Mitte kõik vahustused pole ühesugused: kannabidiooli ja nikotiini vapimise erinevad mõjud kopsudele
Sep 28, 2023
ABSTRAKTNE
Põhjendus Vapingust on saanud populaarne meetod erinevate psühhoaktiivsete ainete sissehingamiseks. Kui vapingu hingamisteede mõjude hindamisel on keskendutud peamiselt nikotiini sisaldavatele toodetele, siis kannabidiooli (CBD) aurustamine on muutumas üha populaarsemaks. Praegu pole teada, kas nikotiini ja kannabinoidide aurustamise mõju tervisele on sarnane.
Eesmärgid
Selles uuringus võrreldakse kõrvuti aurustunud CBD ja nikotiini ägeda sissehingamise mõju kopsudele.
meetodid
In vivo sissehingamise uuringud hiirtel ja in vitro tsütotoksilisuse katsed inimrakkudega viidi läbi, et hinnata CBD või nikotiini aerosoolide kopsukahjustusi esilekutsuvat mõju aurustitest.
cistanche toidulisandi eelised - suurendavad immuunsust
Mõõtmised ja peamised tulemused
Hiirte kopsupõletikku hinnati histoloogia, voolutsütomeetria ning põletikueelsete tsütokiinide ja kemokiinide tasemete kvantifitseerimise abil. Kopsukahjustusi hinnati histoloogia, müeloperoksidaasi aktiivsuse mõõtmise ja neutrofiilide elastaasi tasemete abil bronhoalveolaarses loputusvedelikus ja kopsukoes. Kopsu epiteeli / endoteeli terviklikkust hinnati BAL-valgu taseme, albumiini lekke ja kopsu FITC-dekstraani lekke kvantifitseerimise teel. Oksüdatiivne stress määrati antioksüdantide potentsiaali mõõtmisega BAL-is ja kopsudes. CBD ja nikotiini aerosoolide tsütotoksilist toimet inimese neutrofiilidele ja inimese väikeste hingamisteede epiteelirakkudele hinnati in vitro õhu-vedeliku liidesesüsteemi abil. CBD aerosooli sissehingamine põhjustas nikotiiniga võrreldes suuremaid põletikulisi muutusi, raskemaid kopsukahjustusi ja kõrgemat oksüdatiivset stressi. CBD aerosool näitas ka nikotiiniga võrreldes suuremat toksilisust inimese rakkudele.
Järeldused
CBD aurustamine kutsub esile tugeva põletikulise reaktsiooni ja põhjustab rohkem kopsukahjustusega seotud patoloogilisi muutusi kui nikotiini aurustamine.
SISSEJUHATUS
1990ndad alternatiivse kanepitarbimisviisina. Kanepiaurustid olid tavaliselt suured seadmed, mis soojendasid kuivatatud kanepiürte kuni kannabinoidi aurustumiseni. 2000. aastate alguses tekkisid väiksemad kaasaskantavad aurustid e-sigarettidena ja neist on saanud populaarne nikotiini manustamisviis.1 E-sigaretid soojendavad nikotiini pigem lahuses kui kuivatatud tubakalehtedes. Hiljuti on kanepiturul aurustid järginud sarnast üleminekut, kus on rohkem kasutatud vedelaid kanepiekstrakte.2–7 Aurutoodetest eralduvad aerosoolid ei sisalda mitte ainult psühhoaktiivseid aineid, nagu nikotiin ja kannabinoidid (peamiselt tetrahüdrokannabinool (THC) ja kannabidiool (CBD)). aga ka hingamisteede mürgiseid aineid (nt formaldehüüd, akroleiin, bensaldehüüd).8–11 Paljud nikotiini ja kannabinoidide aurustamises osalevad keemilised koostisosad on sarnased ja teised väga erinevad, mistõttu on oluline kaaluda neid küsimusi hingamisteede tagajärgede mõistmise kontekstis. mõlema aine aurustamine. Näiteks nikotiini ja kannabinoide sisaldavates aurustustoodetes kasutatavad lahustid võivad kannabinoidide lipofiilsete omaduste tõttu olla erinevad.12 E-vitamiini atsetaat tuvastati lisandina THC-d sisaldavates aurustustoodetes ja mängis olulist rolli 2019. aasta puhangus. e-sigareti ja aurustamisega seotud kopsukahjustuse (VALI) kohta.13 14 Piiratud arv uuringuid aurustamise hingamisteede mõjude kohta on keskendunud peamiselt nikotiini sisaldavatele toodetele. In vitro uuringud näitavad, et nikotiini aurustamine võib aktiveerida immuunrakke ja kahjustada mõningaid nende põhifunktsioone.15 Loomkatsed näitasid, et kokkupuude e-sigarettide nikotiiniga mõjutab negatiivselt immunoloogilisi reaktsioone.{19}} Inimeste vaatlusuuringud on näidanud, et nikotiini aurustamine pärsib kaasasündinud immuunsüsteemi aspektid nina epiteelirakkudes.18 19 Epidemioloogilised uuringud on teatanud seostest nikotiini aurustamise ja krooniliste hingamisteede haiguste (krooniline köha, bronhiit, astma) vahel.20–24 Alates uuringutest hingamisteede ja immunoloogiliste tervisega seotud tulemuste kohta. Kanepi tarbimine on keskendunud ainult suitsetatud kanepile25–31, praegu pole teada, kas nikotiini ja kannabinoidide aurustamise mõju tervisele on sarnane. Selle uuringu eesmärk oli võrrelda kõrvuti aurustunud kannabinoidide ägeda sissehingamise mõju nikotiiniga.
Tabel 1 In vivo ja in vitro kokkupuutekatsetes kasutatud aurustustoodetes (kuumutamata vedelikud) leitud kemikaalide võrdlus
MATERJALID JA MEETODID
Kasutatud meetodeid kirjeldatakse üksikasjalikumalt veebipõhises lisafailis.
Vaping tooted
Kasutasime kahte kaubanduslikku vapitoodet, millest üks sisaldas CBD-d ja teine nikotiini (joonisel lühendatult CBD-vape ja Nic-vape). CBD-d sisaldav kaun oli CalmVape firmalt The Kind Group LLC ja nikotiini sisaldav kaun oli Juul, firma Juul Labs. Mõlemad tooted osteti USA-st Internetist 20. novembril0. CalmVape'i kaunad märgistati, et need sisaldavad 50 mg/ml CBD-d, mis on lahustatud keskmise ahelaga triglütseriidide (MCT) segus ja millel oli loomulik maitse. Juul märgistati, et see sisaldab 5,0% nikotiini, mis on lahustatud propüleenglükooli (PG) taimse glütseriini (VG) ja Virginia Tobacco maitseaine segus. Testisime kuumutamata ja kuumutatud vedelikke ning mõlemast tootest tekkivaid emissioone, kasutades täielikult valideeritud ja varem avaldatud kromatograafia-massispektromeetria teste.32 Kahe toote vedelikes tuvastatud peamised koostisosad on loetletud tabelis 1. Üksikasjalik loetelu kemikaalidest, mis on tuvastatud kuumutatud lahused, sealhulgas nelja potentsiaalselt toksilise karbonüülühendi (formaldehüüd, atseetaldehüüd, atsetoon ja akroleiin) saagised eralduvates aerosoolides, on esitatud veebipõhistel lisajoontel E1–E4 ja veebipõhistel lisatabelitel E1 ja E2.
Tistanche toidulisandi eelised - kuidas tugevdada immuunsüsteemi
Hiired
Kuue nädala vanused C57BL/6NCr isased ja emased hiired hangiti Charles Riveri laborist (Wilmington, Massachusetts, USA) ja neid hoiti spetsiifilistes patogeenivabades tingimustes valguse/pimeduse tsüklitega 12/12 tundi. Loomade arv kokkupuuterühmas oli n=10 (5 isast ja 5 emast, välja arvatud Nic-vape, mis sisaldas 5 isast ja 4 emast; üks emane hiir oli väga väikese suurusega ja vajas enne uuringu lõpetamist eutaneerida ). Kõik katsed viidi läbi vastavalt institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee kehtestatud juhistele ning järgiti kõiki osariigi, föderaalseid ja NIH määrusi.
Loomade kokkupuute tingimused
Veipimistoodete aerosoolide tootmiseks kasutati eelnevalt kirjeldatud e-sigareti aerosooligeneraatorit.14 33 Mõlema toote aerosooliks muutmiseks kasutati seadet Juul. Loomi eksponeeriti modifitseeritud 15-liitrises induktsioonkambris iga päev kokku 20 manustamisega, mis genereeriti 1 tunni jooksul (1 manustus iga 3 minuti järel), 5 päeva nädalas 2 nädala jooksul. Iga pahvi maht oli 55 ml ja see muudeti aerosooliks 3 sekundi jooksul. Igast aurustist toodetud aerosoolid loodi identse pahvimisprotokolli abil, mille eesmärk oli jäljendada kogenud nikotiiniaurustite aurustumiskäitumist.34 Kuna puudusid publikatsioonid, mis kirjeldaksid CBD aurustite aurustumiskäitumist, järgisime mõlema toote puhul samu paisutamisprotokolle. Kuigi me ei mõõtnud õhu kaudu levivat CBD-d ja nikotiini loomade kokkupuutekambrites, oleme päevas aurustunud vedeliku mahu, CBD ja nikotiini kontsentratsiooni alusel vedelikes, aerosooli ja õhuvoolukiiruste põhjal hinnanud, et loomad puutusid kokku keskmiselt 20,5 mg/ m3 CBD ja 22,8 mg/m3 nikotiini. Kontrollloomad eksponeeriti filtreeritud õhuga, kasutades sama kokkupuuteprotokolli.
