [11] viitavad sellele, et praegused vaktsiinid ja vaktsineerimisprotseduurid ei ole täielikult tõhusad. Lisaks tavapärastele elus- ja inaktiveeritud vaktsiinidele on viimase kahe aastakümne jooksul uuritud mitmeid ND vaktsineerimise kontseptsioone, sealhulgas vektor-, antigeen-antikehakompleksi-, viiruselaadsete osakeste ja maksutaoliste retseptori ligandivaktsiinide vaktsiine [1, 8,9]. Samuti on oletatud, et mitmed lindude vaktsiinid, mis on loodud immunostimuleerivate tsütokiinide koosekspresseerimiseks, parandavad kaitsvat immuunsust [12]. Teine uuritud lähenemisviis on antigeenselt sobitatud vaktsiinide kasutamine. Kuigi kõiki NDV-sid peetakse ühe serotüübi liikmeteks [3,13], esineb tüvede vahel antigeenseid erinevusi [14]. Varasemad uuringud erinevas vanuses kanadega on näidanud, et kanad, keda vaktsineeriti nakatava viirusega antigeenselt sobitatud tüvedega, eraldasid oluliselt vähem nakatunud vNDV-d kui heteroloogsete vaktsiinidega vaktsineeritud kanade kogus [15–17]. Märkimisväärne on see, et passiivselt ülekantud ema NDV-vastased antikehad, kuigi kaitsevad kanu otsustavatel esimestel elunädalatel, häirivad peremeesorganismi immuunsuse kujunemist pärast vaktsineerimist [18].

In ovo vaktsineerimine on lähenemisviis, millel on mitmeid eeliseid – näiteks märkimisväärne kulude vähendamine, standardimine, vaktsiinide massrakendus, automaatne vaktsineerimine haudejaamas, vaktsiini ühtlane manustamine igas munas ja lindudele stressi puudumine [19–21]. ja see on linnulihatööstuse jaoks atraktiivne immuniseerimismeetod [22]. 80–90 protsenti USA-s kasvatatavatest broilerikanadest vaktsineeritakse praegu kaks kuni kolm päeva enne koorumist [23,24] ning protsessi automatiseerimine võimaldab kuni 70,000 muna. vaktsineerida tunnis [23].

Ülemaailmselt kasutatakse seda vaktsiini manustamismeetodit 26-s maailma 30-st juhtivast linnukasvatusriigist [23]. Praegu on saadaval mõned in-ovo vaktsiinid ND vastu, kuid need kõik on loodud mitte-NDV vektorite abil. On näidatud, et in ovo kasutatavad linnurõugeviiruse (FPV) vektoripõhised vaktsiinid, mis ekspresseerivad NDV F- ja HN-valke, kaitsevad kodulinde vNDV-ga nakatumise eest [25, 26].

Siiski ei kasutata rekombinantseid FPV-ND vaktsiine laialdaselt, kuna varasematest FPV-vaktsineerimisest või kokkupuutest põhjustatud immuunsüsteemi häirib (FPV esineb tavaliselt keskkonnas) ja massimeetodite abil rakendamist ei ole optimeeritud [9]. Rekombinantse ND in ovo vaktsiini tootmiseks kõige laialdasemalt kasutatav vektor on Meleagridi alfaherpesviirus 1, üldtuntud kui kalkunite herpesviirus (HVT) või 3. serotüübi Mareki haiguse viirus [12,23]. Ainuüksi USA-s toodeti 2018. aastal 8,2 miljardit doosi rekombinantset HVT (rHVT)-ND vaktsiini võrreldes 3,6 miljardi doosiga tavaliste ND vaktsiinidega [27].

Lisaks in ovo kasutamise eelisele tekitavad NDV valke ekspresseerivad rHVT vaktsiinid pärast ühekordset manustamist tugeva ja pikaajalise immuunsuse [28]. Lisaks mõjutab neid ajutiselt NDV-vastaste emalt saadud antikehade olemasolu [8]. Kuid rHVT-ND vaktsiinidel on mõned piirangud, näiteks hilinenud immuunsus, ja eelnev HVT vaktsineerimine näib olevat vastupidav HVT revaktsineerimisele samadel lindudel [9, 29]. HV vaktsiinid on rakkudega seotud ning neid tuleb säilitada ja transportida vedelas lämmastikus, mis piirab nende kasutamist paljudes riikides.

Uute in ovo vaktsiinide väljavaade kasvab [23]. In-ovo manustamisviisi jaoks on uuritud erinevaid vektoreid ja paljulubavaid tulemusi on teatatud inimese mittereplitseeruvate adenoviiruse [30] ja alfaviiruse vektoriga vaktsiinide [31] puhul. Kuigi rutiinse kommertskasutuse osas pole edusamme tehtud, on tehtud jõupingutusi ka uute in ovo mitte-HVT NDV-vektoritega vaktsiinide väljatöötamiseks [32–35]. ND elusvaktsiinide kasutamine in ovo on väljakutse. Kuigi ND elusvaktsiinid, nagu LaSota, B1, Clone 30 ja Ulster, tekitavad tugeva immuunvastuse ja neid kasutatakse tavaliselt juba ühepäevaste kanade vaktsineerimiseks, on need seotud kõrge embrüosuremusega, kui manustati 18-päevasel embrüo rahvusel. Pärast in-ovo kasutamist on teatatud suremusest kuni 100 protsenti metsikut tüüpi madala virulentsete viiruste ja 80 protsenti geneetiliselt nõrgestatud elusviiruste kasutamisel ning praegu ei kasutata selle vaktsiini manustamismeetodi jaoks ND elusvaktsiine [36, 37]. .

