Mitmekomponendilised esmase võimendusega Chlamydia Trachomatise vaktsineerimisrežiimid kutsuvad esile antikehade ja T-rakkude reaktsioonid ning kiirendavad infektsioonist vabanemist ahviliste mudelis Ⅱ

materjalid ja meetodid

Vaktsiini antigeenid ja adjuvandid

Selles uuringus kasutati erinevaid vaktsiini antigeene ja adjuvante: MOMP-l (11) põhinevat CTH522 vaktsiini antigeeni manustati intramuskulaarselt (IM) koos CAF01 adjuvandiga (42) või alumiiniumhüdroksiidi (AlOH) adjuvandiga või intranasaalselt ( IN) ilma adjuvandita. Plasmiidne DNA vaktsiin pcDNA3.{5}}MOMP valmistati konsensus-MOMP kloonimisel plasmiidvektorisse pcDNA3.1 (14) ja manustati intradermaalselt (ID) elektroporatsiooniga (EP) tagaküljel. MOMP-d (HuAd5-MOMP) ekspresseeriv rekombinantne inimese adenoviiruse serotüüp 5 (rHuAd5) vaktsiin valmistati konsensus-MOMP (AAC45154.1) homoloogsel rekombineerimisel E1- ja E2-deleteeritud HuAd5-plasmiidiks pAL1112 ja manustati intramuskulaarselt (4) . Modifitseeritud vaktsiinia Ankara-MOMP vaktsiin, tootjakonsensuse MOMP rekombineerimine(AAC45154.1) p3186 plasmiidi ja nõrgestatud MVA vektorisse (14) ning manustati läbiintramuskulaarne tee.

Põletikuvastase Cistanche hankimiseks klõpsake siin

C. trachomatis serovar D varu

Chlamydia trachomatise serovar D (Ct SvD; UW{{0}/Cx, ATCC® VR-885™) saadi ettevõttest American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) ja paljundati HeLa{ {2}} rakud, kogutud ja puhastatud, nagu on kirjeldanud Caldwell et al. (43). C. trachomatis SvD varu säilitati -80 kraadi juures 0,2 M sahharoosis, 20 mM naatriumfosfaadis (pH 7,4) ja 5 mM glutamiinhappes (SPG) ning inklusioone moodustavate ühikute (IFU) kontsentratsioon määrati HeLa-229 rakud ja McCoy rakud.

Ahvilised

Kolmkümmend makaaki (Macaca fascicularis), kes kaaluvad 3–5 kg, kaasati uuringusse, mida käsitleti 3. bioohutuse taseme (ABSL3) NHP rajatistes IDMIT-is (CEA Commissariat à l'Energie Atomique, nakkushaiguste mudelid ja uuenduslikud ravimeetodid). Fontenay-aux-Roses, Prantsusmaa; akrediteeringu nr #D92- 032-02). Protokollid kiitis heaks institutsionaalne eetikakomitee "Comité d'Ethique en Expé rimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) avalduse numbriga A14-026. Uuringule andis loa "Teadusuuringute, innovatsiooni ja haridusministeerium" registreerimisnumbriga APAFIS#720-201505281237660. Kõik loomad määrati enne uuringut SIV, SHIV, STLV (simian Tlymphotropic virus), herpes B viiruse, filoviiruse, SRV-1, SRV-2 suhtes negatiivseks ja kinnitati, et nad on klamüüdia infektsiooni suhtes seronegatiivsed. Kõik katseprotseduurid viidi läbi vastavalt Euroopa loomahooldusjuhistele ("Journal Officiel de l'Union Europé enne", direktiiv 2010/63/UE, 22. september 2010).

Vaktsineerimisprotokollid

30 makaaki jagati juhuslikult kuueks rühmaks, igaühes 5 looma. Erinevad vaktsineerimise esmase võimendusrežiimid 6 rühma jaoks on üksikasjalikult illustreeritud joonisel 1. Kõikide vaktsineerimiste ajal rahustati makaake ketamiinkloorhüdraadiga (10 mg/kg kehamassi kohta intramuskulaarselt). CTH522 (85 µg looma kohta) manustati intramuskulaarselt (IM) koos CAF{{20}}1 adjuvandiga (625 µg/125 µg) või AlOH adjuvandiga (0,425 mg) ), nagu on näidatud joonisel 1. Immuniseerimine viidi läbi 0,6 ml mahus looma paremas reies (M. quadriceps). CTH522 intranasaalne (IN) immuniseerimine (30 µg looma kohta) viidi läbi Vaxinator seadmega, mis oli ühendatud 1 ml süstlaga kahe järjestikuse 0,25 ml manustamisega, üks kummassegi ninasõõrmesse. DNA-MOMP vaktsiini manustati intradermaalselt (ID) elektroporatsiooniga (EP) seljanahasse. 6 korduvat kogust 0,1 ml süstiti ID (kokku 1 mg), millele järgnes EP, kasutades Nepagen™ süsteemi (seaded: 6 ruudukujulist impulssi 10 ms 90 ms intervalliga 110 V, (300- 700 mA)) . HAd5-MOMP vaktsiini manustati intramuskulaarselt annusega 1011 viirusosakest 1 ml-s looma kohta. MVA-MOMP vaktsiini manustati IM annusega 4 x 108 PFU looma kohta 0,5 ml mahus**. Naiivset rühma ei vaktsineeritud ja seda peeti kontrollrühmaks.