In vitro kokkupuute tingimused
In vitro katsetes kasutatud rakud puutusid vahetult kokku äsja tekitatud pahvidega suletud kokkupuutesüsteemis, kus õhu-vedeliku liidese (ALI) kambreid hoiti 37-kraadises inkubaatoris. ALI katsete jaoks kasutasime samu suletud süsteemiga aurustusseadmeid ja täitevedelikke, mida kasutati ülalkirjeldatud in vivo kokkupuutekatsetes. Meetodi üksikasjad on esitatud veebipõhises lisafailis.
Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi
Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin
【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Kopsupõletiku hindamine
Kopsupõletikku hinnati voolutsütomeetria, histokeemia ning tsütokiinide ja kemokiinide tasemete kvantifitseerimise abil (veebi täiendav joonis E5), 14 35 36 ning täielikud üksikasjad on esitatud veebipõhises lisafailis.
Kopsukahjustuse hindamine
Kopsu epiteeli/endoteeli terviklikkust hinnati valgu taseme kvantifitseerimise teel BCA abil ja süsteemse bronhoalveolaarse ruumi albumiini lekke määramisega ELISA abil, kasutades BAL proove ja bronhoalveolaarset kuni süsteemset leket, mõõtes plasma fluorestsentsi 1 tund pärast fluorestsentssondi intratrahheaalset instillatsiooni. Neutrofiilide elastaasi (NE) taset 37 38 mõõdeti BAL-is ja kopsukoes, kasutades R&D süsteemide NE ELISA komplekti (Kat. nr DY4517-05), järgides tootja protokolli. Müeloperoksidaasi aktiivsust (MPO) mõõdeti kalorimeetrilise analüüsiga BAL-is ja kopsukoes39, kasutades MPO analüüsikomplekti firmalt Abcam (kat. nr. ab105136), järgides tootja juhiseid. Lipiididega koormatud alveolaarsete makrofaagide visualiseerimiseks kasutati Oil Red O plekki.14 Analüüsi üksikasjad on toodud veebipõhises lisafailis. Veterinaarpatoloog hindas kopsude osade histoloogilisi hinnanguid vastavalt eelnevalt kirjeldatule.{7}}
Oksüdatiivse stressi mõõtmine hiirtel BAL ja kopsudes
Ägedad põletikulised reaktsioonid löövad kiiresti üle antioksüdantide süsteemid, et soodustada kopsukahjustusi.42–44 Oksüdatiivne stress määrati BAL-i ja kopsulüsaatide antioksüdantide potentsiaali mõõtmisega, nagu on kirjeldatud veebipõhises lisafailis.
In vitro tsütotoksilisuse testid
Inimese väikesed hingamisteede epiteelirakud (hSAEC-id) LONZA-st ja puhastatud inimese neutrofiilid puutusid õhu-vedeliku liidese kultuurides vahetult kokku värskelt loodud CBD ja nikotiini aerosoolidega. Kokkupuuteprotokoll ja metoodilised üksikasjad on veebipõhises lisamaterjalis. Tsütotoksilisust mõõdeti trüpaansinise värvi välistamise, neutraalse punase värvaine omastamise ja anneksiin V-FITC apoptoosi testide abil, nagu on kirjeldatud veebipõhises lisafailis.
NE taseme mõõtmine PMN söötmes
NE tasemed aerosooliga eksponeeritud PMN-rakukultuuri konditsioneeritud söötmes pärast taastumisperioodi kvantifitseeriti ELISA komplektiga R&D süsteemidest (Kat. nr DY4517-05), järgides tootja juhiseid.
FITC-dekstraani läbilaskvuse test
Barjääri terviklikkuse hindamiseks viidi läbi paratsellulaarne läbilaskvus ALI kultuuride aerosooliga eksponeeritud inimese SAEC-de monokihis ja üksikasju on kirjeldatud veebipõhises lisafailis.
Statistiline analüüs
Statistiliselt olulised erinevused erinevate kokkupuuterühmade (CBD, nikotiini ja õhu kontrollid) keskmiste järjestuste väärtuste vahel määrati Kruskal-Wallise mitteparameetrilise testiga. P väärtused korrigeeriti mitme testimise jaoks, kasutades Benjamini, Kriegeri ja Yekutieli kaheastmelist lineaarset astmelist meetodit (FDR) ja erinevusi kahe rühma vahel peeti statistiliselt olulisteks p.<0.05when FDR was set at Q<0.1. We also evaluated if there were differences between male versus female mice in the responses to inhalation of CBD and nicotine aerosols in comparison with air. All statistical analyses were carried out using GraphPad Prism V.9.3.1 software (GraphPad; La Jolla, California, USA).
cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi
TULEMUSED
Kokkupuude CBD aerosooliga põhjustas kaasasündinud ja adaptiivsete immuunrakkude suuremat kogunemist kopsudesse võrreldes nikotiini kokkupuutega
Immuunrakkude koguinfiltraat oli pärast CBD aerosoolide sissehingamist hiirte kopsudes oluliselt suurem kui nikotiini või filtreeritud õhu puhul (joonis 1A). Kümnest uuritud immuunrakkude alamrühmast seitsmel oli CBD-ga kokkupuude oluliselt suurem kui nikotiiniga. Immunofenotüübiline analüüs näitas statistiliselt olulist CD11b+Ly6G+ neutrofiilide infiltratsiooni hiirte kopsudesse pärast CBDaerosoolide sissehingamist (14488 vs 3674 neutrofiili õhus, p.<0.05) as well as following nicotine aerosol exposure (15410 vs 3674 neutrophils in air, p<0.001) (figure 1B). Total numbers of CD11bCD- 11c+Siglec-F+ alveolar macrophages were significantly reduced following CBD-Vape or Nic-Vape inhalation as compared with air-exposed mice (15965 cells in CBD and 18834 cells in NicVape vs 43465 cells in air (p<0.05)) (figure 1C). Inhalation of both CBD and nicotine aerosols resulted in significantly lower numbers of pulmonary interstitial CD11bCD11c+CD206+ macrophages as compared with air-exposed control mice (11460 vs 47319 cells for CBD-Vape, p<0.0001) and 27727 vs 47319 cells for Nic-Vape, p<0.05). The reduction in the numbers of pulmonary interstitial macrophages was significantly greater following inhalation of CBD aerosols compared with nicotine (11460 cells in CBD-vape vs 27727 cells in Nic-Vape, p<0.05) (figure 1D). CD11bCD11c+arginase-1+ macrophages were significantly reduced following inhalation of both CBD-Vape and Nic-Vape compared with air-exposed control (13450 vs 44009 for CBD-Vape (p<0.001), and 24280 vs 44009 for Nic-Vape (p<0.05)) (figure 1E). However, the reduction in the numbers of CD11bD11c+arginase-1+ macrophages was significantly more following inhalation of CBD aerosols compared with Nic-Vape (13450 cells in CBD-vape vs 24280 cells in Nic-Vape (p<0.05). The number of CD19+ B cells was not statistically different (figure 1F). Following inhalation of CBD aerosols, the numbers of CD8+ and CD4+ T cells in the lungs were, respectively, 3.3-fold (p<0.001) and 5.6-fold (p<0.0001) higher than following nicotine inhalation (figure 1G, H). CD4+IL-17A+ T cells were not altered in the lungs following CBD-Vape or Nic-Vape exposures as compared with air control (figure 1I). CD4+RORγt + T cells, expressing the master transcription factor essential for the differentiation into proinflammatory Th17 cells, were significantly increased following inhalation of CBD aerosols as compared with both nicotine (11983 vs. 2015; p<0.001) and air exposure (11983 vs. 5887; p<0.05) (figure 1J). Furthermore, CBD aerosols resulted in markedly increased infiltration of CD4+Foxp3+ regulatory T cells into the lungs compared with nicotine (4401 cells in CBD-Vape vs 1688 cells in Nic-Vape; p<0.001) (figure 1K). There were no statistically significant differences observed between male and female mice concerning the infiltration of any of the innate and adaptive immune cells, regardless of the different exposure conditions (online supplemental figure E6A–K). Relatively more Oil Red O-positive lipid-laden macrophages were detected in BAL following CBD-aerosol inhalation compared with nicotine aerosol (0.66 vs 0.32; p<0.05) or air-exposure (0.66 vs 0.15; p<0.001) (figure 2A). Lung tissue sections of air-breathing mice contained rare (typically 1–2 positive cells in the entire lung lobe) lipid-containing, Oil Red O-positive intra-alveolar macrophages (online supplemental figure E7A). In contrast, lungs from CBD and nicotine-exposed animals regionally contained one or more Oil Red O-positive macrophages within multiple alveolar lumina that were often adjacent to one another (online supplemental figure E7B, C), with no obvious differences found in males versus females. Histological examination of H&E-stained lung tissue sections from filtered air-breathing control mice showed air-filled alveolar lumina bounded by thin alveolar walls (figure 2B). In contrast, peribronchiolar and/or intrabronchiolar, perivascular, alveolar infiltrates, and interstitial infiltrates of lymphocytes, macrophages, and granulocytes were the predominant findings in the CBD and nicotine-exposed mouse lungs (figure 2C–E). Small focal lesions and occasionally larger and more regionally extensive focal lesions were noted. Lesions were found primarily near terminal bronchioles and often subpleural. The frequency and severity of lesions were greater following CBD aerosol inhalation compared with nicotine. The male mice showed a greater frequency of most lesions as compared with female mice following inhalation of both CBD and nicotine.
