Mürtsetiin parandab härja LDL-i indutseeritud HUVEC-ide apoptoosi ja põletikku LncRNA GAS5 kaudu, reguleerides MiR 29a ekspressiooni 3p

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Ateroskleroos (AS) on oluline haigestumuse ja suremuse põhjus südame-veresoonkonna haiguste hulgas, mis on algselt põhjustatud endoteeli düsfunktsioonist ja mida iseloomustab aterogeensete lipoproteiinikomponentide sissevool. See on enamiku surmaga lõppevate haiguste, nagu müokardiinfarkt, ebastabiilne stenokardia, südame äkksurm ja insult, peamine potentsiaalne tegur. Kuigi sellega on seotud etioloogia, on kahjustusreaktsiooni teooria, mille kohaselt vaskulaarsete endoteelirakkude (EC) vigastus on AS-i initsiatiivmehhanism, endiselt laialdaselt omaks võetud3, 4.Oksüdeerivon näidatud, et madala tihedusega lipoproteiin (ox-LDL) osaleb ateroskleroosi tekkes ja selle indutseeritud veresoonte endoteeli kahjustus on üks ateroskleroosi varajastest patogeneesidest. Siiani on AS-i arengu kontrollimine endiselt suur väljakutse, kuna AS-i molekulaarseid mehhanisme ei mõisteta täielikult. Seetõttu võib ox-LDL-indutseeritud EÜ vigastuse vähendamine ja selle mehhanismi edasine selgitamine olla potentsiaalne strateegia AS-i ennetamiseks ja raviks. Mürtsetiin (Myr) on tavaline looduslik flavonoid, mida leidub paljudes puuviljades, köögiviljades ja maitsetaimedes. Myr mängib olulist rolli teatud haiguste, sealhulgas diabeetilise osteoporoosi, hepatotsellulaarse kartsinoomi8, alkohoolse maksa ravis ja ennetamisel.,ja nahavähk9,tänu oma võimsale raua kelaatimise võimele,antioksüdant ja vabu radikaale eemaldav tegevus. Hiljuti,kardioprotektiivneMyri roll on pälvinud teadlaskonna tähelepanu. Myr näitas kaitsvat toimet indutseeritud lipopolüsahhariidide (LPS) suhtespõletikuline müokardivigastus, südahüpertroofiaja isheemiast/reperfusioonist (I/R) põhjustatud müokardi vigastus3. Siiski ei ole Myri mõju lipiidide metabolismile ja ateroskleroosile täielikult teada.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

materjalid ja meetodid

Rakukultuur, ox-LDL-indutseeritud vigastuste mudel ja proliferatsioon.

Inimese nabaveeni endoteelirakke (HUVEC) Hiina Teaduste Akadeemia rakupangast (Shanghai, Hiina) kultiveeriti DMEM-is, millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i.normoksilinetingimused 37 kraadi juures. HUVEC-e töödeldi erinevate kontsentratsioonidega（50,100,200 ug/ml）härja-LDL（Union-Bio Technology,Hiina）ja koguti edasisteks mõõtmisteks 24 tunni pärast. Tootja juhiste kohaselt mõõdeti rakkude proliferatsioonikiirust CCK8 testiga (Solarbio, Hiina).

Cistanche võib parandada immuunsust

Apoptoosi voolutsütomeetria analüüs PI ja anneksiin V topeltvärvimisega.

Rakkude apoptoosi hinnati voolutsütomeetria abil, kasutades PI ja anneksiin V topeltvärvimise apoptoosi testi komplekti (Solarbio, Hiina), järgides tootja juhiseid.

Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) mõõtmine. Intratsellulaarne ROS määrati ROS Assay Kit abil（Beyotime,Hiina）. Lühidalt,rakke inkubeeriti 10 μM DCHF-DA-ga 20 minutit ja seejärel hinnati fluorestsentsi intensiivsust mikroplaadilugeja all.

RNA immunosadestamise (RIP) test.

