Ehhinakosiidi neurotroofsed ja neurorescue-efektid Parkinsoni tõve alaägeda MPTP hiiremudeli korral

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Qing Zhao jt

Abstraktne

Paljud katsed toetavad arvamust, et neurotroofsete tegurite (NTFS) aktiivsuse suurendamine, eriti gliiarakkude liinist tuletatud neurotroofne faktor (GDNF) ja ajust tuletatud neurotroofne faktor (BDNF), võib ennetada või peatada neurodegeneratsiooni progresseerumistParkinsoni tõbihaigus(PD). NTFS-i kasutamine PD raviainetena(Parkinsoni tõbihaigus)seda takistavad raskused nende ohutult ja tõhusalt konkreetsetesse ajupiirkondadesse toimetamisel. Teine potentsiaalne strateegia on NTFS-i endogeense ekspressiooni stimuleerimine. Selles uuringus uurisime selle mõjuehhinakosiid(ECH), ravimtaimedest ekstraheeritud monomeer dopamiinergilise funktsiooni päästmiseks 1-metüül-4-fenüül-1, 2, 3, 6-tetrahüdropüridiini (MPTP) kahjustatud hiirtel. Leidsime, et ECH suukaudne manustamine(ehhinakosiid)(30 mg/kg/päevas 14 päeva jooksul) MPTP-ga ravitud hiirtele, mis algas pärast nigrostriaalse süsteemi kahjustust, pärssis nigraalsete dopamiinergiliste neuronite, striataalsete kiudude, dopamiini ja dopamiini transporteri vähenemist 134,24 protsendini, 203,517 protsenti. ja vastavalt 154,72 MPTP-kahjustusega loomadest (lk< 0.05).="" there="" was="" a="" relative="" elevation="" in="" the="" expression="" of="" gdnf="" and="" bdnf="" mrna="" (2.94="" and="" 3.75-fold)="" and="" protein="" (184.34%="" and="" 185.93%)="" in="" ech="" treated="" mice="" compared="" with="" vehicle-treated="" mptp-lesioned="" mice="">< 0.05).="" in="" addition,="" the="" apoptosis="" cells="" and="" bax/bcl-2="" ratio="" of="" mrna="" and="" protein="" in="" mptp-lesioned="" mice="" significantly="" increased,="" and="" these="" effects="" could="" be="" prevented="" by="" ech.="" at="" the="" 7th="" and="" 14th="" days="" of="" ech="" treatment,="" the="" gait="" disorder="" displayed="" obvious="" improvement="">< 0.05).="" these="" findings="" demonstrate="" that="" ech="" is="" probably="" a="" novel,="" orally="" active,="" a="" non-peptide="" inducer="" of="" ntfs="" and="" inhibitor="" of="" apoptosis,="" and="" they="" provide="" preclinical="" support="" for="" the="" therapeutic="" potential="" of="" this="" compound="" in="" the="" treatment="" of="">

Märksõnad: Parkinsoni tõbi, MPTP, ehhinakosiid, GDNF, BDNF, neurorescue

ehhinakosiidCistanche'is onNeurotroofnejaneuropäästemõjud pealeParkinsoni tõbihaigus

Parkinsoni tõvega seotud kasutegurite saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Parkinsoni tõbihaigus(PD) iseloomustab progresseeruv dopamiinergiline neuronaalsete rakkude surm substantia nigras, mille tulemuseks on tõsine motoorne defitsiit. Erinevalt neuroprotektiivsetest strateegiatest, mille eesmärk on aeglustada degeneratsiooni ja seega tuleb alustada enne märkimisväärse kahjustuse tekkimist, on neurorescue või taastavate teraapiate eesmärk kõrvaldada neuronite defitsiit ja degeneratsioon pärast kahjustuste tekkimist. Neurotroofsed tegurid (NTF) on sekreteeritavad valgud, mis reguleerivad neuronaalsete rakkude ellujäämist, funktsionaalset säilimist ja fenotüübilist arengut, eriti gliiarakuliinist tuletatud neurotroofset faktorit (GDNF) ja ajust pärinevat neurotroofset faktorit (BDNF) peetakse laialdaselt tugevateks. PD-s degenereeruvate dopamiinergiliste neuronite ja nigrostriataalse raja ellujäämisfaktorid(Parkinsoni tõbihaigus). Kuigi nende NTF-ide neuroprotektiivset või neuropäästvat toimet on demonstreeritud paljudes in vitro ja in vivo katsetes (Peterson ja Nutt, 2008), on nende kasutamist PD raviainetena takistanud raskused nende ajju toimetamisel, kuna makromolekuli peptiidid ei suuda läbida aju-verebarjääri (BBB). Seega on kliinilised uuringud, mis testivad PD ravi(Parkinsoni tõbihaigus)kas kirurgia või geeniteraapia kasutamine peab lahendama NTF-ide tõhusa kohaletoimetamise ja ekspressiooni probleemi (Dietz et al., 2006; Torp et al., 2006). Alternatiivina sellistele invasiivsetele lähenemisviisidele on potentsiaalne strateegia stimuleerida NTF-ide endogeenset ekspressiooni. Hiljuti on näidatud, et mitmed mittepeptiidsed NTF-i indutseerijad, nagu XIB4035 ja PYM50028, vähendavad dopamiinergiliste neuronite kadu ja võivad avaldada kasulikku mõju PD ravis (Tokugawa et al., 2003; Visanji et al., 2008). . Neid madala molekulmassiga aineid saab manustada süsteemselt ja seega lahendaksid nad enamiku probleemidest, mis on seotud NTFS-i ajju toimetamise tõhususe ja ohutusega selliste meetoditega nagu NTF-i ekspressiooni esilekutsumine viirusvektorite poolt või kapseldatud NTF-i tootvate vahendite kasutamine. rakud (Bespalov ja Saarma, 2007). Seega on PD alternatiivsete ravivõimalustena järjest rohkem tähelepanu pööratud molekulidele, mis indutseerivad NTF-ide endogeenset ekspressiooni või suurendavad nende signaaliülekannet.(Parkinsoni tõbihaigus).