Uudne rekombinantne NDV (rNDV) vektoriga eksperimentaalne vaktsiin, mis sisaldab lindude antisenss-interleukiin 4 inserte (IL4), nimega ZJ1*l-IL4R, osutus hiljuti pärast spetsiifilise patogeenivaba (SPF) hindamist paljulubavaks in ovo vaktsiini kandidaadiks. ) embrüoneeritud kanamunad (ECE) [38]. Selle uuringu eesmärk oli täiendavalt hinnata selle rekombinantse NDV-vektoriga vaktsiini ja selle rekombinantse karkassi (metsikut tüüpi viirusest nõrgestatud lõhustamiskoht) ja rekombinantse LaSota-IL4R viiruse rakendatavust 18-päevaste in-ovo vaktsineerimiseks. kaubanduslikud munad, millel on kõrge ema antikehade tiiter. Kontrollidena lisati kaubanduslikult saadavad vaktsiinid LaSota ja rHVT-ND. Lisaks oli selle uuringu eesmärk hinnata uuritud vaktsiinide kaitsetõhusust vNDV varajaste väljakutsete vastu. Siin näidatakse nende rekombinantsete vaktsiinide võimet tõhusalt ületada ema immuunsus isegi väikestes annustes ja kutsuda esile tugev immuunvastus. Eksperimentaalsed rNDV vaktsiinid näitasid pärast varajast vNDV-ga nakatumist 100-protsendilist kaitset.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Viirused

Selles uuringus kasutati provotseeriva viirusena virulentset hani/China/ZJ1/2000 (ZJ1, GenBank registreerimisnumber AF431744) NDV-d, mis on alamgenotüübi VII.1.1 liige (endine VIId). Rekombinantset ZJ1 viirust (ZJ1 nõrgestatud versioon) madala virulentse lõhustumiskohaga (ZJ1*L), mis oli varem meie laboris pöördgeneetika abil genereeritud [39], kasutati rekombinantsete ZJ1*L vaktsiinide loomise selgroona ja vaktsiinina. viirus. Madala virulentse LaSota (LS) vaktsiinitüve kasutati vaktsiinikontrollina ja rekombinantse LS-IL4R vaktsiini genereerimiseks. Kõik viirused saadi USA põllumajandusministeeriumi (USDA) Ameerika Ühendriikide riikliku linnukasvatusuuringute keskuse (USNPRC) Southeast Poultry Research Laboratory (SEPRL) hoidlast. Lisaks kasutati kontrollina ka kaubanduslikult saadavat rHVT-ND vaktsiini (fusioongeeni insert).

Selles uuringus kasutatud rekombinantsed NDV eksperimentaalsed vaktsiinid loodi pöördgeneetika abil, nagu eelnevalt kirjeldatud [38, 39]. Lühidalt, lindude IL4 kodeeriv järjestus klooniti P- ja M-geenide vahel vastupidises orientatsioonis (IL4R) ZJ1*L ja LS karkassi, tekitades kaks rekombinantset nõrgestatud elusviirust – nimelt ZJ1*L-IL4R ja LS-. IL4R (GenBanki registreerimisnumbrid vastavalt MM680659 ja MM680665). Rekombinantsed viirused päästeti T7 polümeraasi (MVA/T7) ekspresseeriva modifitseeritud vaktsiiniaviiruse Ankara abil, järgides varem avaldatud protokolle [38–41]. Konstruktsioonide skemaatiline kujutis on esitatud lisajoonisel S1A. Selle töö jaoks viitab edaspidi kasutatav termin "DV vaktsiinid" ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R ja LS-IL4R.

Kõikide NDV-de töövarud paljundati {{0}} 11-päevasteks SPF embrüoneeritud kanamunadeks (ECE) [42]. Selles uuringus munade inokuleerimiseks kasutatud viirusevarusid lahjendati aju südame infusiooni (BHI) puljongis (BD Biosciences, MD, USA), mis sisaldas 200 µg/ml gentamütsiini, 2{{22} }00 U/mL penitsilliini ja 4 µg/mL amfoteritsiin B kolme erineva sihttiitrini, 105,5/0,1 ml, 104,5/0,1 ml ja 103,5/0,1 ml embrüo infektsioosne annus (EID50), välja arvatud LS , mis lahjendati kuni 105,5/0,1 ml ja 104,5/0,1 ml EID50. Elusvaktsiinide lahjendatud töövarude tiitrid kinnitati tagasitiitrimisega 9- kuni 11-päevavanuste SPF ECE-de standardprotseduuride järgi, nagu eespool viidatud. RHVT-ND vaktsiini lahjendati otse, kasutades rHVT vaktsiinide jaoks mõeldud sahharoosfosfaatglutamaatalbumiini lahjendit, mida on kirjeldatud USDA veterinaarbioloogia testimisprotokollis [43].

