Müeloidne heterogeensus neeruhaiguste korral, mis on ilmnenud üherakulise RNA järjestamise kaudu

Abstraktne

Neeruhaigused kujutavad endast üha suureneva levimusega ülemaailmset tervisekoormust ja on sõltumatu südame-veresoonkonna haiguste riskitegur. Müeloidrakud on immuunsüsteemi peamine rakuline osa; neid leidub terves neerus ja üha rohkem kahjustatud ja/või haiges neerus, kus nad toimivad vigastuste, põletiku ja fibroosi progresseerumisel võtmeisikutena. Neil on tohutu plastilisus ja heterogeensus, võttes vastuseks kohaliku miljöö stiimulitele omaks erinevad fenotüübilised ja funktsionaalsed omadused. Kuigi seda loomupärast keerukust tuleb neerudes veel täielikult mõista, lubavad üherakulise genoomika edusammud seda muuta. Täpsemalt, üherakuline RNA sekveneerimine (scRNA-seq) on avaldanud transformatiivset mõju neeruuuringutele, võimaldades profileerida ja analüüsida üksikute rakkude transkriptoome enneolematu eraldusvõime ja läbilaskevõimega ning seejärel luua rakuatlasi. Edasi liikudes, scRNA- ja ühetuumalise RNA-seq kombineerimine suurema eraldusvõimega ruumilise transkriptoomikaga võimaldab erineva etioloogiaga neeruhaiguste ruumilist kaardistamist, et veelgi paljastada immuunrakkude ja mitteimmuunsete neerurakkude muster. See ülevaade võtab kokku müeloidrakkude rollid neerude tervises ja haigustes, eksperimentaalne töövoog on praegu saadaval scRNA-seq tehnoloogiate jaoks ja avaldatud leiud, kasutades scRNA seqi müeloidrakkude ja neeru kontekstis.

Click to herba Cistanche kasulikud omadused neerudele

Rachel MB Bell ja Laura Denby

Sissejuhatus

Neer on keeruline organ, mis täidab erinevaid füsioloogilise homöostaasi jaoks olulisi funktsioone ja seetõttu esineb neeruhaigusega patsientidel sageli olulisi tüsistusi ja kaasuvaid haigusi (1, 2). Neeruhaiguse ilmingud on laiaulatuslikud, hõlmates ägedat neerukahjustust (AKI), autoimmuunhäireid ja neerusiirdamise äratõukereaktsiooni, mis kõik on otseselt või kaudselt immuunvahendatud (3). Suurenenud esinemissageduse tõttu on neeruhaigustel suur mõju ülemaailmsele tervisele nii haigestumuse ja suremuse otsese põhjusena kui ka südame-veresoonkonna haiguste peamise riskitegurina (1). Müeloidrakud on kehas kõige arvukamad tuumaga vereloomerakud, mis hõlmavad monotsüüte, makrofaage, dendriitrakke (DC) ja granulotsüüte. Müeloidrakud moodustavad immuunsüsteemi kriitilise osa ja neil on erinevad funktsioonid (4). Neerudes on makrofaagid ja DC-d pärast mitmesuguseid solvanguid näidanud, et need mõjutavad elundi homöostaasi, vigastusi ja reparatiivseid protsesse. Nende funktsioon, fenotüübiline spekter ja koosmõju teiste immuun- ja mitteimmuunrakkudega on keerulised ja mittetäielikult mõistetavad (3, 5). Meie arusaam immuunsüsteemist on arenenud tänu tehnoloogiate rakendamisele, mis võimaldavad üherakulist eraldusvõimet, peamiselt mikroskoopiat ja voolutsütomeetriat. Nende tehnoloogiatega samaaegselt mõõdetavate parameetrite arv on piiratud ja sõltub eelnevatest teadmistest selle kohta, millised antigeenid on olemas. Viimaste aastate edusammud üherakulise RNA sekveneerimise (scRNA-seq) vallas, mille eesmärk on mõõta geenide ekspressioonitasemeid rakkudes, on muutnud meie võimet profiilida immuunrakke (2, 6, 7).

