Nc886, mittekodeeriv RNA, on uus biomarker ja raku vananemise epigeneetiline vahendaja fibroblastides

Abstraktne:

Organismide ja inimmudelite funktsionaalsed uuringud on näidanud, et epigeneetilised muutused võivad oluliselt mõjutada vananemisprotsessi. Mittekodeeriv RNA (ncRNA), üks epigeneetilistest regulaatoritest, mängib olulist rolli mRNA-de ja nende valkude ekspressiooni muutmisel. See võib vahendada rakkude fenotüüpi. On teatatud, et nc886 (=vtRNA2-1 või pre-miR-886), pikk ncRNA, võib pärssida kasvaja moodustumist ja UVB poolt põhjustatud keratinotsüütide fotokahjustusi. Selle uuringu eesmärk oli kindlaks teha nc886 roll fibroblastide replikatiivses vananemises ja teha kindlaks, kas ained, mis on võimelised kontrollima nc886 ekspressiooni, võivad reguleerida raku vananemist.

Replikatiivsetes vananevates fibroblastides vähenes nc886 ekspressioon, samas kui metüülitud nc886 suurenes. Vananemise biomarkerites, sealhulgas SA- -gal aktiivsuses ja p16INK4A ja p21Waf1/Cip1 ekspressioonis vananevates rakkudes, toimusid muutused. Need leiud näitavad, et vananemisega seotud nc886 vähenemine on seotud fibroblastide raku vananemisega ja et nc886 ekspressiooni suurenemine võib rakkude vananemist pärssida. AbsoluTea kontsentraat 2.{11}} (ATC) suurendas nc886 ekspressiooni ja parandas fibroblastide raku vananemist, inhibeerides vanusega seotud biomarkereid. Need tulemused näitavad, et nc886 võib olla uus vananemisvastane sihtmärk ja et ATC võib olla võimas epigeneetiline vananemisvastane koostisosa.

Rakkude vananemine on lai mõiste, mis hõlmab selliseid nähtusi nagu vähenenud rakufunktsioon, vähenenud proliferatsioonivõime ja paljude tegurite põhjustatud DNA kahjustus. Rakkude vananemine ei ole üksainus etteaimatav protsess, vaid erinevate füsioloogiliste, geneetiliste ja keskkonnategurite koosmõju. Uuringus leiti, et Cistanche suudab vananemisele vastu seista, kuna Cistanche vananemisvastane põhimõte on peamiselt seotud selles sisalduvate erinevate toimeainetega. Cistanche on rikas mitmesuguste bioloogiliselt aktiivsete ainete poolest, nagu polüsahhariidid, flavonoidid, atsetofenoonid jne. Nende hulgas on polüsahhariid Cistanche üks peamisi toimeaineid, millel on erinevad tervisefunktsioonid, nagu immuunsuse tugevdamine, oksüdatsioonivastane toime, reguleerivad ainevahetust jne ning võivad leevendada organismi vananemisastet.

Click cistanche tubulosa eelised

Märksõnad:

fibroblastid; replikatiivne vananemine; epigeneetiline regulatsioon; nc886; rohelise tee ekstrakt.

1. Sissejuhatus

Rakkude proliferatsiooni peatamise järgselt pöördumatus olekus rakkude vananemine on kujunenud potentsiaalselt oluliseks kudede düsfunktsiooni ja organismide vananemise soodustajaks [1]. Vananemist iseloomustab vananemisega seotud beeta-galaktosidaasi (SA- -gal) kõrge aktiivsus, vananemise biomarkerite, nagu p16INK4A ja p21Waf1/Cip1, ekspressiooni suurenemine ning LaminB1 ekspressiooni vähenemine [2]. Rakkude vananemist on kahte peamist tüüpi: replikatiivne vananemine ja stressist põhjustatud enneaegne vananemine. Replikatiivne vananemine on defineeritud kui nähtus, kui normaalsed rakud lõpetavad jagunemise pärast piiratud arvu jagunemiste saavutamist. See on seotud kronoloogilise vananemisega. Pidev kahjustuste kuhjumine võib indutseerida fibroblastide replikatiivset vananemist, mis viib rakuvälise maatriksi (ECM) ümberkujundamise ja korrastamise võime kaotamiseni. Vananenud dermise peamised tunnused on kollageenkiudude vähenemine ja maatriksi metalloproteinaaside (MMP) suurenenud tootmine, mis aitavad kaasa dermise õhukesele ja ebakorrapärasele struktuurile [3,4].

Epigeneetilised regulatsioonimehhanismid on vananemisprotsessi peamised vahendajad, kohanedes stressorite ja vanusega seotud muutustega genoomses ja molekulaarses keskkonnas. Need epigeneetilised muutused toimuvad erinevatel tasanditel, sealhulgas tuuma histooni massiline redutseerimine, histooni deformatsioon translatsioonijärgse modifikatsiooni ja DNA metüülimise teel, kanooniliste histoonide asendamine histooni variantidega ja mittekodeeriva RNA (ncRNA) muutunud ekspressioon organismi ja replikatiivse vananemise ajal [5] ,6]. nc886 on 101 nukleotiidi pikkune ncRNA, mis suudab seonduda sihtvalguga, vahendades seega valgu aktiivsust ja kontrollides geeniekspressiooni [7]. nc886 on pakutud ka kasvaja supressorina, mis tuleneb suuresti selle ekspressioonimustrist ja genoomsest asukohast inimese kromosoomis 5q31, kasvaja supressorgeeni lookuses. nc886 ekspressiooni tunnuseks on pahaloomuliste kasvajate sagedane vaigistamine CpG DNA metüülimise teel promootorpiirkonnas [8]. Varasemate uuringute põhjal oleme leidnud, et UVB-kiirgusest põhjustatud nc886 ekspressiooni vähenemine on seotud COX-2 ja MMP-9 suurenemisega keratinotsüütides proteiinkinaasi RNA-aktiveeritud (PKR) raja kaudu ja et nc886 ekspressiooni edendamine võib olla kasulik strateegia UVB-kaitsematerjalide väljatöötamiseks [9, 10].