RIP viidi läbi Magna RIP komplekti (Millipore, USA) abil, järgides tootja protokolli18. Lühidalt, HUVEC rakud koguti ja lüüsiti täielikus RIP lüüsipuhvris. Seejärel inkubeeriti täisrakuvalgu ekstrakti RIP puhvriga, mis sisaldas inimese anti-AGO2 antikeha või negatiivse kontrolli normaalse hiire IgG-ga konjugeeritud magnethelmeid. Seejärel tuvastati saadud RNA qRT-PCR abil.

RNA fluorestseeruva in situ hübridisatsiooni (FISH) test. GAS5 järjestuse ja miR-29a-3p spetsiifilised sondid kujundas ja sünteesis RiboBio. Sondi signaalide tuvastamiseks kasutati FISH Kit (RiboBio) vastavalt tootja juhistele. Tuumad värviti DAPI-ga.

Kahe lutsiferaasi reporteri test. GAS5 ja miR{3}}a-3p promootori piirkonna vahelise interaktsiooni tuvastamiseks kasutati kahe lutsiferaasi reporteranalüüsi.

Sidumiskohtade metsikut tüüpi ja mutatsioonijärjestused (WT-GAS5 ja MUT-GAS5) kavandati ja sünteesiti. HUVEC-rakud transfekteeriti kombinatsioonis WT(Mut)GAS5 vektori ja miR-NC või miR-29a-3p-ga, kasutades Lipofectamine 2000 transfektsioonireagenti (Invitrogen). Pärast 48-tunnist transfektsiooni kasutati lutsiferaasi testi läbiviimiseks Dual-Luciferase reporteranalüüsi süsteemi (Promega).

VCAM-1, IL-6 ja MCP-1 määramine.

Supernatant monotsüütide kemoatraktandi valgu -1(MCP-1), interleukiini-6 (IL-6) ja vaskulaarse raku adhesioonimolekuli 1 (VCAM{{6}) tasemed })määrati ELISA komplektidega. IL-6 ELISA komplekti (ab178013), MCP-1 ELISA komplekti (ab179886) ja VCAM-1 ELISA komplekti (ab223591) kasutati vastavalt tootja juhistele. juhiseid.

Reaalajas kvantifitseeritud PCR (gRT-PCR).

Kogu RNA eraldati Trizol reagendiga (Takara Bio Inc., Jaapan）vastavalt tootja protokollile. cDNA genereeriti kogu RNA-st（2 ug）cDNA pöördtranskriptsioonikomplektiga (Applied Biosystems, USA) ja kogu mRNA transkriptide tuvastamiseks Applied Biosystems (ABI) 7300 kiire reaalajas PCR süsteemis viidi läbi SYBR-põhine reaalajas PCR. Praimeri järjestused on loetletud allpool.

Western blot test.

Baxi, Bcl{0}}, kaspaas3, CD31, SM22a, p-p65, p65, p-IkBa, IkBa ja TLR4 valgu ekspressiooni mõõdeti Western blot analüüsiga. HUVEC rakkudest (25 ug) eraldatud valguproovid lahutati SDS-PAGE abil ja viidi seejärel polüvinülideenfluoriid (PVDF) membraanile (Millipore, USA), sondeeriti GAPDH-ga (#2118, 1:5000, Cell Signaling), Bax. (#2772S,1:1000, raku signaalimine), Bcl-2 (#15071S,1:1000, raku signaalimine), kaspaas3 (#9662S, 1:1000, raku signaalimine), CD31 (ab9498, 1:1000 , Abcam), SM22a (ab14106,1:1000,Abcam),p-p65 (10745-1-AP 1:1000, Proteintech), p65 (66535-1-Ig,1:1000,valgutehnoloogia), p-IkBa(10268-1-AP,1:1000, Proteintech),IkBa(66418-1-Ig,1:1000, Proteintech) ja TLR4(66350-1-Ig, 1:1000, Proteintech) antikehad millele järgneb sobiv sekundaarne antikeha. Kõiki Western blotte korrati vähemalt kolm korda. Lõpuks visualiseeriti valgu ekspressioon täiustatud kemiluminestsentsi (ECL) süsteemiga.