ehhinakosiid(ECH, joonis 1) on fenüületanoidglükosiidide (PhG) üks peamisi koostisosi, mis on ekstraheeritud kuulsast traditsioonilisest Hiina meditsiinist Herba Cistanches (Cistanche deserticola, Cistanche salsa või Cistanche tubulosa varred). See on ka peamine fenoolne komponent Echinacea Angustifolia ja E. pallida (Pellati et al., 2004) juurtes, mida kasutatakse laialdaselt Euroopas ja Põhja-Ameerikas nende immunoregulatsiooni omaduste tõttu (Hostettmann, 2003). Loodusliku polüfenoolitootena ECH(ehhinakosiid)on mitmesuguse bioaktiivsusega, nagu võimas antioksüdant (Sloley et al., 2001; Dalby-Brown et al., 2005), vabade radikaalide püüdmine ja aktiveeritud makrofaagide tekitatud NO-radikaali vähendamine (Xiong et al., 2000), nii et et see võib kaitsta hepatotoksilisuse (Wu et al., 2007) ja ägedate kopsukahjustuste eest rottidel (Zhang et al., 2007, Xiong et al., 1998). Sellel on ka põletikuvastane, kasvajavastane, vananemisvastane ja õppimismälu parandav tegevus (vaadatud He et al., 2009). Mitmed uuringud on teatanud ECH-st(ehhinakosiid)omab apoptoosivastaseid ja neuroprotektiivseid omadusi neurodegeneratiivsete haiguste, näiteks ECH korral(ehhinakosiid)avaldab olulist neuroprotektiivset toimet H2O2 vigastatud PC-12 rakkudele ja päästab SH-SY5Y neuronaalsed rakud TNF-i indutseeritud apoptoosi eest mitokondriaalse raja kaudu (Kuang et al., 2009; Deng et al., 2004). In vivo on ühend kaitsnud dopamiinergilisi neuroneid 6-hüdroksüdopamiini (6-OHDA) kahjustatud rottidel, vähendades dopamiini (DA) ja selle vaheühendite vähenemist (Chen et al., 2007a, b). Teises uuringus teatati, et ECH-l oli MPTP-indutseeritud dopamiinergiliste neuronaalsete kahjustuste hiiremudelis neuroprotektiivne toime ja käitumise paranemine, samas kui edasine uurimine näitas, et ECH indutseeris MPP-s kaspaasi{14}} ja kaspaasi-8 aktivatsiooni allareguleerimise. pluss-indutseeritud väikeaju graanulite neuronite apoptoos (Geng et al., 2007). Kuid need uuringud uurisid ainult ECH-i apoptootilisi või neuroprotektiivseid rolle eeltöötluse meetodil. Küsimustele selle kohta, kas ECH mõjutab teisi dopamiinergiliste neuronite ellujäämist ja surmaga seotud tegureid (nt NTF-id ja perekond Bcl{21}}) ning kas sellel on neuropäästmise mõju, ei ole veel käsitletud. Uurides vähest kirjandust NTF indutseerimise kohta ürtide või taimsete ühendite poolt, leidsime, et Rehmannia glutinosa ja catalpol, kaks traditsioonilise hiina meditsiini teooria kohaselt Cistanchesiga sarnaste funktsioonidega ürti, võivad indutseerida GDNF geeni ja valgu ekspressioone nii in vitro kui ka in vivo seejärel nõrgendage MPTP-indutseeritud nigraal-striataalse dopamiinergilise raja neuronaalset degeneratsiooni (Yu et al., 2006; Xu et al., 2010). Seetõttu oletasime, et ECH-l võib olla ka analoogne efektiivsus. Teisest küljest on alaäge MPTP hiiremudel üsna populaarne raviskeem, mis hõlmab ühte süsti 30 mg/kg päevas viie järjestikuse päeva jooksul. See režiim põhjustab noortel täiskasvanud C57BL/6 hiirtel apoptoosi ja kahandab striataalset dopamiini 40–50 protsenti ning dopamiinergiline kahjustus stabiliseerub 21 päeva pärast MPTP manustamist (Tatton ja Kish, 1997; Jackson-Lewis ja Przedborski, 2007). Nii et meie praegune uuring valib selle mudeli ja uurib ECH mõju GDNF-i ja BDNF-i ekspressioonidele, mis on kaks kõige tugevamat NTF-i, mis on seotud dopamiinergiliste neuronite ellujäämisega, ning demonstreerib veelgi selle ühendi neuropäästmis- ja anti-apoptootilisi võimeid pärast alaägedat MPTP-kahjustust. induktsioon PD hiiremudelis(Parkinsoni tõbihaigus).

2. Tulemused

2.1. ECH(ehhinakosiid)parandab kõnnaku düsfunktsioone PD alaägedas MPTP hiiremudelis(Parkinsoni tõbihaigus)

Lühenenud sammu pikkus on PD ebanormaalse kõnnaku üks peamisi tunnuseid(Parkinsoni tõbihaigus). Meie uuringu tulemused näitavad, et MPTP-kahjustusega hiirtel, keda raviti vehiikuliga (soolalahusega) 9. päeval pärast viimast MPTP manustamist, st vehiikuliga töötlemise 7. päeval, vähenes oluliselt esi- ja tagajäseme sammupikkus, võrreldes tavaline kontrollrühm (p= 0.023, 0,014, joonised 2A, B). Samal ajal on hiirte sammupikkused suure annusega ECH-s(ehhinakosiid)(30 mg/kg/päevas) ravirühm on pikem kui MPTP-kandjaga loomadel, eriti tagajäsemete puhul (p= 0.024, 0.009). Veelgi enam, suure annuse ECH-ga seotud paranemine(ehhinakosiid)täheldati ka 14. ravipäeval (p= 0.015, 0,012), kuigi MPTP-kahjustusega hiirtel esines ka väike spontaanne paranemine. Mõõdukas (20 mg/kg/päevas) ja madal (10 mg/kg/päevas) annus ECH(ehhinakosiid)ravitud rühmad näitasid kalduvust pikema sammu pikkuse poole, kuid erinevused nende ja MPTP-kandjaga töödeldud hiirte vahel ei olnud olulised.

Joonis 2 – ECH(ehhinakosiid)parandas alaägedate MPTP süstide põhjustatud kõnnaku halvenemist. V: Esijäseme sammu pikkus. Kõnnianalüüsi testi esijäsemete pikkused näitasid MPTP pluss NS (soolalahus) rühmas olulist vähenemist võrreldes NS pluss NS rühmaga MPTP-vahendiga ravimise 7. päeval, kuid need puudujäägid välditi ECH suure annusega.(ehhinakosiid)(30 mg/kg/päevas), mõõdetuna 7. ja 14. ravipäeval. B: tagajäseme sammu pikkus. MPTP-kahjustusega hiirte tagajäsemete sammupikkus vähenes füsioloogilise lahuse kontrollidega võrreldes ilmselgelt MPTP-kandjaga ravi 7. päeval ja seda parandas oluliselt ka ECH suur annus.(ehhinakosiid). Andmed on väljendatud keskmistena ± SEM (igaüks n{0}}). * lk< 0.05="" vs.="" ns+ns="" group;="" #="">< 0.05="" vs.="" mptp+ns="">

ehhinakosiidCistanche'is onNeurotroofnejaneuropäästemõjud pealeParkinsoni tõbihaigus

2.2. ECH(ehhinakosiid)nõrgendab nigraalsete TH-positiivsete neuronite ja juttkeha TH-positiivsete aksonite kadu alaägedatel MPTP-kahjustusega hiirtel