Müeloidrakkude roll neerude tervises ja haigustes

Müeloidrakud on kohanemisvõimelised, näidates mööduvaid reaktsioone, kontrollitud diferentseerumist, kudedesse (ümber)paigutamist ja plastilisust vastuseks erinevatele keskkonnastiimulitele, olgu need siis homöostaatilised või põletikulised (4). See kujutab endast komplikatsiooni seoses nende neeruuuringuga, kuna see peamine hemofiltratsioonielund pakub väljakutseid pakkuvat miljööd, mis ei ole ruumiliselt ühtlane, ning on teatatud erinevustest immuunrakkude tüüpides neerukoores ja medullas (8, 9). Makrofaagid on neerudes kõige levinumad müeloidsed rakutüübid ja koos DC-dega koordineerivad põletikulisi reaktsioone vabalt filtreeritud antigeense materjali suhtes ja kaitsevad neerude nakatumise eest (8). Oluline on see, et nad osalevad ka neeruhaiguse tekkes ja progresseerumises ning sellele järgnevas kudede regenereerimises. Selle mitmekesisuse tõttu soovitatakse üldiselt makrofaagid jagada põletikueelseteks (M1 või "klassikaliselt aktiveeritud") ja kudede reparatiivseteks (M2 või "alternatiivselt aktiveeritud") fenotüüpideks.

Kuid see iseloomustus on liiga lihtsustatud, kuna mitte ainult makrofaagid, vaid ka DC-d, millel on loomupärane plastilisus. Tõepoolest, on kindlaid tõendeid haigusega seotud müeloidrakkude kohta, millel on nii pro- kui ka põletikuvastased tunnused markergeenid (4, 10). Immuunrakke määratlevad tavaliselt erinevad rakupinna markerid, kuigi erinevatel müeloidrakkude tüüpidel on palju ühiseid markereid; seetõttu on huvipakkuva rakutüübi tuvastamiseks sageli vaja mitmeid markereid. Lisaks võivad markerid liikide lõikes erineda (tabel 1). Immunohistokeemiat ja kaastsütomeetriat kasutatakse sageli nii intra- kui ka ekstratsellulaarsete markerite tuvastamiseks (6). Hiirtel on neerudes elavatel makrofaagidel (CD11bloF4/80hi) kahekordne hematopoeetiline päritolu, mis tulenevad munakollasest ja lõplikust vereloomest, kusjuures Ly6Clo "patrullib" monotsüüte (inimestel CD14loCD16hi) (11–13). Põletikulistes tingimustes tungivad Ly6Chi monotsüüdid (inimestel CD14hiCD162) neerudesse, diferentseerudes (CD11bhiF4/80lo) makrofaagideks (11–13). Vaatamata sellele, et tsütomeetria piirdub umbes 16 parameetriga ja spektraalsest kattumisest tulenevate probleemidega, on eriti kaastsütomeetria olnud väga kasulik ja esindab kõige elementaarsemat üherakutehnoloogiat, kuid tõenäoliselt ei paku see müeloidrakkude täielikku fenotüübilist spektrit (6). ,7,10).

Ülevaade üherakulistest sekveneerimistehnoloogiatest

Suure läbilaskevõimega geeniekspressiooni tehnikad, nagu microarray ja RNA-seq, on andnud parema arusaamise elundite keerulistest transkriptoomidest; nende RNA sisendnõuetel on aga piiratud populatsioonide uuringud. Kuna neer sisaldab 0,20 erinevat rakutüüpi (sealhulgas epiteeli-, endoteeli-, mesenhümaalsed ja immuunpopulatsioonid), peegeldab neerukoe geeniekspressiooniprofiil ainult nende heterogeensete koostisosade keskmist (14). Neeru sees domineerib proksimaalsete tuubulite rakkude arv ja võib seega varjata haruldasemate populatsioonide ekspressiooniprofiili. scRNA-seq tehnoloogiad on neid piiranguid käsitlenud, võimaldades konkreetse proovi üksikute rakkude transkriptoome objektiivselt uurida imetajate neerukomponentide rakuatlaste loomisega. Nimelt on neeruuuringute kogukond investeerinud avatud juurdepääsusse ja teinud need andmed veebisaitide kaudu vabalt kättesaadavaks (tabel 2). See võimaldab erapooletult hinnata raku heterogeensust, tuvastada uusi raku olekuid ja alatüüpe ning dünaamilisi raku üleminekuid väga kõrge eraldusvõime ja täpsusega (6, 14, 15).

