Treeningu ja MitoQ neuroprotektiivsed eelised mälufunktsioonile, mitokondriaalsele dünaamikale, oksüdatiivsele stressile ja neuropõletikule D-galaktoosist põhjustatud vananevatel rottidel 2. osa

2.6. Kudede ettevalmistamine

Pärast 8-nädalaste TE- ja mälukäitumise testide lõpetamist surmati kõik rotid CO2 sissehingamise teel ja igas ravirühmas koguti 7 loomalt ajukude.

Mälu käitumise test on tõhus vahend mälu hindamiseks. Suureneva sotsiaalse ja töösurve tõttu muutub inimeste mälu üha olulisemaks. Seetõttu võib mälukäitumise testi tegemine aidata meil mõista oma mälu taset ja võtta tõhusaid meetmeid mälu parandamiseks ja säilitamiseks vastavalt testi tulemustele.

Täpsemalt võivad mälukäitumise testid hinnata inimeste võimet teavet vastu võtta, töödelda, salvestada ja hankida. Inimeste mälu saab täielikult testida erinevat tüüpi teabe (nt keele, numbrite, kujutiste jne) testimisega. Testi tulemused annavad erinevaid hindeid, mis aitavad meil mõista oma nõrkusi ja tugevaid külgi ning kuidas oma mälu tugevdada.

Praktikas annavad paljud mälukäitumise testid ka professionaalseid näpunäiteid ja soovitusi. Näiteks hea uni, tasakaalustatud toitumine, korralik treening ja regulaarne ajuharjutus on kasulikud inimeste mälu parandamiseks. Nende meetodite abil saame parandada oma mälu säilivusaega, mälu taasesitamise võimet ja muid aspekte, et paremini kohaneda igapäevaelu või töövajadustega.

Lühidalt öeldes on mälukäitumise test väga kasulik mälu mõistmiseks, hindamiseks ja parandamiseks. Samuti peaksime kasutama asjakohaseid meetodeid, et tugevdada oma mälu vastavalt meie tegelikule olukorrale, et rajada kindel alus täisväärtuslikumale ja rikkamale elule. On näha, et me peame parandama mälu ja Cistanche võib oluliselt parandada mälu, sest Cistanche on traditsiooniline Hiina ravimmaterjal, millel on palju ainulaadseid toimeid, millest üks on mälu parandamine. Cistanche toime tuleneb selles sisalduvatest erinevatest toimeainetest, sealhulgas parkhape, polüsahhariidid, flavonoidglükosiidid jne. Need koostisosad võivad aju tervist mitmel viisil edendada.

Klõpsake käsul Tea lühiajalist mälu, kuidas parandada

Pärast ajukoore ja hipokampuse eraldamist külmutati ajukude vedelas lämmastikus ja hoiti kuni analüüsimiseni temperatuuril –80 ◦C. Ülejäänud 5 looma kasutati immunohistokeemia (IHC) analüüsiks.

Pärast rinnaõõne avamist lasti 50 mM fosfaatpuhverdatud soolalahust (PBS) läbi vasaku vatsakese 10 minuti jooksul ja seejärel perfuseeriti looma 4% paraformaldehüüdiga (PFA) 100 mM PBS-is.

Pärast perfusiooni fikseerimist koguti aju, asetati 4% PFA-sse ja fikseeriti 4 tundi temperatuuril 4 °C. Fikseeritud ajukude sukeldati 2 päevaks 30% sahharoosilahusesse ja seejärel lõigati krüostaadi abil 40 µm paksusteks viiludeks ( Leica Microsystems, Nussloch, Saksamaa).

2.7. Mitokondrite isoleerimine

Mitokondrite isoleerimiseks kasutasime vastavalt tootja juhistele Mitokondrite ekstraktsioonikomplekti (IMGENEX Corporation, San Diego, CA, USA). Iga 100 mg hipokampuse koe kohta lisati 1 ml homogeniseerivat puhvrit.

Pärast homogeniseerimist tsentrifuugiti kude 900 × g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C, supernatant koguti ja tsentrifuugiti uuesti 15,000 × g juures 30 minutit temperatuuril 4 °C.