Pärast 14-päevase ECH-ravi lõpetamist(ehhinakosiid)või vehiiklit ja käitumise hindamise lõpuleviimist, ohverdati pooled iga rühma hiirtest Nissl ja TH-immunoreaktiivsete tuvastamiseks. Tüüpilised koronaalsed mesencefaloni lõigud, mis sisaldavad TH-positiivseid neuroneid ja kiude hiirte substantia nigra compacta (SNpc) ja striatumis, on näidatud joonistel fig. 3A, B, C, D. Vehiikuliga töödeldud MPTP kahjustatud rühmas vähenes märkimisväärselt Nissl-positiivsete neuronite (ainult kresüülvioletsed positiivsed) ja TH-positiivsete neuronite (nii TH kui ka kresüülvioletsed positiivsed neuronid) arv SNpc-s võrreldes kahjustusteta kontrollhiirtega (71,89 protsenti ja 67,97 protsenti soolalahuse kontrollist, p= 0.000, 0.000, joonised 3A, B, E) . Hiirtel, kellele manustati iga päev suukaudselt suures annuses ECH-d(ehhinakosiid)Nissl-positiivsete ja TH-positiivsete neuronite arv oli oluliselt suurem kui MPTP-kandjaga ravitud loomadel (135,39 protsenti ja 134,24 protsenti MPTP kontrollist, p= 0.000) ​​ning see oli ühtlane. kahjustusteta kontrollhiirte omadele lähedal (97,34 protsenti ja 91,25 protsenti). Sarnast, kuid nõrgemat efekti täheldati ka mõõduka annusega ECH-ravi rühmas (125,39 protsenti ja 124,59 protsenti MPTP kontrollist, p= 0.002, 0,004). Kuid väikeses annuses ECH-ravi ei andnud olulist päästvat toimet. Teisest küljest välistas Nissl-positiivsete ja TH-positiivsete neuronite muutuste sarnane tendents SNpc-s TH-ensüümi reguleerimisest tingitud tulemuste häirimise.

Kaasneb DA neuronite kadumine PD MPTP mudelis(Parkinsoni tõbihaigus)on TH-positiivsete kiudude vähenemine juttkeha kaudu. Me täheldasime TH-positiivsete aksonite näilist killustumist MPTP-kahjustusega loomade juttkehas, kuid kahjustus paranes ECH-s(ehhinakosiid)ravirühmas, eriti suure doosiga ECH puhul(ehhinakosiid)(joonis 3D). Lisaks näitas TH-positiivsete kiudude optilise tiheduse (OD) analüüs DA-klemmide märkimisväärset kaotust MPTP-vahendiga töödeldud rühmas (47,37 protsenti soolalahuse kontrollist, p= 0.001, joonis 3F). Seevastu hiirtel, kes said suures annuses ECH-d, täheldati TH-positiivsete kiudude tiheduse ilmset suhtelist tõusu.(ehhinakosiid)ravi võrreldes MPTP-kahjustusega kontroll-loomadega (203,17 protsenti MPTP kontrollist, p= 0,003, joonised 3C, F), viies selle 96,24 protsendini normaalsest kontrolltasemest. Samal ajal ilmnes mõõduka doosiga ECH rühmal ka märkimisväärne, kuid nõrgem neuropäästeefekt (177,78 protsenti MPTP kontrollist, p= 0,022), samas kui väikese annuse puhul ei ilmnenud mingit kasu.

2.3. ECH(ehhinakosiid)pärsib striataalse DA vähenemist PD alaägeda MPTP hiiremudeli korral(Parkinsoni tõbihaigus)

Katse lõpus oli DA sisaldus juttkehas vehiikuliga töödeldud MPTP mudelis vaid 31,25 protsenti normaalsetest kontrollidest (p= 0.000, tabel 1). Pärast ECH suurte annuste manustamist(ehhinakosiid)2 nädala jooksul tõusis DA sisaldus 47,97 protsendini normaalsest ja oli oluliselt kõrgem kui MPTP-kahjustusega hiirtel (p= 0,015). Teisest küljest suurendas ECH ka MPTP mudelis vähenenud metaboliitide DOPAC sisaldust.(ehhinakosiid)so that the ratio of DOPAC/DA was not significantly changed (p>0.05). Tundus, et ECH(ehhinakosiid)ei ole selgeid eeskirju DA katabolismi kohta.

2.4. ECH(ehhinakosiid)tõstab striataalset DAT valku alaägedatel MPTP-kahjustusega hiirtel

Western blot analüüs näitas, et MPTP-ga indutseeritud märgatav dopamiini transporter (DAT) valgu vähenemine juttkeha koes võrreldes soolalahuse kontrolliga 14 päeva pärast viimast süsti (p=0.000, joonised 4A, B ). Kuid MPTP-kahjustusega loomi raviti ECH suurte ja mõõdukate annustega(ehhinakosiid)pärssis DAT-valgu vähenemist (p{0}},001, 0,046). ECH väike annus ei näidanud mingit aktiivsust DAT ekspressiooni tõusule.

2.5. ECH(ehhinakosiid)vähendab apoptoosirakke subakuutsete MPTP-kahjustusega hiirte nigralis

Terminaalse desoksünukleotidüültransferaasi poolt vahendatud dUTP-biotiini hüüdotsa märgistamise (TUNEL) tehnika abil tuvastati subakuutsete MPTP-kahjustusega hiirte SNpc-s rohkem apoptootilisi rakke, mis sisaldasid intensiivselt tumepruuni värvumise tuumasid ja märgatavalt kahanevat somat, võrreldes tavalise kontrolliga ( p= 0.000, joonised 5A, B, C). Kuid MPTP-ga süstitud looma raviti ECH suurte ja mõõdukate annustega(ehhinakosiid)näitas TUNEL-positiivsete rakkude olulist vähenemist võrreldes soolalahusega töödeldud MPTP mudeliga (p= 0.000, 0,003).

2.6. ECH(ehhinakosiid)suurendab GDNF ja BDNF suhtelist mRNA ja valgu taset subakuutsete MPTP-kahjustusega hiirte mustas aines