Rohelist teed on uuritud mitmesuguste dermatoloogiliste seisundite, näiteks akne, rosaatsea, psoriaasi, viiruslike tüükade ja isegi nahavähi raviks. Fenoolsed ühendid, sealhulgas gallushape (GC) ja epigallokatehhiingallaat (EGCG), on rohelises tees hästi tuntud aktiivsed ühendid. (-)-Epigallokatehhiin-3-(3"-O-metüül)gallaat (3" Me-EGCG) on ainulaadne O-metüülitud EGCG vorm ning seda leidub oolongi tees ja rohelises tees. Eelkõige sisaldab Jangwon No. 3 (Amorepacific rohelise tee sordid) rohkem 3-tollist Me-EGCG-d kui teised rohelise tee sordid [11]. On teatatud, et 3-tollisel Me-EGCG-l on keratinotsüütidele antioksüdantne ja fotokaitsev toime [12]. . Selles uuringus uurisime nc886 rolli fibroblastide replikatiivses vananemises ja tegime kindlaks, kas kõrge kontsentratsiooniga rohelise tee 3-tolline Me-EGCG preparaat (AbsoluTea Concentrate 2.0), mis võib suurendada nc886 ekspressiooni, võib parandada rakkude vananemist.

2. Tulemused

2.1. AbsoluTea kontsentraadi 2 keemiline profiil.0 (ATC)

AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) keemiline profiil on näidatud joonisel 1B. Tulemused saadi HPLC abil ATC jaoks, mis valmistati meetodi jaotises kirjeldatud viisil. ATC sisaldas 30% või rohkem 3" Me-EGCG-d (joonis 1B). On teada, et rohelise tee ekstrakt ei sisalda 3" Me-EGCG-d või selle kontsentratsioon on alla 6 protsendi [13,14]. Nii noortel kui ka vananevatel fibroblastidel, mida raviti ATC-ga, suurenes nc886 ekspressioon rohkem kui neil, mida raviti 70-protsendilise rohelise tee etanooliekstraktiga (täiendav joonis S1A). Lisaks vähenesid SA- -gal ekspressioonitasemed ATC-ga töödeldud vananevates fibroblastides rohkem kui rohelise tee ekstraktiga ravitud patsientidel (täiendav joonis S1B).

2.2. nc886 Reguleerib fibroblastide rakulist vananemist

Et jälgida nc886 rolli fibroblastide rakulises vananemises, kasutasime kasvatamise ja subkultuuri kaudu replikatiivset vananemismudelit. Nagu on näidatud lisajoonisel S2, suurenes SA- -gal aktiivsus ja vananevate markerite p16INK4A ja p21Waf1/Cip1 ekspressioonitasemed ning vananevates fibroblastides vähenes B1 ekspressioon võrreldes noorte rakkudega. Paljud varasemad uuringud on teatanud, et vananemist põhjustab oksüdatiivne stress. Kinnitamaks, kas see oksüdatiivse stressi seeria on seotud rakkude vananemisega, mõõdeti noorte (p3) ja vananevate fibroblastide (p30) ROS-i taset. Tulemused näitasid, et ROS-i tase tõusis vananemisega (täiendav joonis S2D).

Et jälgida nc886 potentsiaalset mõju rakkude vananemisele fibroblastides, määrati nc886 geeniekspressiooni tase igas passaažis. Nc886 ekspressiooni tase vähenes passaažide arvu suurenemisega (joonis 2A). On teatatud, et nc886 ekspressioon väheneb CpG saarte metüleerimisega. Et teha kindlaks, kas nc886 alareguleerimist vananevates fibroblastides vahendas nc886 metüülimine, viidi läbi metülatsioonispetsiifiline PCR. Nagu on näidatud joonisel fig 2A, suurendati nc886 metüülimist passaažide arvu suurenemisega (joonis 2A). See tulemus näitab, et nc886 vähenenud ekspressioon suurel arvul fibroblastidel on tingitud nc886 DNA metüülimise suurenemisest. Et kontrollida nc886 rolli fibroblastide vananemises, määrati muutused vananemismarkerites nc886 üleekspressiooni ja knock-down mudelites. Tulemused näitasid, et nc886 üleekspressiooniga vananevate fibroblastide rühm näitas SA-beeta-gal aktiivsuse vähenemist, p16INK4A ja p21Waf1/Cip1 ekspressioonitaseme langust ning laminB1 suurenenud taset.

Lisaks vähendas nc886 üleekspressioon ROS-i suurenemist vananevates fibroblastides (joonis 2B). Seevastu noorte fibroblastide rühmas, millel oli nc886 knock-down, kiirenes rakkude vananemine ja raku vananemismarkerite, nagu p16INK4A ja p21Waf1 / Cip1, ekspressioonitasemed tõusid (joonis 2C). Need tulemused viitavad sellele, et nc886 võib reguleerida fibroblastide rakulist vananemist, reguleerides vananemismarkerite ekspressiooni (joonis 2B, C).