2.2. Munad

Selle katse jaoks annetati lahkelt kakssada kuuskümmend kaks kaubanduslikku (mitte-SPF) muna Hy-Line Rockside W-36 tõukarjast (Mansfield, GA, USA). Kihikarja oli rutiinselt vaktsineeritud LaSota vaktsiiniga. Karja immuunsust on regulaarselt testitud ELISA abil ja kuigi need tulemused ei ole otseselt tõlgitavad hemaglutinatsiooni inhibeerimise (HI) tiitriteks, olid vanemkarja keskmised NDV-vastaste antikehade tasemed väga kõrged (st 15 534 positiivsete tiitritega). proovid 1159). SPF ECE-de (42 muna) allikaks oli SEPRL SPF White Leghorni kari. Kõiki mune inkubeeriti 18 päeva temperatuuril 37,5 ◦C ja suhtelisel õhuniiskusel 55–60 protsenti.

2.3. Vaktsineerimine

Kaubanduslikud (n {{{10}}}}) ja SPF (n=42) munad jaotati 18-päevasel embrüoneerimisel (DOE) 14 rühma, mõlemas 21 muna rühm (välja arvatud BHI ja Hatch kontrollrühmad, kus mõlemas oli 26 muna). Kasutades 1 ml, 24 G × 1/2 süstlaid, inokuleeriti iga muna allantoisiõõnde 0,1 ml lahjendatud vaktsiiniga või BHI-ga, välja arvatud Hatchi kontrollrühm, kus mune ei manipuleeritud kõik. Inokuleeritud munade rühma oli kolmteist, mis jagunesid seitsmeks katse- ja kuueks kontrollrühmaks. Seitse katserühma olid järgmised: ZJ1*L-IL4R 104.5, ZJ1*L-IL4R 105.5, LS-IL4R 103.5, LS-IL4R 104.5, LS-IL4R 105.5, ZJ1*L 104.5, ZJ1*L 104.5 ja Z1J1*5. vastav inokulaadi EID50 annus 0,1 ml kohta, nagu on märgitud rühma nimetuses. Lisaks loodi kuus kontrollrühma. Kaks kaubanduslike munade kontrollrühma inokuleeriti ülalkirjeldatud viisil vastavalt BHI ja rHVT-ND-ga. Kaks kaubanduslike munade kontrollrühma inokuleeriti ülalkirjeldatud viisil LS 104,5 ja LS 105,5 EID50 inokulaadi doosiga 0,1 ml kohta. Kaks SPF-munade kontrollrühma inokuleeriti ZJ1*L 103.5 ja ZJ1*L-IL4R 103.5-ga. Uuringu ülesehituse skemaatiline esitus on esitatud lisajoonisel S1B, C.

Pärast nakatamist paigutati munad Turbofan Hova-Bator inkubaatoritesse (GQF Manufacturing Company Inc., GA, USA), mis seejärel paigutati isolaatoritesse loomade bioturvalisuse taseme 2 (ABSL-2) rajatisse. Inkubaatoreid reguleeriti termostaatidega, et hoida konstantset temperatuuri 37,5 ◦C ja suhtelist õhuniiskust vahemikus 55–60 protsenti.

2.4. Haudumine, proovide võtmine, suremus

Pärast koorumist 21 DOE juures paigutati tibud alarõhuisolaatoritesse (ABSL-2) ning neile võimaldati ad libitum juurdepääs toidule ja veele. Viis mitte-SPF-kana nii Hatchi kontroll- kui ka BHI rühmast surmati ja neilt lasti kohe pärast koorumist verd, et määrata kindlaks ema NDV-vastaste HI-vastaste antikehade algtaseme tiiter. Kõik kanad kaaluti 1, 8 ja 13 päeva pärast koorumist (DPH). Orofarüngeaalsed ja kloaagi tampoonid koguti BHI-sse igalt linnult 2 ja 4 DPH juures. Kliinilised nähud ja suremus registreeriti kaks korda päevas kogu koorumisjärgse perioodi vältel ning vereproovid koguti 13 DPH juures.

2.5. Väljakutse

Kaksteist lindu igast rühmast (välja arvatud LS 1{{10}}5.5, mille puhul kõik linnud surid 6 DPH võrra) viidi ABSL-3E rajatisse kell 13 DPH. Linnud paigutati alarõhuisolaatoritesse ja lasti 24 tundi enne väljakutset aklimatiseeruda. Kõik linnud nakatati 14 DPH juures virulentse ZJ1 NDV-ga 106 EID50/0,1 ml okulo-nasaalselt. Linde jälgiti iga päev kliiniliste tunnuste ja suremuse suhtes. Igalt linnult koguti suuneelu ja kloaagi tampoonid 2 ja 4 päeva pärast nakatamist (DPC). Kõik ellujäänud linnud kaaluti ja neist võeti veri 14 DPC juures ning nad surmati emakakaela dislokatsiooniga pärast anesteesiat 0,2 ml ketamiini/ksülasiini lahusega (66 mg/ml ketamiini ja 6,6 mg/ml ksülasiini), mis manustati intramuskulaarselt 25- gauge nõelaga.