To define the changes in GDNF and BDNF expression at both transcriptional and protein levels after the different treatments real-time PCR and Western blot analysis were used. There were no significant differences in mRNA and protein levels of GDNF and BDNF in the ventral midbrain between the MPTP-vehicle treated animals and the saline control group at the end of the experiment (p>0.05, joonised fig. 6A, B, C). Kuid pärast kahenädalast ravi suure annusega ECH-ga(ehhinakosiid), oli GDNF suhteline mRNA ja valgu tase oluliselt suurenenud võrreldes vehiikuliga töödeldud MPTP-kahjustusega hiirtega (294- korda mRNA-s ja 184,34 protsenti MPTP kontrollvalgus, p=0.{{ 8}}05, 0.000). Need tõusud olid olulised ka võrreldes soolalahuse kontrollloomadega (1.{11}}kordne ja 142,63 protsenti soolalahuse kontrollist, p=0,003, 0,001, joonised 6A, C). Vahepeal mõõdukas annuses ECH(ehhinakosiid)näitasid nõrgemat, kuid siiski ilmset GDNF-i mRNA ja valgu taseme tõusu (213- korda ja 160,55 protsenti MPTP kontrollist, p= 0,012, 0,001). Sarnased muutused olid ka BDNF-i ekspressioonis, mille suhteline mRNA ja valgu tase suures annuses ECH-s oli oluliselt kõrgem.(ehhinakosiid)ravitud rühm võrreldes MPTP-kahjustusega või normaalsete kontrollhiirtega (3,75 korda ja 185,93 protsenti MPTP kontrollist, p= 0.001, 0.000; 2,33 korda ja 154,39 protsenti soolalahuse kontrollist, p= 0,002, 0,001, joonised 6A, C). Ravi mõõduka annusega ECH-ga(ehhinakosiid)suurendas nii BDNF mRNA kui ka valgu ekspressiooni (2,51 korda ja 162,69 protsenti MPTP kontrollist, p= 0.044, 0,002). Seega ECH(ehhinakosiid)suutis mingil annusest sõltuval viisil suurendada GDNF ja BDNF mRNA ja valgu ekspressiooni.

2.7. ECH(ehhinakosiid)nõrgendab Bax/Bcl{0}} suhtelist mRNA ja valgu suhet subakuutsete MPTP-kahjustusega hiirte substantia nigras

ECH mõju(ehhinakosiid)apoptoosi suhtes, mis on teadaolevalt veel üks oluline tegur, mis on seotud nigraalsete dopamiinergiliste neuronite kadumisega PD-s(Parkinsoni tõbihaigus), were assessed by analyzing the Bax and Bcl-2 expression by Real-time PCR and Western Blot. The relative mRNA levels of the pro-apoptotic factor Bax increased in SN of MPTP-lesioned mice (2.14-fold of saline control, p=0.036), while those of the anti-apoptotic factor Bcl-2 were not significantly different with normal control mice (p>0.05, joonis 7A). Kuid Bax/Bcl-2 mRNA suhe suurenes kahjustatud hiirtel märkimisväärselt (1.99-kordus soolalahuse kontrollist, p=0,002) ja seda tõusu võis tagasi pöörata. suure annuse ECH abil(ehhinakosiid) after 14 days of treatment (37.12% of MPTP control, p=0.000, Fig. 7A) due to a slight down-regulation of Bax (82.71% of MPTP control, p>0.05) ja Bcl-2 geeniekspressiooni ilmselge ülesreguleerimine (2.39-MPTP kontrolli kord, p=0.000). Mõõduka annusega ECH puhul esines sarnaseid, kuid nõrgemaid mõjusid Bax/Bcl-2 mRNA suhtele.(ehhinakosiid)võrreldes vehiikuliga töödeldud MPTP-kahjustusega hiirtega (63,88 protsenti MPTP kontrollist, p=0.016, joonis 7A). Ühel kokkuleppel suurenes Bax/Bcl-2 valgu suhe MPTP-kahjustusega hiirtel oluliselt (265,97 protsenti soolalahuse kontrollist, p=0.000) ning vastupidine kõrge ja ECH mõõdukad annused(ehhinakosiid)(52,33 protsenti , 67,25 protsenti MPTP kontrollist, p=0.000, 0.001 Joonised 7B, C), kuid mitte ECH annuse 10 mg/kg järgi, peegeldades mRNA Bax/Bcl{10}} suhtele.

3. Arutelu

Käesolevas uuringus demonstreerime esimest korda, et ECH(ehhinakosiid), traditsioonilisest Hiina ürdist ekstraheeritud monomeer, omab neuropäästetegevust PD alaägedas MPTP hiiremudelis(Parkinsoni tõbihaigus)samuti potentsiaal indutseerida NTF-ide ekspressiooni nii transkriptsiooni kui ka valgu tasemel. Pärast 14-päevast suukaudset manustamist ilmnes ECH(ehhinakosiid)demonstreerisid multifunktsionaalset toimet dopamiinergiliste neuronite funktsiooni päästmisel, DAT vähenemise leevendamisel, SNpc-s paljude apoptoosirakkude kasvu pärssimisel ja kõnnakuhäirete parandamisel võrreldes soolalahusega töödeldud MPTP-kahjustusega hiirtega. Eeldame, et ECH neuropäästmistegevused on vähemalt osaliselt seotud GDNF-i ja BDNF-i mRNA ja valgu ekspressiooni suhtelise suurenemisega, aga ka Bcl-i kahe võtmemolekuli Baxi ja Bcl-2 regulatsiooniga. }} perekond, mis on seotud SN-i dopamiinergiliste neuronite apoptoosiga.

Kuigi leiud erinevate terapeutiliste võimaluste kohta mitmesugustest in vitro ja in vivo PD-st(Parkinsoni tõbihaigus)mudelid on paljulubavad, neuroprotektsioon PD korral(Parkinsoni tõbihaigus)jääb tabamatuks eesmärgiks. Võrreldes tuvastatud neuroprotektsiooni strateegiatega, mis peaaegu alati nõudsid eelravi (st manustamist enne vigastust), on neurorescue või taastavad strateegiad rohkem kooskõlas kliinilise farmakoloogilise sekkumise viisiga PD varases staadiumis. Meie uuringus on ECH(ehhinakosiid)manustamist alustati pärast MPTP kahjustust, mis erines varasematest uuringutest, ja sellel oli selgeid eeliseid. Teine hilinenud ravi eesmärk oli tagada, et kõik täheldatud toimed ei oleks tingitud sellest, et ühend segab MPTP muutumist selle aktiivseks metaboliidiks MPP plus , MAO-B vahendatud reaktsioonist ega võimalikust kiirest allareguleeritud DAT funktsioonist ja seejärel blokeerige MPP pluss omastamine (Sagi et al., 2007; Lai et al., 2009).