2.3. ATC leevendab raku vananemist, reguleerides nc886 ekspressiooni

Eespool saadud tulemused näitasid, et nc886 ekspressiooni suurenemine võib vananemismarkereid vahendades parandada rakkude vananemist. Et jälgida ATC mõju nc886 ekspressioonile, hinnati nc886 ekspressioonitaset ja metüülimist vananevates fibroblastides pärast töötlemist ATC-ga mittetsütotoksilises kontsentratsioonis (joonis 3A). Nagu on näidatud joonistel 3B ja C, suurendas ATC kontsentratsioonist sõltuval viisil oluliselt nc886 ekspressiooni ja vähendas nc886 metüülimist. See tulemus näitas, et nc886 ekspressiooni suurenemine ATC poolt oli vahendatud nc886 metüülimise inhibeerimise kaudu. Lisaks täheldasime, et ATC inhibeeris SA- -gal aktiivsust ja vähendas vananevates fibroblastides vananevate markerite p16INK4A ja p21Waf1/Cip1 ekspressioonitaset (joonis 3D, E). Kuid LaminB1 ekspressioon, mis teadaolevalt vähenes vananemisega, suurenes ATC-ga töödeldud vananevates fibroblastides (joonis 3E). Need tulemused näitavad, et ATC võib leevendada rakkude vananemist, suurendades nc886 ekspressiooni.

Joonis 2. nc886 reguleerib fibroblastide raku vananemist. (A) nc886 ja metüülitud nc886 ekspressioon vastavalt passaažile kinnitati reaalajas PCR-iga ja normaliseeriti 18s rRNA-ga. (B) Inimese genoomsest DNA-st amplifitseeritud ja puhastatud nc886 fragment transfekteeriti vananevatesse rakkudesse lipofektamiiniga 3000. Üleekspressiooni kinnitas nc886 ekspressiooni jälgimine reaalajas PCR abil ja SA- -gal ekspressiooni fluorestsentsmikroskoopia ja voolutsütomeetria abil. Vananemismarkervalgu ekspressiooni ja rakusisest ROS-i teket täheldati nc886 üleekspressioonimudelis. (C) Rakud transfekteeriti anti-oligodega (si-ctrl ja si-nc886) kontsentratsioonil 250 ppm, kasutades LipofectaminTM RNAiMAX reaktiivi. nc886 väljalangemist kinnitati, jälgides nc886 ekspressiooni reaalajas PCR abil ja SA- -gal ekspressiooni fluorestsentsmikroskoopia ja voolutsütomeetria abil. Vananemismarkerite ekspressioon kinnitati Western blot'iga. Skaalavardad: 200 µm. Andmed on esitatud kolme sõltumatu analüüsi keskmisena ± SD. *, p < 0,05; **, p < 0,01 võrreldes kontrolliga.

2.4. ATC reguleerib ECM-i ja SASP-i vanusega seotud muudatusi

Fibroblastide vananemisele on iseloomulik, et kollageeni lagundava komponendi MMP-1 aktiivsus suureneb, samas kui kollageeni süntees väheneb [15,16]. MMP-1 suurenemine ja kollageeni vähenemine kinnitati vananevates fibroblastides, mille läbipääsude arv on suur (joonis 4A).

Kuid ATC pärssis MMP{0}} ekspressiooni ja suurendas kollageeni sünteesi vananevates fibroblastides. See tulemus näitab, et ATC võib parandada ECM-i vanusega seotud muutusi, reguleerides MMP-1 ekspressiooni ja kollageeni sünteesi vananevates fibroblastides (joonis 4B). On teatatud, et vananemisega seotud sekretoorne fenotüüp (SASP), milles vananevad rakud eritavad spetsiifilisi põletikueelseid tegureid, kasvufaktoreid ja proteolüütilisi ensüüme, aitab kaasa vananemisega seotud haiguste tekkele ja progresseerumisele [17–19]. Me täheldasime ATC mõju SASP-le, eriti põletikueelsetele tsütokiinidele, nagu IL-1, IL_6 ja IL-8. Nagu on näidatud joonisel 4C, vähendas ATC vananemisest põhjustatud IL-1, IL-6 ja IL-8 ekspressioonitasemeid. See viitab sellele, et ATC võib SASP-i pärssimise kaudu avaldada vananemisvastast toimet.

3. Arutelu

Vananevad rakud läbivad iseloomulikud morfoloogilised muutused, mis hõlmavad laienenud ja sageli ebaregulaarset tuuma ja kromatiini ümberkorraldamist. Kui vananemine on indutseeritud DNA kahjustuse, replikatsiooni vähenemise või onkogeeni ekspressiooni tõttu, kaob peamiselt B1-lamin. Erinevad sisemised või välised stressorid võivad käivitada DNA kahjustuse vastuse (DDR) raja, et aktiveerida p53 ja/või p16INK4A rada. p16INK4A võib inaktiveerida Cdk4/6, põhjustada fosforüülitud pRb akumuleerumist, häirida E2F transkriptsioonifaktori regulatsiooni ja indutseerida rakutsükli seiskumist või vananemist [20, 21]. Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) suurenenud tootmine, mida enamasti toodavad düsfunktsionaalsed mitokondrid, võib põhjustada rakkude vananemist DNA kahjustuse ja vananemise signaaliradade, sealhulgas p53, p16INK4A ja p21Waf1/Cip1 [22] transaktiveerimise kaudu.