Joonis 1 CBD või nikotiini aerosoolide akuutse kokkupuute mõju kopsu immuunrakkude infiltratsioonile. Leukotsüütide (A), CD11b+ Ly6G+ neutrofiilide (B), CD11b-CD11c+ Siglec-F + makrofaagide (C), CD11b- CD11c+ CD206+ makrofaagide (D), CD11b- CD11c+ arginaas+ makrofaagide (E) koguarv. CD19+ B-rakkude (F), CD8+ T-rakkude (G), CD4+ T-rakkude (H), CD4+ IL17A+ (I) ja CD arvu 4+ ROR t + põletikulised T-rakud (J) ja CD4+ FOXP3+ T-rakud (K) õhu, nikotiini või CBD aerosooliga kokku puutunud hiirte kopsudes määrati voolu abil tsütomeetria, kasutades spetsiifilisi markereid ja järgides väravastrateegiat, nagu on kirjeldatud eelnevalt ja näidatud veebipõhisel lisajoonisel 1. Andmed on näidatud kastigraafikutena koos vurrudega min ja max. Kahe rühma erinevust peetakse oluliseks p<0.05, the statistical significance of the difference between the two groups is indicated with symbols *p<0.05; ***p<0.001; ****p<0.0001after performing non-parametric Kruskal-Wallis test with false discovery rate (FDR) correction for multiple comparisons by GraphPad Prism V.9 software (GraphPad; La Jolla, California, USA). In each exposure condition, n=10 mice (5 males+5 females) (n=9 (5 males+4 females) for Nic-Vape) were used. CBD, cannabidiol.
CBD aerosoolil oli tugevam moduleeriv toime tsütokiinide tasemele kui nikotiini aerosoolil
Leidsime, et CBD aerosooli sissehingamine suurendas oluliselt tsütokiinide IL-5, IL-6 ja G-CSF taset BAL-is võrreldes nii nikotiini kui ka õhuga kokkupuutega (p<0.01) and enhanced the levels of chemokine KC compared with air-control only (p<0.001) (figure 3A–D). Levels of IL-2 were significantly lower following CBD and Nic-vape aerosol exposures compared with air (p<0.05) (figure 3E). IL-10 and IFN-γ levels were significantly reduced only after CBD aerosol exposure compared with air (p<0.05) (figure 3F, G). IL-1α levels were not significantly different, though there was a trend for the values to be lower following exposure to CBD-Vape aerosols (figure 3H). There were no statistically significant differences observed between male and female mice in the levels of these cytokines or chemokines (online supplemental figure E8A–H and online supplemental table E3).
Kokkupuude CBD aerosoolidega põhjustas rohkem kopsude endoteeli kahjustusi kui kokkupuude nikotiini aerosooliga
BAL-i valgu kogutase tõusis pärast CBD aerosoolide sissehingamist võrreldes õhukontrollidega (435 µg/mL vs 287 µg/ml; p<0.01) (figure 4A, left panel). Additionally, serum albumin levels leaking into the BAL were markedly increased following CBD aerosol inhalation when compared with both nicotine aerosol (70303ng/mL vs 32741ng/mL in NicVape; p<0.01) and air inhalation (70303ng/mL vs 26042ng/ mL in air control; p<0.0001) (figure 4B, left panel). The systemic leak of FITC-dextran from the lungs into the plasma was markedly higher following CBD aerosol inhalation than Nic-vape aerosol (469.9ng/mL vs 227.6ng/mL in Nic-Vape; p<0.01) or air exposures (469.9ng/mL vs 157.5ng/mL in air control; p<0.0001) (figure 4C, left panel). Furthermore, the FITC-dextran leak following Nic-vape aerosol exposure was not significantly different when compared with air control (227.6ng/mL vs 157.5ng/mL). There were no statistically significant differences observed in the levels of these markers when comparing male with female mice following any of the exposures (figure 4A–C, right panels and online supplemental table E3). It is known that elastase activity in inflammatory diseases increases and correlates with the levels of elastase proteins and neutrophil infiltrates as the disease progresses.45 46 NE levels in the BAL were markedly augmented following inhalation of CBD aerosols (1.8-fold vs air; p<0.001) and Nic-Vape aerosols (1.42-fold vs air; p<0.01) (figure 5A, left panel). The levels of NE measured in lung tissue were significantly increased following CBD-Vape as compared with both Nic-Vape (1.3-fold; p<0.01) and air (1.41-fold; p<0.001) (figure 5B, left panel). There were no statistically significant differences observed in NE levels between male and female mice, measured either in the BAL or lung tissues (figure 5A, B, right panels and online supplemental table E3). We detected higher MPO activity in lung tissues following inhalation of CBD aerosols compared with nicotine aerosols (~2fold; p<0.05) and air (~8.44fold; p<0.0001) (figure 6A). BAL MPO activity following CBD and nicotine aerosol-inhalation was equivalent, but greater than air controls (p<0.01) (online supplemental figure E9A). There were no statistically significant differences observed in MPO activity between male and female mice, either in lung tissue or in the BAL (figure 6B; online supplemental figure E9B and online supplemental table E3).
Joonis 2 Põletikulised muutused kopsudes pärast kokkupuudet CBD ja nikotiini aerosoolidega. Kokkupuute lõpus hiired surmati, hingetoru kanüüliti BAL-i kogumiseks 1% FBS-is PBS-is ja kopsud koguti. (A) Objektiklaasidel olevad BAL-rakud tsütospin värviti 0,5% Oil Red O lahusega ja Oil Red O-positiivsed rakud loendati meetodites kirjeldatud viisil. Tulemused on kujutatud kastdiagrammidena vurrude min ja max juures. Kahe rühma erinevust peetakse oluliseks p<0.05 and indicated with the symbols *p<0.05; ***p<0.001 by performing non-parametric Kruskal-Wallis test with FDR correction for multiple comparisons using GraphPad Prism V.9 software (GraphPad; La Jolla, California, USA). In each experiment n=10 (5 males+5 females) for CBD-vape and air exposure and n=9 (5 males+4 females) for Nic-vape). (B–E) Left lung lobes from all mice were embedded, sectioned and H&E stained as described in the methods. (B) (Air): Image of the histologically unremarkable lung from air-breathing control mouse showing air-filled alveolar lumina bounded by thin alveolar walls (arrows). H&E, ×20. (C) Nic-vape: Peribronchiolar lymphocytic, macrophagic (arrowhead) granulocytic infiltrate (circle). H&E, ×20 magnification. B=bronchiolar lumen. (D, E) CBD-vape: Perivascular infiltrates composed of mononuclear (lymphocytes and macrophages) and granulocytic infiltrates (arrows). Intra-alveolar granulocytes (circles) and macrophages (arrowheads) were also present. H&E, ×20 magnification. BD, cannabidiol; B, bronchiolar lumen; FDR, false discovery rate; PBS, phosphate-buffered saline; V, vessel lumen.
Kokkupuude CBD ja nikotiini aerosoolidega vähendas kopsude antioksüdantide potentsiaali
Antioksüdantide koguvõimsus oli märgatavalt vähenenud mõlemas kopsukoes (lk<0.01vs air) and BAL (p=0.001vs air) following inhalation of CBD aerosols (figure 7A; online supplemental figure E10A). However, following nicotine aerosol exposure it was significantly reduced only in the BAL (p<0.01vs air) compared with air (online supplemental figure E10A). We did not observe any statistically significant differences in the antioxidant potential between male and female mice for each exposure group, either in lung tissue or in the BAL (figure 7B; online supplemental figure E10B and online supplemental table E3).
Joonis 3 Põletikulise tsütokiini/kemokiini miljöö moduleerimine BAL vedelikus pärast CBD ja nikotiini aerosoolide sissehingamist. Erinevate põletikuga seotud tsütokiinide ja kemokiinide tasemed hiirte BAL-is (A-H) pärast 2-nädalast kokkupuudet õhuga, Nic-Vape aerosoolidega või CBD-Vape aerosoolidega kvantifitseeriti MULTIPLEX MAP Kitiga, nagu on kirjeldatud materjalides ja meetodites. Andmed on näidatud kastdiagrammidena, mille vurrud on min ja max. Mitteparameetriline Kruskal-Wallise test FDR-korrektsiooniga mitme võrdluse jaoks viidi läbi, et näha, kas kahe rühma vahel on statistiliselt olulisi erinevusi, kasutades tarkvara GraphPad Prism V.9 (GraphPad; La Jolla, California, USA). Kahe rühma erinevust peetakse oluliseks p<0.05 and is indicated with symbols *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001. In each experiment n=10 for CBD-vape and air exposure (5 males+5 females) and n=9 (5 males+4 females) for Nic-Vape). CBD, cannabidiol.