2.6. Reaalajas RT-PCR

RNA ekstraheeriti kõikidest tampooni söötmetest, kasutades MagMAX 96 AI/ND viiruse RNA isolatsioonikomplekti (Ambion, Inc. Austin, TX, USA) KingFisheri magnetosakeste protsessoriga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), järgides tootja juhiseid. , koos inhibiitori eemaldamise modifikatsiooniga, mida on kirjeldanud Das et al. [44]. Kvantitatiivne reaalajas RT-PCR (rRT-PCR) NDV tuvastamiseks, mis oli suunatud maatriksi (M) geenile, viidi läbi, kasutades AgPath-ID üheastmelist RT-PCR komplekti (Ambion) ja ABI 750{{31 }} Kiire reaalajas PCR süsteem (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA), mis kasutab praimereid ja sondi, mida on eelnevalt kirjeldanud Wise et al. [45]. Analüüsi tingimused olid pöördtranskriptsioon 10 min temperatuuril 45 ◦C; esialgne denatureerimine 10 min 95 ◦C juures; 40 denatureerimistsüklit 10 sekundit temperatuuril 94 °C, praimeri anniilimist 30 sekundit temperatuuril 56 °C ja praimeri pikenemist 10 sekundit temperatuuril 72 °C. Reaktsiooni kogumaht 25 µl iga proovi kohta koosnes molekulaarsest veest – 2,5 µL; 2X puhver – 12,5 ui; päripidine praimer – 0,25 µL (20 pmol/µL); pöördpraimer – 0,25 µL (20 pmol/µL); sond - 0,50 ui (6 pmol/uL); 25X ensüümide segu – 1,0 µL; ja RNA matriits – 8,0 µL. Viiruse kvantifitseerimiseks koostati iga viiruse jaoks standardkõver, kus RNA ekstraheeriti samast tiitritud viirustest, mida kasutati munade inokuleerimiseks (pärast koorumist kogutud tampooniproovide puhul) või nakatamise viiruse (pärast koorumist kogutud tampooniproovide puhul) - väljakutse).

Tulemused on esitatud kui EID50/ml. Analüüside arvutatud alumine avastamispiir oli vahemikus 101,7 kuni 101,9 EID50/ml. Oluline on märkida, et rRTPCR tuvastab viiruse nukleiinhapped ja et hinnangulised väärtused ei pruugi tingimata esindada nakkavaid viirusi. EID50/ml väärtuste eesmärk ei ole näidata nakkavust ja neid kasutatakse viiruse leviku suhtelise võrdlemiseks rühmade vahel. Vaatamata inhibiitori eemaldamise nukleiinhapete ekstraheerimisprotokolli kasutamisele võis RNA matriitsi suur maht mõjutada standardkõvera arvutusi. Pange tähele, et kõigis reaktsioonides kasutati sama kogust RNA matriitsi ja potentsiaalsed jääkide inhibiitorid oleksid mõjutanud kõiki tulemusi võrdselt.

2.7. HI analüüs

Antikehade olemasolu ja tiitrite hindamiseks kogu katse jooksul kogutud seerumiproovides kasutati hemaglutinatsiooni inhibeerimise (HI) testi. Pärast standardprotseduure [46] kasutati iga vaktsiini selgroona kasutatud viirust antigeenina iga vastava seerumirühma jaoks (ZJ1*L kõigi ZJ1 rühmade ja LS kõigi LS rühmade jaoks). Pärast nakatamist kogutud seerumiproovide jaoks kasutati HI testis antigeenina virulentset ZJ1 viirust. Tiitrid arvutati viimase HI-positiivse seerumi lahjenduse pöördväärtusena ja proove, mille HI tiitrid olid log2 3 ja alla selle, loeti negatiivseteks.

2.8. Statistilised analüüsid

Andmete analüüsimiseks kasutati Prism v.7.{7}}3 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) tarkvara ja kõrvalekalded tuvastati ROUT testi abil. D'Agostino-Pearsoni normaalsuse test viidi läbi, et hinnata, kas iga rühma väärtused pärinevad Gaussi jaotusest. Normaalsuse jaotuse põhjal kasutati rühmade vahel mitmekordseks võrdluseks mitteparameetrilist Kruskal-Wallis testi koos Dunni järeltestiga. Statistilistel eesmärkidel anti kõikidele tampooniproovidele, millelt viiruseid ei tuvastatud, iga viiruse avastamispiirist 1 log võrra väiksem arvväärtus. Elulemuskõveraid analüüsiti Log-rank (Mantel-Cox) testi abil. Statistiline olulisus määrati p-väärtusele < 0,05.

3. Tulemused

3.1. Haudutavus, koorumisejärgne ellujäämine ja kehakaal

Kõigi kaubanduslikest munadest koorunud rühmade koorumisjärgne ellujäämine on kujutatud ellujäämiskõveratena joonisel 1 (selguse ja graafika ummistumise vältimiseks joonistel 1A ja B eraldatud). Kombineeritud graafik on saadaval lisajoonisel S2. Hatch kontrollrühm (ei nakatatud) lisati kavandisse tagamaks, et ei esinenud ebanormaalset koorumist ega koorumisjärgset suremust, mis ei olnud seotud munade nakatamisega.

Nagu oodatud, täheldati kolmes kontrollrühmas väga madalat (rHVT-ND) kuni mitte (Hatch ja BHI) koorumisjärgset suremust. Seevastu LS-i kontrollrühmade elulemus oli 57,1 protsenti ja 0 protsenti, kui kasutati vastavalt 104,5 ja 105,5 annust, mida on varem teatatud tavapäraste ND elusvaktsiinide puhul. Kaks muna ei koorunud LS-IL4R 105.5 rühmas ja üks muna ei koorunud LS 104.5 rühmas. Teistes rühmades täheldati varieeruvat suremust sõltuvalt vaktsiini ja pookimise annusest. ZJ1*L-IL4R 104,5 ja 105,5 rühmade elulemus oli vastavalt 90,5% ja 71,4% ning ZJ1*L 104,5 ja 105,5 rühmades registreeritud elulemus oli vastavalt 80,9% ja 76,2%, kuid erinevused olid (joonis 1A). ei ole statistiliselt oluline. Elulemus LS-IL4R 103,5 rühmas oli 95,2 protsenti. LS-IL4R 104,5 ja 105,5 rühmades täheldatud elulemusnäitajad olid vastavalt 85,7% ja 66,7% (joonis 1B).