On hästi teada, et neuronite ellujäämine nõuab troofilist tuge. GDNF ja BDNF on kõige lootustandvamad troofilised tegurid neurodegeneratiivsete haiguste, eriti PD, neuropäästmisel või taastavas ravis.(Parkinsoni tõbihaigus). Praeguseks on läbi viidud mitmeid kliinilisi uuringuid, et uurida troofiliste tegurite, eriti GDNF-i otse PD ajju jõudmist, kuid need on andnud erinevaid tulemusi. Probleem võib olla tingitud kohaletoimetamiskohast ja -meetodist, nimelt GDNF-i jaotumisest pärast erinevaid süstimis- või infusioonitehnikaid (Lang et al., 2006; Morrison jt, 2007; Nutt et al., 2003; Slevin jt. , 2007). Ravides, milles kasutatakse rakupõhiseid manustamissüsteeme või viirusvektoritega rakendatud geeniteraapiat, võib GDNF geeni ja valgu üleekspressioon soodustada rakkude elujõulisust dopamiinergilistes keskaju neuronites ja indutseerida sümptomaatilist paranemist 6-OHDA kahjustustega rottidel ja ravitud ahvidel. MPTP-ga (Andereggen et al., 2009; Kong et al., 2008). Nendel ravimeetoditel on siiski kriitilisi probleeme seoses nende kliinilise kasutamisega, kuna on küsimusi geeniülekande tõhususe ja stabiilsuse ning immuunvastuse võimalikkuse kohta (Mochizuki, 2009).
Kuigi on tehtud jõupingutusi neurokirurgia kaudu tarnimisega seotud raku- või geeniteraapia probleemide ületamiseks, pööratakse nüüd üha enam tähelepanu strateegiatele, mis indutseerivad endogeensete troofiliste tegurite ekspressiooni või suurendavad nende signaaliülekannet kui alternatiivseid ravivõimalusi PD jaoks.(Parkinsoni tõbihaigus)(Chen et al., 2007a,b; Saavedra jt, 2008). Selles uuringus teatame esimest korda, et ECH(ehhinakosiid)omab PD neurorescue ja neurotroofset toimet(Parkinsoni tõbihaigus)hiire mudelit ja need mõjud on seotud GDNF ja BDNF ülesreguleerimisega mRNA ja valgu tasemel. Oluline erinevus aksonite või kiudude arvus ECH-s(ehhinakosiid)ravitud hiired, võrreldes vehiikuliga töödeldud MPTP-kahjustusega hiirtega, näitasid, et see ühend soodustas neuriitide väljakasvu ja regeneratsiooni. Eelkõige lähenes ravitud hiirte kiudude tihedus normaalsele vigastamata tasemele (suure annuse ECH puhul ∼ 96,24%). Võimalik selgitus TH-positiivsete neuronite näiliselt suuremale arvule ECH-ga ravitud kahjustatud hiirtel on see, et ECH jäljendab või suurendab GDNF-i ja BDNF-i rolli, eriti GDNF võib tugevalt moduleerida dopamiini ventraalsete mesentsefaalsete neuronite elujõulisust ja fenotüüpilist ekspressiooni. võib kompenseerida rakkude kadu (Palfi et al., 2002). Teisisõnu, on võimalik, et ECH reguleerib TH geeni transkriptsiooni sarnaselt GDNF-ga (Xiao et al., 2002). Seetõttu ei kinnitanud meie uuring mitte ainult, et ECH on kasulik loodusliku madala molekulmassiga ravimina MPTP hiiremudelis, vaid näitas ka nende mõjude potentsiaalseid mehhanisme, mis on kooskõlas troofiliste tegurite vahendamisega.

ehhinakosiidsisseCistancheonNeurotroofnejaneuropäästemõjud pealeParkinsoni tõbihaigus

Veel üks huvitav leid meie uuringus on see, et MAPK/ERK1/2 või Ras-PI3K-Akt ellujäämisraja aktiveerumise märke ei ole, mis on väidetavalt kaasa aidanud NTF-ide neurorescue-efektidele (Yu et al., 2006; Sagi et al. ., 2007). Kuna p-ERK1/2 (MAPK aktiveeritud fosforüülitud vorm) ja p-Akt (Ras-PI3K-Akt raja aktiveeritud märk) ei tuvastatud Western blot analüüsiga suure doosi ECH-ga ravitud MPTP-kahjustusega loomade keskajus. (andmeid ei näidatud). Üks võimalikest seletustest on tuvastamise hilinenud aeg, kuna ERK aktiivsus suureneb tavaliselt kiiresti pärast ravimi stimuleerimist (Hisaoka et al., 2007) ja teine ​​​​tõenäosus on nende signaaliradade mittekaasamine ECH neuropääste või neurotroofsete mõjude jaoks alaägedas MPTP hiiremudelis. PD-st(Parkinsoni tõbihaigus)mida tuleb edasi uurida.

Meie uuringus alaäge MPTP-režiim PD-s(Parkinsoni tõbihaigus)hiiremudel põhjustab apoptoosi ja dopamiinergilisi kahjustusi, mis stabiliseeruvad 21 päeva pärast MPTP manustamist, mis on kooskõlas varasema kirjanduse andmetega (Jackson-Lewis ja Przedborski, 2007). Apoptoosi pärssimine võib kaitsta neuroneid vigastuste eest, mis ulatuvad troofiliste tegurite puudumisest patoloogiliste stiimuliteni (Yuan ja Yankner, 2000). Lisaks võivad NTF-id kaitsta neuroneid mitokondrite poolt indutseeritud apoptoosi eest, mis tekib fosfatidüülinositool-3- kinaasi raja aktiveerimise tõttu (Toth et al., 2002). On teada, et apoptoosi reguleerib mitu rada. Varasemad uuringud Bcl-2 valkude kohta toetavad arvamust, et sellised pro-apoptootilised pereliikmed osalevad neuronaalses surmas mitmesuguste PD korral.(Parkinsoni tõbihaigus)mudelid (Levy et al., 2009). Apoptoosi soodustavad valgud, sealhulgas Bax, toimivad mitokondriaalses membraanis tsütokroomile, samas kui apoptoosi ennetavad valgud, nagu Bcl-2, toimivad Baxi valkudega heterodimeerudes ja nende aktiivsust takistades. Seetõttu on teada, et Bax/Bcl-2 suhe määrab, kas mõned rakud jäävad ellu või surevad (Tanaka et al., 2004). Meie labori varasemad uuringud on näidanud ECH potentsiaalset neuroprotektiivset ja apoptootilist rolli(ehhinakosiid)MPP pluss-indutseeritud SH-SY5Y rakkudel voolutsütomeetria ja muude apoptoosiga seotud testide kaudu (Wang et al., 2007). Seega analüüsisime ECH anti-apoptootilise toime molekulaarset alust(ehhinakosiid)in vivo käesolevas uuringus. Leiame, et ECH-ravi suured ja mõõdukad annused pärsivad nii TUNEL-positiivsete apoptoosirakkude arvu tõusu SNpc-s kui ka Bax/Bcl-2 suhte geeni- ja valgutasemel võrreldes MPTP-kahjustusega rühmaga. Need tähelepanekud annavad mõningaid vihjeid ECH võimalike apoptootiliste mehhanismide kohta väljaspool kaspaaside perekondadele avalduvat toimet. Kuigi meie esialgne uuring ei ole kindlaks teinud apoptootiliste rakkude fenotüüpi, viitavad varasemad uuringud sellele, et TH-positiivsed neuronid läbivad apoptootilise degeneratsiooni ja kaotavad oma TH aktiivsuse, kuid mitte gliiarakud PD mitteägeda MPTP hiiremudeli korral (Novikova et al., 2006). . Lisaks kinnitab meie uuring veelgi Bcl-2 pereliikmete osalust subakuutse MPTP-indutseeritud PD hiiremudeli patogeneesis.(Parkinsoni tõbihaigus). Jääb ebaselgeks, kas Bcl{0}} pereliikmete ja NTF-ide vaheliste suhete osas on ühiseid viise. Sellegipoolest näitavad meie praegused tulemused, et endogeense GDNF-i ja/või BDNF-i taseme tõstmine ning Bcl-2-pro-apoptootiliste pereliikmete ekspressioonide reguleerimine võib olla kasulik strateegia neuronite regeneratsiooniteraapias.

