NGF moduleerib kolesterooli metabolismi ja stimuleerib ApoE sekretsiooni gliiarakkudes, andes neuroprotektsiooni oksüdatiivse stressi vastu, 2. osa

2.6. NGF-vahendatud ApoE sekretsioon U373 poolt kaitseb neuronaalseid rakke oksüdatiivse kahjustuse eest

Koguvad tõendid näitavad, et ApoE suurendab neuronite vastupanuvõimet oksüdatiivsete solvangute suhtes, vältides seega apoptoosi ja neurodegeneratsiooni [17, 18, 37]. Selles kontekstis hindasime, kas NGF-indutseeritud ApoE sekretsioon U373 rakkude poolt võib kaitsta N1E-115 neuroneid oksüdatiivse stressi eest. Täielikult diferentseeritud N1E-115 töödeldi eelnevalt rotenooniga, mis kutsub esile oksüdatiivse stressi, inhibeerides mitokondriaalset kompleksi I.

Apoptoos on enesehävitamise protsess ja see on rakkude jaoks oluline viis säilitada keha homöostaas teatud tingimustel programmeeritud enesehävitamise kaudu. Apoptoos mängib erinevatel eluetappidel erinevaid rolle.

Hiljutised uuringud on näidanud, et apoptoosi ja mälu vahel on teatav seos. Teame juba, et mälu on ajus keeruline närviprotsess, mis hõlmab ühendusi ja koordineerimist mitme ajupiirkonna vahel. Apoptoos võib selles närviprotsessis rolli mängida.

Ühelt poolt võib apoptoos stabiliseerida neuronite võrgustruktuuri, puhastades mittevajalikud neuronid ja sünapsid, muutes neuronite ühendused rafineeritumaks, parandades seeläbi mälu kvaliteeti ja tõhusust. Teisest küljest võib liigne apoptoos viia ka ajurakkude arvu vähenemiseni, mis võib negatiivselt mõjutada mälestuste salvestamist ja jäädvustamist.

Seega, säilitades samal ajal apoptoosi sobiva taseme, saame parandada mälu mitme käitumise ja oskuste kaudu, nagu lugemine, õppimine, treenimine ja oma mõtteviisi kohandamine. Need käitumised ja oskused võivad soodustada ajurakkude kasvu ja ühendamist ning parandada mälu kvaliteeti ja tõhusust, stimuleerides aju neuronite vahelisi ühendusi ja koordinatsiooni.

Kokkuvõtteks võib öelda, et apoptoosi ja mälu vaheline seos on keeruline. Ainult õiget apoptoosi säilitades saame stimuleerida oma aju ja parandada mälu mitmesuguste käitumisviiside ja oskuste kaudu. Sellest vaatenurgast peame oma mälu parandama. Cistanche deserticola võib aidata meil oluliselt parandada mälu, sest Cistanche deserticola võib reguleerida ka neurotransmitterite tasakaalu, näiteks tõsta atsetüülkoliini ja kasvufaktorite taset. Need ained on mälu jaoks olulised. See on õppimiseks ja õppimiseks väga oluline. Lisaks võib lihast saadud liha parandada ka vere voolavust ja soodustada hapniku transporti, mis tagab aju piisava toitainete ja energia kättesaamise, parandades seeläbi aju elujõudu ja vastupidavust.

Mälu parandamiseks klõpsake teadmise lisandeid

Pärast 16-tunnist kokkupuudet rotenooniga kasvatati N1E-115 neuroneid värskes söötmes (Ctrl), konditsioneeritud söötmes U373 rakkudest (U373-Ctrl) ja konditsioneeritud söötmes U373-st, mida oli eeltöödeldud NGF-iga 48 tundi. (U373-NGF) või konditsioneeritud sööde ApoE-vaigistatud U373-st, mida on eeltöödeldud NGF-iga 48 tundi (U373-NGF ApoE siRNA). Rotenooni eeltöötlus vähendas tugevalt kontrollsöötmes kultiveeritud N1E-115 arvu, mis näitab, et selle pestitsiidi manustamine mõjutab tõsiselt N1E-115 ellujäämist.

Rotenooni tsütotoksilisus määras ka intensiivse neuriitide tagasitõmbumise, mida täheldas neuriitide pikkus. Rotenoonravi poolt esile kutsutud neuriitide kahjustus ilmnes eriti selgelt neuriite kandvate rakkude hindamisel, kuna neuriitidega N1E-115 arv vähenes 50%-ni. Sarnased tulemused saadi, kui N1E-115 rakke kultiveeriti U373-Ctrl konditsioneeritud söötmes, mis viitab sellele, et stimuleerimata astrotsüütidest saadud supernatandi olemasolu ei ole piisav, et kaitsta neuronirakke rotenooni vahendatud toksilisuse eest. Igapäevaselt hoidis NGF-iga töödeldud U373-st saadud konditsioneeritud söötme n kasutamine tõhusalt ära neuronite surma, samuti neuriite kandvate rakkude arvu ja neuriitide pikkuse vähenemise, mis oli põhjustatud rotenooni manustamisest (joonis 5).