Eksperimentaalsete ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R ja LS-IL4R vaktsiinirühmade ning Hatch, BHI ja rHVT-ND kontrollrühmade vahel elulemuses olulisi erinevusi ei olnud, kuid nende kontrollrühmade ellujäämise protsent oli arvuliselt kõrgem. , kusjuures täheldati negatiivset korrelatsiooni vaktsiiniannuse ja koorumisjärgse elulemuse vahel (elulemus suurenes vaktsiiniannuse vähenemisega). LS 1{{10}}5,5 kontrollrühmal oli ellujäämises olulisi erinevusi võrreldes katserühmadega (p väärtused vahemikus 0.0001 kuni 0,02). LS 104.5 kontrollrühmal, kuigi see ei olnud statistiliselt erinev, oli oluliselt madalam elulemus võrreldes sama annusega katserühmadega. Kahel LS kontrollrühmal oli elulemuse osas olulisi erinevusi võrreldes Hatch, BHI ja rHVT-ND kontrollrühmadega (p väärtused vahemikus 0,0001 kuni 0,04). Kliinilisi tunnuseid ei täheldatud üheski rühmas pärast koorumist. Rühmades, kus esines koorumisjärgne suremus, leiti linnud igapäevasel kontrollimisel surnud.

Kõik linnud kaaluti 1., 8. ja 13. päeval pärast koorumist (tabel 1). 1 DPH juures oli keskmine kehakaal linnu kohta enamikus rühmades vahemikus 38,5–42,6 grammi (g). Olulised kehakaalu erinevused olid ainult rHVT-ND ja ZJ1*L-IL4R 104,5 rühmade vahel ühelt poolt ning ZJ1*L 104,5 ja kontrollrühma LS 1{{4{{42} }}}4,5 teisest (kahe esimese rühma linnud kaalusid rohkem kui kontrollrühma linnud) (p väärtused vastavalt vahemikus 0.0001 ja 0,017). Kell 8 DPH oli kahe ZJ1*L rühma ning LS-IL4R 104.5, LS-IL4R 105.5 rühma ja LS-i kontrollrühma (keskmine kaal 50–63 g) kehakaal oluliselt väiksem kui Hatchist pärit lindudel. BHI ja rHVT-ND kontrollrühmad (keskmine kaal 77–82 g) (p väärtused vahemikus 0,0001 kuni 0,03). Samadel rühmadel, mis erinesid oluliselt kontrollrühmadest 8 DPH juures (välja arvatud LS-IL4R 104,5), oli oluliselt väiksem kehakaal kui Hatch, BHI ja rHVT-ND kontrollrühmadel ka 13 DPH juures (p väärtused vahemikus 0,0001 kuni 0,01). Sellesse võrdlusesse ei kaasatud nakatatud SPF kontrollrühmade linde, kuna SPF munad (ja neist koorunud linnud) on traditsiooniliselt väiksemad ja kergemad kui kaubanduslikud munad.

Joonis 1. Kanade ellujäämine pärast koorumist pärast kaubanduslike munade nakatamist 18-päevasel embrüoneerimisel eksperimentaalsete in ovo NDV vaktsiinidega. Hy-Line Rockside W-36 munad inokuleeriti rekombinantsete viiruste ja LaSotaga. Kolm kontrollrühma inokuleeriti BHI või rHVT-ND vaktsiiniga või ei nakatatud (Hatch kontrollrühm). Linde jälgiti 13 päeva pärast koorumist. Elulemuskõverad on esitatud kahel joonisel: (A) kontrollrühmad ja ZJ1*L rühmad ning (B) kontrollrühmad ja LS-IL4R rühmad. Erinevad ülaindeksi tähed näitavad statistiliselt olulisi erinevusi rühmade vahel (p-väärtus < 0,05). Rühma lühendid: HATCH — munad ei ole inokuleeritud; BHI – BHI-ga nakatatud munad; rHVT-ND – rekombinantse HVT vaktsiiniga nakatatud munad; ZJ1*L – rekombinantse ZJ1*L viirusega nakatatud munad, mille lõhustumiskohta muudeti madala virulentsusega; ZJ1*L-IL4R – munad, mis on inokuleeritud rekombinantse madala virulentse ZJ1*L-ga, millele on sisestatud vastupidises orientatsioonis interleukiin-4 geen; LS — LaSota tüvega nakatatud munad; LS-IL4R – munad, mis on inokuleeritud rekombinantse LaSota viirusega, mille interleukiin-4 geen on sisestatud vastupidises orientatsioonis. Viiruse doos, mille iga rühma munad said, on esitatud rühma nime järel numbrina EID50/muna kohta.

Tabel 1. Kanade keskmine kaal (ja standardhälbed) 1., 8. ja 13. päeval pärast koorumist pärast kaubanduslike munade nakatamist 18. päeval embrüoneerimisel eksperimentaalsete in ovo vaktsiinidega ja 14 päeva pärast virulentse Newcastle'i haigusega nakatamist viirus.