Selles uuringus leidsime, et nc886 ekspressioon vähenes passaažide arvu suurenemisega ja et nc886 ekspressiooni ülesreguleerimine leevendas rakkude vananemist LaminB1, p16INK4A, p21Waf1 / Cip1 ja ROS-i tootmise vahendusel. nc886 transkribeerib RNA polümeraas III (Pol III) ja vaigistab CpG DNA hüpermetüleerimisega paljudes pahaloomulistes kasvajates [8]. Me täheldasime, et nc886 ekspressioon vähenes CpG saarte metüülimisega vananevates fibroblastides. See tulemus näitab, et CpG saarte hüpermetüleerimine kahjustab nc886 funktsionaalsust raku vananemise supressorina.

nc886 poolt mõjutatud spetsiifilised geeniekspressioonirajad on ebaselged. Tõenäoliselt hõlmavad need ka teiste ncRNA-de kohta varem teatatud. nc886 võib mängida kriitilist rolli rakkude vananemises, vahendades otseselt või kaudselt vananemissignaali rada kromatiini struktuuri, transkriptsioonifaktori aktiivsuse, transkriptsioonijärgse ja translatsioonijärgse geeniregulatsiooni tasemel [23]. Näiteks võib nc886 vahendada rakutsükli progresseerumise vananemisrada.

On teatatud, et AK156230 kui ncRNA on seotud fibroblastide replikatiivse vananemise indutseerimisega oma rolli kaudu autofagias ja rakutsükli progresseerumises. AK156230 indutseeritud rakkude alareguleerimine, et näidata vananemisreaktsioone, aktiveerides p53 ja p21, vähendades samal ajal tsükliinist sõltuvat kinaasi 1 (CDK1) [24]. Vananemisega seotud ncRNA1 (SAL-RNA1), MALAT1 ja MIAT on tuntud kui raku vananemise negatiivsed regulaatorid. Need on vähenenud vananevates fibroblastides. Nende geenide allareguleerimine võib viia vananemismarkerite, nagu SA-gal, p16, p21 ja p53, suurenemiseni [25]. MALAT1 mõju rakkude vananemisele saavutati onkogeense transkriptsioonifaktori b-Myb / Mybl2 vähenemise kaudu.

Kuigi erinevate ncRNA-de ekspressioon on vananemise ajal mõjutatud, on vananemisega funktsionaalselt seotud vaid vähesed. Kuna ncRNA-de lokaliseerimine on funktsiooniga seotud mehhanismide mõistmiseks oluline, arutatakse vananemist mõjutavate molekulaarsete mehhanismide kirjeldamisel eraldi tuuma- ja tsütoplasmaatilisi ncRNA-sid [26]. Tsütoplasmas paiknev ncRNA võib sihtmärk-mRNA-ga aluste sidumise kaudu toimida translatsiooniregulaatorina [27]. ncRNA võib mõjutada valgu ekspressioonitaset, suurendades või vähendades mRNA stabiilsust [28].

Näiteks RAS-i indutseeritud vananemise ajal aitab tsütoplasmaatiline UCA1 kaasa p16 mRNA stabiliseerumisele, eraldades hnRNPA1 [29]. nc886 sisaldab proteiinkinaasi RNA-aktiveeritud (PKR) sidumissaiti. PKR-nc886 seondumine võib pärssida PKR aktiivsust. PKR-i, kaheahelalise RNA (dsRNA) tsütoplasmaatilist retseptorit, reguleerib seriini/treoniini proteiinkinaas, mida aktiveerib infektsioon, tsütokiinid, oksüdatiivne stress ja kiiritamine (sh UV), mis põhjustab järgnevat põletiku ja apoptoosi esilekutsumist [20 ,21] [30,31]. nc886 seondub PKR-ga dsRNA-ga võrreldava afiinsusega ja takistab PKR-i aktiveerimist. nc886 knockdown põhjustab eukarüootse initsiatsioonifaktori 2 subühiku (eIF2) fosforüülimist PKR raja kaudu, mis põhjustab rakusurma ja pärsib raku globaalset valkude sünteesi. On teatatud, et COX-2, IL-8 ja MMP-de tootmist TNF- poolt vahendab inimese kondrotsüütide PKR rada [32].

Eelmises uuringus näitasime ka, et UVB-indutseeritud põletikku saab reguleerida keratinotsüütides nc886-PKR-raja kaudu [10]. Lisaks on PKR seotud oksüdatiivse stressi põhjustatud vigastusega vastsündinute südame müotsüütides. PKR inhibeerimine kaitseb H2O2-indutseeritud vigastuste eest, nõrgendades apoptoosi ja põletikku [33]. Põletik ja oksüdatiivne stress on peamised vananemisprotsessi esilekutsuvad tegurid. Seega võib PKR rada vahendada nc886 ammendumise poolt indutseeritud fibroblastide rakulist vananemist. Et selgitada üksikasjalikku regulatiivset mehhanismi, mis on seotud nc886 mõjuga fibroblastide raku vananemisele, on vaja täiendavaid uuringuid.