Praeguseks on välja pakutud mitmeid scRNA-seq tehnikaid ja uute protokollide väljatöötamine on väga aktiivne uurimisvaldkond (nagu on läbi vaadanud Li ja Humphreys [16]). Üldiselt jagavad kõik scRNA-seq katsed ühist töövoogu: proovide ettevalmistamine, ühe raku püüdmine, pöördtranskriptsioon ja transkriptsiooni amplifikatsioon, raamatukogu ettevalmistamine, sekveneerimine ja analüüs (joonis 1). Ühetuumaline RNA-seq (snRNA-seq) on scRNA-seq-i üha populaarsem alternatiiv. Siin eraldatakse rakkudest tuumad ja neid kasutatakse tilgapõhiseks sekveneerimiseks (14). On teatatud, et snRNA-seq-il on täiskasvanu neeru scRNA-seq-ga võrreldav geenituvastus ja see kõrvaldab dissotsiatsioonist põhjustatud transkriptsioonilised stressireaktsioonid põletikulises fibrootilises neerus. Lisaks ühildub see külmutatud proovidega, kuid püüab immuunrakke madalama efektiivsusega (19). Selle põhjus jääb selgusetuks. Seetõttu võib olla vajalik isoleerida CD451 rakud, mis moodustavad vaid 2–17 protsenti kogu neerurakkude populatsioonist (20), et saada selle meetodi abil võimalikult suur ülevaade neerude leukotsüütidest.

Arendamisel on palju teisi üherakulisi tehnikaid, mis võimaldavad otsest mikroRNA-, proteoomi- või metaboolsete andmete mõõtmist, mida scRNA-seq ja snRNA-seq lähenemisviisid ei paku. Kõige olulisem on see, et nüüd on võimalik transkriptide ja rakupinna valkude samaaegne ekspressiooniprofiil, nagu RNA ekspressiooni ja valgu (REAP) järjestamine (21) ning transkriptoomide ja epitoopide rakuline indekseerimine (CITE) sekveneerimise teel (22), mis võimaldab korrelatsiooni. valgu ekspressioonist koos transkriptoomiliste andmetega. Lisaks võimaldab transposaasile ligipääsetava kromatiini (ATAC) analüüs koos sekveneerimisega profileerida kromatiini ligipääsetavust, võimaldades uurida epigeneetilist heterogeensust (23). Seda on hiljuti kasutatud kombinatsioonis snRNA-seq-ga, et tuvastada ainulaadsed rakuseisundid proksimaalses tuubulis ja paksus tõusvas jäsemes inimese neerus (24) ning peamised kromatiini remodelleerumissündmused ja geeniekspressiooni dünaamika, mis on seotud neerude arenguga hiirtel (joonis 2). ) (25).

Kuna neerudel on selged piirkondlikud erinevused, on rakkude anatoomiline lokaliseerimine ja rakkudevahelised interaktsioonid olulised, kuid need tegurid lähevad dissotsieerunud üksikute rakkude analüüsimisel suures osas kaotsi. Koostoimeid võib mõnevõrra tuvastada kemokiinide ja tsütokiinide retseptor-ligand paari analüüsidest; sellistele küsimustele täielikuks vastamiseks on aga vaja rakkudevaheliste ruumisuhete otsest visualiseerimist. See tähendab lisaks, et ei ole võimalik eristada leukotsüütide populatsioone, mis infiltreeruvad või asuvad neerudes, nendest, mis võivad ringelda neeruveresoonkonna kaudu (6, 15). scRNA-seq ja snRNA-seq kombineerimine ruumilise transkriptoomikaga võib seda aspekti parandada. Tõepoolest, Ferriera et al. (26) kasutas hiljuti neid täiendavaid tehnoloogiaid transkriptoomilise allkirja ruumiliseks kaardistamiseks hiire AKI mudelites ja näitas, kuidas seda saab rakendada inimese proovidele. Nad tuvastasid immuun- ja epiteelirakkude kolokaliseerimise mustrid ja kuigi need on resolutsiooniga piiratud, paranevad need metoodikad tõenäoliselt tulevase tööga.