3.2. Vaktsiiniviiruste levik pärast vaktsineerimist, nagu on näidatud rRT-PCR-ga

2 DPH korral ei olnud vaktsiinirühmade vahel viiruse levimises olulisi erinevusi. (Joonis 2A). Samamoodi ei olnud 4 DPH juures erinevused rühmade vahel statistiliselt olulised. (Joonis 2B). Viiruse levikut ei tuvastatud ühelgi Hatch ja BHI kontrolllinnul.

Joonis 2. Keskmine koorumisjärgne vaktsiini eritumine kanadelt, kes on koorunud kaubanduslikust munast, mis on nakatatud 18-päevase embrüonatsiooni ajal eksperimentaalsete in ovo vaktsiinidega. Iga andmepunkt esindab ühte lindu ja NDV tiitreid, mis on tuvastatud orofarüngeaalsetes (OP) ja kloaagis (CL) võetud tampooniproovides erinevatel päevadel pärast koorumist (DPH). Varisemine esitatakse eraldi 2 päeva pärast koorumist (A) ja 4 päeva pärast koorumist (B). Tulbad tähistavad keskmise standardhälbeid. Kõigile tampooniproovidele, millelt viirust ei tuvastatud, anti iga vastava viiruse puhul arvväärtus 1 log allpool avastamispiiri. rRT-PCR tuvastamise piir on esitatud horisontaalse punktiirjoonena (kasutatakse madalaimat piiri). Rühma lühendid: HATCH — munad ei ole inokuleeritud; BHI – BHI-ga nakatatud munad; rHVT-ND – rekombinantse HVT vaktsiiniga nakatatud munad; ZJ1*L – rekombinantse ZJ1*L viirusega nakatatud munad, mille lõhustumiskohta muudeti madala virulentsusega; ZJ1*L-IL4R – munad, mis on inokuleeritud rekombinantse madala virulentse ZJ1*L-ga, millele on sisestatud vastupidises orientatsioonis interleukiin-4 geen; LS — LaSota tüvega nakatatud munad; LS-IL4R – munad, mis on inokuleeritud rekombinantse LaSota viirusega, mille interleukiin-4 geen on sisestatud vastupidises orientatsioonis. Viiruse doos, mille iga rühma munad said, on esitatud rühma nime järel numbrina EID50/muna kohta.

3.3. Humoraalne immuunvastus pärast koorumist

13 DPH juures (diagonaalse triibuga täidetud tulbad) kogutud seerumiproovide analüüs HI-testiga (NDV hemaglutinatsiooni antikehade tuvastamine) on kujutatud joonisel 3. Passiivselt ülekantud anti-NDV emapoolsete HI-antikehade tiitri määramiseks kaubanduslikes munades tuleb kümme kanadelt veretati kohe pärast koorumist (0 DPH). HI-tiitrid viirutamisel varieerusid log2 5 ja log2 8 vahel, keskmiselt log2 7.17 (joonis 3, punktiir horisontaalne punane joon). Antikehad 13 DPH juures Hatch, BHI ja rHVT-ND rühmades (keskmine log2 4.7) on ema jääkantikehad, kuna neid rühmi ei vaktsineeritud või vaktsineeriti rHVT-ND vaktsiiniga, mis ei indutseeri HI antikehi NDV vastu. Antikehade tiitrid ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R ja LS 104.5 rühmades olid oluliselt kõrgemad kui Hatch, BHI ja rHVT-ND kontrollrühmades. Sama karkassiga vaktsiinide erinevate annustamisrühmade vahel olulisi erinevusi ei täheldatud. LS-IL4R rühmadel olid vaktsineerimisjärgsed HI tiitrid madalamad võrreldes ZJ1*L-IL4R ja ZJ1*L rühmadega, kuigi need erinevused ei olnud statistiliselt olulised. Pange tähele, et kuigi arvuliselt veidi kõrgemad, ei erinenud lindude vaktsineerimisjärgsed HI-tiitrid kõigis LS-IL4R rühmades oluliselt vaktsineerimata kontrolllindude tiitritest.

Joonis 3. Enne ja pärast nakatamist HI-antikehade tiitrid (ja standardhälve) kanadel, mis on koorunud kaubanduslikust munast, mis on nakatatud 18-päevasel embrüonatsioonil eksperimentaalsete in ovo vaktsiinidega ja varajane nakatamine virulentse Newcastle'i haiguse viirusega 14 päeva pärast koorumist. Diagonaalsed triibuga täidetud tulbad tähistavad nakatamiseelseid tiitreid 13 päeva pärast koorumist. Tahke täidisega tulbad tähistavad nakatamisjärgseid tiitreid 14 päeva pärast nakatamist. Statistiliselt olulised erinevused erinevate rühmade vahel on esitatud iga rühma kohal väikeste tähtedega (p-väärtus<0.05). The level of maternal antibodies on the day of hatch (0 DPH) is presented as a horizontal dotted line. Group abbreviations: HATCH—eggs not inoculated; BHI—eggs inoculated with BHI; rHVT-ND—eggs inoculated with recombinant HVT vaccine; ZJ1*L—eggs inoculated with the recombinant ZJ1*L virus whose cleavage site was modified to be of low virulence; ZJ1*L-IL4R—eggs inoculated with the recombinant low virulent ZJ1*L with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation; LS—eggs inoculated with the LaSota strain; LS-IL4R—eggs inoculated with the recombinant LaSota virus with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation. The virus dose that the eggs in each group received is represented as a number after the group name in EID50/per egg.