Veelgi olulisem on see, et ApoE-ga vaigistatud U373 rakkudest tuletatud konditsioneeritud sööde kaotas täielikult U373-NGF-ga konditsioneeritud söötme poolt indutseeritud kasulikud mõjud, mis näitab, et neuroprotektsiooni juhib NGF-vahendatud ApoE vabanemine söötmes. Eelkõige säilitas segatud siRNA-ga transfekteeritud NGF-ga töödeldud U373 konditsioneeritud sööde täielikult U373-NGF-ga konditsioneeritud söötme kaitsvad toimed, mis näitab, et ApoE-ga vaigistatud rakkude konditsioneeritud söötmes täheldatud neuroprotektsiooni kadu sõltub tõhusalt ApoE-st. allareguleerimine (joonis S3C).

Joonis 5. U373 konditsioneeritud söötme mõju neuronite oksüdatiivsele stressile. Tüüpilised kujutised eredas väljas ja N1E-115 neuronaalse morfoloogia kvantitatiivne hinnang. Rakke töödeldi eelnevalt (+) või mitte (-) rotenooniga (0,1 µM) 16 tundi ja kultiveeriti seejärel värskes DMEM-is (Ctrl) kontrollitud U373-st (U{{) saadud konditsioneeritud söötmes. 9}}Ctrl), NGF-ga eeltöödeldud U373 (U373-NGF) ja NGF-ga eeltöödeldud U373, mis vaigistati apoE jaoks (U373-NGF ApoE siRNA) 48 tunniks. n=5 erinevat katset. Andmed tähistavad keskmisi ± SD. Statistilist analüüsi hinnati ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes Tukey post hoc test. ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Konditsioneeritud söötmest saadud tulemuste tugevdamiseks viisime läbi U373 / N1E115 kaaskultuurid. Alustuseks töödeldi U373 rakke 48 tundi NGF-iga või mitte. Lisaks töödeldi diferentseeritud N1E-115 rakke rotenooniga 16 tundi või mitte. Seejärel asendati U373 sööde värske söötmega, mis sisaldas 0,5% FBS-i, ja N1E-115-ga külvatud katteklaasid kanti kaaskultuuride ettevalmistamiseks U373 kihile (joonis 6A).

Rotenoonravi poolt esile kutsutud oksüdatiivne kahjustus mõjutas märkimisväärselt rakkude viabilineuriiti kandvaid rakke ja neuriitide pikkust kontroll-N1E-115 ja N1E-115, mida kultiveeriti koos U373-Ctrl astrotsüütidega (joonis 6B). Kooskõlas konditsioneeritud söötme katsetega kaitsti U373-NGF-rakkudega koos kultiveeritud N1E-115 rakke oksüdatiivsete kahjustuste eest, samas kui ApoE vaigistamine U373-s kaotas NGF-i poolt toetatud neuroprotektsiooni.

Joonis 6. ApoE sekretsioon NGF-ga töödeldud U373 rakkude poolt tagab neuroprotektsiooni oksüdatiivse stressi eest. (A) Astrotsüütide ja neuronite kaaskultuuride tüüpiline skeem, mis on loodud materjalide ja meetodite jaotises kirjeldatud viisil. Neuriite kandvaid rakke, neuriitide pikkust ja rakkude arvu hinnati tundi pärast ühiskultuuri loomist. (B) Tüüpilised kujutised eredas väljas ja N1E-115 rakkude neuronaalse morfoloogia kvantitatiivne hindamine, mida on eelnevalt töödeldud (+) või mitte (-) rotenooniga (0,1 µM) 16 tundi.

Seejärel hoiti N1E-115 värskes DMEM-is (Ctrl) või kultiveeriti koos kontrollrühmaga U373 (U373-Ctrl), NGF-i eeltöödeldud U373-ga (U373-NGF) ja NGF-iga eeltöödeldud U373 vaigistati ApoE (U373-NGF ApoE siRNA) suhtes 48 tundi. n=5 erinevat katset. Andmed tähistavad keskmisi ± SD. Statistiline analüüs viidi läbi ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes Tukey post hoc test. * p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

3. Arutelu

Neurotrofiinide signaaliradade tasakaalustamatus, samuti aju kolesterooli metabolismi muutused on tugevalt seotud neuroloogiliste ja neurodegeneratiivsete haigustega, nagu Retti sündroom, HD, Alzheimeri tõbi (AD) ja Parkinsoni tõbi (PD) [2, 38, 39]. . Selles kontekstis on neurotrofiinide bioloogilise aktiivsuse fundamentaaluuringud kolesterooli metabolismi ja aju füsiopatoloogiat ühendavate molekulaarsete mehhanismide lahkamisel otsustava tähtsusega. Viimastel aastatel on huvitav uuring teatanud BDNF-i rollist kolesterooli metabolismi reguleerimisel astrotsüütides [38].