Varasemates uuringutes on laialdaselt kirjeldatud rohelise tee ekstrakti vananemisvastast toimet. Rohelise tee antioksüdantne ja põletikuvastane toime on tuntud mehhanismid, mis aitavad kaasa selle vananemisvastasele toimele. Esialgse testi käigus avastasime, et ATC suurendas nc886 ekspressiooni oluliselt rohkem kui 70% rohelise tee etanooliekstrakti võrra (täiendav joonis S1A). See tulemus viitab sellele, et kontsentreeritud katehhiinid, sealhulgas 3" Me-EGCG, võivad olla tingitud nc886 ekspressiooni ülesreguleerimisest. Et teha kindlaks, kas nc886 stimuleeriv aine võib takistada rakkude vananemist, jälgisime ATC mõju vananevatele fibroblastidele. ATC suurendas nc886 ekspressiooni nc886 geeni metüülimise taseme pärssimine vananevates fibroblastides (joonis 3B, C). ATC leevendas ka rakkude vananemist, vahendades vananevaid biomarkereid, nagu SA- -gal aktiivsus, LaminB1, p16INK4A ja p21Waf1/Cip1 (joonis 3E). ). Lisaks taastas ATC rakkude vananemisest põhjustatud suurenenud MMP-1 ja vähenenud kollageenitootmise (joonis 4B). SASP-tegurid varieeruvad veidi sõltuvalt raku tüübist ja vananemisest põhjustatud stressi tüübist, need on tavaliselt tuntud kui NF-κB sihtgeenid, mis reguleerivad põletikueelseid tsütokiine nagu IL-6 ja IL-8.

Selles uuringus kinnitasime, et ATC surus alla IL-1, IL_6 ja IL-8 suurenenud ekspressiooni vananevates rakkudes (joonis 4C). Me ei saa välistada võimalust, et rohelise tee parandav toime rakkude vananemisele saavutatakse mitme mehhanismi abil, sealhulgas nc886 regulatsiooni, antioksüdatsiooni ja põletikuvastase toimega. Kuid meie tulemused viitavad sellele, et ATC poolt suurenenud nc886-l on oluline roll raku vananemise pärssimisel, mõjutades seejärel fibroblastide ECM-i tootmist.

4. Materjalid ja meetodid

4.1. ATC ettevalmistamine

Käesolevas uuringus kasutatud kuivatatud rohelise tee lehed (Camellia sinensis var. sinensis cv. Jangwon No. 3) saadi Lõuna-Koreas Jeju linnas Dolsongi teeaias (33◦16023.900 N 126◦28058.300 E) kasvatatud teetaimedest. Kuivad teelehed (170 g) ekstraheeriti 70% EtOH-ga (maht/maht) toatemperatuuril 16 tundi. Seejärel pulbristati ekstrakt lüofilisaatoriga (TF10D, TEFIC BIOTECH, Xian, Hiina). ATC valmistamiseks kontsentreeriti EtOH ekstrakt pöördaurustiga kümme korda ja kanti kolonni, mis oli täidetud AB-8 vaiguga (siseläbimõõt 5 cm, pikkus 45 cm). Kolonni elueerimine lahustiga viidi läbi 4-kordse kihi mahuga (BV) 20%, 30% ja 100% EtOH-ga (maht/maht). Selles uuringus eemaldati kolonnis olevad lahustid enne elueerimist õhukompressoriga. 30% EtOH eluaat kontsentreeriti kakskümmend korda ja kanti polüamiidkolonnile (siseläbimõõt 2,5 cm, pikkus 40 cm). Polüamiidkolonn elueeriti 5 korda BV 10% ja 100% EtOH-ga. 100% EtOH eluaat kontsentreeriti ettevaatlikult ja lüofiliseeriti.

4.2. Rakukultuur ja rakuravi ATC-ga

Inimese naha fibroblastid (HDF-id) osteti ATCC-st (Manassas, VA, USA). Rakukultuur viidi läbi kontrollitud tingimustes 37 °C juures 5% CO2-ga, kasutades Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söödet (WELGENE, Daegu, Korea), millele oli lisatud 10% veiseloote seerumit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja 1% penitsilliini. -streptomütsiin (WELGENE, Daegu, Korea). Rakud külvati 6-süvendplaatidele tihedusega 2 × 105 rakku plaadi kohta. Pärast 60-protsendilise liitumise saavutamist töödeldi neid näidatud kontsentratsiooniga ATC-ga 72 tundi.

4.3. SA- -Gal värvimise ja voolutsütomeetria analüüs

Rakud värviti SPiDER- -Galiga (Dojindo, Kumamoto, Jaapan) vastavalt tootja juhistele. Rakke analüüsiti EVOS® FL rakukujutise süsteemiga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja BD FACS Calibur voolutsütomeetriga (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

4.4. Intratsellulaarne ROS-i mõõtmine

Intratsellulaarse ROS-i tootmist jälgiti fluorestseeruva ROS-indikaatori C20,70 -diklorodihüdrofluorestseiindiatsetaati (H2DCFDA; Molecular Probes) abil. Rakke inkubeeriti H2DCFDA-ga (5 uM) 30 minutit temperatuuril 37 °C. Rakkudega seotud fluorestsents tuvastati BD FACS Calibur voolutsütomeetriga (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

4.5. Reaalajas PCR ja metüülimisespetsiifiline PCR

Kogu RNA ekstraheeriti TRIzoliga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). RNA kvantitatiivne mõõtmine viidi läbi, kasutades Epoch mikroplaadi spektrofotomeetrit (BioTek, Winooski, VT, USA). cDNA sünteesiti am-fiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX, USA) abil. Genoomne DNA ekstraheeriti, kasutades AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (BIONEER, Daejeon, Korea). Bisulfiti muundamine viidi läbi, kasutades EZ DNA metüülimiskomplekti (Zymo Research, CA, USA). qRT-PCR teostamiseks kasutati AMPIGENE® cDNA sünteesikomplekti (Enzo Life Sciences Inc., Farming-dale, NY, USA) ja ABI7500 reaalajas PCR-süsteemi (Ambion Inc, Austin, TX, USA). Selles uuringus kasutatud praimeri järjestusi on kirjeldatud tabelis 1.