Lõpuks ECH mõju(ehhinakosiid)MPTP hiiremudeli kõnnihäirete leevendamise kohta illustreerivad selle potentsiaali sümptomaatilise ravimina, keskendudes mittedopamiinergilistele sihtmärkidele, mis on praegu kliinilistes uuringutes paljulubavate uuringute keskmes. PD-s(Parkinsoni tõbihaigus), motoorsed sümptomid, nagu bradükineesia ja jäikus, reageerivad hästi dopamiini asendusravimitele. Tasakaalu- ja kõnniprobleeme võivad dopamiinergilised ained samuti haiguse alguses tagasi pöörata, kuid tavaliselt muutuvad need haiguse progresseerumisel resistentseks (Meredith ja Kang, 2006). Meie uuringus lühiajaline (7 päeva) manustamine suure ECH annusega(ehhinakosiid)avaldas positiivset mõju hiirte sammu pikkusele, mis viitab sellele, et see võib olla paljulubav täiendus dopamiini asendusravimitele.

Tuleb märkida, et meie uuringus uuriti ka gliiarakkude ekspressiooni immunofluorestsentsi abil, kuid ECH-ga ravitud MPTP-kahjustusega hiirtel ei täheldatud astrogliaalse või aktiveeritud mikrogliia ekspressiooni muutust.(ehhinakosiid)võrreldes soolalahusega töödeldud MPTP hiirtega (andmeid pole näidatud). Vaatamata sellele võime oletada, et ECH mõju(ehhinakosiid)ei piirdu dopamiinergilise süsteemi ülaltoodud poolustega ja järgmised uuringud on vajalikud ECH täieliku rolli ja mehhanismide määratlemiseks PD näriliste või primaatide mudelites.(Parkinsoni tõbihaigus).

Kokkuvõtteks näitab käesolev uuring, et ECH(ehhinakosiid)avaldas neurorescue mõju MPTP-indutseeritud dopamiinergiliste neuronite ja kiudude kadumisele in vivo, samuti käitumise halvenemisele. Need mõjud näisid olevat korrelatsioonis selle ühendi multifaktoriaalsete toimetega, sealhulgas MPTP toksilisuse leevendamine DAT-ile, neurotroofsete faktorite GDNF/BDNF ekspressiooni suurendamine ja ebanormaalse apoptoosi pärssimine subakuutsete MPTP-kahjustusega hiirte ventraalses keskajus Bcl{{ reguleerimise kaudu. 1}} pereliiget. Koos meie eelmise uuringu tulemustega ECH neuroprotektiivse toime kohta(ehhinakosiid)in vitro eeldame, et sellel ühendil on potentsiaal mitte ainult PD progresseerumist edasi lükata(Parkinsoni tõbihaigus)vaid ka olemasolevate neurodegeneratiivsete kahjustuste tagasipööramiseks ja isegi sümptomite parandamiseks. Kokkuvõttes näitavad need andmed, et ECH(ehhinakosiid)on paljulubav, kliiniliselt rakendatav lähenemisviis PD raviks(Parkinsoni tõbihaigus).

4. Katseprotseduurid

4.1. Loomade protokollid

Kõik protseduurid kiitis heaks Zhongshani haigla Fudani ülikooli loomaeetikakomitee ja need viidi läbi vastavalt riiklike tervishoiuinstituutide laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendile.

Katsed viidi läbi isastega C57BL/6 hiiri, mis osteti ettevõttest Shanghai Slac Laboratory Animal Company (Shanghai, Hiina) 10 nädala vanuselt ja kaaluga 24–26 g. Loomi hoiti standardtingimustes (12 ⁄ 12 h valguse ja pimeduse tsükkel, 21 ± 2 kraadi ja suhteline õhuniiskus 40 protsenti) ning neile võimaldati juurdepääs toidule ja veele ad libitum.

4.2. MPTP administreerimine

Parkinsonismi esilekutsumiseks süstiti hiirtele iga päev intraperitoneaalselt (ip) füsioloogilises lahuses lahustatud vehiikulit (soolalahust) või MPTP-d (30 mg/kg/päevas; Sigma, USA) viis järjestikust päeva. Igas ravirühmas oli kümme hiirt. ECH osteti ettevõttelt Chengdu Push Bio-Technology Co. Ltd (Sichuan, Hiina). Ekstrakt vastab ettevõtte standardile ja seda analüüsiti HPLC-ga 98% või suurem. ECH(ehhinakosiid)lahustati füsioloogilises soolalahuses ja reguleeriti pH väärtuseni 7,4, enne kui see manustati intragastrilise (ig) manustamise teel. ECH mõju(ehhinakosiid)MPTP-indutseeritud parkinsonismi kohta uuriti järgmistes katserühmades: I rühm, NS (soolalahus, ip) pluss NS (ig); II rühm, MPTP (ip) pluss NS (ig); III rühm, MPTP (ip) pluss ECH 10 mg/kg/päevas (ig); IV rühm, MPTP (ip) pluss ECH 20 mg/kg/päevas (ig); V rühm, MPTP (ip) pluss ECH 30 mg/kg/päevas (ig); VI rühm, NS (ip) pluss ECH 30 mg/kg/päevas (ig).

I–VI rühma loomad said soolalahust või MPTP-d (ip) iga päev 5 päeva jooksul; sõiduk (soolalahus) või ECH(ehhinakosiid)ravi (ig) alustati 72 tundi pärast viimast MPTP manustamist ja seda manustati iga päev 14 päeva jooksul. Hiired tapeti emakakaela dislokatsiooni või perfusiooniga pärast viimast kandja või ECH manustamist ja käitumise jälgimist.

4.3. Kõnnaku test

Kõnnikatse viidi läbi varem avaldatud meetodite järgi (Fernagut et al., 2002; Fleming et al., 2004; Tillerson et al., 2002) väikese modifikatsiooniga. Seade koosnes tulega (60 W) valgustatud rajast 4,5 cm (laius) × 40 cm (pikkus) × 12 cm (kõrgus) ja mustast puidust kastist, 20 cm (laius) × 17 cm (pikkus) × 10 cm (kõrgus), mis asetatakse raja ühte otsa. Loomade esi- ja tagakäpad said pliiatssinise tindiga märjaks ning neil lasti paberiribal (laius 4,5 cm, pikkus 40 cm) mööda eredalt valgustatud rada mööda tumeda väravakasti poole traavida. Sammu pikkust mõõdeti käsitsi kahe käpajälje vahelise kaugusena. Iga jooksuga mõõdeti kolm kõige pikemat sammu pikkust (mis vastavad maksimaalsele kiirusele). Jooksu alguses (7 cm) ja lõpus (7 cm) tehtud käpajäljed jäeti kiiruse muutuste tõttu välja. Analüüsist jäeti välja jooksud, mille käigus katsetaja täheldas hiirte peatumist või ilmset aeglustumist. Käitumise hindamine viidi läbi 3 päeva enne esimest MPTP süsti ning ECH 7. ja 14. päeval(ehhinakosiid)või sõiduki töötlemine.