Võttes tsentrifuugitud tsütosoolfraktsiooni, tsütosool eraldati ja järelejäänud pellet segati põhjalikult 1 ml suspensioonipuhvris, enne kui tsentrifuugiti 15, 000 × g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C.

Supernatant eemaldati ja enne põhjalikku segamist lisati veel 1 ml suspensioonipuhvrit ja tsentrifuugiti uuesti 15,000 × g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C.

Supernatant eemaldati ja järelejäänud pellet lahustati 1 ml täielikus mitokondriaalses lüüsipuhvris 30 minutit temperatuuril 4 °C. Seejärel tsentrifuugiti mitokondri ekstrakti 15,000 × g juures 5 minutit temperatuuril 4 °C ja supernatant (mitokondriaalne fraktsioon) koguti.

2.8. Western Blotting
Mitokondriaalse isoleerimisega saadud kogu valk kvantifitseeriti Bradfordi meetodi abil. Võrdne kogus mitokondriaalseid valke (30 µg raja kohta) laaditi naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesile (SDS-PAGE) (8% või 12%).

Pärast elektroforeesi kanti valgud polüvinülideenfluoriidi (PVDF) membraanile (Millipore, Boston, MA, USA).

Blokeerimine viidi läbi 1 tund toatemperatuuril, kasutades 1 × Tris-puhverdatud soolalahust, mis sisaldas Tween-20 (TBS-T) lahust koos 5% BSA-ga, ja seejärel pandi membraan reageerima primaarsete antikehadega üleöö temperatuuril 4 °C.

Kasutati järgmisi primaarseid antikehi: Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p22 phox, p47 phox, gp91phox, SOD-2, katalaas ja -aktiin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, lahjendus:1 :1000); ja TNF- (Abcam, Cambridge, UK, lahjendus: 1:1000).

Seejärel pesti membraane pesupuhvriga (PBS koos 0,1% Tween 20-ga), misjärel neid inkubeeriti mädarõika peroksidaasiga (HRP) konjugeeritud kitse küülikuvastaste sekundaarsete antikehadega forp22 phox, gp91 phox ja TNF. - (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, lahjendus: 1:5000).

HRP-konjugeeritud kitse hiirevastaseid sekundaarseid antikehi kasutati Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p47 phox, SOD-2, katalaasi ja -aktiini jaoks (Santa Cruzi biotehnoloogia, lahjendus: 1:5000).

Valgu ekspressioonitasemed tuvastati ECL Western blot tuvastamise süsteemi (Santa Cruz Biotechnology) abil. Arenenud valguribade tihedust analüüsiti ChemiDoc XRS geelkuvamissüsteemi abil (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

2.9. Immunohistokeemia (IHC)
IHC analüüsi jaoks kasutati igas ravirühmas valitud koe jaoks vabalt ujuvat meetodit. Pärast koe pesemist 3x 10 min iga kord 0,01 M PBS-s, inkubeeriti kudet 80 ◦C juures 60 minutit keeduklaasis, mis sisaldas 0,01 M naatriumtsitraati, millele järgnes blokeerimine 10% lahuses. tavaline eesli seerum (Millipore Sigma, Burlington, MA, USA).

Seejärel pandi koeproov reageerima primaarsete anti-p22-phox-antikehadega (Santa Cruzi biotehnoloogia, lahjendus: 1:5{11}}0) ja anti-gliali fibrillaarse happelise valguga (GFAP) (Abcam, lahjendus: 1:500) 12-ks. h 4 ◦C juures. Järgmisel päeval pesti kude 3 korda 5 minutit iga kord 0, 01 M PBS-is ja seejärel pandi 2 tundi toatemperatuuril reageerima HRP-ga konjugeeritud kitse hiirevastase sekundaarse antikehaga (Santa Cruz Biotechnology, lahjendus: 1:5000).

Lõpuks inkubeeriti kude toatemperatuuril, kasutades Vectastain-Elite ABC komplekti (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) lahust ja tulemused visualiseeriti DABPeroxidase Substrate Kit (Vector Laboratories) abil.