Immunofluorestsentsanalüüs.

Slaididel kasvatatud rakud fikseeriti, permeabiliseeriti, blokeeriti ja immunovärviti üleöö CD31 (ab9498, 1:200, Abcam) ja SM22a (ab14106, 1:200, Abcam) antikehadega. Pärast pesemist inkubeeriti spetsiifilisi teisi FITC-märgistatud IgG antikehi pidevalt rakkudega. Lõpuks saadi pildid sobiva suurendusega mikroskoobi all (Olympus, Jaapan).

Statistiline analüüs. Kõik tulemused on näidatud keskmisena ± keskmise standardviga (SEM). Statistiliselt olulised tulemused määrati ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes Student-Newman-Keuls(SNK)q test. p-väärtus<0.05 was="" considered="" to="" be="">

Tulemused

Mürtsetiin nõrgendab HUVEC-ides ox-LDL-indutseeritud apoptoosi ja ROS-i.

Esiteks põhjustas 24-tunnine 100 ug/ml ox-LDL-i inkubeerimine rakkude elujõulisuse olulise annusest sõltuva vähenemise. Eeltöötlemine l uM Myr-ga 2 tunni jooksul ei mõjutanud oluliselt rakkude elujõulisust. Kuid,2,5 ja 5 μM Myr põhjustasid rakkude elujõulisuse olulise vähenemise (joonis 1A ja B). Lisaks märkasime, et ox-LDL-i poolt indutseeritud ROS-i suurenemist HUVEC-des vähendas Myr (joonis 1C). Uurisime ka Myri mõju apoptoosile. Veelgi enam, voolutsütomeetria ja apoptoosiga seotud valgu tulemused näitasid ka, et 100 ug/ml ox-LDL-indutseeritud HUVEC-i apoptoos oli annusest sõltuvalt vastupidine MYR-i eeltöödeldud rakkudele (joonised 1D ja E).

Mürtsetiin inhibeerib põletikulist vastust ja EndMT-d ox-LDL-indutseeritud HUVEC-rakkudes. Immunofluorestsentsvärvimine näitas, et HUVEC-ide inkubeerimine ox-LDL-iga vähendas endoteeli markeri CD31 ekspressiooni ja suurendas mesenhümaalse markeri SM22a ekspressiooni, mis näitab, et ox-LDL-i seisund käivitab EndMT. Kuid MYR leevendab neid mõjusid. Järjekindlalt näitas Western blot, et Myr nõrgendas ülesreguleeritud SM22a valgu taset ox-LDL-i poolt indutseeritud HUVEC-des (joonis fig 2A ja B). Ox-LDL-i juuresolekul on IL-6, MCP{{ mRNA tasemed. 11}}, VCAM-1 olid HUVEC-ides ilmselgelt ülesreguleeritud, samas kui ravi Myr'iga muutis need kõrvalekalduvad muutused (joonis 2C). Sarnaseid tulemusi kinnitati ka ELISA abil (joonis 2D).

GAS5 üleekspressioon nõrgendab müritsetiini kaitsvat toimet ox-LDL-vahendatud HUVEC iniuri vastu.

Lisaks tuvastasime gRT-PCR abil GAS5 ekspressiooni HUVEC-ides. Nagu on näidatud joonisel 3A, täheldati ox-LDL rühmas oluliselt kõrgemat GAS5 taset kui kontrollrühmas. Seevastu GAS5 mRNA tase vähenes Myr-ga töödeldud rühmas annusest sõltuval viisil. Need andmed näitasid, et GAS5 võib mõjutada Myri toimet endoteelirakkudele. Et mõista mehhanisme, mille abil GAS5 võib kaasata Myri kaitsvasse toimesse, kasutasime pcDNA-GAS5 GAS5 ekspressiooni üleekspresseerimiseks HUVEC-ides. GAS5 ekspressiooni võimendas pcDNA-GAS5, mida algselt vähendas Myr ox-LDL-indutseeritud HUVEC-des (joonis 3B). Täiendavad katsed näitasid, et GAS5 üleekspressiooniga HUVEC-rakkude elujõulisus vähenes oluliselt ja apoptoos suurenes märgatavalt Myr-ravi ajal (joonised 3C ja D). Lisaks näitas GAS5 üleekspressioon ox-LDL-ga töödeldud HUVEC-des kõrgemat ROS-i sisaldust võrreldes sobitatud kontrolliga (joonis 3E). Need andmed viitavad sellele, et GAS5 ekspressiooni ülesreguleerimine nõrgendab Myri kaitsvat toimet ox-LDL-vahendatud HUVEC-i vigastuste vastu.