4.6. Laktaatdehüdrogenaasi test

Tsütotoksilisuse määramiseks kasutati LDH testi, mõõtes kahjustatud rakkudest vabanenud laktaatdehüdrogenaasi (LDH) aktiivsust. Analüüs viidi läbi, kasutades LDH tsütotoksilisuse WST testikomplekti (Enzo life sciences, Farmingdale, NY, USA) vastavalt tootja juhistele.

4.7. DNA transfektsioon nc886 üleekspressiooni jaoks ja siRNA transfektsioon nc886 knockdowni jaoks

DNA saamiseks nc886 üleekspressiooniks rakkudes amplifitseeriti DNA-d AccuPower® PCR PreMixiga (BIONEER, Daejeon, Korea), kasutades matriitsina HDF-ide genoomset DNA-d ja järgmisi tabelis 2 kirjeldatud praimereid.

Amplifitseeritud DNA puhastati, kasutades QIAquick PCR puhastuskomplekti (QIAGEN, Hilden, Saksamaa). Puhastatud DNA transfekteeriti LipofectamineTM 3000 reagendiga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). nc886 hävitamiseks transfekteeriti rakud anti-oligodega (si-ctrl ja si-nc886) kontsentratsioonil 250 pM, kasutades Lipofectamine™ RNAiMAX reaktiivi (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

4.8. Western Blotting

Rakulüsaadid valmistati PRO-PREP™ valgu ekstraktsioonilahusega (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi do, Korea). Koguvalgud eraldati NuPAGE elektroforeesisüsteemiga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja kanti polüvinülideendifluoriidi (PVDF) membraanidele. Immunoblotanalüüs viidi läbi, kasutades primaarset antikeha p16INK4A, p21Waf1/Cip1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), MMP1, Col1A2 ja -aktiini (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA). Ribade skaneerivaid densitomeetrilisi väärtusi analüüsiti ImageJ tarkvara versiooniga 1.52a (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.9. Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs

Pärast näidatud inkubeerimist mõõdeti kollageeni (Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Jaapan) ja MMP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) kultuuri supernatandis, kasutades ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi. (ELISA) komplekti järgides tootja juhiseid.

4.10. Statistiline analüüs

Kõik tulemused on esitatud kui keskmine ± standardhälve (SD). Kahe rühma vahelisi erinevusi hinnati t-testi või dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, kasutades GraphPad Prism. Statistiline olulisus märgiti kas p < 0.05 või p < 0,01.

5. Kokkuvõtted

Kokkuvõtteks võib öelda, et nc886 ekspressiooni reguleerimine võib olla potentsiaalne rakkude vananemise sihtmärk fibroblastides ja ATC võib olla võimas epigeneetiline vananemisvastane koostisosa.

Autori kaastööd:

Kontseptualiseerimine, YK, KH ja EJ; metoodika YK, HJ, N.-HP ja K.-SL; andmete kureerimine, YK, HJ ja EC; uurimine, YK, HJ, EC, K.-SL, N.-HP ja EJ; projektihaldus, WP, DP ja EJ; ressursid, töörühm ja DP; järelevalve, DP ja EJ; kirjutamine — algne mustand, YK; kirjutamine – läbivaatamine ja toimetamine, N.-HP, KH, WP, DP ja EJ Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.

Rahastamine:

See uuring ei saanud välist rahastamist.

Institutsioonilise ülevaatenõukogu avaldus:

Ei kohaldata.

Teadliku nõusoleku avaldus:

Ei kohaldata.

Andmete kättesaadavuse avaldus:

Andmed tehakse nõudmisel kättesaadavaks.

Huvide konfliktid:

Autorid ei kinnita huvide konflikti.

Viited

1. Campisi, J.; d'Adda di Fagagna, F. Raku vananemine: Kui heade rakkudega juhtuvad halvad asjad. Nat. Rev Mol. Cell Biol. 2007, 8, 729–740. [CrossRef] [PubMed]

2. Kapoor, VK; Dureja, J. Vananemine: lähenemised selle kontrollile. Drug Discov. Täna Ther. strateegia. 2010, 7, 43–44. [CrossRef]

3. Fisher, GJ; Kang, S.; Varani, J.; Bata-Csorgo, Z.; Wan, Y.; Datta, S.; Voorhees, JJ Fotovananemise ja kronoloogilise naha vananemise mehhanismid. Arch. Derm. 2002, 138, 1462–1470. [CrossRef]

4. Tigges, J.; Krutmann, J.; Fritsche, E.; Haendeler, J.; Schaal, H.; Fischer, JW; Kalfalah, F.; Reinke, H.; Reifenberger, G.; Stuhler, K.; et al. Fibroblastide vananemise tunnused. Meh. Aging Dev. 2014, 138, 26–44. [CrossRef]