Sellest arusaamast hoolimata ei ole teavet NGF-i oletatava osaluse kohta astrotsüütide kolesterooli reguleerimises. Seetõttu keskendusime selles töös NGF-i tulevasele rollile kolesterooli metabolismi reguleerimisel, pöörates erilist tähelepanu ApoE sekretsiooni mõjule neuronite diferentseerumisele ja ellujäämisele. Inimese astrotsüütide eksperimentaalse mudelina kasutatav astrotsütoomi rakuliin U373 säilitab potentsiaali täielikult reageerida NGF-ile, kuna see ekspresseerib nii TrkA kui ka p75NTR märgatavaid tasemeid.

Peamised tulemused näitasid, et NGF reguleerib üles peamiste kolesterooli biosünteesi (HMGCR), rakusisese inimkaubanduse (NPC1) ja sekretsiooniga (ABCA1) seotud valkude taset. Nende sündmustega kaasneb samaaegne ApoE ja kolesterooli leini suurenemine söötmes, mis viitab sellele, et NGF suurendab kolesterooli biosünteesi ja ekstrusiooni gliiarakkudest. On teatatud, et NGF indutseerib ApoE valgu ekspressiooni, suurendades selle transkriptsiooni [40]. Kuid me ei täheldanud intratsellulaarses ApoE ekspressioonis olulisi muutusi. Seda näilist ebajärjekindlust saab seletada, kuna ApoE kogunemist ei saa hinnata selle suurenenud väljavoolu tõttu NGF-iga töödeldud UIn-st
Molekulaarsete mehhanismide paremaks eraldamiseks töötlesime U373 LM11A-31-ga ja leidsime, et p75NTR modulaator suutis jäljendada ainult NGF-i vahendatud HMGCR ekspressiooni tõusu. P75NTR osalemine HMGCR tasemete moduleerimises on kooskõlas varasemate andmetega, mis on saadud teistes rakutüüpides, mis näitavad, et see retseptor kontrollib kolesterogeensete ensüümide transkriptsiooni [41]. Kuid LM11A-31 ei kutsunud esile mingeid muutusi ei teistes selles uuringus analüüsitud valkudes, sealhulgas ABCA1, ega kolesterooli ja ApoE tasemetes kultiveerimissöötmes, mis näitab, et p75NTR selektiivne moduleerimine ei ole kolesterooli soodustamiseks piisav. ekstrusioon läbi ApoE-rikaste osakeste, mida täheldati NGF-iga töödeldud rakkudes. Need tulemused panevad meid oletama, et NGF reguleerib kolesterooli metabolismi gliiarakkudes nii p75NTR kui ka TrkA retseptorite kaasamise kaudu.

On hästi teada, et neurotrofiinide seondumine Trk retseptoritega aktiveerib ERK1/2, reguleerides seega mitmeid rakkude diferentseerumise, proliferatsiooni ja ellujäämisega seotud teid [2,38]. Huvitaval kombel on täheldatud, et ERK1 / 2 aktiveerimine reguleerib ka ABCA1 ja ApoE ekspressiooni erinevates rakutüüpides [38, 42, 43]. Need leiud koos tõenditega, et BDNF/TrkB/ERK telg soodustab ApoE ekstrusiooni ja ABCA1 ekspressiooni gliiarakkudes [38], viitavad sellele, et TrkA/ERK telge hõlmav signaaliülekande rada võib seletada osa NGF-i mõjudest. meie uuringus.

Kuigi neuriitide väljakasvus muutusi ei täheldatud, näitas U373- konditsioneeritud söötme kasutamine ja ühiskultuuri katsete loomine, et NGF-i vahendatud suurenenud ApoE sekretsioon gliiarakkudest on oksüdatiivsest põhjustatud kahjulike tagajärgede ärahoidmisel määrav. stress neuronaalsetes rakkudes. Tsütotoksilisuse esilekutsumiseks kasutasime rotenooni, pestitsiidi, mida tavaliselt kasutatakse prekliinilistes uuringutes mitokondritest pärinevate reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) ja sellele järgneva apoptoosi esilekutsumiseks [44].