scRNA-Seq uuringud neeru tervises

Normaalse neeru terviklik rakuline anatoomia on neeruhaiguse arengu ja lahenemise täielikuks mõistmiseks ülioluline; kuid siiani on katsed täielikult kaardistada immuunpopulatsioone neerudes tervises piiratud. 2018. aastal tegid Park jt. (2) andis seni esimese ja suurima ulatusega hiire neeruraku scRNA-seq tervest hiire neerust. Nad tuvastasid peamised raku alatüübid, mis hõlmavad nefroni ja varem teadaolevaid neeru immuunrakkude tüüpe, sealhulgas makrofaagid ja neutrofiilid. Siiski on võimalik, et mõned müeloidsed alatüübid jäid avastamata, võib-olla tingitud immuunrakkude tüüpidest, mis moodustasid väikese osa vigastamata neerudest, ja/või proovide ettevalmistamise tõttu, kuna ligikaudu 25 protsenti rakkudest ei läbinud selles uuringus kvaliteedikontrolli.

Hiljutises võtmeuuringus kasutati scRNA-seq koos voolu- ja massitsütomeetriaga, et määratleda tervete inimeste täiskasvanud ja loote neerude globaalne immuunmaastik, profileerides rakke kogu eluea jooksul (9). Mononukleaarsed fagotsüüdid (MNP-d), looduslikud tapjarakud (NK) ja T-rakud olid kõige levinumad ning küpse neeru müeloidsektsioonis tuvastati neli MNP-de, neutrofiilide, nuumrakkude ja plasmatsütoidsete DC-de (pDC) alamhulka. MNP klastris domineerisid kaks monotsüütidest pärinevat makrofaagipopulatsiooni: üks oli transkriptsiooniliselt sarnane CD141 klassikaliste monotsüütidega ja teine ​​CD161 mitteklassikaliste monotsüütidega. See sisaldas ka tavalist DC (CDC) populatsiooni ja koe-makrofaagide populatsiooni, mis oli kaldu CD206 ekspresseeriva põletikuvastase M2 transkriptoomi poole. Lisaks näitasid teadlased immuunrakkude anatoomilist lokaliseerimist, viidates oma töödele teadaolevatest neerupiirkondadest genereeritud avalikult kättesaadavatele RNA-seq-andmetele, mis näitasid immuunsüsteemi alamhulkade erinevat jaotust medullas ja vaagnas võrreldes ajukoorega. Ligand-retseptori interaktsioonide analüüs, mis näitab epiteeli ja immuunrakkude ristkõnet, ennustas, et see lokaliseerib antibakteriaalsed makrofaagid ja neutrofiilid neerupiirkondades, mis on kõige vastuvõtlikumad kuseteedest tõusva infektsiooni suhtes. See on kooskõlas varasema tööga, mis näitas, et medulla kõrge interstitsiaalne naatriumi kontsentratsioon stimuleerib kemokiinide tootmist tubulaarsete epiteelirakkude poolt, mis aitab makrofaagidel positsioneerida, et seista vastu tõusva bakteriaalse infektsiooni põhjustatud immunoloogilise ohu vastu (8). Loote neerudes puudus võime korraldada immuunrakkude lokaliseerimist konkreetsetesse piirkondadesse, kusjuures postnataalne transkriptsioonisignatuuride omandamine viitab rollile põletikus ja immuunkaitses (9). Veel üks hiljutine Menoni jt uuring. (27) tuvastatud residendist immuunrakud kasvaja-nefrektoomia, seire- ja reperfusioonibiopsiate mittehaigestunud inimese proovides; need hõlmasid kahte müeloidset klastrit, kuigi neid ei määratletud alatüüpideks.

Dünaamilised muutused immuunsüsteemis on vananemise tunnus (28). Hiljuti viidi scRNA-seq läbi 0,350,000 rakkudega mitmetest elunditest ja kudedest, mis võeti C57BL/6J hiirtelt, kes kuulusid vanuserühmadesse 1 kuni 30 kuud (29). Pärast üldise mitmekesisuse skoori arvutamist tuvastati kaks neeru makrofaagide klastrit, mille koostis muutus vanusega oluliselt. Üks klaster koosnes enamasti 1- ja 3-kuuste hiirte rakkudest, mis olid rikastatud põletikuvastase tunnusega (nt Cq1a, Cd74, Cd81). Ja vastupidi, teine ​​klaster koosnes peamiselt 18-, 21-, 24- ja 30-kuuste hiirte rakkudest, mis meenutasid põletikueelset makrofaagi seisundit (nt Intgal, Msrb1). Praegu puuduvad sellised põhjalikud vananemisuuringud inimestel, kuid need on tulevikus olulised, kuna neeruhaiguste levimus suureneb koos vanusega (1).