4.4. Perfusioon ja kudede töötlemine

Katse lõpus ohverdati pooled loomad (n{{0}}) igas rühmas 10 protsendilise kloraalhüdraadi üledoosi anesteesia all (360 mg/kg). ), seejärel perfundeeriti intrakardiaalse infusiooni teel soolalahusega (0,9 protsenti), millele järgnes 4 protsenti paraformaldehüüdi (PFA), pH 7,4. Pärast intrakardiaalset perfusiooni koguti ajud kokku ja fikseeriti 4-protsendilises PFA-s 24 tundi 4 kraadi juures, sisestati parafiini ja lõigati 5 µm koronaalseteks osadeks, mis hõlmasid kogu musta aine kompaktset osa (SNpc) ja juttkeha (ST) (anteroposterior). tasemed: Bregma –2,92 mm kuni –3,64 mm ja pluss 0,02 kuni pluss 0.{20}} mm) hiire ajuatlase abil (Franklin ja Paxinos, 1996).

Veel 5 looma igas rühmas tapeti emakakaela dislokatsiooniga ning nende ventraalse keskaju ja juttkeha kuded lõigati kiiresti jääl (Jackson-Lewis ja Przedborski, 2007), külmutati vedelas lämmastikus ja säilitati -80 kraadi juures kuni kasutamiseni.

ehhinakosiidsisseCistancheonNeurotroofnejaneuropäästemõjud pealeParkinsoni tõbihaigus

4.5. Türosiinhüdroksülaas ja Nissli immunohistokeemia

Ajukudede immunohistokeemia viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud (He et al., 2008; Yokoyama et al., 2008) väikeste muudatustega. Lühidalt, üks sektsioonide komplekt läbi SNpc (koosneb 14–15 sektsioonist) valmistati ette Nissli värvimiseks (kresüülvioletne), kasutades rutiinseid protseduure, samal ajal kui töödeldi teist komplekti läbi SNpc ja ühte läbi ST (koosneb 15–16 sektsioonist). türosiinhüdroksülaasi (TH) immunohistokeemia jaoks. Viimaseid sektsioone inkubeeriti endogeense peroksidaasi aktiivsuse eemaldamiseks 0,3 protsendi vesinikperoksiidiga (H2O2) 10 min toatemperatuuril ja seejärel pandi blokeerimispuhvrisse, mis sisaldas 10 protsenti kitse seerumit 0,2 protsenti Triton X-100-ga 0,01 M PBS-is (pH 7,2) 30 minutit 37 kraadi juures. Igas töötlemises pesti slaide vähemalt kolm korda 0, 01 M PBS-ga 5 minuti jooksul. Seejärel inkubeeriti neid 4 kraadi juures üleöö hiire TH-vastase monoklonaalse antikehaga (Sigma, USA) lahjenduses 1:2000 0,01 M PBS-is, mis sisaldas 1 protsenti kitse seerumit ja 0,2 protsenti Triton X-i -100. Teisel päeval töödeldi sektsioone 30 minutit biotinüülitud hiirevastase IgG-ga ja seejärel töödeldi streptavidiini-peroksidaasi kompleksiga (ABC komplekt, Vector, USA). Peroksidaasi reaktsiooni visualiseeriti 0,05% diaminobensidiini (DAB) ja 0,03% H2O2-ga Tris-HCl puhvris. SNpc-d läbivad lõigud värviti anatoomiliseks võrdluseks kresüülvioletiga (Sigma, USA). Kontrollide jaoks töödeldi sektsioone ülalkirjeldatud viisil, välja arvatud see, et primaarset antikeha ei kasutatud. Kontrollsektsioonid olid immunonegatiivsed

4.6. TH-immunoreaktiivsete neuronite ja kiudude kvantifitseerimine

Iga kümnendat sektsiooni (kokku 14–15 sektsiooni) läbi SNpc, mis vastab Bregmale –2,92 mm kuni –3,64 mm, analüüsiti Olympus BX51 mikroskoobi abil koos DP71 kaameraga (Olympus, USA). Pärast SNpc piiritlemist väikese suurendusega (4-kordne objektiiv) vastavalt hiire aju atlasele loendati kaks vaatlejat, kes olid pimedad suurema suurendusega (20-kordne objektiiv) paremas servas olevad Nissl-värvitud ja TH-immunoreaktiivsed rakud. . Mõlemad TH-positiivsed (TH ja kresüülvioletsed positiivsed) ja Nissl-värvitud (kresüülvioletsed positiivsed) rakud koos tuumaga loendati, et tagada raviefektide seos TH-rakkude suurenemisega, mitte ensüümi ülesreguleerimisega. Pange tähele, et TH-immunoreaktiivsete profiilide analüüsid piirdusid SNpc-ga ja jätsid seega välja ventraalse tegmentaalse piirkonna.

Striataalsete dopamiinergiliste kiudude optilist tihedust (OD) analüüsiti arvutis, kasutades tarkvara Image-Pro Plus, järgides eelnevalt kirjeldatud optilise dissektori meetodit (Burke et al., 1990; Wu et al., 2{). {5}}02). Iga piirkonna keskmine märgistus arvutati sama looma viie automaatselt sobitatud ajulõigu põhjal, mis vastavad hiire ajuatlasele Bregma pluss 0,38 mm– pluss 0,50 mm (n= 5 iga rühm). Striataalsete kujutiste parem pool saadi sama suurendusega (10 × objektiiv) ja seega hinnati värvimise OD-d kogu sektsioonide piirkonnas automaatselt. Igast mõõtmisest lahutati TH-värvimiseta corpus callosumi tausta intensiivsused.

4.7. TUNELi analüüs

Hiire ajuatlase abil koguti aju koronaallõigud läbi SNpc, mis vastavad Bregmale –2,92 mm kuni –3,64 mm (Franklin ja Paxinos, 1996). Vähemalt ühte igast 10 sektsioonist (kokku 14–15 sektsiooni) igast loomast töödeldi fragmenteeritud DNA värvimise (TUNEL) in situ lõppmärgistamiseks, kasutades In Situ rakusurma tuvastamise komplekti, AP (Roche, Saksamaa) vastavalt standardile. tootja juhised ja kirjandus väikeste muudatustega (Novikova et al., 2006; He et al., 2008). Negatiivsed kontrollid viidi läbi paralleelselt ilma terminaalse desoksünukleotidüültransferaasita. Lõigud värviti lõpuks hematoksüliiniga. TUNEL-positiivsete rakkude koguarv ühel slaidil (kokku 14–15 sektsiooni paremal pool) igalt loomalt loendati pimesi valgusmikroskoobi all 20-kordse objektiivi suurendusega SNpc anatoomilistes piirides.