Näidiste kogumine

Kõigi proovivõtuprotseduuride ajal rahustati makaake ketamiinkloorhüdraadiga (10 mg/kg kehamassi kohta IM). Veri koguti reieluu veenipunktsiooniga nädalatel 0, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 18, 20, 22, 24. Antikehade tuvastamiseks koguti emakakaela vedelikku Weck-Cel® spearsiga (Medtronic Ophthalmics, Jacksonville, FL). , USA) 4., 8., 16., 18., 20., 22. ja 24. nädalal. Klamüüdiakoormuse tuvastamiseks koguti emakakaela-vaginaalsed proovid tavaliste flatlock-tampoonidega (Mast Diagnostic – viide: 552C/10). Pärast kokkupuudet vagino-emakakaela limaskestaga asetati tampoon UTM-RT söödet sisaldavasse viaali (Mast Diagnostic – viide: 330C/6) ja hoiti jääl.

Vaginaalne nakatumine C. trachomatis SvD 5*107 IFU-ga

Loomad rahustati ketamiinkloorhüdraadiga (10 mg/kg IM), pandi kõhuli lamavasse asendisse tõstetud puusadega ja 1 ml inokulaadi kanti traumaatiliselt otse tupe limaskestale vagino-emakakaela üleminekul, kasutades 1 ml süstalt. Igale loomale anti annus 5*107 IFU-d. Loomal lasti pärast inokuleerimist lühikest aega kõhuli lamavas asendis puusade tõstmisega.

Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs

CTH522spetsiifilised antikehadseerumis ja tampooniproovides tuvastati kaudse ELISA abil. Maxisorp® plaadid (NUNC A/S, Roskilde, Taani) kaeti CTH522-ga (0,5 µg/ml) üleöö temperatuuril 4 °C. Isotüübid IgG ja IgA tuvastati HRP-ga konjugeeritud antikehadega, mis on spetsiifilised ahvilise IgG (43R-IG020HRP, Fitzgerald, Acton, MA, USA, 1:75) vastu.{10 }}) ja IgA (43C-CB1631, Fitzgerald, USA, 1:50.{16}}). Reaktsioonid visualiseeriti TMB PLUS substraadiga (KemEnTec, Taastrup, Taani) ja peatati 0,5 M väävelhappega. Plaate loeti ELISA lugejaga lainepikkusel 450 nm, korrektsiooniga 650 nm juures. Positiivset kontrolli (eelmise uuringu seerumit) kasutati sisestandardina, et korrigeerida plaatide vahelisi erinevusi. Mõlemal plaadil viidi negatiivse kontrollina läbi kaks süvendit ilma substraadita. Antikehade tiitrid arvutati suurima lahjenduse pöördväärtusena, mille optilise tiheduse (OD) väärtus oli suurem kui piirväärtus. Piirväärtus määrati 0. päeva proovi keskmisest pluss 2*SD.

Peptiidide massiiv ja analüüs

CTH522 peptiidide massiiv töötati välja immobiliseeritud 15-meersete peptiidide kolmes korduses, mis kattusid 14 aminohappega, mis trükiti funktsionaliseeritud klaasslaididele ja inkubeeriti seerumiproovidega ettevõtte JPT Peptide Technologies, Berliini poolt. Lühidalt, massiivi inkubeeriti 24. nädalal kogutud seerumiproovidega ja IgG peptiidikompleksid visualiseeriti, kasutades biotinüülitud kitse ahvivastast IgG-d ja Alexa Fluor® 647 streptavidiini. Slaidid skaneeriti kõrge eraldusvõimega skanneriga 635 nm juures ja andmed esitati suvaliste fluorestsentsühikutena. Määrati kolmekordsete väärtuste keskmine, kui variatsioonikordaja oli suurem kui 0,5, kasutati ainult 2 lähimat väärtust. 10 protsenti maksimaalse intensiivsusega signaalist (65 535) kasutati katkestusena.positiivne vastus, ja sellest lävest allapoole jäävatele keskmistele signaalidele omistati väärtus, mis vastab poolele läviväärtusest (3277).