miR-29a-3p on HUVECis GAS5 sihtmärk.

Siht-GAS5 tuvastati RegRNA 2.0 ja star-Base kaudu, otsingutulemused on näidatud joonisel 4A. Nende miRNA-de hulgas oli miR-29a-3p kõige olulisem ox-LDL-vahendatud HUVEC-kahjustuse vähenemine (joonis 4B). GAS5 ja miR{11}}a-3p vaheliste seondumispiirkondade ennustamiseks viidi läbi bioinformaatika analüüsid (joonis 4C). Selle bioinformaatika ennustuse kinnitamiseks näitasid kahe lutsiferaasi reportergeeni testid, et GAS5-WI näitas madalamat lutsiferaasi aktiivsust kui vastav MUT rühm, mis kinnitas GAS5 ja miR-29a-3p seostumist. (joonis 4D). Samal ajal oli Ago2 RIP-ga rikastatud GAS5 tase miR-29a-3p-ga transfekteeritud rakkudes kõrgem kui miR-NC rühmas (joonis 4E). Vahepeal näitas FISH-analüüs HUVECrakkudes, et GAS5 paiknes koos miR-29a-3p-ga peamiselt tuumas (joonis 4F). Need leiud viitasid sellele, et GAS5 sihib miR-29a-3p.

miR-29a-3p matkisid GAS5 mõju müritsetiiniga ravitud ox-LDL-indutseeritud HUVEC-is.

Nagu on näidatud joonisel 5A, suurenes miR-29a-3p ekspressioon oluliselt ox-LDL pluss Myr pluss pcDNA-GAS5 pluss miR-29a-3 p matkinud rühma võrreldes ox-LDL pluss Myr pluss pcDNA-GAS5 pluss miimika kontrollrühmaga (joonis 5A). Veelgi enam, ülesreguleeritud GAS5 suurendas märkimisväärselt Myriga töödeldud ox-LDL-i indutseeritud HUVEC-de elujõulisust, samal ajal kui pcDNA-GAS5andmiR-29a-3p jäljendid HUVEC-idesse kaotasid need mõjud (joonis 5B). Lisaks indutseeris ROS-i tootmine ja apoptoos ox-LDL-is HUVEC-ides, mida raviti Myr'iga pärast GAS5 üleekspressiooni, samas kui miR-29a-3p imiteerisid need efektid (joonised 5C ja D).

sh-GAS5 või miR-29a-3p jäljendid võivad kiirendada müritsetiini kaitsvat rolli ox-LDL-indutseeritud HUVEC-rakkudes.

Uurimaks, kas GAS5 ja miR-29a-3p osalesid Myr-vahendatud regulatsioonimehhanismis, transfekteeriti HUVEC-id NC-ga, sh-GAS5 jäljendab kontrolli, miR-29a{{7} }p jäljendab. GAS5 ekspressioon oli sh-GAS5 rühmas oluliselt vähenenud võrreldes NC rühmaga (joonis 6A). Pärast transfektsiooni suurendas ox-LDL pluss Myr elujõulisust võrreldes ox-LDL rühmaga ning GAS5 või ülesreguleeritud miR-29a-3p inhibeerimine suurendas ox-LDL-i indutseeritud HUVEC-de elujõulisust, mida raviti Myr (joonis 6B). Lisaks piiras Myr ox-LDL-i põhjustatud raku apoptoosi, mida hiljem muutsid sh-GAS5 ja miR{22}}a-3p jäljendid (joonis 6C). Lisaks tõusis CD31 ja SM22a valgu tase