Meie tulemused näitavad, et NGF stimuleerib ApoE sekretsiooni gliiarakkude poolt, mis on vajalik neuroprotektiivse toime tagamiseks rotenooni manustamise vastu diferentseerunud N1E-115 rakkudes. ApoE roll oksüdatiivse stressi ennetamisel on hästi dokumenteeritud. Näiteks ApoE ammendumine hiiremudelites süvendab ajukoe oksüdatiivseid vigastusi [45, 46]. Sellest lähtuvalt kaitseb eksogeense ApoE manustamine vesinikperoksiidiga töötlemise pöördumatute oksüdatiivsete kahjustuste eest, neutraliseerides sekundaarse glutamaadi toksilisuse [18]. Lisaks on ApoE-d sisaldavad lipoproteiinid tõhusad võrkkesta ganglioni neuronite troofilise toe ärajätmisest põhjustatud apoptoosi nõrgestamisel [47].

Meie uuringus viitab rotenooni kasutamine sellele, et ApoE-vahendatud neuroprotektsioon, mida soodustavad NGF-i poolt stimuleeritud gliiarakud, võib olla oluline neurodegeneratiivsete seisundite, nagu PD, kontekstis. Nimelt taastoodab rotenoon nii loommudelites kui ka rakukultuurides, sealhulgas N1E-115--st pärinevates neuronites, sarnaselt PD puhul täheldatuga sarnase dopamiinergilise neuronite degeneratsiooni [48–50]. Sidusalt toetavad meie tulemused varasemaid tõendeid, mis näitavad, et ApoE kutsub esile neuroprotektsiooni 6-hüdroksüdopamiini (6-OHDA), teise neurotoksiini, mis on võimeline esile kutsuma PD-sarnase fenotüübi [51], manustamisel. Meie uuring näitab kollektiivselt, et NGF on kolesterooli metabolismi ja gliaalrakkudest ApoE ekstrusiooni oluline modulaator. Kõige tähtsam on see, et selle neurotrofiini poolt soodustatud ApoE sekretsiooni suurendamine on vajalik, et tagada neuroprotektsioon rotenooni tsütotoksilisuse vastu.

BDNF on täiskasvanu ajus kõige rikkalikum neurotrofiin. Vaatamata nendele tõenditele on näidatud, et NGF võib mängida otsustavat rolli mitte ainult arengu ajal, vaid ka täiskasvanu kesknärvisüsteemis. Näiteks mõjutab NGF hipokampuse aktiivsust ja sellest tulenevalt ruumimälu ja õppimist [52]. Teised leiud viitavad sellele, et NGF-il on neuroprotektiivne toime nigrostriataalsete dopamiinergiliste neuronite suhtes ja see aktiivsus võib olla aluseks uudsetele NGF-põhistele PD ravimeetoditele [53].

Selle arusaama kohaselt on näidatud, et NGF-i tootmine on täiskasvanueas astrotsüütides sügavalt reguleeritud ja avaldab neuropõletikku, ajukahjustust ja neurodegeneratsiooni moduleerivat toimet [54–56]. Selles kontekstis oleks huvitav hinnata tulevastes uuringutes, kas neid mõjusid võiks vähemalt osaliselt vahendada NGF-i poolt soodustatud gliaalkolesterooli moduleerimine. Käesolevas töös esitatakse mõned piirangud, mis tuleks järgmistes eksperimentaalsetes uuringutes ületada; Näiteks oleks oluline paremini eraldada molekulaarsed mehhanismid, mis seovad NGF-ravi ja kolesterooli metabolismi gliiarakkudes.

Laiaulatuslik arusaam on kasulik selleks, et tuvastada spetsiifilisi molekulaarseid sihtmärke, mida saab farmakoloogiliselt manipuleerida ja mida saaks kasutada neurodegeneratiivsetes kontekstides. Veelgi enam, kuigi U373 ja N1E-115 rakke kasutatakse laialdaselt juhitavate rakuliinidena vastavalt astrotsüütiliste ja neuronaalsete tunnuste reprodutseerimiseks [27–29,57], tuleks neid leide primaarsetes rakukultuurides täiendavalt kinnitada. Kuigi tuleks teha täiendavaid jõupingutusi neurotrofiini signaaliülekande tugevdamiseks aju kolesterooli homöostaasis, näitab see töö esimest korda, et NGF võib kaudselt avaldada neuroprotektsiooni, mõjutades gliaalkolesterooli metabolismi.

4. Materjal ja meetodid

4.1. Rakukultuur

N1E-115 neuroblastoomirakke ja U373 rakke kultiveeriti 5% CO2 juures DMEM-is kõrge glükoosisisaldusega (Merck Life Science, Milano, Itaalia) 10% (maht/maht) veiseloote seerumiga (FBS) (Merck Life Science). , Milano, Itaalia) ja lisati penitsilliini/streptomütsiini lahusega.

