Nanoensüümi hüdrogeel alküülradikaalide suurendamiseks ja tõhusaks kasvajavastaseks raviks†

Alküülradikaalid (Rc), mis ei sõltu hapniku tekkestrakuline stress, on rakendatud aastalkasvaja ravi, kuid suur kogus glutatiooni (GSH) kasvajarakkudes reageerib alküülradikaalidega, mistõttuvähendada nende kasvajavastast toimet. Selles uuringus on täiustatud alküülradikaalide genereerimise süsteem, mis reageeriblähiinfrapuna valgusoli kujundatud. Alküülradikaali vallandaja 2,20 -asobis[2-(2-imidasoliin-2-üül)propaan]divesinikkloriid (AIPH) ja ensüümpüriit (FeS2) kapseldati agarooshüdrogeeli, et valmistada AIPH–FeS2–hüdrogeeli (AFH) süsteem. FeS2 saab kasutada fototermilise ainena, et muuta lähi-infrapuna valguse energia soojusenergiaks, mis viib hüdrogeeli lahustumiseni. AIPH indutseeritakse samaaegselt tootma alküülradikaale. FeS2 saab kasutada ka kuioksüdatiivse stressi võimendajarakusisese GSH sisalduse vähendamiseks, suurendades seeläbi alküülradikaalide terapeutilist toimet. Lõpuks võivad AFH-süsteemi tekitatud hapnikust sõltumatud vabad radikaalid infrapuna laserkiirguse ja fototermilise töötlemise korraltapavad vähirakkesünergilise kauduoksüdatsioon/fototermiline efekt. Siin välja töötatud AFH-süsteem annab uusi teadmisi alküülradikaalide terapeutilise toime suurendamise kohta.

KLIKKIGE SIIN, ET TEADA, KUIDAS CISTANCHE VÄHIVASTANE VÄHEND

Sissejuhatus

Viimastel aastatel on rinnavähi ravis populaarseteks valikuteks muutunud vabadel radikaalidel põhinevad ravimeetodid, nagu fotodünaamiline ravi, seega mittedünaamiline ravi ja elektrodünaamiline ravi. reaktiivsete hapnikuliikide (ROS), mis indutseerivad rakusurma, põhjustades tõsiseid oksüdatiivseid kahjustusi või raku metabolismi düsfunktsiooni. 4–6 Kahjuks vähendavad hüpoksiline kasvajakeskkond ja kasvajarakkude kiire proliferatsioon selliste ravimeetodite terapeutilisi tulemusi, mis sõltuvad ROS-i tootmisest, eriti tahkete kasvajate ravi.7–10 Alküülradikaalid on uut tüüpi vabad radikaalid, mis ei sõltu rakkude hävitamiseks hapniku tootmisest ja on osutunud efektiivseks kasvajate ravis normoksilises ja hüpoksilises keskkonnas.11 Vabanenud alküül radikaalid võivad indutseerida vähirakkude apoptoosi, suurendades oksüdatiivset stressi, põhjustades raku lipiidide ja DNA kahjustusi. Tüüpilise vabade radikaalide initsiaatorina võib 2,20 -asobis[2-(2-imidasoliin-2-üül)propaan]divesinikkloriid (AIPH) tekitada kõrgetel temperatuuridel alküülradikaale. 12 Ta teeb seda isegi hapniku puudumisel. Tekkinud vabad radikaalid on rakkudele toksilised ja oksüdeerivad koheselt rakuelemendid või interakteeruvad hapnikuga, tekitades sekundaarseid toksilisi aineid.13 Isegi hüpoksilise kasvaja mikrokeskkonnas võib AIPH toota alküülradikaale, et suurendada rakusisese lipiidide hüdroperoksiidi ja veelgi vallandada kasvajarakkude apoptoosi.14 Kõik need näitavad, et Rc on paljutõotav vähiravi ravim.