3.4. Kliinilised nähud ja ellujäämine pärast CDV varajast väljakutset

Kontrollrühmades olid esimesed kliinilised nähud Hatch ja BHI rühmas 3 DPC juures. Kolmel Hatch-rühma linnul ja ühel BHI-rühma linnul oli hingamisraskusi. 4 DPC korral täheldati BHI ja luude rühmas kortsutatud sulgi ja pea värisemist ning rHVT-ND rühmas 5 DPC juures; viimases rühmas registreeriti kahel linnul ka ataksia ja raskekujuline tortikollis. Hatchi kontrollrühma lindudel ilmnes 5 DPC juures letargia ja kahel BHI rühma linnul oli halvatus. Letargiat ja halvatusi täheldati rHVT-ND rühmas kell 6 ja 7 DPC. Hatch ja BHI kontrollrühmades täheldati opisthotonose, torticollis ja hingamisraskusi alates kell 9 DPC. RHVT-ND rühmas täheldati tortikollist juba 5 DPC ajal, hingamisraskused ja ataksia algasid 6 DPC ajal ning opisthotonos algas kell 13 DPC. 14 DPC-ks surid kõik linnud, välja arvatud kaks haudunud lindu, üks BHI ja kaks rHVT-ND lindu (vastavalt 83,3%, 91,6% ja 83,3%), või neil tekkisid valdavalt neuroloogilised kliinilised nähud, nagu ataksia, opistotonus, tortikollis, treemor. , ja halvab. Linnud, kellel ilmnesid rasked kliinilised nähud, lõpetasid söömise või joomise või jäid lamavasse asendisse, surmati ja ellujäämisaegade arvutamiseks teatati järgmisel päeval surnutena. Kliinilisi tunnuseid ei täheldatud üheski ZJ1*L ja ZJ1*L-IL4R rühmas. Opisthotonose või torticollise kergeid kliinilisi tunnuseid täheldati ühel linnul (haigestumine 8,4 protsenti) mõlemas LS-IL4R rühmas ja LS 104.5 rühmas 14 DPC juures.

Elulemus pärast virulentse ZJ1 NDV nakatamist on kujutatud ellujäämiskõveratena joonisel 4. Kui kõik rekombinantsete vaktsiinide ja LS-ga nakatatud rühmad näitasid 100-protsendilist ellujäämist, oli Hatch, BHI ja rHVT-ND rühma lindude ellujäämine 58,3 protsenti. elulemus vastavalt 58,3 protsenti ja 66,6 protsenti. Hatch'i ja BHI kontrollrühmade nakatamisjärgne elulemus oli oluliselt madalam võrreldes eksperimentaalsete vaktsiinirühmadega. Märkimisväärne on see, et kuigi nakatatud rühmade lindude kehakaal kõikus pärast koorumist võrreldes Hatch, BHI ja rHVT-ND kontrollidega, ületasid kõik rNDV-ga vaktsineeritud linnud (282–328 g) vaktsineerimata kehamassi. kontrolllinnud pärast nakatamist (255–266 g) (tabel 1). Siiski ei täheldatud ühegi uuritud rühma vahel olulist kehakaalu erinevust.

Joonis 4. Kanade ellujäämine pärast kaubanduslike munade nakatamist 18-päevasel embrüoneerimisel eksperimentaalsete in ovo vaktsiinidega ja varajast nakatamist virulentse Newcastle'i haiguse viirusega 14 päeva pärast koorumist. Linde jälgiti 14 päeva pärast nakatamist. Erinevad ülaindeksi tähed näitavad statistiliselt olulisi erinevusi rühmade vahel (p-väärtus < 0,05). Rühma lühendid: HATCH — munad ei ole inokuleeritud; BHI – BHI-ga nakatatud munad; rHVT-ND – rekombinantse HVT vaktsiiniga nakatatud munad; ZJ1*L – rekombinantse ZJ1*L viirusega nakatatud munad, mille lõhustumiskohta muudeti madala virulentsusega; ZJ1*L-IL4R – munad, mis on inokuleeritud rekombinantse madala virulentse ZJ1*L-ga, millele on sisestatud vastupidises orientatsioonis interleukiin-4 geen; LS — LaSota tüvega nakatatud munad; LS-IL4R – munad, mis on inokuleeritud rekombinantse LaSota viirusega, mille interleukiin-4 geen on sisestatud vastupidises orientatsioonis. Viiruse doos, mille iga rühma munad said, on esitatud rühma nime järel numbrina EID50/muna kohta.

3.5. Post-Challenge vabanemine, nagu näitas rRT-PCR

2 DPC korral eraldasid Hatch'i, BHI ja rHVT-ND kontrollrühmade linnud suukaudsel manustamisel kõrgeid viirustiitreid (1{{20}}5,3–5,7 EID50/mL), samas kui kõik vaktsiinirühmad olid madalamad kui 104 EID50/mL keskmised heitetiitrid (joonis 5A). Kloaagi kaudu leviva viiruse tulemused olid kõigis rühmades testi tuvastamispiirist madalamad. 2 DPC korral tuvastati kõigis ZJ1*L ja ZJ1*L-IL4R rühmades ning LS-IL4R 105.5 rühmas olevatel lindudel suukaudsel manustamisel oluliselt vähem viiruse RNAd võrreldes Hatch, BHI ja rHVT-ND kontrollrühmadega. (p väärtused jäid vahemikku 0,001–0,02). Kell 4 DPC oli Hatch, BHI ja rHVT-ND rühmades suukaudse manustamise teel levik kõrge (106,2–6,9 EID50/ml) (joonis 5B).