4.8. HPLC

Striataalset kudet analüüsiti DA ja selle metaboliitide tasemete suhtes, kasutades kõrgsurvevedelikkromatograafiat (HPLC) Coulochem III süsteeme koos elektrokeemilise detekteerimisega (ESA Inc., Chelmsford, MA), nagu eelnevalt kirjeldatud väikeste modifikatsioonidega (Petroske et al., 2{{). 4}}{{10}}1; Schneider et al., 2006). Lühidalt, juttkeha lõigati välja ja kaaluti (vasakul pool), pandi plasttorudesse, homogeniseeriti ultraheliga 10 sekundit 0,4 M perkloorhappes ja tsentrifuugiti kiirusel 15, 000 pööret minutis 20 minutit 4 kraadi juures. Supernatandid juhiti läbi 0{11}}μm millipoorfiltri. Liikuv faas, mis koosnes 100 mM NaH2PO4, 50 mM sidrunhappest, 6% metanoolist, 1,7 mM 1-oktaansulfoonhappest, 50 μM EDTA-st, 10% atsetonitriilist, juhiti kohale voolukiirusel 0,6 ml/min 25 kraadi ümberpööratud faasi kolonni suhtes. Supernatandi lahuse 20 ul alikvoodid süstiti HPLC automaatse proovivõtturiga, mille jahutusmoodul oli seatud 4 kraadile. Andmed kalibreeriti välise standardiga. Dopamiini ja selle metaboliitide tasemed arvutati ja väljendati ng/mg koe massi kohta.

4.9. Reaalajas PCR

Kogu RNA eraldati ventraalse keskaju külmutatud koe homogeniseerimisel (vasakul pool) 1 ml Trizol reagendis (Invitrogen, USA), millele järgnes isopropanooli sadestamine (n= 5). Pelleteid pesti 70% etanooliga ja suspendeeriti RNaasi-vabas vees ning RNA kontsentratsioon määrati GeneQuant RNA/DNA kalkulaatoriga (Amersham Biosciences, NJ). RNA (1 ug) võeti matriitsina ja täielik cDNA süntees viidi läbi PrimeScriptTM RT reagendi komplekti (Takara, Jaapan) abil. SYBR Green PCR amplifikatsioon viidi läbi Realplex4 S Real-time PCR instrumendis (Eppendorf, Saksa; Premix Ex TaqTM, Takara). Endogeense kontrollina märgistati -aktiin reportervärviga. Termotsüklilise profiili tingimused olid järgmised: 95 kraadi 3 min esialgne denatureerimine, seejärel 40 tsüklit 95 kraadi 15 s denaturatsiooni, 61 kraadi 15 s lõõmutamist, lõpliku pikendusega 72 kraadi 45 s. Suhtelised voldimuutused määrati eelnevalt kirjeldatud 2−ΔΔCt meetodil (Livak ja Schmittgen, 2001). Praimerite järjestused olid järgmised tabelis 2. Kõik praimerid kujundati vastavalt asjakohasele kirjandusele ja sünteesis Genemed Company.

4.10. Western blot

Western blot analüüsi jaoks homogeniseeriti RIPA puhvris (5{{9}). } mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% naatriumdeoksükolaati, 0,1% SDS ja naatriumortovanadaat, naatriumfluoriid, EDTA, leupeptiin) ja tsentrifuugiti temperatuuril 13,000 rpm 4 kraadi juures 5 min. Supernatandi valgu kogusisaldus määrati BCA valguanalüüsi komplekti kasutades spektrofotomeetriga ning see lahjendati homogeniseerimispuhvri ja valgu solubiliseerimislahusega sobiva lõppkontsentratsioonini. Proovi keedeti 3 minutit ja 20 ul (sisaldas 30 ug valku) igast proovist kanti elektroforeesiks SDS polüakrüülamiidi (10 protsenti) geelile. Geeli töödeldi 2 tundi pingel 80 V, seejärel kanti elektroforeetiliselt nitrotselluloosmembraanile ülekandepuhvris, kasutades Trans-Blot SD (Bio-Rad) 20 V juures 1,5 tundi, seejärel blokeeriti 1,5 tunni jooksul sukeldamisega TBST-sse, mis sisaldas 1 protsenti BSA-d. toatemperatuuril ja inkubeeriti 4 kraadi juures üleöö vastavate primaarsete antikehadega: küüliku anti-DAT (1:200, Chemicon International Inc, USA), hiire anti-GDNF, BDNF (1:200, Santa Cruzi biotehnoloogia, USA), hiire anti-DAT. Bax, Bcl-2, -aktiin (1:1000, Santa Cruz). Pärast kolm korda 10-minutilist loputamist TBST-s inkubeeriti blotte 2 tundi toatemperatuuril konjugeeritud küülikuvastase IgG-peroksidaasiga (1:2000, Santa Cruz). Immunoreaktiivsus visualiseeriti ECL fluorestsentsi tuvastamise süsteemiga (GE, USA). Blotid skaneeriti seadmega KODAK In-Vivo Multispectral Imaging Systems FX (Carestream Health, USA) 5-minutilise säriajaga ja CCD hankis pildid automaatselt. Valguribade intensiivsust mõõdeti densitomeetria abil ja väljendati suhtena -aktiini intensiivsusse, et tagada, et valkude taseme muutused ei ole tingitud lihtsalt proovi laadimise erinevustest (Matsunaga et al., 2006).

4.11. Statistilised analüüsid

Kõik andmed esitati kui keskmine ± SEM. Statistilistel eesmärkidel viidi läbi ühesuunaline ANOVA, millele järgnes Tukey HSD post-hoc analüüs ja Student-Newman-Keulsi mitme võrdluse test. Väärtus p< 0.05="" was="" considered="" statistically="">

Tänuavaldused

Seda tööd toetasid teaduslik ja tehniline tugiprogramm, Hiina teadus- ja tehnoloogiaministeerium (nr 2006BAI04A11-3) ja Shanghai linnavalitsus (nr 2007- 057). Täname professor Fang Huangi ja professor Danian Zhu nende juhendamise eest katsete ja käsikirja kohta.

ehhinakosiidsisseCistancheonNeurotroofnejaneuropäästemõjud pealeParkinsoni tõbihaigus

Alates: ' Neurotroofsed ja neurorescue-efektidehhinakosiidalaägedas MPTP hiiremudelisParkinsoni tõbihaigus' kõrvalQing Zhao jt

---AJUUURINGUD 1346(2010)224-236