Iga koelõik paigaldati slaidile, kasutades paigalduskeskkonda (Vector Laboratories) ja kontrolliti valgusmikroskoobiga (Leica Microsystems).

2.10. Statistilised analüüsid

Andmeid analüüsiti, kasutades SPSS for Windows Version 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kõik väärtused on väljendatud keskmisena ± SEM. Statistiline olulisus määrati ühesuunalise ANOVA abil. Mitme võrdluse jaoks kasutati Bonferroni post hoc teste. Erinevusi peeti statistiliselt olulisteks p < 0,05.

3. Tulemused

3.1. Jooksuriharjutuse ja MitoQ mõju mitokondriaalse dünaamikaga seotud valkude ekspressioonile D-Gal-indutseeritud vananevate rottide hipokampuses

Kontrollisime, et TE ja MitoQ mõjutasid vananevate rottide hipokampuses mitokondriaalseid fusiooniga seotud tegureid (Mfn1, Mfn2, Opa1) ja lõhustumisega seotud tegureid (Drp1, Fis1) (joonis 1).

Mitokondriaalse fusiooniga seotud tegurite ekspressioonitasemed erinesid oluliselt ravirühmade vahel (Mfn1, F4, 34=134.750, p < 0.001; Mfn2, F4, 34=80). 816, p < 0,001;Opa1, F4, 34=51.456, p=0.001).

Mitokondriaalse lõhustumisega seotud tegurite ekspressioonitasemed erinesid oluliselt ka ravirühmade vahel (Drp1, F4, 34=53.448, p < 0.001; Fis1, F4,34=116 0,313, p < 0,001). Post hoc testi tulemused on näidatud joonisel 1.

Võrreldes Y-CON rühmaga vähenes mitokondriaalse fusiooniga seotud tegurite ekspressioon D-CON rühmas ja näitas D-TE, D-MI ja D-COMBI rühmades kasvavaid suundumusi.

Teisest küljest suurenes mitokondriaalse lõhustumisega seotud faktori Drp1 ekspressioon D-CON rühmas võrreldes Y-CON rühmaga. Kuigi mitokondriaalse lõhustumise signaalid vähenesid kombineeritud raviga TE-ga, ei põhjustanud MitoQ-ravi üksi olulisi muutusi.

Teine mitokondriaalse lõhustumisega seotud tegur Fis1 näitas samu vähenemistrende kui Drp1, kuid seda vähendas ka ainult MitoQ-ravi.

Joonis 1. Jooksuraja treeningu ja mitokinooni (MitoQ) mõju mitokondriaalse dünaamikaga seotud valkude ekspressioonile D-galaktoosi (D-gal) indutseeritud vananemise rottide hipokampuses. (A) mitokondriaalse fusiooni ja lõhustumisega seotud valkude tüüpilised Western blotid. (B – F) Western blot ribade densitomeetriline analüüs, mis on normaliseeritud aktiiniks. Western blot'is näidatud andmed on seitsme roti aju keskmised.

- Aktiini uuriti sisekontrollina. Pärast ANOVA-d kasutati Bonferroni post hoc testi. Väärtused on keskmised ± SEM.

a Tähistab statistilist erinevust noore kontrollrühma (Y-CON) rühmast. b Tähistab statistilist erinevust D-galaktoosi rühma (D-CON) rühmast. c Tähistab statistilist erinevust D-galaktoosi pluss jooksulindi treeningu (D-TE) rühmast.

d Tähistab statistilist erinevust D-galaktoosi pluss MitoQ (D-MI) rühmast (p < 0,05). D-COMBI; D-galaktoos pluss TE ja MitoQ rühm.

3.2. Jooksulindi harjutuste ja MitoQ mõju NADPH oksüdaasi alaühikute ekspressioonile D-Gal-indutseeritud vananevate rottide ajukoores ja hipokampuses

Täheldasime olulisi erinevusi ravirühmade vahel p22-phoxi immunoreaktiivsuses vananevate rottide ajukoores ja hipokampuses (joonis 2) (CA3,F4, 24=18.786, p < 0.{11) }}01; ajukoor, F4, 24=12.662, p < 0,001).