Fototermilises ravis kasutatakse välise stiimulina valgust või soojust.15–17 Kasvajarakkude agregatsiooni vältimiseks on kasutatud lähiinfrapuna (NIR) laserkiirgusel põhinevat fototermilist teraapiat (PTT); see tugineb kasvajate eemaldamisel lokaalsetele termilistele efektidele.18–20 Mitmeid fototermilisi aineid (PTA-sid), nagu kulla nanokristallid ja molübdeendisulfiid, kasutatakse kombinatsioonis AIPH-ga alküülradikaalide vabastamiseks vastuseks infrapuna laserkiirgusele.19,21–23 , on tuumori mikrokeskkonnas (TME) tahkete kasvajate puhul tavaliselt kõrge glutatiooni (GSH) ekspressioon, kuna GSH mängib olulist rolli kiiritusravile vastupanuvõimes spontaanse reaktsiooni või GSH S transferaasi katalüüsitud reaktsiooni kaudu ksenogeense ainega.24,25 Lisaks redutseerijana võib GSH alküülradikaale otse eemaldada.21,26 See vähendab alküülradikaalil põhinevate ravimeetodite efektiivsust. Püriidi (FeS2) nanoensüümil kui uudsel fototermilisel nanomaterjalil ei ole mitte ainult hea fototermiline efekt NIR-valguses, vaid ka nanoensüümi aktiivsus.27 FeS2 nanaas on näidanud sarnast aktiivsust glutatioonoksüdaasiga (GSH OXD), oksüdeerides. GSH oksüdeeritud glutatiooniks (GSSG).28 TME-s leiti, et GSH vähenemine häirib rakkude REDOX tasakaalu ja põhjustab oksüdatiivset stressi.29 Seetõttu eeldatakse, et FeS2 saavutab AIPH-ga hea sünergilise efekti.

Minimaalselt invasiivsed fototundlikud hüdrogeelid on viimasel ajal muutunud populaarseks ravimite kontrollitud vabanemise platvormina.30–32 Hüdrogeelid koaguleeruvad, kui neid süstitakse kasvajakoesse ja toimivad pikaajalise depoona.33 Seda paikset manustamisviisi saab korrata pärast ühte süstimine. Lisaks saab parameetreid, nagu laseri võimsus ja kiiritusaeg, muuta, et muuta ravimi vabanemise kiirust, laiendades seega selle ravimeetodi rakendatavust.34,35 Arvestades neid eeliseid, püstitati hüpotees, et hüdrogeelide kasutamine FeS2 kohaletoimetamiseks ja AIPH TME-le parandaks vabade radikaalidel põhinevate ravimeetodite tõhusust.

Selles uuringus töötati välja meetod, mis kasutas FeS2 ensüümi ja vabade radikaalide initsiaatorit AIPH sisaldava süstitava hüdrogeeli intratumoraalset manustamist. Esiteks valmistati AIPH-FeS2-hüdrogeeli (AFH) hübriidsüsteem, laadides FeS2 nanoosakesed ja AIPH agarooshüdrogeeli. Hüdrogeel on toatemperatuuril tahke ja FeS2 ja AIPH on kapseldatud selle maatriksisse. Pärast lähiinfrapuna (NIR) valguse kiiritamist muudab FeS2 NIR-valguse energia soojusenergiaks, mis põhjustab AFH-süsteemi kuumenemise ning seejärel sulab hüdrogeel ja vabastab FeS2 ja AIPH. Kõrgetel temperatuuridel laguneb AIPH, moodustades alküülradikaale. Seejärel vähendab ensüüm FeS2, mis jäljendab GSH-OXD aktiivsust, rakusisest GSH sisaldust. GSH hävitamine soodustab alküülradikaalide tapvat toimet. Kuna AFH võib kasvaja asukohas viibida pikka aega, võimaldab AFH-süsteem laseri intensiivsust ja kiirgusaega muutes täpset kontrolli alküülradikaalide vabanemise üle. Lõpuks võivad AFH-süsteemi poolt NIR-kiirguse ja fototermilise ravi käigus tekitatud hapnikust sõltumatud vabad radikaalid sünergistlikult tappa vähirakke sünergilise oksüdatsiooni / fototermilise efekti kaudu ning kasvaja kasv ravitsükli ajal on hästi asustatud. Lühidalt, siin kavandatud AFH-süsteem võimendab veelgi AIPH terapeutilist toimet, muutes redoks-homöostaasi (skeem 1).