Mürtsetiin inaktiveeris TLR4/NF-KB signaaliraja ox-LDL-ga töödeldud HUVEC-is, vähendades GAS5 või ülesreguleerides miR-29a-3p. TLR4/NF-KB signaalirada on AS-i protsessis tihedalt seotud. Selleks et uurida, kas Myr pärssis TLR4/NF-B signaalirada, tuvastati HUVEC rakkudes Western blot abil TLR4 ja mitmed pöördelised allavoolu valgud, nt p-p65, p65, p-IkBa, IkBa ja TLR4. analüüs. Joonis 6 näitab, et Myr vähendas p-p65, p-IkBa ja TLR4 ekspressiooni võrreldes ox-LDL rühmaga, samas kui p-p65, p-IkBa valgu tase. ja TLR4 vähenesid ox-LDL pluss Myr pluss sh-GAS5 ja ox-LDL pluss Myr pluss miR-29a-3p matkimisrühmades võrreldes ox-LDL pluss Myr rühmaga (joonis 7). . Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB rada võib olla üks alusmehhanismidest, mille kaudu Myr vähendas HUVEC-rakkude põletikulist ja EndMT-d. Arutelu

AS on püsiv põletikuline seisund, mis saab alguse madala tihedusega lipoproteiinide ladestumisest ja kuhjumisest arteri seina19. Hoolimata tohututest edusammudest nii põhi- kui ka teadusuuringutes on see endiselt üks peamisi surmapõhjuseid maailmas2. Selles uuringus uurisime Myri molekulaarset mehhanismi HUVEC-ide ox-LDL-indutseeritud kahjustuste korral, paljastades lncRNA GAS5 otsustava rolli selles sündmuses. Meie tulemused näitasid, et Myr reguleerib HUVEC-i rakkude elujõulisust, ROS-i, apoptoosi, põletikku ja EndMT-d läbi GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB raja, selgitades Myri uut mehhanismi. kaitseb AS-i eest.

On näidatud, et Ox-LDL kutsub esile ROS-i suurenenud põlvkonna, mis mängib AS-i progresseerumisel olulist rolli. Olulised tõendid näitavad, et suurenenud oksüdatiivne stress mängib olulist rolli veresoonte endoteeli düsfunktsiooni patogeneesis koos endoteelirakkude EndMT, põletiku ja apoptoosiga. Varajase ateroskleroosi esinemise simuleerimiseks kasutasime ox-LDL-ga stimuleeritud HUVEC-e ning HUVEC-ide põletikuline reaktsioon ja EndMT-d suurenesid ning Myr inhibeeris märkimisväärselt põletikulist vastust ja EndMT-d ox-LDL-iga stimuleeritud HUVEC-dele. Myr avaldab teadaolevalt antioksüdatiivset tsütoprotektiivset toimet erinevates rakkudes, sealhulgas HUVEC rakuliinis21. Eelmises uuringus leiti, et Myr avaldas LPS-indutseeritud kardiomüotsüütide H9c2 rakkude vigastuste korral proproliferatiivset ja apoptootilist toimet . Selles uuringus kontrollisime Myri tulemusi ox-LDL-indutseeritud aterosklerootiliste rakkude versiooni kohta. Meie tulemused näitasid, et 5 μM Myr-i eeltöötlus võib märkimisväärselt ümber pöörata ox-LDL-indutseeritud rakkude elujõulisuse alareguleerimise HUVEC-ides. Meie tulemused näitasid, et ox-LDL-ravi võib reklaamida HUVEC-de põletikku ja EndMT-d, reguleerides CD31, SM22a ja põletikulisi tsütokiine (IL-6, MCP-1, VCAM-1), mis saab Myr-i eeltöötlusega tagasi pöörata. Mitmed elemendid näitasid, et ateroskleroosiga kaasnevad põletik ja EndMT23. Eelmises uuringus leiti, et VCAM-1 ja ICAM-1 ekspressiooni pärssimine on tunnistatud oluliseks ateroskleroosivastaseks strateegiaks24. Veelgi enam, vaktsiin pärssis ox-LDL-indutseeritud endoteeli EndMT, vähendades endoteeli markerit CD31 ja suurendades mesenhümaalset markerit SM22a25. Meie tulemused on nende uuringutega oluliselt kooskõlas.