Neuronaalse diferentseerumise esilekutsumiseks külvati N1E-115 rakud 30% konfluentsusega ja lülitati 96 tunniks DMEM-i 0,5% FBS-iga.

Neuronaalse diferentseerumise esilekutsumiseks külvati N1E-115 rakud 30% konfluentsusega ja lülitati 96 tunniks DMEM-i 0,5% FBS-iga.

Astrotsüütide ja neuronite kaaskultuurid loodi vastavalt Ioannou ja kolleegide kirjeldatud protokollile koos muudatustega [59]. Kinnituse tagamiseks suruti katteklaasidele parafiini vahetükid; kasutasime neuronite katteklaasidel vahetükke, et tõhusalt vältida mehaanilisi kahjustusi, kui rakud asetati vastamisi. Seejärel steriliseeriti katteklaasid etanoolis ja kaeti polü-D-lüsiiniga (Merck Life Science, Milano, Itaalia). N1E-115 külvati kaetud katteklaasidele soovitud tihedusega ja kui need olid kooskultuuriks valmis, kasutati steriilseid tange, et tõsta N1E-115 neuronitega katteklaasid ja asetada need näoga allapoole { {10}}kaevud, mis on külvatud U373 astrotsüütidega.

N1E-115 rakkude eeltöötlus viidi läbi, manustades 16 tunni jooksul 0,1 µM rotenooni (Sigma-Aldrich, Milano, Itaalia, R8875). Kontrollrakud said kandjana DMSO-d (lahjendus 1:1000 rakukultuurisöötmes). Kõigis katsetes töödeldi U373 rakke NGF-iga (Alomone Labs, Jeruusalemm, Iisrael, N-245) annuses 100 ng/ml 48 tundi.

4.2. Lüsaadi valmistamine ja Western blot analüüs

U373 rakke töödeldi ultraheliga (töötsükkel 20%, väljund 3) proovipuhvris (0,1 Tris-HClisHCl, mis sisaldas 10% SDS-i, proteaasi inhibiitori kokteil, pH 6,8), et saada kogu lüsaat, nagu eelnevalt kirjeldatud [ 60,61]. Lisati Laemmli puhver ja proove denatureeriti 95 °C juures 5 minutit. Valguekstraktid (kakskümmend mikrogrammi valke) lahutati SDS-PAGE-ga ja ülekanne nitrotselluloosmembraanile viidi läbi, kasutades trans-blot turboülekandesüsteemi (Biorad Laboratories, Milano, Itaalia), nagu varem teatatud [62].

Seejärel inkubeeriti membraani toatemperatuuril 1 tund 5% rasvavaba kuivpiimaga Tris-puhverdatud soolalahuses (25 mM Tris-HCl, 138 mM NaCl, 27 mM KCl, 0,05% Tween{ {10}}, pH 6,8) ja sondeeriti üleöö temperatuuril 4 ◦C järgmiste primaarsete antikehadega: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-271708, lahjendus 1:500), anti-p75NTR TrkA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-118, lahjendus 1:500), anti-SREBP-1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-8984 , lahjendus 1:1000), anti-SREBP-2 (Abcam, Cambridge, UK, ab30682, lahjendus 1:1000), anti-HMGCR (Abcam, Cambridge, UK, ab242315, lahjendus 1:1000), anti-LDLr (Abcam, Cambridge, UK, ab30532, lahjendus 1:500), anti-NPC1 (Novus Biologicals, Centennial, CO, USA, NB400-148, lahjendus 1:3000 ), antiABCA1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-58219, lahjendus 1:400), anti-ApoE (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-53570, lahjendus 1 :400), anti-vinkuliin (SigmaAldrich, Milano, Itaalia, V9264, lahjendus 1:10 000) ja anti- -aktiin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-47778, lahjendus 1 :10 000).

Membraane inkubeeriti järjestikku 1 tund toatemperatuuril HRP-konjugeeritud sekundaarsete hiire- või küülikuvastaste antikehadega (Bio-Rad Laboratories, Milano, Itaalia). Valkudega seotud antikehad visualiseeriti selge ECL Western blot analüüsiga (Bio-Rad Laboratories, Milano, Itaalia, # 1705061) ja kemoluminestsents registreeriti ChemiDoc MP süsteemi kaudu (Bio-Rad Laboratories, Milano, Itaalia). Seejärel viidi läbi Western blot'idest tuletatud densitomeetriline analüüs, kasutades Windowsi jaoks mõeldud tarkvara ImageJ versiooni 1.52t (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Vinkuliini või -aktiini kasutati majapidamisvalkudena, mis toimisid valgu laadimise sisekontrollina. Densitomeetrilised arvutused saadi suvaliste ühikutena, mis tuletati valguriba intensiivsuse ja vastava majapidamisvalgu vahelisest suhtest.