5. Brunet, A.; Berger, SL Vananemise ja vananemisega seotud haiguste epigeneetika. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S17–S20. [CrossRef] [PubMed]

6. Moskalev, AA; Aliper, AM; Smit-McBride, Z.; Buzdin, A.; Žavoronkov, A. Vananemise ja pikaealisuse geneetika ja epigeneetika. Lahtritsükkel 2014, 13, 1063–1077. [CrossRef]

7. Lee, K.; Kunkeaw, N.; Jeon, SH; Lee, I.; Johnson, BH; Kang, GY; Bang, JY; Park, HS; Leelayuwat, C.; Lee, YS Precursor miR-886, uudne vähis represseeritud mittekodeeriv RNA, seostub PKR-ga ja moduleerib selle aktiivsust. RNA 2011, 17, 1076–1089. [CrossRef] [PubMed]

8. Park, JL; Lee, YS; Song, MJ; Hong, SH; Ahn, JH; Seo, EH; Shin, SP; Lee, SJ; Johnson, BH; Stampfer, MR; et al. RNA polümeraasi III transkriptsioonide epigeneetiline regulatsioon varases rinnakasvaja tekkes. Onkogeen 2017, 36, 6793–6804. [CrossRef] [PubMed]

9. Lee, KS; Shin, S.; Cho, E.; Im, WK; Jeon, SH; Kim, Y.; Park, D.; Frechet, M.; Chajra, H.; Jung, E. nc886, mittekodeeriv RNA, inhibeerib UVB-indutseeritud MMP-9 ja COX-2 ekspressiooni PKR raja kaudu inimese keratinotsüütides. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2019, 512, 647–652. [CrossRef] [PubMed]

10. Lee, KS; Cho, E.; Weon, JB; Park, D.; Frechet, M.; Chajra, H.; Jung, E. Laminaria japonica ekstrakti UVB-indutseeritud põletiku pärssimine nc886-PKR raja reguleerimise kaudu. Toitained 2020, 12, 1958. [CrossRef]

11. Ji, HG; Lee, YR; Lee, MS; Hwang, KH; Kim, EH; Park, JS; Hong, YS Epigallokatehhiin-3-O-(3-Ometüül)gallaadi (EGCG300Me) ja aminohapete profiilide identifitseerimine erinevates tee (Camellia sinensis L.) kultivarides. Andmete lühikirjeldus. 2017, 14, 607–611. [CrossRef]

12. Kim, E.; Han, SY; Hwang, K.; Kim, D.; Kim, EM; Hossain, MA; Kim, JH; Cho, JY (-)-epigallokatehhiin-3-(300-O-metüül)gallaadi antioksüdant ja tsütoprotektiivne toime. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3993. [CrossRef]

13. Huang, LH; Liu, CY; Wang, LY; Huang, CJ; Hsu, CH Rohelise tee ekstrakti mõju ülekaalulistele ja rasvunud naistele, kellel on kõrge madala tihedusega lipoproteiini-kolesterooli (LDL-C) tase: randomiseeritud, topeltpime ja rist-platseeboga kontrollitud kliiniline uuring. BMC täiendus. Altern. Med. 2018, 18, 294. [CrossRef] [PubMed]

14. Soares, S.; Soares, S.; Brandao, E.; Guerreiro, C.; Mateus, N.; de Freitas, V. Rohelise tee flavanooli ekstrakti ja punase veini antotsüaniini ekstrakti suukaudsed interaktsioonid, kasutades uut rakupõhist mudelit: ülevaated erinevate suuepiteeli mõjust. Sci. Rep. 2020, 10, 12638. [CrossRef] [PubMed]

15. Levi, N.; Papismadov, N.; Solomonov, I.; Sagi, I.; Krizhanovsky, V. Vananemise ECM-tee vananemisel: komponendid ja modifikaatorid. FEBS J. 2020, 287, 2636–2646. [CrossRef] [PubMed]

16. Pitozzi, V.; Mocali, A.; Laurenzana, A.; Giannoni, E.; Cifola, I.; Battaglia, C.; Chiarugi, P.; Dolara, P.; Giovannelli, L. Krooniline resveratrooli ravi parandab rakkude adhesiooni ja leevendab põletikulist fenotüüpi vananevates inimese fibroblastides. J. Gerontol. Ser. 2013, 68, 371–381. [CrossRef] [PubMed]

17. Coppe, JP; Patil, CK; Rodier, F.; Sun, Y.; Munoz, DP; Goldstein, J.; Nelson, PS; Desprez, PY; Campisi, J. Vananemisega seotud sekretoorsed fenotüübid paljastavad onkogeense RAS-i ja kasvaja p53 supressori raku-mitteautonoomsed funktsioonid. PLoS Biol. 2008, 6, 2853–2868. [CrossRef]

18. Tchkonia, T.; Zhu, Y.; van Deursen, J.; Campisi, J.; Kirkland, JL Rakuline vananemine ja vananev sekretoorne fenotüüp: terapeutilised võimalused. J. Clin. Uurige. 2013, 123, 966–972. [CrossRef] [PubMed]

19. Munoz-Espin, D.; Serrano, M. Raku vananemine: füsioloogiast patoloogiani. Nat. Rev Mol. Cell Biol. 2014, 15, 482–496. [CrossRef]