CBD aerosool oli hSAEC-dele toksilisem kui nikotiini aerosool ja häiris nende epiteeli barjääri terviklikkust
Me täheldasime, et kui inimese SAEC-sid eksponeeriti in vitro CBD aerosoolidega 1 tunni jooksul, oli epiteelirakkude morfoloogia märgatavalt häiritud (joonis 8A, B vs 8C). Rakusurm hSAEC-des suurenes märkimisväärselt ainult pärast kokkupuudet CBD aerosooliga, võrreldes õhuga (41% vs. 12,5% õhukontrollis; p<0.05) (figure 8D, E). Even though the cell death following CBD-Vape exposure was higher compared with exposure to nicotine aerosols, it, however, did not reach statistical significance (41% vs. 16% in Nic-Vape). Additionally, exposure to CBD aerosols diminished the epithelial barrier integrity of human SAECs compared with air by 2.1-fold (p<0.05) and while the exposure to nicotine aerosols also showed an increased trend, it was not significantly different compared with air-control (1.7-fold decrease in Nic-Vape vs air control) (figure 8F).
cistanche taime suurendav immuunsüsteem
CBD aerosoolid, kuid mitte nikotiini aerosoolid, kutsusid inimese puhastatud neutrofiilides esile apoptootilise rakusurma, kuid mõlemad suurendasid NE vabanemist
Akuutne kokkupuude CBD aerosoolidega põhjustas inimese puhastatud neutrofiilides märgatava rakusurma (44,5% rakusurm pärast CBDVape'i vs. 14% õhukontrollis; p<0.0001) and (44.5% vs 21%cell death in Nic-Vape; p<0.001) (figure 9A). CBD aerosol-induced neutrophil cell death was mainly due to increased apoptosis compared with air (29% vs. 10% in air control; p<0.0001) and compared with Nic-Vape (29% vs. 12% in Nic-Vape; p<0.001) (figure 9B). Furthermore, both CBD and nicotine aerosols lead to enhanced accumulation of NE levels in the neutrophil cell culture media as compared with air control (2-fold increase in CBD-Vape; p<0.001and 1.45-fold increase in Nic-Vape; p<0.05) (figure 9C). However, the levels were significantly higher following CBD versus nicotine exposure (CBD-Vape 1.4-fold higher than Nic-Vape; p<0.05) (figure 9C). Pictures of human neutrophils after ALI exposures and the 24-hour recovery period are provided in online supplemental figure E12. Importantly, an aliquot of purified neutrophils that were incubated in media (unexposed) for the duration of the experiment showed low cell death (~11%) that was equivalent to values noted in neutrophils exposed to air (~14%) in the ALI chambers (figure 9A), nor was apoptosis or increased NE levels induced (figure 9B, C).
Joonis 4 Kopsukahjustuse markerid, mis on põhjustatud pärast CBD ja nikotiini aerosoolide sissehingamist. Kokkupuute lõpus hiired surmati, BAL koguti ja (A) üldvalkude ja (B) albumiini tase BAL-is kvantifitseeriti, nagu on kirjeldatud jaotises Materjalid ja meetodid. (C) Kvantifitseeriti plasmasse lekkiva FITC-dekstraani tasemed. Iga joonise vasakpoolsed paneelid esindavad andmeid meeste ja naiste kohta, parempoolsed paneelid aga meeste ja naiste andmeid. Tulemused on näidatud kastdiagrammidena, mille vurrud on min ja max. Erinevusi rühmade vahel peetakse oluliseks p<0.05 and are indicated as symbols **p<0.01, ****p<0.0001, calculated after performing non-parametric Kruskal-Wallis test with FDR correction for multiple comparisons by employing GraphPad Prism V.9 software (GraphPad; La Jolla, California, USA). In each experiment n=10 (5 males+5 females) for air and CBD-vape exposures and n=9 (5 males+4 females) for the Nic-Vape group. CBD, cannabidiol.
Joonis 5 Neutrofiilide elastaasi tase kopsudes, mõõdetuna pärast kokkupuudet CBD ja nikotiini aerosoolidega. 2-nädalase kokkupuute lõpus hiired surmati, BAL ja kopsud koguti ning koelüsaadid valmistati. (A, B) NE tasemed BAL-is ja kopsukoe lüsaatides kvantifitseeriti ELISA abil. Iga joonise vasakpoolsed paneelid näitavad andmeid meeste kombineerituna, parempoolsed paneelid aga meeste ja naiste andmeid. Tulemused on näidatud kastdiagrammidena, mille vurrud on min ja max. Kasutati mitteparameetrilist Kruskal-Wallise testi koos FDR-korrektsiooniga mitme võrdluse jaoks, et näha, kas kahe rühma vahel on statistiliselt olulisi erinevusi, kasutades GraphPad Prism V.9 tarkvara (GraphPad; La Jolla, California, USA). Kahe rühma erinevust peeti oluliseks p<0.05 and is indicated with symbols **p<0.01, ***p<0.001. In each experiment n=10 (5 males+5 females) for air and CBD-vape exposures each and n=9 (5 males+4 females) for Nic-Vape. CBD, cannabidiol; NE, neutrophil elastase.
ARUTELU
Meie leiud näitasid, et kahjulik mõju immuunsüsteemile ja kopsukahjustused pärast kannabinoide sisaldavate aurutoodete sissehingamist olid tõsisemad kui pärast kokkupuudet nikotiini sisaldava aurustusseadme aerosoolidega. Oleme avastanud aurustatud CBD kahjuliku mõju, mis mõjutab kopsu immuunsüsteemi homöostaasi, kasutades aurustamise hiiremudelit ja in vitro katseid inimrakkudega. Meie uuringud näitasid, et CBD vaping indutseerib põletikueelset kopsu mikrokeskkonda, mis põhjustab põletikuliste immuunrakkude märkimisväärset kuhjumist, millel on kudesid kahjustavate tegurite, nagu MPO ja NE, suurenenud aktiivsus ning mis põhjustab kopsukahjustusi protsesside kaudu, mis võivad hõlmata oksüdatiivset stressi. Kuigi mitmed uuringud on uurinud nikotiini aurustamise mõju hingamisteedele, on see meie teadmiste kohaselt esimene aruanne, mis näitab, et isegi lühiajaline kokkupuude aurustunud CBD-ga muudab põletikulist miljööd kopsudes, põhjustades kopsukahjustusi. Oluline on märkida, et kasutasime CBD-d sisaldavaid aurustamistooteid, mis ei sisalda THC-d, et kõrvaldada THC võimalik mõju kopsumõjudele. Seaduslike piirangute tõttu THC-d sisaldavatele aurutoodetele juurdepääsul ei saanud me läbi viia katseid, mis võrdleksid ka THC aurustamise mõju. Ühes hiljutises uuringus teatati, et aurustitoodetes sisalduvat CBD-d võib pidada THC eelkäijaks, mis süvendab probleemi veelgi, kutsudes esile CBD-st sõltumatud THC-vahendatud mõjud, mis on seotud kanepi aurustamistoodete üldise kasutamisega.47
Lisaks võivad aurustamise mis tahes hingamisteede toksilised mõjud potentsiaalselt süvendada aurustumistoodete muude koostisosade, sealhulgas erinevate lahustid (CBD tootes MCT ja nikotiinitoodetes PG: VG), mõlemas tootes esinevad erinevad maitsed ja terpeenid, nagu näitas tooteanalüüs. Mõlemas kuumutatud lahuses tuvastati arvukalt potentsiaalseid lagunemise kõrvalsaadusi, mis viitab sellele, et mõlemad tooted on vastuvõtlikud kõrgetele temperatuuridele. CBD-d sisaldavas aerosoolis tuvastati aga kõrgemad karbonüülühendite tasemed, mis viitab sellele, et meie uuringus kasutatud CBD aurustumistoode võis olla termilise lagunemise suhtes vastuvõtlikum kui nikotiinitoodetega. See võib olla tingitud erinevustest kahe lahuse keemilises koostises ja/või erinevustest aurustumistingimustes aurustusseadmetes. Paljud meie uuringus mõõdetud põletiku- ja kopsukahjustuse markerid olid pärast kokkupuudet CBD-d sisaldavate aurutoodetega järjekindlalt kõrgemad kui nikotiini sisaldavad aurutamisseadmed. Näiteks teatame, et aerosoolitud CBD vapeõli sissehingamine suurendas palju tugevamalt nii CD4+ kui ka CD8+ T-rakkude arvu ja neutrofiilide arvu kopsudes. Sarnast neutrofiilide arvu suurenemise ning CD4+ ja CD8+ T-rakkude modulatsiooni profiili täheldati patsiendi kopsus, kes oli aurutanud kanepiõli, põhjustades kopsuvigastuse ja hingamispuudulikkuse.3 Nende vahel on tihe seos. põletikulised T-rakud, neutrofiile mobiliseerivad tegurid ja neutrofiilide värbamine kopsupõletike häirete korral.48 Suurenenud põletikuline miljöö kopsudes pärast kokkupuudet CBD aerosoolidega võib otseselt korraldada neutrofiilide akumuleerumist ja/või aktiveerumist bronhoalveolaarses ruumis, vabastades spetsiifilisi aineid. neutrofiile mobiliseerivad tegurid nagu IL-6, G-CSF ja KC (CXCL1) või kaudselt residentsete kopsumakrofaagide ja epiteelirakkude aktiveerimise kaudu.