4.3. Õlipunane O värvimine

U373 rakud külvati polü-L-lüsiiniga (Sigma-Aldrich, P6282-5MG) kaetud katteklaasidele 6-süvendiga plaatidele ja õlipunase O värvimine viidi läbi, nagu eelnevalt kirjeldatud [60]. Lühidalt, rakud fikseeriti paraformaldehüüdis (4% lahus) 10 minutit ja loputati õrnalt kolm korda PBS-iga. Fikseeritud rakke inkubeeriti 60% isopropanooliga 5 minutit ja seejärel pesti destilleeritud veega. Seejärel sondeeriti rakke 1 ml Oil Red O töölahusega (Sigma-Aldrich, O1391-250ML) 15 minutit toatemperatuuril, asetades 6-süvendi plaadi orbitaalrotaatorloksutile. Pärast värvimislahusega inkubeerimist pesti süvendeid kolm korda destilleeritud veega, et eemaldada liigne plekk.

Katteklaasid paigaldati lõpuks Fluoroshieldi kinnitusmeediumiga (Sigma-Aldrich, F6182) ja Oil red O autofluorestsentsi visualiseeriti konfokaalse mikroskoopia abil (TCS SP8; Leica, Wetzlar, Saksamaa). Pildid jäädvustati Leica TCS SP8 abil, mis oli varustatud 63-kordse suurendusega ja Leica LAS X tarkvaraga (Milano, Itaalia). Õlipunase O värvimise kvantifitseerimine viidi läbi Windowsi jaoks mõeldud ImageJ tarkvara abil ja arvutati keskmise fluorestsentsi intensiivsusena rakupiirkonna kohta.
4.4. Filipiinide värvimine

Filipiinide värvimine viidi läbi Filipiinide kompleksi (Sigma-Aldrich, F9765) abil. Filipiinide põhilahus (10 mg/ml PBS-s) valmistati alati vahetult enne kasutamist. Rakud fikseeriti paraformaldehüüdis (4% lahus) 10 minutit ja pesti PBS-ga. Seejärel värviti U373 1 ml Filipiini töölahusega (0,05 mg / ml PBS-s) 1 tund pimedas toatemperatuuril. Seejärel pesti rakke kolm korda PBS-iga ja katteklaasid paigaldati Fluoroshieldi kinnitussöötmega ja analüüsiti kohe konfokaalse mikroskoopia abil, kasutades UV-filtrikomplekti (340–380 nm ergastus). Pildid saadi 40-kordse suurendusega. Filipiinide kvantifitseerimine arvutati keskmise fluorestsentsi intensiivsusena rakupiirkonna kohta, kasutades Windowsi jaoks mõeldud ImageJ tarkvara.

4.5. Kolesterooli kvantifitseerimine

Kolesterooli kvantifitseerimine viidi läbi kolorimeetrilise analüüsi abil (Cholesterol Quantitation Kit, MAK043, Sigma-Aldrich, Milano, Itaalia), järgides tootja juhiseid.

4.6. ELISA
ApoE tasemeid söötmes hinnati, kasutades Human Apolipoprotein E ELISA komplekti (Abcam, Cambridge, UK, ab108813) vastavalt tootja juhistele.

4.7. Immunofluorestsents

U373 rakkude immunofluorestsents viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [60]. U373 fikseeriti paraformaldehüüdis (4% PBS-is) ja sondeeriti üleöö primaarsete antikehadega: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc{6}}, lahjendus 1:100) ja anti-TrkA ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc{10}}, lahjendus 1:100). Seejärel inkubeeriti rakke 1 tund kitse hiirevastase sekundaarse antikehaga Alexa Fluor 555 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA, A28180) ja kitse küülikuvastase sekundaarse antikehaga Alexa Fluor 488 (ThermoFisher Scientific, USA Waltham, MA, USA). , A27034). Tuumade visualiseerimiseks viidi läbi DAPI värvimine ja lõpuks paigaldati katteklaasid Fluoroshieldi kinnitusmeediumiga. Proove analüüsiti konfokaalse mikroskoopia abil, nagu eespool kirjeldatud.

4.8. ApoE vaigistamine

ApoE mRNA vaigistamine viidi läbi U373 rakkudel, kasutades ApoE siRNA-d (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc{1}}) vastavalt tootja juhistele. Transfektsioon viidi läbi 6-süvendiga koekultuuri plaadil, kus 100,000 rakku süvendi kohta külvati 24 tunniks DMEM antibiootikumivabasse kasvusöötmesse, millele oli lisatud 10% FBS-i. Iga süvendi jaoks lisati siRNA transfektsioonireaktsiooni lahusele siRNA transfektsioonisööde (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc{8}}), mis valmistati siRNA dupleksi ja siRNA transfektsioonireagendiga (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc29528). Seejärel pesti rakke üks kord siRNA transfektsioonisöötmega ja kaeti eelnevalt valmistatud transfektsiooniseguga. Seejärel inkubeeriti kultuuriplaati 7 tundi 37 °C juures 5% CO2 inkubaatoris.