Tulemused ja arutlus

FeS2 ja AIPH sisaldava komposiithüdrogeeli valmistamiseks kasutati madala sulamistemperatuuriga agaroosi hüdrogeeli. FeS2 segati agaroosi vesilahusega temperatuuril 60 C ja seejärel laaditi alküülradikaali käivitaja AIPH, millele järgnes kiire jahutamine toatemperatuurini. Seega moodustus AFH hüdrogeeli maatriks. FeS2 morfoloogia iseloomustamiseks kasutati ülekandeelektronmikroskoopiat (joonis 1A). FeS2 nano zyme näitas sfääritaolist morfoloogiat, mille osakeste keskmine suurus oli umbes 148 nm (joonis S1 †). FeS2 UV-vise neeldumisspektrid (joonis 1B) näitasid, et FeS2 neeldus tugevalt NIR vahemikus 808 nm juures. See omadus muudab FeS2 hea PTA-ks. FeS2 ensüümi fototermilist jõudlust erinevatel kontsentratsioonidel (0, 25, 50 ja 100 mg ml 1 ) uuriti lahuse kiiritamisel 0,5 W cm 2 808 nm lasersüsteemiga (joonis 1C). Lahuse soojendav toime oli otseselt võrdeline FeS2 kontsentratsiooniga. 100 mg ml 1 FeS2 lahuse temperatuur tõusis vaid 5 minuti jooksul laserkiirgusega umbes 17,5 ° C, mis näitab FeS2 head fototermilist jõudlust. Skaneeriv elektronmikroskoopia näitas ka, et AFH hüdrogeelil on keeruline pooride struktuuri ja pooride suuruse jaotuse võrgustik (joonis 1D), mis muudab hüdrogeeli sobivaks kohaletoimetamiseks ravimite laadimiseks. Fototermiline stabiilsus on samuti oluline kriteerium PTA kvaliteedi hindamisel.36 200 mg ml 1 FeS2 lahust kuumutati 808 nm NIR laseriga 5 minutit, seejärel lülitati laser välja ja FeS2 lahusel lasti jahtuda. loomulikult toatemperatuurini. Seda protsessi korrati mitu korda, et hinnata FeS2 fototermilist stabiilsust (joonis 1E). Iga fototermilise tsükli küttekõver ei muutunud ilmselgelt ja pärast 5-minutilist kiiritamist saavutati tipptemperatuuril vaid väike erinevus, mis kinnitas FeS2 fototermilist stabiilsust. Reoloogiline analüüs näitas ka valmistatud hüdrogeeli kõrget säilitusmoodulit tahkes olekus toatemperatuuril (joonis 1F). Temperatuuri tõustes hüdrogeel järk-järgult eraldus ja lahustus ning säilitusmoodul vähenes järk-järgult. Järgmisena viidi FeS2 hüdrogeelil läbi fototermilise lahustumise katse. Tahkestatud AFH (hüdrogeelis sisalduv FeS2) asetati deioniseeritud vett sisaldavasse klaasnõusse. Toatemperatuuril säilitas valmistatud AFH hüdrogeel oma tahke kuju, kuid pärast 10-minutilist kiiritamist 808 nm laseriga lahustus hüdrogeel peaaegu täielikult ning FeS2 nanomaterjal eraldus ja lahustus klaasnõus vees (joonis fig. 1G). Termiline infrapunakaamera kinnitas ka AFH temperatuuri olulist tõusu kiiritamise ajal (joonis 1H). Röntgenikiirguse fotoelektronspektroskoopia (XPS) spekter FeS2 pärast reaktsiooni hüdrogeeliga näitas, et FeS2 sisaldas Fe ja S elemente (joonis S2 †). Nagu on näidatud joonisel S3, vähenes † GSH sisaldus pärast FeS2 ja GSH koosinkubeerimist märkimisväärselt, sellel on positiivne korrelatsioonikõver aja ja kontsentratsiooniga. Lisaks sõltus FeS2 POD-laadne aktiivsus suurusest. Nanoensüümid suurusega 150 nm näitasid suuremat aktiivsust kui need, mille suurus oli 280 ja 687 nm (joonis S4†).