{13}} Samuti on võimalik, et CBD aerosoolid võivad kahjustada kopsuepiteeli ja käivitada neutrofiilide värbamise ja aktiveerimise protsess mehhanismide, sealhulgas lokaalsete koekahjustuste kaudu.51 Tõepoolest, me demonstreerime, et CBD aerosoolid kahjustavad epiteeli terviklikkust ja kutsuvad esile rakusurma hSAEC-des, mis viitab sellele, et CBD aerosoolid võivad otseselt esile kutsuda kopsukoe kahjustusi ja aktiveerida DAMP-sid, et vahendada kopsupõletikku. . On teada, et neutrofiilide infiltratsioon ja NE-indutseeritud kopsukoe hävimine vahendavad sigaretisuitsust põhjustatud kopsukahjustusi ja kahjustavad epiteeli barjääri terviklikkust.52–56 Neutrofiilidel on pärast kopsudesse sattumist aktiveeritud fenotüüp ja nad jätkavad põletikulist protsessi. CBD aerosoolidega kokkupuutunud hiirte kopsudesse kogunevate neutrofiilide arvu suurenemine (14488 vs 3674 õhus) võib nende aktiveerimisoleku tõttu omada bioloogilisi tagajärgi. Need granulotsüüdid rakud on kahe olulise teguri, müeloperoksidaas ja NE allikaks, mis on seotud mikrobitsiidse toimega ja kopsude ümberkujunemisega. Meie uuringus täheldatud MPO kõrgendatud tasemeid peetakse oluliseks põletikuliseks ja oksüdatiivseks stressimarkeriks mitme haiguse, sealhulgas kopsukahjustuse korral.{24}} Aktiveeritud neutrofiilidest vabanev MPO valk toimib autokriinse modulaatorina, avaldades põletikueelset tsütokiinilaadset toimet. omadused indutseerida PMN-i aktivatsiooni viisil, mis ei sõltu MPO katalüütilisest aktiivsusest.59 Seega, nende aruannete ja meie praeguste leidude valguses oletame, et krooniline CBD aerosooli sissehingamine võib esile kutsuda tugeva põletikueelse mikrokeskkonna, mis võib kopsudele rohkem kahjulik olla. homöostaasi ja võib olemasolevaid kopsuhaigusi veelgi süvendada. Neutrofiilide infiltratsioon kopsudesse pärast CBD aerosooli sissehingamist võib olla põhjustatud lahustuvate kemokiinide, nagu KC, ülesreguleerimisest ja seega võib see olla vastutav BAL-is ja kopsukoes leiduva NE suurenenud taseme eest. Kuna kokkupuude CBD aerosooliga kutsus esile NE vabanemise inimese neutrofiilidest in vitro, toetab see järeldust, et CBD aerosoolidel on potentsiaal in vivo otseselt neutrofiile aktiveerida ja suurendada kasutajate kopsupõletikku. Kuna NE tase ja sellega seotud aktiivsus suurenevad neutrofiilide poolt vahendatud põletikuliste reaktsioonide ajal, mõõdeti seega ainult NE taset selle aktiivsuse indeksina. Lisaks võivad CBD aurustamise kahjulikku mõju tõenäoliselt süvendada kahjustatud antioksüdantide süsteemid, nagu me täheldasime, kus sellised tegurid nagu CBD-Vape-indutseeritud MPO võivad mängida olulist rolli.{31}} CD4+ROR t + T-rakud. , mis ekspresseerivad peamist transkriptsioonifaktorit, mis on oluline põletikueelseteks Th17 rakkudeks diferentseerumiseks, suurendati ja ennustasid CBD aerosoolide poolt indutseeritud põletikueelset mikrokeskkonda. CD4+FoxP3+ T regulatoorsete rakkude (Treg-rakkude) suurenenud indutseerimine võib olla üks mehhanism, mille abil CBD vaping võib esile kutsuda immunosupressiooni. Tregid pärsivad CD4+ ja CD8+ T-rakkude aktivatsiooni, proliferatsiooni ja tsütokiinide tootmist ning on seotud dendriitrakkude supresseerimisega kostimuleerivate molekulide allareguleerimise kaudu.60 Tregid ekspresseerivad IL-2 retseptori ahelat. , mis hõlbustab IL-2 tarbimist ja võib seega jätta T-efektorrakud ilma IL-2 kättesaadavusest, aidates kaasa T-efektorrakkude supressioonile.61 Seega vähenes IL-2 tase BAL-is CBD tõttu aerosoolist põhjustatud Tregide suurendamine võib vahendada T-rakkude düsfunktsiooni ja adaptiivse immuunsuse pärssimist kopsudes, suurendada vastuvõtlikkust hingamisteede infektsioonidele ja põhjustada profülaktilise vaktsineerimise halbu tulemusi. Pärast CBD-ga kokkupuudet täheldasime kopsude interstitsiaalsete makrofaagide arvu olulist vähenemist. Siglec-F+, mida tavaliselt peetakse eosinofiilide markeriks, ekspresseerub kõrgelt hiire alveolaarsetes makrofaagides ja kui seda kasutatakse koos CD11c-ga, tagab see alveolaarsete makrofaagide kõige täpsema identifitseerimise hiire kopsus. CBD-ga kokkupuutunud hiirtel täheldatud CD11bCD11c+Siglec-F+ alveolaarsete makrofaagide arvu olulist vähenemist toetavad varasemad uuringud.62 Varasemast uuringust teatati, et EC ekspositsioon hiirtel kutsus esile alveolaarsete makrofaagide düsfunktsiooni, mis on seotud patogeeni halva omastamisega, millega kaasneb kopsupatogeenide koorem, mis korreleerus hilinenud taastumisajaga ja suurenenud suremusega pärast nakatumist.16 Põletikuvastaste kopsuarginaasi -1+ M2 makrofaagide arvu märkimisväärne vähenemine pärast CBD aerosooli sissehingamist võib veelgi kaasa aidata reguleerimata kopsuimmuunsuse homöostaasile ja kahjustustele. .63 Kopsudes pärast CBD sissehingamist tuvastatud suurenenud põletikueelset mikrokeskkonda võib osaliselt seostada põletikuvastaste M2 kopsumakrofaagide arvu vähenemisega. Makrofaagide arvu vähenemine võib märkimisväärselt mõjutada kopsureaktsioone hingamisteede infektsioonidele, mida võib täiendada düsfunktsionaalne makrofaagi-fagotsütoos. Seega põhjustas kokkupuude nikotiini sisaldavate elektrooniliste sigarettide aerosoolidega makrofaagide poolt mittetüpiseeritava Haemophilus influenza (NTHI) fagotsütoosi vähenemise, peamiselt e-sigareti lõhna- ja maitseainete olemasolu tõttu.64 Kuna tavalisi lõhna- ja maitseaineid kasutatakse ka CBD koostistes, see tõstatab võimaluse, et CBD aerosoolist põhjustatud makrofaagide düsfunktsiooni võib erinevate lõhna- ja maitseainete lisamisega süvendada.
Joonis 6 Müeloperoksidaasi (MPO) aktiivsuse suurenemine kopsudes pärast kokkupuudet CBD ja nikotiini aerosoolidega. (A, B) Mõõtsime MPO aktiivsust nikotiini või CBD aerosooliga kokkupuutunud loomade kopsukoe lüsaatides, kasutades Abcami MPO testikomplekti, nagu on üksikasjalikult kirjeldatud lisamaterjali jaotises. Vasakpoolne paneel kujutab andmeid meeste ja parempoolne paneel meeste ja naiste kohta. Andmed on näidatud kastdiagrammidena, mille vurrud on min ja max. Mitteparameetriline Kruskal-Wallise test FDR-korrektsiooniga mitme võrdluse jaoks viidi läbi, et näha, kas kahe rühma vahel on statistiliselt olulisi erinevusi, kasutades tarkvara GraphPad Prism V.9 (GraphPad; La Jolla, California, USA). Kahe rühma erinevust peeti oluliseks p<0.05 and is indicated with the symbols *p<0.05, ****p<0.0001. In each experiment n=10 mice for air and CBD-vape exposures each (5 males+5 females) and n=9 for Nic-Vape group (5 males+4 females). CBD, cannabidiol; FDR, false discovery rate
Joonis 7 Antioksüdantide potentsiaali muutused kopsudes pärast kokkupuudet CBD ja nikotiini aerosoolidega. Nikotiini või CBD aerosoolidega kokkupuute lõpus hiired surmati ja valmistati kopsukoe lüsaadid. (A, B) Antioksüdantide kogutase kopsukoe lüsaatides kvantifitseeriti Caymani antioksüdantide testikomplekti (Cat # 709001) abil, nagu on üksikasjalikult kirjeldatud veebipõhises lisamaterjali jaotises. Vasakpoolne paneel kujutab andmeid meeste ja naiste kombineerituna, parempoolne paneel aga meeste ja naiste andmeid. Andmed on näidatud kastdiagrammidena, mille vurrud on min ja max. Kasutati mitteparameetrilist Kruskal-Wallise testi koos FDR-korrektsiooniga mitme võrdluse jaoks, et näha, kas kahe rühma vahel on statistiliselt olulisi erinevusi, kasutades GraphPad Prism V.9 tarkvara (GraphPad; La Jolla, California, USA). Kahe rühma erinevust peeti oluliseks p<0.05 and is indicated by the symbol **p<0.01. In each experiment, n=10 mice for air and CBD-vape exposures each (5 males+5 females) and n=9 for the Nic-Vape group (5 males+4 females). CBD, cannabidiol; FDR, false discovery rate.