Transfektsioonisegule lisati igasse süvendisse vahekorras 1:1 DMEM kasvusöödet 20% FBS-i ja antibiootikumidega (normaalsest kontsentratsioonist 2-kordne). Rakke inkubeeriti 18 tundi, seejärel sööde eemaldati ja asendati värske normaalse kasvusöötmega; 24 tundi pärast viimast etappi olid rakud valmis edasisteks katseteks kasutamiseks. ApoE vaigistamise efektiivsust hinnati RT-qPCR-ga U373 rakkudes ja ELISA-ga raku supernatandis; ApoE siRNA takistas tõhusalt ApoE indutseerimist NGF-i poolt, kui võrrelda siRNA-ga (ApoE mRNA: 83% langus; ApoE ELISA: 78% langus). Eelkõige oli ApoE ekspressioon siRNA vaigistamisel madalam kui kontroll-U373 puhul täheldatud põhiekspressioonitasemed (ApoE mRNA: 72% langus; ApoE ELISA: 58% langus) (joonis S 3A, B).

4.9. RNA ekstraheerimine ja reaalajas PCR

mRNA analüüs viidi läbi nagu varem teatatud [22, 63]. Lühidalt, kogu RNA U373 rakkudest ekstraheeriti TRI reagendiga (Merck Life Science, Milano, Itaalia) vastavalt tootja juhistele. Viidi läbi DNA-töötlus (Ambion, Thermo Fisher Scientific, Milano, Itaalia) ja seejärel puhastati RNA, kasutades RNA puhastuskomplekti (Zymo, Itaalia). RNA pöördtranskribeeriti järjestikku cDNA-ks läbi suure võimsusega cDNA pöördtranskriptsiooni rakukomplekti (Applied Bio-System, Foster City, CA, USA) ja kasutati qPCR analüüsiks.

qRT-PCR-is apoE jaoks kasutatud praimerid olid: edasisuunas 5 0 -GGGTCGCTTTTGGGATTACCTG-30 ja vastupidine 50 -CAACTCCTTCATGGTCTCGTCC3 0. qRT-PCR-is gapdh jaoks kasutatud praimerid (valitud võrdlusgeeniks) olid: pärisuunaline 50 - GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-30 ja vastupidine 50 -ACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-30. Õige amplikoni tootmist hinnati sulamiskõvera hindamisega. Iga bioloogilist proovi töödeldi kolmes eksemplaris SYBR rohelise IQ reagendiga (Bio-Rad Laboratories, Milano, Itaalia) ja kasutades CFX Connecti tuvastamissüsteemi (Bio-Rad Laboratories, Milano, Itaalia).

4.10. Neuronaalse morfoloogia kvantitatiivne hindamine

N1E-115 rakkude neuronaalset morfoloogiat hinnati ümberpööratud mikroskoobiga kujutiste jäädvustamisel. Morfomeetriline analüüs viidi läbi Windowsi jaoks mõeldud ImageJ tarkvara abil ning hinnati rakkude koguarvu (väljendatud kontrolli protsendina), neuriitide keskmist pikkust (väljendatud protsendina kontrollist) ja neuriite kandvate rakkude arvu. Neuriite kandvate rakkude puhul arvutati protsent, jagades diferentseerunud rakkude arvu rakkude koguarvuga välja kohta. N1E-115 eristati deevadest, kui neil oli vähemalt üks neuriit a pikkusega, mis oli võrdne sooma läbimõõduga või sellest suurem. Morfoloogiline hindamine viidi läbi vähemalt viie sõltumatu katsega, milles analüüsiti vähemalt kolme pilti.

4.11. Statistiline analüüs

Kõik selles uuringus esitatud tulemused väljendati keskmisena ± SD (andmete standardhälbe normaaljaotust kontrolliti Shapiro-Wilki testiga. Kahe katserühma võrdlemisel kasutati paarituid teste. Kui aga kolm või enam rühma Võrreldi, kasutati ühesuunalist dispersioonanalüüsi (ANOVA), millele järgnes Tukey post hoc test. Rotenooniga tehtud katsete puhul, kus esines kaks muutujat, kasutati kahesuunalist ANOVA-d, millele järgnes Bonferroni järeltest. p < 0.05 loeti statistiliselt erinevateks Statistiliseks analüüsiks kasutati GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, USA) Windowsile.