Kuigi uuringuid on tehtud nii inimese kui ka hiire kudedega, esineb piisavalt värskete inimproovide hankimisel puudujääke, mis rõhutab translatsiooniprobleemide ületamise tähtsust. Uuringud on tuvastanud müeloidsete rakutüüpide täpselt määratletud markerid hiire kudedes, kuid neil puudub liikide säilivus. Tuntud näide on F4/80 (kodeeritud adgre1-ga), mida kasutatakse kudedes elavate makrofaagide tuvastamiseks hiirtel, kuid mida ei ekspresseerita inimestel makrofaagide populatsioonid. Lisaks on teada, et markereid, mida ajalooliselt kasutati DC-de eristamiseks makrofaagidest, nagu CD11c ja MHCII, ekspresseerivad tavaliselt koe makrofaagid (28, 30). Zimmerman et al. (31) kasutas scRNA-seq, et tuvastada liikidevahelise neeru makrofaagispetsiifiline marker. CD451 rakud, välja arvatud lümfotsüütide populatsioon, eraldati ühest hiirest, rotist, sea ja inimese neerust, paljastades rakuklastri, mis ekspresseerib C1q-d. Teised hiirte (2, 10) ja inimeste (32) terve neerukoe scRNA-seq analüüsid on samuti tuvastanud selle C1q-d ekspresseeriva klastri. C1q-d ekspresseerivas klastris tuvastati uudsed pinnamarkerid Cd74 ja Cd81 potentsiaalsete kandidaatmarkeritena neerudes elavate makrofaagide vahel liikide lõikes (31). Need kinnitati voolutsütomeetria analüüsidega, mis näitasid, et CD741 CD811 rakud esinesid residentides (CD11bloF4/80hi) rohkem kui infiltreeruvates (CD11bhiF4/80lo) makrofaagides, ja need kinnitasid minimaalset vahetust luuüdist pärinevate rakkudega, kasutades parabiootilist hiiremudelit. Jääb teadmata, kas need kandidaadid varieeruvad kogu põletiku ajal. Tõepoolest, meie pöörduva ühepoolse ureetra obstruktsiooni (R-UUO) uuringus varieerus C1qa ekspressioon 12 müeloidse alamrühma vahel (10). Tulevikus on oluline täiendavalt uurida hiire tüve mõju tulemuste kontekstualiseerimiseks. Tõepoolest, sisearetatud laborihiirte tüved võivad oma immuunvastuse mustrites olla väga erinevad; Näiteks pärast ühepoolset isheemilist reperfusioonikahjustust (IRI) on 129/Sv hiirtel vähem infiltreeruvaid leukotsüüte kui C57BL6/J hiirtel (33).