Joonis 8 Inimese väikeste hingamisteede epiteelirakkude (SAEC) epiteelirakkude morfoloogia, tsütotoksilisus ja epiteeli barjääri terviklikkus pärast kokkupuudet CBD ja nikotiini aerosoolidega. Inimese SAEC-e (0,5 miljonit rakku/kultuuri vahetükk 6-süvendiplaadi formaadis) kultiveeriti täielikus kasvusöötmes üleöö ja järgmisel päeval eksponeeriti õhu-vedeliku liidesel (ALI) otse 110 pahvi. õhku, nikotiini (50 mg/mL nikotiini) või CBD-d (50 mg/ml) sisaldavad aerosoolid, nagu on kirjeldatud meetodites. Kõik aerosoolid genereeriti 55 ml pahvimahus, nagu on kirjeldatud jaotises Meetodid. Kokkupuute lõpus eemaldati rakud ALI kambrist ja inkubeeriti täielikus kasvusöötmes 24 tundi 37 kraadi juures. Pärast taastumisperioodi lõppu pildistati rakud esmalt (A–C) faasikontrastmikroskoobis (Olympus IX73) juures × 200 ja seejärel rakkude toksilisuse analüüsid, kasutades (D) trüpaansinise meetodit (mõõdetuna rakusurma protsendina) või (E ) viidi läbi neutraalse punase neeldumise meetod (kujutatud õhukontrolli protsendina). (F) FITC-dekstraani läbilaskvuse testi jaoks kultiveeriti 1 miljonit inimese SAEC-i/kultuuri inserte üleöö ja järgmisel päeval eksponeeriti ALI-s otse 110 õhu, nikotiini (50 mg/ml nikotiini) või CBD-d (50 mg/ml) sisaldava õhuga. aerosoolid. Pärast kokkupuute lõpetamist lisati apikaalsesse kambrisse FITC-dekstraan kontsentratsioonis 10 mg/ml ja inkubeeriti 2,5 tundi. proovid koguti basolateraalsest kambrist ja fluorestsentsi mõõdeti Exci485 / Emi528 lainepikkuste abil sünergia H1 hübriidplaadilugejas (BioTek). FITC-dekstraani kontsentratsioon basolateraalses kambris arvutati standardkõvera abil. Kahe rühma erinevust peeti oluliseks p<0.05 and is indicated with the symbol *p<0.05, calculated using non-parametric Kruskal-Wallis test with FDR correction for multiple comparisons by GraphPad prism V.9 software (GraphPad; La Jolla, California, USA). Results are depicted as box plots with whiskers at min and max from three independent experiments each performed in triplicate as described in online supplemental methods. CBD, cannabidiol; FDR, false discovery rate; SAECs, small airway epithelial cells.
Joonis 9 Apoptootiline rakusurm puhastatud inimese neutrofiilides ja neutrofiilide elastaasi (NE) tase, mis vabaneb pärast kokkupuudet CBD ja nikotiini aerosoolidega. Inimese täisverest puhastatud neutrofiilid külvati 0,8 miljoni raku/kultuuri vahetüki kohta 6-süvendiplaadi formaadis ja viidi kohe kokku 110 õhu, nikotiini (50 mg/ml nikotiini) või CBD-ga. 50mg/mL) sisaldavad aerosoolid õhu ja vedeliku liidesel 55 ml pahvimahus, nagu on kirjeldatud jaotises Meetodid. Kokkupuute lõpus eemaldati rakud ALI kambrist ja koguti täielikus kasvusöötmes 24 tundi. Järgmisena mõõdeti rakusurma, kasutades (A) trüpaansinise värvaine välistamise testi ja (B) anneksiin V-FITC apoptoosi, nagu on üksikasjalikult mainitud jaotises Meetodid. Vahetult pärast isoleerimist hoiti puhastatud neutrofiilide alikvooti täielikus söötmes CO2 inkubaatoris negatiivsete "eksponeerimata kontrollidena" kogu testi vältel, et hinnata rakusurma ulatust, apoptoosi esilekutsumist või NE taset veres. kokkupuute puudumine. (C) NE tasemed kvantifitseeriti konditsioneeritud söötmes, mis koguti pärast taastumisperioodi lõppu, teostades NE ELISA, nagu on kirjeldatud jaotises Meetodid. Andmed on kujutatud kastdiagrammidena, mille vurrud on min ja max, saadud sõltumatutest katsetest, millest igaüks viidi läbi kolmes eksemplaris. Apoptoositesti jaoks: keskmised andmed n=5 doonorilt rühma kohta. Trüpaansinise meetodi puhul: keskmised andmed säritamata kontroll-n=6 doonoritelt, õhukontrolli ja Nic-Vape n=7 doonoritelt ning CBD-Vape n=8 doonoritelt. NE testi keskmised andmed n=6 doonorilt rühma kohta). Kahe rühma erinevust peeti oluliseks p<0.05 which is indicated by the symbols *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 calculated using non-parametric Kruskal-Wallis test with FDR correction for multiple comparisons by GraphPad Prism V.9 software (GraphPad; La Jolla, California, USA). ALI, air–liquid interface; CBD, cannabidiol; FDR, false discovery rate.
Tabel 2 Erinevate uuringutulemuste markerite võrdlus pärast kokkupuudet CBD-d sisaldava aurustiga (CBD-vape) ja nikotiini sisaldava aurustustootega (Nic-vape)
Lipiididega koormatud intraalveolaarsete makrofaagide olemasolu, mida täheldati hiirte BAL-ist taastunud rakkudes pärast CBD aerosooli sissehingamist meie uuringus, kinnitab varasemat aruannet, mis näitas eksogeense lipoidse kopsupõletiku algust patsiendil, kes aurutas kanepiõli ja kellel oli lipiide. -koormatud kopsumakrofaagid.65 Kuna eksogeenne lipoidne kopsupõletik koos lipiididega koormatud kopsumakrofaagidega on EVALI tunnus, viitab see seega sellele, et CBD vapeõli sissehingamine ei pruugi olla riskivaba ja võib põhjustada kanepiaurude kopsukahjustusi. EVALI kliinilistes aruannetes esitatud juhtumid viitasid tugevamale etioloogilisele seosele kanepi aurustamise ja hingamispuudulikkuse vahel, võrreldes nikotiini aurustamisega.65–68 Erinevalt meie varasematest uuringutest hiirtega, kes hingasid VEA-d (EVALI tõenäoline põhjus), tegime selles uuringus. ei täheldanud vahuste makrofaagide esinemist.14 Kuigi aurustamisega seotud kopsutüsistuste üldine risk võib olla suitsetamisega võrreldes väiksem, näib, et veipimine kujutab endast ohtu hingamisteede tervisele, eriti pikaajaliste kanepiauruste puhul. Kokkuvõttes näitab meie uuring selgelt, et CBD aerosooli sissehingamisel indutseeritud põletikueelne miljöö kopsudes oli suurem kui nikotiini aerosoolide indutseeritud miljöö ja see kajastus kopsubarjääri terviklikkuse katkemises ja kopsukahjustuses (kokkuvõte tabelis 2). See viitab sellele, et kanepi aurustamine võib potentsiaalselt põhjustada raskemaid tagajärgi, sealhulgas suurenenud vastuvõtlikkus hingamisteede infektsioonidele, halb reaktsioon profülaktilisele vaktsineerimisele ja sümptomite halvenemine kopsupõletikuliste haigustega patsientidel.16–19 35 36 69 70 Me ei täheldanud ühtegi nähtavad muutused loomade käitumises kokkupuute ajal või pärast seda ega kaalumuutused võrreldes õhukontrolliga (veebipõhine lisajoonis E11). Selles uuringus ei indutseerinud nikotiini aerosooliga kokkupuude erinevate tsütokiinide/kemokiinide taset BAL-is samal määral kui eelmise uuringuga.71 Selle lahknevuse põhjuseks võib olla see, et need autorid mõõtsid erinevate tsütokiinide transkriptsioonitasemeid kopsudes. homogeniseerub pärast kokkupuudet nikotiini-aerosooliga ja transkriptsioonitasemed ei too mõnikord kaasa muutusi, kui neid mõõdetakse valgu tasemetel, nagu me oleme teinud. Lisaks sõltuvad tsütokiinide profiil ja immuunsüsteemi modulatsioon konkreetsest e-vedelikust, aerosooli tekitamise meetodist / kokkupuute kestusest ja lisatud lõhna- ja maitseainetest. Kuigi kanep on tõestanud tervisele kasulikke omadusi valu leevendamisel, unel ning keemiaravist põhjustatud iivelduse/oksendamise sümptomite leevendamisel vähihaigetel ja patsientidel, kellel on krambid,72–76 puuduvad lihtsalt kindlad tõendid kanepi ohutuse kohta aurustamisel. tooted. Sellega seoses on meie uuring uudne ja tuvastab CBD aerosooli sissehingamise rolli kopsupõletiku ja kopsukahjustuste esilekutsumisel.
cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi
Kuna meie uuringus kasutati loomade ja in vitro kokkupuutemudeleid, tuleb inimeste tegelikule kokkupuutele esitatud tulemuste ekstrapoleerimisel arvestada mitmete piirangutega. Selle uuringu üks piirang on see, et see keskendus ainult lühiajalisele kokkupuutele. Pikaajalise kroonilise CBD-aerosoolidega kokkupuute tulemus ja nende mõju hingamisteede infektsioonidele ja/või profülaktilisele vaktsineerimisele on olulised. Meie loomade kokkupuute metoodika põhines kogu keha kokkupuute süsteemil ja ainult ninaga kokkupuude võib olla sobivam kogenud aurudega kokkupuute simuleerimiseks. Vaatamata kogu kehaga kokkupuute süsteemi kasutamisele kontrollisime, et loomade karusnahale (ja puuri seintele) sadestumine ei aidanud kaasa tahkete osakeste allaneelamisele loomade hooldamisel ja mõjutas seega täheldatud toksilisust. Kasutasime piiratud arvu hiiri kokkupuuterühma kohta; on tõenäoline, et suurem arv hiiri oleks võinud meie uuringu järeldusi veelgi tugevdada. Kuigi in vitro ALI mudel pakub sissehingamisel kokkupuute spetsiifilist lähenemisviisi aurustite kasutamisega seotud tervisemõjude bioloogilise uuringu läbiviimiseks, jääb in vitro uuringute andmete ekstrapoleerimine inimriskidele hüpoteetiliseks. Meie tulemuste kinnitamiseks on vaja tulevasi vaatlus- ja eksperimentaalseid uuringuid CBD ja nikotiini sisaldavate veipitoodete regulaarsete kasutajatega. Lõpuks puutusid meie katsetes loomad ja rakud mõlema identsel viisil genereeritud toote aerosoolidega. Kanepipõhiste aurutoodete kasutajad võivad aga neid tooteid kasutada nikotiiniaurudest väga erineval viisil (nt harvemini). Kuna ilmnevad kanepiaurude vaatlusuuringute andmed, tuleks loomade ja in vitro kokkupuute simuleerimisel laboritingimustes arvesse võtta võimalikke erinevusi toote kasutusharjumustes, mida täheldatakse realistlikes tingimustes. Tulevased uuringud peaksid uurima laia spektri kannabinoide, sealhulgas THC-d, sisaldavate aurustumistoodete mõju hingamisteedele.
VIITED
1 USA tervishoiuministeerium ja. E-sigareti kasutamine noorte ja noorte täiskasvanute seas: üldkirurgi aruanne [PDF–8,47 MB]PDF-i ikoon. Atlanta, GA: USA tervishoiu- ja inimteenuste osakond, CDC, 2016.
2 Borodovsky JT, Crosier BS, Lee DC jt. Suitsetamine, veipimine, söömine: kas legaliseerimine mõjutab inimeste kanepitarbimist? Int J Drug Policy 2016;36:141–7.
3 He T, Oks M, Esposito M jt. "Tree-in-bloom": kanepiõli aurustamisest põhjustatud tõsine äge kopsukahjustus. Ann Am Thorac Soc 2017;14:468–70.
4 Knapp AA, Lee DC, Borodovsky JT jt. Tekkivad suundumused kanepi manustamises noorukite kanepitarbijate seas. J Adolesc Health 2019;64:487–93.
5 Kriegel D. Vaping marihuaana vs. suitsetamine: kas on võitja? 2021. Saadaval: https:// vaping360.com/learn/vaping-vs-smoking-weed/ [Kasutatud 15. septembril 2021].
6 Volkow ND, Baler RD, Compton WM et al. Marihuaana kasutamise kahjulik mõju tervisele. N Ingl J Med 2014;370:2219–27.
7 Pahr K, Carter A. CBD juhend algajatele. terviseliin. 2019. Saadaval: https://www. healthline.com/health/your-cbd-guide [Kasutatud 19. augustil 2021].
8 Suleiman SA. Nafta süsivesinike toksilisus in vitro: n-alkaanide, benseeni ja tolueeni mõju kopsualveolaarsetele makrofaagidele ja kopsu lüsosomaalsetele ensüümidele. Arch Toxicol 1987;59:402–7.
9 Lachenmeier DW, Kuballa T, Reusch H jt. Benseen imikute porgandimahlas: täiendav ülevaade moodustumise mehhanismist ja riskianalüüsist, sealhulgas Donaldi uuringu tarbimisandmed. Food Chem Toxicol 2010;48:291–7.
10 Li YS, Li YF, Li QN jt. Mitmeseinaliste süsiniknanotorude, benseeni ja nende kombinatsiooni põhjustatud äge kopsutoksilisus hiirtel. Environ Toxicol 2010;25:409–17.
11 Anderson RP, Zechar K. Butaani räsiõli sissehingamisel tekkinud kopsuvigastus jäljendab kopsupõletikku. Respir Med Case Rep 2019;26:171–3.
12 Holt AK, Poklis JL, Peace MR. Reguleeritud ja reguleerimata e-sigareti vedelike keemiliste koostisosade retrospektiivne analüüs. Front Chem 2021;9:752342.
13 Blount BC, Karwowski MP, Shields PG jt. E-vitamiini atsetaat bronhoalveolaarses loputusvedelikus, mis on seotud EVALI-ga. N Ingl J Med 2020;382:697–705.
14 Bhat TA, Kalathil SG, Bogner PN jt. Inhaleeritava E-vitamiini atsetaadi ja EVALI-laadse kopsukahjustuse loommudel. N Ingl J Med 2020;382:1175–7.
15 Merecz-Sadowska A, Sitarek P, Zielinska-Blizniewska H jt. Kokkuvõte in vitro ja in vivo uuringutest, milles hinnatakse e-sigaretiga kokkupuute mõju elusorganismidele ja keskkonnale. Int J Mol Sci 2020;21:652.
16 Sussan TE, Gajghate S, Thimmulappa RK jt. Elektrooniliste sigarettidega kokkupuude kahjustab hiiremudelil kopsude antibakteriaalset ja viirusevastast kaitset. PLoS One 2015;10:e0116861.
17 Hwang JH, Lyes M, Sladewski K jt. Elektrooniliste sigarettide sissehingamine muudab kaasasündinud immuunsust ja hingamisteede tsütokiine, suurendades samal ajal koloniseerivate bakterite virulentsust. J Mol Med (Berl) 2016;94:667–79.
18 Martin EM, Clapp PW, Rebuli ME jt. E-sigareti kasutamine põhjustab immuun- ja põletikureaktsiooni geenide pärssimist nina epiteelirakkudes sarnaselt sigaretisuitsuga. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2016;311:L135–44.
19 Rebuli ME, Glista-Baker E, Hoffman JR jt. Elektrooniliste sigarettide kasutamine muudab nina limaskesta immuunvastust elusalt nõrgestatud gripiviirusele. Kliiniline uuring. Am J Respir Cell Mol Biol 2021;64:126–37.
20 Bloom JW, Kaltenborn WT, Paoletti P jt. Mittetubaka sigarettide mõju hingamisteedele. Br Med J (Clin Res. Ed) 1987;295:1516–8.
21 Wills TA, Pagano I, Williams RJ jt. E-sigareti tarbimine ja hingamishäired täiskasvanud proovis. Narkootikumide alkoholist sõltuv 2019; 194:363–70.
22 Xie W, Kathuria H, Galiatsatos P jt. Elektrooniliste sigarettide kasutamise seos USA täiskasvanute hingamishäiretega aastatel 2013–2018. JAMA Netw Open 2020;3:e2020816.
23 Bhatta DN, Glantz SA. E-sigareti kasutamise seos täiskasvanute hingamisteede haigustega: pikisuunaline analüüs. Am J Eelmine Med 2020;58:182–90.
24 Li D, Sundar IK, McIntosh S et al. Suitsetamise ja elektrooniliste sigarettide kasutamise seos vilistava hingamise ja sellega seotud hingamisteede sümptomitega täiskasvanutel: tubaka ja tervise (tee) uuringu populatsioonihinnangu ristlõike tulemused, 2. laine. Tob Control 2020;29:140–7.
25 Tashkin DP, Coulson AH, Clark VA jt. Hingamisteede sümptomid ja kopsufunktsioon ainult marihuaanat suitsetavatel, marihuaana ja tubaka suitsetajatel, ainult tubakat suitsetajatel ja mittesuitsetajatel. Am Rev Respir Dis 1987;135:209–16.
26 Taškini DP. Suitsutatud marihuaana kopsukahjustuse põhjuseks. Monaldi Arch Chest Dis 2005;63:93–100.
27 Taškini DP. Marihuaana suitsetamise mõju kopsudele. Ann Am Thorac Soc 2013;10:239–47.
28 Baldwin GC, Tashkin DP, Buckley DM jt. Marihuaana ja kokaiin kahjustavad alveolaarsete makrofaagide funktsiooni ja tsütokiinide tootmist. Am J Respir Crit Care Med 1997;156:1606–13.
29 Taylor DR, Poulton R, Moffitt TE jt. Kanepisõltuvuse mõju hingamisteedele noortel täiskasvanutel. Sõltuvus 2000;95:1669–77.
30 Aldington S, Williams M, Nowitz M jt. Kanepi mõju kopsude struktuurile, funktsioonile ja sümptomitele. Thorax 2007;62:1058–63.
31 Moore BA, Augustson EM, Moser RP jt. Marihuaana ja tubaka kasutamise mõju hingamisteedele USA proovis. J Gen Intern Med 2005;20:33–7.
32 Goniewicz ML, Knysak J, Gawron M, et al. Valitud kantserogeenide ja toksiliste ainete sisaldus elektrooniliste sigarettide aurus. Tob Control 2014;23:133–9.
33 Bhat TA, Kalathil SG, Leigh N jt. Kuumutatud tubakatoote (IQOS) aerosooli sissehingamise äge mõju kopsukoe kahjustustele ja põletikulistele muutustele kopsudes. Nicotine Tob Res 2021;23:1160–7.
34 Kosmider L, Jackson A, Leigh N jt. Ööpäevane pahvimiskäitumine ja topograafia e-sigareti kasutajate seas. Tob Regul Sci 2018;4:41–9.