Autori kaastööd:

Kontseptualiseerimine, MS; metoodika, MS ja MC; valideerimine, MS ja MC; formaalne analüüs, MS, MC, DP ja MP; uurimine, MC, NM, LL, MP ja DP; ressursid, MS ja VP; andmete kureerimine, MS ja MC; kirjutamine – algse mustandi ettevalmistamine, MS ja MC; kirjutamine – läbivaatamine ja toimetamine, MP, LL, DP, NM ja VP; visualiseerimine, MS, MC ja MP; järelevalve, MS; projektihaldus, MS; rahastamise omandamine, MS Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.

Rahastamine:

Seda uurimistööd rahastati MS-i osakondade teadusuuringute fondist 2021 (Molise Ülikool) ja Jerome Lejeune'i fondi toetussessiooni 2021a, #2043 raames MS-ile.

Institutsioonilise ülevaatenõukogu avaldus:

Ei kohaldata.

Teadliku nõusoleku avaldus:

Ei kohaldata.

Andmete kättesaadavuse avaldus:

Ei kohaldata.

Tänuavaldused:

Täname Claudia Tonini abi eest kolesterooli analüüsil

Huvide konfliktid:

Autorid ei kinnita huvide konflikti.

Viited

1. Björkhem, I.; Meaney, S.; Fogelman, AM Aju kolesterool: pikk salajane elu barjääri taga. Arterioskleer. Tromb. Vasc. Biol. 2004, 24, 806–815. [CrossRef] [PubMed]

2. Colardo, M.; Martella, N.; Pensabene, D.; Siteni, S.; Di Bartolomeo, S.; Pallottini, V.; Segatto, M. Neurotropiinid kui rakkude metabolismi peamised regulaatorid: mõju kolesterooli homöostaasile. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5692. [CrossRef] [PubMed]

3. Goritz, C.; Mauch, DH; Pfrieger, FW Mitmed mehhanismid vahendavad kolesterooli poolt indutseeritud sünaptogeneesi kesknärvisüsteemi neuronis. Mol. Kamber. Neurosci. 2005, 29, 190–201. [CrossRef] [PubMed]

4. Pfenninger, KH Plasma membraani paisumine: neuroni Heraklese ülesanne. Nat. Rev Neurosci. 2009, 10, 251–261. [CrossRef]

5. Takamori, S.; Holt, M.; Stenius, K.; Lemke, EA; Grønborg, M.; Riedel, D.; Urlaub, H.; Schenck, S.; Brügger, B.; Ringler, P.; et al. Kaubitseva organelli molekulaarne anatoomia. Cell 2006, 127, 831–846. [CrossRef] [PubMed]

6. Suzuki, S.; Kiyosue, K.; Hazama, S.; Ogura, A.; Kashihara, M.; Hara, T.; Koshimizu, H.; Kojima, M. Ajust tuletatud neurotroofne faktor reguleerib kolesterooli metabolismi sünapsi arenguks. J. Neurosci. 2007, 27, 6417–6427. [CrossRef]

7. Segatto, M.; Leboffe, L.; Trapani, L.; Pallottini, V. Kolesterooli homöostaasi rike ajus: mõju sünaptilisele düsfunktsioonile ja kognitiivsele langusele. Curr. Med. Chem. 2014, 21, 2788–2802. [CrossRef] [PubMed]

8. Jeske, DJ; Dietschy, JM Kolesterooli sünteesi kiiruse reguleerimine in vivo roti maksas ja rümbas, mõõdetuna [3H] veega. J. Lipid Res. 1980, 21, 364–376. [CrossRef]

9. Pfrieger, FW; Ungerer, N. Kolesterooli metabolism neuronites ja astrotsüütides. Prog. Lipid Res. 2011, 50, 357–371. [CrossRef]

10. Nieweg, K.; Schaller, H.; Pfrieger, FW Märkimisväärsed erinevused kolesterooli sünteesis postnataalsete rottide neuronite ja gliiarakkude vahel. J. Neurochem. 2009, 109, 125–134. [CrossRef]

11. Oram, JF; Heinecke, JW ATP-d siduva kasseti transporter A1: raku kolesterooli eksportija, mis kaitseb südame-veresoonkonna haiguste eest. Physiol. Rev. 2005, 85, 1343–1372. [CrossRef]

12. Pfrieger, FW Allhange ajus: kas neuronid sõltuvad kolesterooli kohaletoimetamisest astrotsüütide poolt? BioEssays 2003, 25, 72–78. [CrossRef]

13. Christopherson, KS; Ullian, EM; Stokes, CCA; Mullowney, CE; põrgu, JW; Agah, A.; Lawler, J.; Mosher, DF; Bornstein, P.; Barres, BA Trombospondiinid on astrotsüütide poolt sekreteeritud valgud, mis soodustavad kesknärvisüsteemi sünaptogeneesi. Cell 2005, 120, 421–433. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com