scRNA-Seq uuringud neerukahjustuste ja -haiguste alal

Neeruhaiguste ajal esineb faasist sõltuv müeloidrakkude sissevool ja muutused nende fenotüübis (34). Rakulise maastiku määratlemiseks AKI progresseerumisel krooniliseks neeruhaiguseks (CKD), Valle Duraes et al. (35) kasutasid scRNA-seq ühepoolses IRI mudelis koos kohese kontralateraalse nefrektoomiaga või ilma, et uurida vastavalt neeru regeneratsiooni või fibroosi. Tuvastati seitse peamist klastrit, sealhulgas püsivad ja põletikulised makrofaagid, neutrofiilid/monotsüüdid, DC/monotsüüdid, NK-rakud, T-rakud ja B-rakud. Terves neerus domineerisid püsivad makrofaagid, samas kui pärast vigastust laienesid põletikulised makrofaagid märkimisväärselt ja residendist makrofaagid kadusid, olenemata kasutatud mudelist või vigastusejärgsest ajahetkest. Neutrofiilide / monotsüütide ja DC / monotsüütide segapopulatsioonid laienesid ka pärast vigastust. Teises uuringus kasutati snRNA-seq koos AKI kahepoolse IRI mudeliga (36). Kuigi siin olid fookuses proksimaalsed tuubulid, tuvastati kuus leukotsüütide klastrit: kolm makrofaagi alatüüpi, DC-d, T-rakud ja B-rakud. Kombineeritud leukotsüütide klastri ligand-retseptori analüüs viitas muutustele Ccl2 (tubulointerstitium) ja Ccr2 (leukotsüüdid) signaaliülekandes aja jooksul; fibroblastid ja endoteelirakud olid esimesed rakutüübid, mis andsid signaali leukotsüütidest, millele järgnes leukotsüütide-leukotsüütide signaalimine ja suurenev Ccl{11}}Ccr2 signaaliülekanne proksimaalsetest tuubulitest, mis ei paranenud 2 päeva ja 6 nädalat pärast vigastust. Esimene ja teine ​​makrofaagide klaster on tõenäoliselt püsivad ja põletikulised makrofaagid, mis põhinevad sellistel markeritel nagu F13a1 ja Vcan. Kolmas klaster väljendas kõrgel tasemel Mmp12, makrofaagispetsiifilist metalloproteinaasi ja Gpnmb, negatiivset põletiku regulaatorit, mis soovitas soodustada M2 polarisatsiooni. See ja alalisvooluklaster olid kõige rikkalikumad 2 ja 6 nädalat pärast vigastust, kui neer on reparatiivses faasis. Meie rühm kasutas hiljuti scRNA-seq hiire R-UUO mudelis, kus pärast obstruktsiooni pöördumist toimub väljakujunenud tubulointerstitsiaalse fibroosi, CKD tunnuse, regressioon (10). Huvitaval kombel teatasime ka makrofaagide klastrist, mis asus ainult neerudes, mis olid läbinud UUO pöördumise; seda iseloomustas ka Mmp12 ja püüduri retseptorite, sealhulgas Gpnmb ja Mrc1, ekspressioon. Oleme varem teatanud sarnasest Mmp121 mac-profaagist maksas maksahaiguse lahendamise ajal (37). Kuigi need Mmp121 rakud kaardistati immunoloogilise genoomiprojekti andmebaasis makrofaagidega, sarnanesid nad morfoloogiliselt monotsüütidega ja ekspresseerisid immunofluorestsentsi abil kõrget Ccr2 taset, kuid madalat F4/80 taset. Lisaks on nende transkriptoom kõige tihedamalt joondatud monotsüütidega, mis imbuvad neerudesse IRI-st taastumise ajal. Leidsime, et luuüdist pärinevad monotsüüdid, millele toideti FITC-märgistatud kollageeni, suurendasid nende Mmp12 ja Gpnmb ekspressiooni, mis viitab sellele, et kollageeni fagotsütoos võib indutseerida nende markerite ekspressiooni.

Neerukahjustuse ja -paranduse müeloidrakkude iseloomustamisel tuvastasime R-UUO mudelis veel üksteist müeloidsete rakkude alamhulka, sealhulgas mõned uudse fenotüübiga. See tehti ainulaadselt, integreerides tilga- ja plaadipõhise scRNA-seq koos indeksiga, et kaardistada alamhulgad voolutsütomeetria abil monotsüütide ja makrofaagide väravatele (10). Tuvastati kolm monotsüütide klastrit: patrullivad ja põletikulised alatüübid ning ainulaadne "profibrootiline" alatüüp, mis ekspresseeris Arg1, mis esines ainult UUO päeval 2 (äge vigastusfaas). Need Arg11 rakud ekspresseerisid Ly6C1 põletikuliste monotsüütide markereid, sealhulgas Ccr2 ja F13a1, kuigi mitte Ly6c2. Lisaks näidati, et nad ekspresseerivad hüpoksia, profibrootilisi ja põletikueelseid geene koos geenidega, mis kodeerivad rakuvälise maatriksi komponente ja rakuvälise maatriksi ristsidujaid. Koos mitmete Arg11 monotsüütide ja mesenhümaalsete rakkude vahel ilmnenud ligandi-retseptori paaridega näitavad need andmed, et Arg11 rakud võivad pärineda värvatud Ly6C1 monotsüütidest, mis aktiveeruvad akuutselt profibrootilise fenotüübi suunas vigastatud neeru hüpoksilises ja põletikulises keskkonnas. Tõepoolest, kroonilise progresseeruva neerukahjustuse ajal esineb monotsüütide sissetungi laineid (35).