AFH suure jõudlusega omaduste põhjal hinnati selle kasvajavastast toimet. Esialgu kasutati fluorestseiindiatsetaadi / propiidiumjodiidi elusate / surnud rakkude värvimiskomplekti, et uurida ettevalmistatud AFH hüdrogeeli tapvat toimet koos NIR-kiirgusega. PBS pluss NIR rühm ja ainult AFH rühm näitasid tugevat rohelist fluorestsentsi, samas kui AIPH ei näidanud peaaegu mingit tapvat toimet (joonis 2A). Suhteliste katsete tulemuste kontrollimiseks valmistasime hüdrogeeli, mis sisaldas ainult FeS2 (FH). Valmistatud hüdrogeelil, mis sisaldas ainult FeS2 (FH) kombineerituna NIR-iga, oli mõõdukas surmav toime. Eelkõige oli AFH pluss NIR-ravil parim tsütotoksiline toime.

AIPH võime tuvastamiseks toota ROS-i kasutati diklorofluorestseiindiatsetaadi sondi. AIPH näitas nõrgemat võimet indutseerida ROS-i laserkiirguse puudumisel, samas kui FeS2-ga koormatud FH näitas pärast NIR-i kiiritamist mõõdukat ROS-i tootmist (joonis 2B). AFH pluss NIR ravirühmas täheldatud erkrohelist fluorestsentsi võib seostada FeS2 ja AIPH vabanemisega pärast laserkiirgust (joonis 2C). Lisaks näitasid AIPH ja AIPH pluss NIR rühmad väga vähe rohelist fluorestsentsi (joonis S5 †). CCK-8 test näitas samuti samu tulemusi. AFH pluss NIR rühma rakkude elujõulisus oli umbes 8,5 protsenti, mis erines oluliselt teiste rühmade omast (joonis 2D). Kõrge temperatuur soodustab AIPH lagunemist alküülradikaalide tekkeks. Samal ajal võib FeS2 avaldada GSH-OXD aktiivsust rakusisese GSH vähendamiseks. GSH kui üldlevinud tiooli sisaldav tripeptiid sünteesitakse paljudes rakkudes selle koostises olevatest aminohapetest (glutamiinhape, tsüsteiin ja glütsiin). GSH-d toodetakse rohkesti erinevat tüüpi vähirakkudes. GSH esineb rakkudes üldiselt redutseeritud kujul, mis võib reageerida oksüdeerivate ainetega, näiteks alküülrühmadega, oksüdeerudes samal ajal oma oksüdeeritud vormiks glutatioondisulfaadiks (GSSG), vähendades seeläbi vabadel radikaalidel põhinevat kasvajavastast toimet.37 GSH ammendumine. häirib rakkude redoks-tasakaalu, põhjustab oksüdatiivset stressi ja viib lõpuks raku apoptoosini.38 Ellmani reaktiivi kasutati selleks, et testida iga rühma võimet kahandada GSH-d. AFH kombineeritud NIR-rühm näitas parimat GSH-d kahandavat võimet (joonis 2E).

Skeem 1 Nanoensüümi hüdrogeel alküülradikaalide suurendamiseks ja tõhusaks kasvajavastaseks raviks

Joonis 1 (A) FeS2 TEM-pilt. (B) FeS2 lahuse UV-Vis-NIR neeldumisspekter. (C) FeS2 nanoosakeste lahuste erinevate kontsentratsioonide kuumutuskõverad laserkiirgusel 808 nm (0,5 W cm 2 ) 5 minuti jooksul. (D) hüdrogeeli SEM-pilt. (E) FeS2 lahuse temperatuurimuutus tsüklilise laserkiirguse all. (F) Reoloogilised ja temperatuurikõverad (vastavalt punane ja must) ettevalmistatud AFH jaoks vastuseks 0,5 W cm 2 808 nm laserkiirgusele. (G) Valmistatud AFH morfoloogia enne ja pärast 0,5 W cm 2 808 nm laserkiirgust 10 minutit ja (H) infrapuna-termopildid valmistatud AFH-st pärast kiiritamist.