Ajukoores näitasid D-CON rühmad p22 phoxi immunoreaktiivsust võrreldes Y-CON rühmaga, mis D-TE, D-MI ja D-COMBI rühmades oluliselt vähenes.

CA3-s vähenes p22-phoxi suurenenud immunoreaktiivsus D-TE ja D-COMBI rühmades võrreldes D-CON-iga. NOX-i subühikute p22 phox, gp91 phox ja p47phox valgu ekspressioonitasemed erinesid rühmade lõikes oluliselt (p22 phox, F4, {{10}}.513, p < 0.{{24} }01; gp91 phox, 34=57.282, p < 0,001; F4, 34=69.249, p < 0,001).

Post hoctesti tulemused näitasid NOX subühiku taseme olulist tõusu D-CONis võrreldes Y-CONiga. Siiski olid NOX-i subühiku tasemed kõigis sekkumisrühmades madalamad kui D-CON rühmas.

Eelkõige vähenes p22 phoxi ja gq91 phoxi ekspressioon D-TE-s võrreldes D-MI rühmaga oluliselt. Need leiud viitavad sellele, et harjutus ja MitoQ hoiavad eraldi ära vananemisest põhjustatud oksüdatiivse stressi ajus, kuid nende kombinatsioon ei too kaasa täiendavaid mõjusid.

Joonis 2. Jooksuraja treeningu ja MitoQ mõjud NADPH oksüdaasi subühikute ekspressioonile D-gal indutseeritud vananevate rottide ajukoores ja hipokampuses. (A1) Mikrofotod, mis näitavad NAPDH p22 phox immunoreaktiivsust D-gal-indutseeritud vananemisrakkude ajukoores ja hipokampuses igas rühmas. Mustad ristkülikud A1-s näitavad kujutiste osa, nagu on näidatud f–i ja p–t. (A2, A3) NADPH p22 foksiga värvimise optilise tiheduse kvantifitseerimine ajukoores ja hipokampuses.

Bonferroni post hoc test pärast ANOVA-d. Väärtused on esitatud keskmistena ± SEM. (n=5 looma). (a–e ja k–o) Skaalariba=100 µm, (f–j ja p–t) Skaalariba=50 µm. (B) Tüüpilised Western blot kujutised NADPH oksüdaasi alaühikute jaoks hipokampuses.

(C – E) NADPH oksüdaasi subühikute kvantifitseerimine hipokampuses. Western blot'is näidatud andmed olid seitsme roti aju keskmised. - Aktiini uuriti sisekontrollina. Pärast ANOVA-d kasutati Bonferroni post hoc testi. Väärtused on keskmised ± SEM.

a Tähistab statistilist erinevust Y-CON rühmast. b Näitab statistilist erinevust D-CON rühmast. c Tähistab statistilist erinevust D-TE rühmast. (p < 0,05).

3.3. Jooksuriharjutuse ja MitoQ mõju GFAP-i ekspressioonile D-Gal-indutseeritud vananevatel rottidel ajukoores ja hipokampuse hambumuses

Täheldasime olulisi erinevusi ravirühmade vahel GFAP immunoreaktiivsuses vananevate rottide ajukoores ja hipokampuse dentate gyrus (DG) (joonis 3) (Cortex, F4, 24=13.524, p < 0.001 ; DG, F4, 24=30.364).

Post hoc testi tulemused näitasid, et D-gal-ravi suurendas oluliselt GFAP-i immunoreaktiivsust nii ajukoores kui ka DGG-s.

Võrreldes D-CON rühmaga vähenesid GFAP tasemed ajukoores kõigis sekkumisrühmades ja GFAP tasemed DG-s D-TE ja D-COMBI rühmades, samas kui D-MI rühmas ilmnes erinevusi ainult GFAP immunoreaktiivsuses. ajukoore piirkonnas.

Seega, kuigi TE või MitoQ ravi vähendas D-gal-indutseeritud neuropõletikku ajukoores, andis ainult TE sekkumine DG-s positiivseid mõjusid.

For more information:1950477648nn@gmail.com