Huvitaval kombel näitas sepsisest tingitud neerukahjustuse mudelis makrofaagide alamklastri Arg1 ekspressiooni suurenemist hilisematel vigastusjärgsetel ajahetkedel, ehkki alternatiivsete makrofaagide aktivatsiooni markeritega, nagu Mrc1 (38). Lisaks jälgisime paarisverevahetuse abil neerudesse värvatud ringlevate immuunrakkude saatust. Sellel on eelised parabioosi ees, kuna doonorrakud püsivad suurtes kogustes vereringes suhteliselt lühikest aega, võimaldades seega rakkude jälgimist mitmel ajahetkel pärast vigastust või haiguse lahenemise ajal. Kombineerides paarisverevahetuse, voolutsütomeetria ja pseudoaja analüüse, näitasime doonormonotsüütide varajast värbamist ummistunud neerudesse UUO 2. päeval; UUO 7. päeval läksid nad üle CCR2hi makrofaagidele, mille transkriptoom oli peaaegu identne kohalike makrofaagidega. Muud tööd näitavad, et CCR21 rakud on kahjulikud: CCR2 inaktiveerimisega IRI mudelis vähenes neerude F4/80 makrofaagide laienemine ja neerufibroosi raskusaste (5). Tuleb veel kindlaks teha, kas need uued populatsioonid esinevad kroonilise neeruhaiguse kõigis etappides; Näiteks, kas Mmp121 makrofaagid esinevad vigastuse varajastes punktides, kus endogeensed neeruparandusmehhanismid on aktiivsed ja üritavad paraneda, või ainult siis, kui esineb armistunud maatriks ilma pideva vigastusstiimulita? Dhillon et al. (39) tegi foolhappe nefropaatia mudeli põhjal tervete ja fibrootiliste hiire neerude scRNA-seq analüüsi. Tuvastati neliteist immuunklastrit, võrreldes ainult viiega nende eelmises uuringus (2), sealhulgas makrofaagid, DC-de alamklastrid (CD11b1/2, PDC), granulotsüüdid ja lümfotsüüdid. Teises uuringus võrreldi scRNA-seq ja snRNA-seq ummistunud (fibrootiliste) hiire neerudega UUO päeval 14. Mõlemal meetodil oli võrreldav geenide tuvastamine; kuid võrreldes scRNA-seq-ga oli snRNA-seq-il dissotsiatsiooni kallutatus ja dissotsiatsioonist põhjustatud transkriptsioonilised stressivastused (19).

Siin tuvastati üks makrofaagide klaster, kuigi teadlased tuvastasid uudse "diferentseeritud" proksimaalse tuubulite klastri, mis ekspresseeris arvukalt sekreteeritud põletikueelseid tsütokiine, sealhulgas Ccl2, makrofaagide proliferatiivset tsütokiini IL-34 ja neutrofiilide kemoatraktante Cxcl1 ja Cxcl2. See uuring näitab taas, et snRNA-seq ei ole kahjustatud ja põletikuliste neerude immuunpopulatsioonide tuvastamisel nii võimeline kui scRNA-seq. Tõepoolest, sama rühm teostas snRNA-seq krüokonserveeritud inimese diabeetilise neeruproovidega (40). Leiti, et diabeetikute neerudes on leukotsüütide arv võrreldes kontrollneerudega ootuspäraselt suurenenud. Tuvastati monotsüüdid, plasmarakud, T-rakud ja B-rakud; makrofaagide populatsioon siiski ei olnud, kuigi makrofaagide roll II tüüpi diabeedi korral on hästi dokumenteeritud (41). Lisaks võrdlesid teadlased oma diabeediproove avalikult kättesaadavate PBMC andmekogumitega, kuna leukotsüütide arv kontrollproovides oli väike. Põletikuliste markerite suurenemist täheldati nii infiltreeruvates diabeetilistes CD141 monotsüütides kui ka CD161 monotsüütides. Hiljuti on Kuppe jt. (42) koostas inimese neeru üherakulise kaardi, keskendudes tubulointerstitiumi ja fifibroosi arengule kroonilise neeruhaiguse korral. Kuid CD102 (mitteproksimaalsed tubulaarsed) sorteeritud rakkudes tuvastati kolm makrofaagi alatüüpi, monotsüüdid, DC-d ja nuumrakud, nagu ka NK-, T- ja B-rakud. Teadlased pakkusid välja neerufibroosiga seotud radade töötava mudeli, kuid immuunrakud, mis mängivad olulist rolli profibrootilises signaalimises, puudusid sellest mudelist hoolimata kinnipüüdmisest. Täiendades meie arusaama immuunrakkudest erinevates patoloogilistes seisundites, kirjeldas uuring inimese neeru immuunmaastikku patsientidel, kellel oli luupusnefriit, mis on süsteemse erütematoosluupuse sagedane tüsistus (43).