Seevastu 4 DPC korral täheldati kõigis vaktsiinirühmades vähem eraldumist, võrreldes 2 DPC-ga, kusjuures kõrgeim keskmine tiiter oli 102,9 EID50/ml rühmas ZJ1*L 104,5 ja madalaim keskmine tiiter 101,5 EID50/ml ZJ1* rühmas. l-IL4R 104.5 rühm (mõnedel lindudel viiruse RNA-d ei tuvastatud). Kõik eksperimentaalsed rNDV vaktsiinirühmad eraldasid suukaudse manustamise kaudu oluliselt vähem viirust võrreldes Hatch, BHI ja rHVT-ND kontrollrühmadega (p väärtused alates<0.0001 to 0.03). No significant differences in oral shedding were observed among the experimental rNDV vaccine groups. The birds in the rNDV vaccine groups shed significantly less virus through the cloacal route compared with the Hatch, BHI, and rHVT-ND control groups (p values from <0.0001 to 0.007). The differences in the titers were not significant among the experimental rNDV vaccine groups and the LS control group.

Joonis 5. Keskmine nakatamisjärgne viiruse levik kanadelt pärast kaubanduslike munade inokuleerimist 18-päevasel embrüoneerimisel eksperimentaalsete in ovo vaktsiinidega ja varajast nakatamist virulentse Newcastle'i haiguse viirusega 14 päeva pärast koorumist. Iga andmepunkt tähistab erinevatel päevadel pärast nakatamist (DPC) orofarüngeaalsete (OP) ja kloaagi (CL) tampooniproovides tuvastatud NDV tiitreid. Varisemine esitatakse eraldi 2 päeva pärast nakatamist (A) ja 4 päeva pärast nakatamist (B). Tulbad tähistavad keskmise standardhälbeid. Kõigile tampooniproovidele, millelt viirust ei tuvastatud, anti numbriline väärtus 1 log alla avastamispiiri. rRT-PCR tuvastamise piir on esitatud horisontaalse punktiirjoonena.

Statistiliselt olulised erinevused erinevate rühmade vahel on esitatud iga rühma kohal väikeste tähtedega (p-väärtus < 0.05). Rühma lühendid: HATCH — munad ei ole inokuleeritud; BHI – BHI-ga nakatatud munad; rHVT-ND – rekombinantse HVT vaktsiiniga nakatatud munad; ZJ1*L – rekombinantse ZJ1*L viirusega nakatatud munad, mille lõhustumiskohta muudeti madala virulentsusega; ZJ1*L-IL4R – munad, mis on inokuleeritud rekombinantse madala virulentse ZJ1*L-ga, millele on sisestatud vastupidises orientatsioonis interleukiin-4 geen; LS — LaSota tüvega nakatatud munad; LS-IL4R – munad, mis on inokuleeritud rekombinantse LaSota viirusega, mille interleukiin-4 geen on sisestatud vastupidises orientatsioonis. Viiruse doos, mille iga rühma munad said, on esitatud rühma nime järel numbrina EID50/muna kohta.

3.6. Väljakutsejärgne seroloogia

Kõigil Hatch, BHI ja rHVT-ND kontrollrühmade lindudel oli HI-antikehade tiitrid 14 DPC juures (üle log2 10) suurenenud (rohkem kui kaks korda) võrreldes nakatamiseelsete tiitritega 13 DPH juures (log{ {6}}.7). Nende kolme rühma tiitrite erinevused enne ja pärast nakatamist olid olulised (p-väärtus<0.0001) (Figure 3, solid bars). In contrast, the post-challenge HI titers in all experimental rNDV vaccine groups and the LS control group did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups. In all groups, the differences between pre-and post-challenge antibody titers were within a log (except LS-ILR4 103.5, in which the difference was log2 1.8).

3.7. Inokuleeritud SPF kontrollrühmad

Elulemus SPF kontrollrühmades pärast koorumist oli 66,7 protsenti rühmas, kellele oli inokuleeritud ZJ1*L 103,5 ja 57,1 protsenti rühmas, kellele oli inokuleeritud ZJ1*L-IL4R 103.5 (täiendav joonis S3A). SPF-i kontrollrühmade lindudel tuvastati mõlemal viisil aktiivne viiruse levik, kusjuures orofarüngeaalsetes tampooniproovides tuvastati kõrgemad tiitrid (vt täiendav joonis S3B). Inokuleeritud SPF-i kontrolllindude vaktsineerimisjärgsed HI-tiitrid olid kõrgemad kui Hatch, BHI ja rHVT-ND kontrollrühmade tiitrid ning saavutasid keskmised väärtused log2 7.08 ja log2 7. 58 kell 13 DPH vastavalt ZJ1 * L-IL4R 103.5 ja ZJ1 * L-IL4R 103.5 rühmades (vt lisajoonist S3C). Kahes nakatatud SPF-i kontrollrühmas ei täheldatud nakatamisjärgseid kliinilisi tunnuseid ega suremust (elulemuskõverate kohta vt lisajoonist S3D). Inokuleeritud SPF kontrollrühmade linnud eraldasid suukaudsel manustamisviisil 2 DPC ja 4 DPC korral oluliselt vähem viirust võrreldes kontrollrühmadega (p väärtused alates<0.0001 to 0.009) (see Supplementary Figure S3E). The post-challenge antibody titers in both inoculated SPF control groups did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups (see Supplementary Figure S3C).

For more information:1950477648nn@gmail.com