Pidades silmas selle head in vitro jõudlust PTA ja GSH OXD-d jäljendava ensüümina, uuriti AFH mõju NIR-i valguse-kuumuse konversioonile in vivo. BALB/c hiirtele süstiti kasvajate moodustamiseks subkutaanselt 4T1 rakke. Joonisel 3A on näidatud PBS-rühma ja AFH-rühma temperatuurimuutuste kõver pärast 808 nm NIR-laseriga 0,5 W cm 2 kiiritamist 10 minuti jooksul. AFH rühma temperatuur tõusis pärast kiiritamist umbes 17, 6 C võrra, samas kui PBS rühma temperatuur peaaegu ei tõusnud. Kõrge temperatuur võib muuta kasvajarakumembraani niiskust, suurendades seeläbi rakumembraani läbilaskvust, mis omakorda põhjustab valkude termilisi kahjustusi.39,40 Lõpuks kaotavad vähirakud vohamisvõime. Järgmisena hinnati AFH-vahendatud kasvajavastast toimet 4T1 kasvajaga hiirtel. Kasvajat kandvad hiired jagati juhuslikult viieks rühmaks. PBS pluss NIR rühma ja AIPH rühma hiirte kasvaja maht suurenes kahenädalase raviperioodi jooksul kiiresti ja AFH rühmas ilmnes kerge kasvaja supressor (joonis 3C). Selle põhjuseks oli asjaolu, et agaroos metaboliseerus aeglaselt ja mõned ravimid vabanesid aeglaselt. AFH pluss NIR rühmal oli kõige tugevam mõju kasvaja kasvule. Ravi ajal oli hiirte kasvaja maht oluliselt alla surutud. Pärast raviperioodi hiired surmati ning kasvajad isoleeriti ja kaaluti. Kasvaja massi tulemused olid kooskõlas kasvaja mahu tulemustega (joonis 3D).

Oluline on see, et kogu uuringu jooksul ei täheldatud ravirühmas kehamassi muutusi, mis näitab, et ravi ei põhjustanud hiirtele olulist süsteemset toksilisust (joonis S6†). See tulemus on väga julgustav, sest kuigi paljud materjalid on andnud häid katsetulemusi, põhjustasid need ka tõsiseid kõrvalmõjusid, mis raskendavad tõsiselt nende kliinilisi väljavaateid.41,42 20 ,70 - Intraktsiooni mõõtmiseks kasutati diklorouorestsiindiatsetaati. - kasvaja ROS teke ravitud hiirtel. AFH ja NIR kombinatsioonravi allutatud kasvajate värvumine paranes oluliselt (joonis 3E). Suurenenud vabade radikaalide tootmine tõi loommudelil kaasa parema terapeutilise toime. Rakkude apoptoosi ja proliferatsiooni kontrollimiseks kasutati TUNELi ja Ki{6}} värvimisanalüüse (joonis 3E). AFH pluss NIR rühma kasvajakoed olid massiliselt nekrootilised ilma olulise proliferatsioonita.

Joonis 3 (A) Kasvajate infrapuna-termopildid pärast kiiritamist 808 nm laseriga (0,5 W cm 2 ) 10 min jooksul näidatud ravirühmades. (B) Temperatuuri tõus hiirtel, kellele on implanteeritud 4T1 kasvajad pärast 808 nm laserkiirgust (0,5 W cm 2 ) 10 minuti jooksul näidatud ravirühmades. (C) Kasvaja maht muutub aja jooksul rühmades, mida raviti vastavalt näidustustele. (D) Näidatud raviga seotud keskmised kasvaja massi väärtused. (E) ROS, Ki-67 ja TUNEL värvitud kasvajalõigud näidatud ravirühmadest. **P < 0,01, ***P < 0,005; Üliõpilase t-test.