Luupusnefriidiga patsientide ja tervete kontrollide neeruproove analüüsiti scRNA-seq. See paljastas kakskümmend üks immuunklastrit, sealhulgas arvukalt müeloidrakkude alamhulka nii põletikueelsetes kui ka põletikku lahendavates reaktsioonides: põletikulised CD161 makrofaagid, fagotsüütilised CD161 makrofaagid, kudedes elavad makrofaagid, M2-nagu CD161 makrofaagid, cDC-d ja pDC-d. Kudedes elavad makrofaagid olid tervete neerude domineeriv klaster. Müeloidrakke tunnustatakse üha enam ka siirdamise äratõukereaktsiooni peamiste osalejatena. Dangi et al. (18) kasutas scRNA seq-i, et analüüsida müeloidrakkude alamhulkade panust neerutransplantaadi äratõukereaktsiooni hiiremudelis. Immuunrakutüüpidena tuvastati kolmteist klastrit, sealhulgas kaks makrofaagide alamhulka, monotsüüdid, pDC-d, cDC-d ja ülemineku monotsüütide / makrofaagide populatsioon. Ootuspäraselt oli rakkude arv kõigis immuunrakkude klastrites suurim äratõukereaktsiooniga neerudes, millele järgnesid talutavad neerud ning naiivsete neerude puhul oli see märkimisväärselt madalam ja sageli tühine. Makrofaagide klaster oli T-rakkude järel suuruselt teine. Huvitav on see, et peamiste klastrit määratlevate geenide hulgas ekspresseerisid Axl eranditult ainult siirikuga infiltreeruvad müeloidrakkude klastrid makrofaagide klastrid 1 ja 2 ning makrofaagide / monotsüütide klaster, kuid mitte ükski teine ​​rakutüüp. Leiti, et Axl11 makrofaagid olid märkimisväärselt kõrgemad tagasilükatud neerudes võrreldes tolereeritud neerudega ja Axl soodustas põletikuliste makrofaagide intratransplantaadi diferentseerumist. Teises scRNA-seq uuringus Wu et al. (32) analüüsis ägeda äratõukereaktsiooni läbinud retsipiendi neeru allotransplantaadi biopsiat. Nad tuvastasid kaks erinevat monotsüütide populatsiooni, tõenäoliselt põletikueelset ja klassikalist või vahepealset, toetades veelgi müeloidrakkude rolli neerude äratõukereaktsioonis inimestel.

Järeldused

Viimastel aastatel on üherakuline genoomika (scRNA-seq eesotsas) andnud teadlastele uue eksperimentaalse tööriistakasti, et analüüsida üksikute rakutüüpide rolle ja koostoimeid tervises ja haigustes. See võimaldab ümber hinnata meie arusaama müeloidrakkude bioloogiast keerulistes elundites, sealhulgas raku ontogeneesi, diferentseerumise, homöostaasi ja aktiveerimisolekute ulatuse aspekte. See on eriti oluline neerudes, kus müeloidse sektsiooni rakkude heterogeensus ja plastilisus peegelduvad nii homöostaatilistes kui ka haiguslikes tingimustes. Oluline on inimproove kasutavate eraldi katsete andmekogumite integreerimine; Inimesed on geneetiliselt heterogeensed ja neil on erinev kokkupuude keskkonnaga ning piisava koguse proovide hankimine võib olla väljakutse. See rõhutab ka vajadust jätkata meie leidude tõlkitavuse kindlaksmääramist. Eeldatakse, et scRNA-seq rakendamine nii alus- kui ka translatsiooniuuringutes kasvab eksponentsiaalselt koos eksperimentaalsete ja analüütiliste meetodite jätkuva arengu ja standardiseerimisega.

lisateabe saamiseks:ali.ma@wecistanche.com