35 Bhat TA, Kalathil SG, Bogner PN jt. Passiivne suitsetamine kutsub esile põletikku ja nõrgendab immuunsust hingamisteede infektsioonide suhtes. J Immunol 2018; 200:2927–40.
36 Bhat TA, Kalathil SG, Bogner PN jt. AT-rvd1 leevendab passiivse suitsetamise ägenemist kopsupõletikku ja taastab passiivse suitsu allasurutud antibakteriaalse immuunsuse. J Immunol 2021;206:1348–60.
37 Carden D, Xiao F, Moak C jt. Neutrofiilide elastaas soodustab kopsude mikrovaskulaarseid vigastusi ja endoteeli kadheriinide proteolüüsi. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology 1998;275:H385–92.
38 Kawabata K, Hagio T, Matsuoka S. Neutrofiilide elastaasi roll ägedas kopsukahjustuses. Eur J Pharmacol 2002;451:1–10.
39 Khan AA, Alsahli MA, Rahmani AH. Müeloperoksüdaas kui aktiivne haiguse biomarker: hiljutised biokeemilised ja patoloogilised perspektiivid. Med Sci (Basel) 2018;6:33.
40 Dietert K, Gutbier B, Wienhold SM jt. Patogeeni- ja mudelispetsiifiliste histopatoloogiate spekter ägeda kopsupõletiku hiiremudelites. PLoS One 2017;12:e0188251.
41 Butt YM, Smith ML, Tazelaar HD jt. Auruga seotud kopsukahjustuse patoloogia. N Ingl J Med 2019;381:1780–1.
42 Lee WL, Downey GP. Neutrofiilide aktiveerimine ja äge kopsukahjustus. Curr Opin Crit Care 2001;7:1–7.
43 Fink MP. Reaktiivse hapniku ja lämmastiku liikide roll ägeda respiratoorse distressi sündroomi korral. Curr Opin Crit Care 2002;8:6–11.
44 Abraham E. Neutrofiilid ja äge kopsukahjustus. Crit Care Med 2003;31:S195–9.
45 Pham CTN. Neutrofiilide seriini proteaasid reguleerivad põletikulist vastust. Int J Biochem Cell Biol 2008;40:1317–33.
46 Arecco N, Clarke CJ, Jones FK jt. Elastaasi tase ja aktiivsus suurenevad düstroofsetes lihastes ning kahjustavad müoblastirakkude ellujäämist, proliferatsiooni ja diferentseerumist. Sci Rep 2016;6:24708.
47 Czégény Z, Nagy G, Babinszki B jt. CBD on e-sigarettides sisalduva THC eelkäija. Sci Rep 2021;11:8951.
48 Lindén A, Laan M, Anderson GP. Neutrofiilid, interleukiin-17A ja kopsuhaigus. Eur Respir J 2005;25:159–72.
49 Ma K, Yang L, Shen R jt. Th17 rakud reguleerivad CXCL1 tootmist rinnavähi korral. Int Immunopharmacol 2018;56:320–9.
50 Becker S, Quay J, Koren HS jt. Konstitutiivne ja stimuleeritud MCP-1, GRO alfa-, beeta- ja gammaekspressioon inimese hingamisteede epiteelis ja bronhoalveolaarsetes makrofaagides. Am J Physiol 1994;266:L278–86.
51 Potey PM, Rossi AG, Lucas CD jt. Neutrofiilid ägeda kopsupõletiku algatamisel ja lahendamisel: bioloogilise funktsiooni ja terapeutilise potentsiaali mõistmine. J Pathol 2019; 247:672–85.
52 Heijink IH, Brandenburg SM, Postma DS jt. Sigaretisuits kahjustab hingamisteede epiteeli barjääri funktsiooni ja raku-raku kontakti taastumist. Eur Respir J 2012;39:419–28.
53 Aghapour M, Raee P, Moghaddam SJ jt. Hingamisteede epiteeli barjääri düsfunktsioon kroonilise obstruktiivse kopsuhaiguse korral: sigaretisuitsuga kokkupuute roll. Am J Respir Cell Mol Biol 2018;58:157–69.
54 Shapiro SD, Goldstein NM, Houghton AM jt. Neutrofiilide elastaas aitab kaasa sigaretisuitsu põhjustatud emfüseemi tekkele hiirtel. Am J Pathol 2003;163:2329–35.
55 Antunes MA, Rocco PRM. Elastaasi poolt indutseeritud kopsuemfüseem: ülevaated eksperimentaalsetest mudelitest. An Acad Bras Cienc 2011;83:1385–96.
56 Ghosh A, Coakley RD, Ghio AJ jt. Krooniline e-sigareti kasutamine suurendab neutrofiilide elastaasi ja maatriksi metalloproteaasi taset kopsudes. Am J Respir Crit Care Med 2019;200:1392–401.
57 Fortunati E, Kazemier KM, Grutters JC jt. Inimese neutrofiilid lülituvad pärast kopsudesse sattumist aktiveeritud fenotüübile, olenemata põletikulisest haigusest. Clin Exp Immunol 2009;155:559–66.
58 Faith M, Sukumaran A, Pulimood AB jt. Kui usaldusväärne põletikunäitaja on müeloperoksidaasi aktiivsus? Clin Chim Acta 2008;396:23–5.
59 Lau D, Mollnau H, Eiserich JP jt. Müeloperoksidaas vahendab neutrofiilide aktivatsiooni, seotuna CD11b/CD18 integriinidega. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102:431–6.
60 Schmidt A, Oberle N, Krammer PH. Treg-vahendatud T-rakkude supressiooni molekulaarsed mehhanismid. Front Immun 2012;3:51.
61 Thornton AM, Shevach EM. CD4+CD25+ immunoregulatoorsed T-rakud pärsivad polüklonaalsete T-rakkude aktivatsiooni in vitro, inhibeerides interleukiin 2 tootmist. J Exp Med 1998;188:287–96.
62 Kalininskiy A, Kittel J, Nacca NE et al. Kokkupuude e-sigaretiga, hingamisteede infektsioonid ja kaasasündinud immuunsuse kahjustus: narratiivne ülevaade. Pediatr Med 2021; 4:5.
63 Lucas R, Czikora I, Sridhar S jt. Arginaas 1: ootamatu vahendaja kopsukapillaarbarjääri düsfunktsiooni korral ägeda kopsukahjustuse mudelites. Front Immunol 2013;4:228.
64 Ween MP, Whittall JJ, Hamon R jt. Fagotsütoos ja põletik: e-sigareti aurude komponentide mõju uurimine makrofaagidele. Physiol Rep 2017;5:e13370.
65 Gay B, Field Z, Patel S jt. Vaping-indutseeritud kopsukahjustus: kanepit sisaldavate e-sigarettidega seotud lipoidse kopsupõletiku juhtum. Juhtum Rep Pulmonol 2020;2020:7151834.
66 Abeles M, Popofsky S, Wen A jt. Aurutamisega seotud kopsuvigastus, mis on põhjustatud kanepiõli sissehingamisest. Pediatr Pulmonol 2020;55:226–8.
67 Adapa S, Gayam V, Konala VM jt. Kanepi aurustamisest põhjustatud äge kopsutoksilisus: juhtumite seeria ja kirjanduse ülevaade. J Investig Med High Impact Case Rep 2020;8:2324709620947267.
68 Conuel EJ, Chieng HC, Fantauzzi J jt. Kannabinoidõli aurustamisega seotud kopsukahjustus ja selle radiograafiline välimus. Am J Med 2020;133:865–7.
69 Lugade AA, Bogner PN, Thatcher TH jt. Sigaretisuitsuga kokkupuude süvendab kopsupõletikku ja kahjustab immuunsust bakteriaalse infektsiooni vastu. J Immunol 2014;192:5226–35.
70 Bhat TA, Kalathil SG, Miller A jt. Spetsiaalsed lahutusvõimet soodustavad vahendajad saavad üle passiivse suitsuga kokkupuutest põhjustatud immuunsupressioonist. J Immunol 2020;205:3205–17.
71 Garcia-Arcos I, Geraghty P, Baumlin N jt. Krooniline kokkupuude elektrooniliste sigarettidega hiirtel kutsub esile KOK-i tunnused nikotiinist sõltuval viisil. Rindkere 2016;71:1119–29.
72 Booz GW. Kannabidiool on esilekerkiv ravistrateegia põletiku mõju vähendamiseks oksüdatiivsele stressile. Free Radic Biol Med 2011;51:1054–61.
73 Rosenberg EC, Tsien RW, Whalley BJ jt. Kannabinoidid ja epilepsia. Neurotherapeutics 2015;12:747–68.
74 riiklikku teaduste, tehnika ja meditsiini akadeemiat; Tervise ja meditsiini osakond. Kanepi ja kannabinoidide terapeutiline toime. Teoses: Kanepi ja kannabinoidide mõju tervisele: tõendite praegune seis ja soovitused uuringuteks. National Academies Press, 2017.
75 Thiele EA, Marsh ED, prantsuse JA jt. Kannabidiool Lennox-gestalt sündroomiga (GWPCARE4) seotud krambihoogudega patsientidel: randomiseeritud topeltpime platseebokontrolliga 3. faasi uuring. Lancet 2018;391:1085–96.
76 USA Toidu- ja Ravimiamet. FDA kiitis heaks esimese ravimi, mis koosneb marihuaanast saadud toimeainest, et ravida haruldasi raskeid epilepsia vorme. 2018. Saadaval: https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ ucm611046.htm [Kasutatud 15. septembril 2021].