Pärast ravi ei olnud elutähtsatel organitel (süda, maks, põrn, kops ja neer) põletikku ega kahjustusi. Maksa ja neerude indeksid olid normaalsed (joonis 4A–D ja S7†). Põhjalikud in vivo eksperimentaalsed andmed näitavad, et sünergilisel AFH- ja PTT-teraapial on hea terapeutiline toime ja biosobivus. Sellel on head väljavaated kliiniliseks meditsiiniliseks rakenduseks tulevikus.

Joonis 4 In vivo ohutuskatsete tulemus. Vere biokeemilised andmed, sealhulgas neerufunktsiooni markerid: (A) maksafunktsiooni markerid: CRE, (B) BUN ja (C) ALT pärast erinevaid ravimeetodeid. (D) 16 päeva pärast süstimist erineva raviga kokku puutunud hiirte peamiste organite, südame, kopsu, maksa, neerude ja põrna histopatoloogilise analüüsi tulemused (H&E-värvitud kujutised). Skaalavardad: 100 mm.

Järeldus

Kujundasime süstitava fototundliku hüdrogeeli, mis suudab samaaegselt saavutada vabade radikaalide ravi ja PTT, kapseldades ensüümi FeS2 ja alküülradikaali allika AIPH agarooshüdrogeeli. 808 nm laserkiirguse all soodustab PTA FeS2 AFH-süsteemi kuumutamist ja viib AIPH vabanemiseni ja selle lagunemiseni alküülradikaalide tekkeks. Samal ajal võib FeS2 vähendada rakusisest GSH sisaldust, hävitades seeläbi redoks-homöostaasi veelgi. Hüdrogeeli lahustumiskiirust saab muuta selliste parameetritega nagu laseri võimsustihedus ja punkti suurus. Nii in vivo kui ka in vitro uuringud on näidanud, et AFH kombinatsioon NIR-kiirgusega võib saavutada võimsa kasvaja tapmise efekti, millel on ebaoluline kõrvalmõju. Selles uuringus kavandatud hüdrogeelisüsteem pakub strateegiat alküülradikaalidel põhinevate ravisüsteemide tõhustamiseks.

Viited

1 D. Zhu, J. Zhang, G. Luo, Y. Duo ja BZ Tang,Adv. Sci., 2021, e2004769.

2 C. Huang, S. Ding, W. Jiang ja F.-B. Wang,Nanoskaala, 2021, 13, 4512–4518.

3 J. Wu, Y. Qu, K. Shi, B. Chu, Y. Jia, X. Xiao, Q. He ja Z. Qian,Lõug. Chem. Lett., 2018, 29, 1819–1823.

4 S. Ning, Y. Zheng, K. Qiao, G. Li, Q. Bai ja S. Xu,J. Nanobiotechnol., 2021, 19, 344. 

5 D. Zhu, T. Zhang, Y. Li, C. Huang, M. Suo, L. Xia, Y. Xu, G. Li ja BZ Tang,Biomaterjalid, 2022, 283, 121462. 

6 D. Zhu, R. Ling, H. Chen, M. Lyu, H. Qian, K. Wu, G. Li ja X. Wang,Nano Res., 2022, DOI:10.1007/s12274-022-4359-6. 

7 D. Zhu, M. Lyu, W. Jiang, M. Suo, Q. Huang ja K. Li,J. Mater. Chem. B, 2020, 

8, 5312–5319. 8 H. Ranji-Burachaloo, PA Gurr, DE Dunstan ja GG Qiao,ACS Nano, 2018, 12, 11819–11837. 

9 D. Zhu, Z. Liu, Y. Li, Q. Huang, L. Xia ja K. Li,Biomaterjalid, 2021, 274, 120894. 

10 X. Li, R. Luo, X. Liang, Q. Wu ja C. Gong,Lõug. Chem. Lett., 2021, DOI:10.1016/j.cclet.2021.11.048.