20. Lagger, G.; O'Carroll, D.; Rembold, M.; Khier, H.; Tischler, J.; Weitzer, G.; Schuettengruber, B.; Hauser, C.; Brunmeir, R.; Jenuwein, T.; et al. Histooni deatsetülaasi 1 oluline funktsioon proliferatsiooni kontrollis ja CDK inhibiitori repressioonides. EMBO J. 2002, 21, 2672–2681. [CrossRef] [PubMed]

21. Freitas-Rodriguez, S.; Folgueras, AR; Lopez-Otin, C. Maatriksi metalloproteinaaside roll vananemisel: kudede remodelleerimine ja kaugemalgi. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res. 2017, 1864, 2015–2025. [CrossRef]

22. Victorelli, S.; Passos, JF Reaktiivsete hapnikuliikide tuvastamine vananevates rakkudes. Meetodid Mol. Biol 2019, 1896, 21–29. [PubMed]

23. Puvvula, PK LncRNA-de reguleerivad võrgud raku vananemises. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2615. [CrossRef] [PubMed]

24. Chen, YN; Cai, MY; Xu, S.; Meng, M.; Ren, X.; Yang, JW; Dong, YQ; Liu, X.; Yang, JM; Xiong, XD LncRNA AK156230 identifitseerimine uudse raku vananemise regulaatorina hiire embrüonaalsetes fibroblastides. Oncotarget 2016, 7, 52673–52684. [CrossRef] [PubMed]

25. Abdelmohsen, K.; Panda, A.; Kang, MJ; Xu, J.; Selimjan, R.; Yoon, JH; Martindale, JL; De, S.; Puit, WH, 3.; Becker, KG; et al. Vananemisega seotud lncRNA-d: vananemisega seotud pikad mittekodeerivad RNA-d. Aging Cell 2013, 12, 890–900. [CrossRef]

26. Montes, M.; Lund, AH LncRNA-de esilekerkivad rollid vananemises. FEBS J. 2016, 283, 2414–2426. [CrossRef] [PubMed]

27. Carrieri, C.; Cimatti, L.; Biagioli, M.; Beugnet, A.; Zucchelli, S.; Fedele, S.; Pesce, E.; Ferrer, I.; Collavin, L.; Santoro, C.; et al. Pikk mittekodeeriv antisenss-RNA kontrollib Uchl1 translatsiooni manustatud SINEB2 korduse kaudu. Loodus 2012, 491, 454–457. [CrossRef]

28. Kretz, M.; Siprashvili, Z.; Chu, C.; Webster, DE; Zehnder, A.; Qu, K.; Lee, CS; Flockhart, RJ; Groff, AF; Chow, J.; et al. Somaatilise koe diferentseerumise kontroll pika mittekodeeriva RNA TINCR abil. Loodus 2013, 493, 231–235. [CrossRef] [PubMed]

30. Kumar, PP; Emechebe, U.; Smith, R.; Franklin, S.; Moore, B.; Yandell, M.; Lessnick, SL; Moon, AM Vananemise koordineeritud kontroll lncRNA ja uudse T-box3 kaasrepressori kompleksi abil. Elife 2014, 3, e02805. [CrossRef]

30. Freund, A.; Laberge, RM; Demaria, M.; Campisi, J. Lamin B1 kadu on vananemisega seotud biomarker. Mol. Biol. Cell 2012, 23, 2066–2075. [CrossRef]

31. Gal-Ben-Ari, S.; Barrera, I.; Ehrlich, M.; Rosenblum, K. PKR: Kinaas, mida meeles pidada. Ees. Mol. Neurosci. 2018, 11, 480. [CrossRef] [PubMed]

32. Ma, CH; Wu, CH; Jou, IM; Tu, YK; Hung, CH; Hsieh, PL; Tsai, KL PKR aktiveerimine põhjustab põletikku ja MMP{1}} sekretsiooni inimese degenereerunud liigesekondrotsüütides. Redox Biol. 2018, 14, 72–81. [CrossRef] [PubMed]

33. Wang, Y.; Mehed, M.; Xie, B.; Shan, J.; Wang, C.; Liu, J.; Zheng, H.; Yang, W.; Xue, S.; Guo, C. PKR inhibeerimine kaitseb H2O2 -indutseeritud vastsündinute südame müotsüütide kahjustuste eest, nõrgendades apoptoosi ja põletikku. Sci. Vabariik 2016, 6, 38753–38763. [CrossRef] [PubMed]

Yuna Kim 1, Hyanggi Ji 1, Eunae Cho 1, Nok-Hyuni park 2, Kyeonghwan Hwang 2, Wonseok Park 2, Kwang-Soo Lee 1, Deokhoon Park 1 ja Eunsun Jung 1,*.

1 Biospectrum Life Science Institute, A-1805, U-TOWER, Yongin-si 16827, Korea; bioyn@biospectrum.com (YK); biocr@biospectrum.com (HJ); biozr@biospectrum.com (EÜ); bioyc@biospectrum.com (K.-SL); pdh@biospectrum.com (DP)

2 Põhiuuringute ja innovatsiooni osakond, Amorepacific Corporationi uurimis- ja arenduskeskus, Youngin-si 17074, Korea; aquareve@amorepacific.com (N.-HP); khhwang@amorepacific.com (KH); wspark@amorepacific.com (WP)

* Correspondence: bioso@biospectrum.com

For more information:1950477648@nn.com