GAS5 ekspressioon oli kõrgelt ekspresseeritud nii inim- kui ka loomamudelites26, 27. Selles uuringus leidsime, et ox-LDL-indutseeritud HUVEC vigastuse korral oli GAS5 ülesreguleeritud ja miR{4}}a-3p alareguleeritud. . Myr-ravi võib need mõjud tagasi pöörata. Eelmine uuring näitas, et Mvr inhibeeris HMGB1, TLR4 ja MyD88 ekspressioone neuronites ning taastas NF-KB ja MAPK signaaliradade aktiveerimisest põhjustatud neuronite kahjustused ja põletiku*8. Selles uuringus lncRNA GAS5 ülesreguleerimine ja miR-29a-3p allareguleerimine põhjustas raku apoptoosi, põletiku ja EndMT vähenemise, samuti TLR4/NF-KB signaaliraja aktiivsuse vähenemise. Meie leidude kohaselt vähendab Myr HUVEC-ides p-p65,p-IkBa ja TLR4, reguleerides GAS5/miR-29a-3p-d, nõrgendes põletikulist vastust ja EndMT-d ox-LDL-indutseeritud HUVEC-kahjustuse korral. Lõpuks näitas meie uuring, et Myr on võimeline leevendama raku apoptoosi, rakupõletikku ja EndMT-d GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB raja kaudu (joonis 8), mis viitab sellele, et Myr kui võimalik AS-i raviaine. Lisaks pakuti, et GAS5 on paljutõotav sihtmolekul, mis hõlmab AS-i patofüsioloogilisi protsesse.

Viited

1. Kondapalli, L., Bottinor, W.&Lenneman, C. Immunoteraapiaga pidurite vabastamisega kiirendame ateroskleroosi teket?.

Tiraaž 142(24), 2312-2315(2020).

2. Libby, P.Ridker, PM& Hansson, GKPogress ja väljakutsed ateroskleroosi bioloogia tõlkimisel. Nature 473 (7347),

317-325 (2011).

3. Couto, NFet al. OxLDL-i muutused endoteelirakkude membraani dünaamikas põhjustavad muutusi vesiikulite kaubitsemises ja suurenemises

rakkude vastuvõtlikkus vigastustele.Biochim.Biophys.Acta Biomembranes 1862,183139 (2019).

4. Yamagata, K. Epigallokatehhiingallaadi kaitsev toime endoteeli häiretele ateroskleroosi korral. J. Cardiovasc. Pharmacol.75,

292-298(2019).

5. Gao, S. & Liu, J. Tsirkuleeriva oksüdeeritud madala tihedusega lipoproteiini ja aterosklerootilise kardiovaskulaarse haiguse seos.

Krooniline Dis. Tõlk. Med. 3(2),89-94 (2017).

6. Torisu,K. jt.Vaskulaarsete lipiidide homöostaasi säilitamiseks on vajalik puutumatu endoteeli autofagia.Aging Cell15(1),187-191 (2016).

7. Pan,X. jt. Nrf2/HO-1 signaali aktiveerimine müritsetiiniga ECM-i degradatsiooni nõrgendamiseks inimese kondrotsüütides ja hiire osteoartriidi leevendamiseks. Int. Immunopharmacol. 75,105742 (2019).

8. Li, M. et al. Myricetin pärsib hepatotsellulaarse kartsinoomi levikut YAP ekspressiooni allareguleerimise kaudu. Lahtrid 8(4),

358(2019).

9. Guo, C. et al. Mürtsetiin parandab etanoolist põhjustatud lipiidide akumulatsiooni maksarakkudes, vähendades rasvhapete biosünteesi. Mol

Nutr. Food Res. 63(14), e1801393 (2019).