In vitro neutraliseerimise test

In vitro neutraliseerimise test viidi läbi, et testida vaktsiinist indutseeritud seerumi antikehade võimet neutraliseerida HaK-rakkude klamüüdiainfektsiooni in vitro. Analüüs järgis peamiselt eelnevalt kirjeldatud protokolli (44). Esiteks inkubeeriti üksikute loomade seerumiproove 56 kraadi juures 30 minutit, et komplemendi inaktiveerida. Klamüüdia põhivara (SvD, SvE ja SvF) segati ja inkubeeriti iga vaktsineeritud looma inaktiveeritud seerumi seerialahjendustega 30 minutit ning seejärel inokuleeriti HaK rakkude monokihile 96-kaevu lamedapõhjalistel plaatidel. duplikaadid. Pärast 30-tunnist inkubeerimist rakud ja inklusioonid fikseeriti ja visualiseeriti polüklonaalse küüliku anti-Ct043 seerumi ja fluorestsentsmärgistatud sekundaarse antikehaga (Alexa Flour 488, kitse küülikuvastane IgG, A11008, Life Technologies) lahjenduses 1: 5000 . Inklusioonide loendamine viidi läbi käsitsi 20 vaateväljas 40-kordse suurendusega (Olympus IX71 inverteeritud fluorestsentsmikroskoop). Neutraliseerimine arvutati kui IFU-de keskmise arvu vähenemine protsentides võrreldes kontrollrühma loomade (naiivsed) seerumite kogumiga.

Intratsellulaarne PBMC tsütokiinide värvimine ja kaastsütomeetria

PBMC-d eraldati ja ({{0}} x 106) resuspendeeriti 150 µl täielikus söötmes, mis sisaldas 0,2 µg iga kostimuleerivat antikeha CD28 ja CD49b. Stimuleerimine viidi läbi 96 süvendis/plaadis, kasutades 2 uM iga peptiidi kogumit või SEB-d (positiivse kontrollina) või söödet üksi (negatiivse kontrollina). Igasse süvendisse lisati Brefeldiin A lõppkontsentratsioonis 10 ug/ml ja plaati inkubeeriti 37 °C juures 5% CO2 juures üleöö. Seejärel rakke pesti, värviti elujõulise värviga (violetne, fluorestseeruv reaktiivne värv, Invitrogen), fikseeriti ja permeabiliseeriti reagendiga BD Cytofifix/Cytoperm. Permeabiliseeritud rakuproove säilitati seejärel enne värvimisprotseduuri -80 kraadi juures. Antikehade värvimine viidi läbi ühes etapis pärast permeabiliseerimist. Kõik kasutatudantikehadon loetletud tabelis 1. Pärast 30-minutilist inkubeerimist jääl pimedas pesti rakke BD Perm/Wash puhvris. Rakud loendati LSR II (BD) abil kohe pärast värvimisprotseduuri ja andmete analüüsimiseks kasutati FlowJo tarkvara.

TABEL 1 Immuunrakumarkerite ja rakusiseste tsütokiinide värvimiseks kasutatavad antikehad

Vaginaalse klamüüdia DNA tuvastamine kvalitatiivse PCR-iga

Abbott RealTime CT/NG test (ABBOTT, Rungis, Prantsusmaa) on in vitro polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) test CT (C. trachomatis) ja NG (N. gonorrhoeae) genoomide plasmiidse DNA otseseks ja kvalitatiivseks tuvastamiseks. . Nukleiinhape ekstraheeriti UTM-i (universaalne transpordikeskkond) proovidest M2000SP-l ja amplifikatsioon viidi läbi M2000SP-ga vastavalt tootja juhistele. Tulemused väljendati tsükli lävena (Ct).

Statistiline analüüs

Kogu statistika tehti GraphPad Prism tarkvaraga (versioon 8.1.2). Mittenormaalselt jaotunud andmeid analüüsiti mitteparameetriliste testidega; Kruskal-Wallise test ja Dunni mitmekordne võrdlustest, et määrata rühmadevahelise erinevuse olulisus. PCR-negatiivsete loomade protsenti näitavaid kõveraid võrreldi log-rank (Mantel-Cox) statistilise testiga. Võrdlusi peeti statistiliselt olulisteks, kui P väärtus oli < 0.05 (P < 0.05). Edasised olulisuse tasemed on tähistatud tärnidega *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Andmete kättesaadavuse avaldus

Uuringus esitatud algsed panused on lisatud artiklisse / lisamaterjali. Täiendavad päringud võib pöörduda vastava autori poole.

Eetikaavaldus

Loomkatse vaatas läbi ja kiitis heaks Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives (CEtEA #44) avalduse numbri A14-026 all. Uuringu andis loa Teadus-, Innovatsiooni- ja Haridusministeerium registreerimisnumbriga APAFIS#720-201505281237660.

Autorite kaastööd

Mõeldud ja kavandatud katsed: JD, FF, EL, PA, RG, RS. Tehtud katsed: VC, DD, BD, SL, CD, CJ, ND-B, CB, BB, AT. Toodetud vaktsiinid ja antigeenikonstruktsioonid: IR, PM, AO. Analüüsitud andmeid: JD, EL, FF, IR, HJ. Referaadi koostanud ja toimetanud: JD, EL, FF. Kõik loetletud kaasautorid andsid oma töösse olulise panuse andmete kavandamise ja kontseptsiooni ning/või hankimise, analüüsi ja tõlgendamise kaudu. Kõik autorid panustasid artiklisse ja kiitsid esitatud versiooni heaks.

Tänuavaldused

Täname Fondation Dormeur, Vaduz annetuse eest Viral Evolution and Transmission Unit'ile selle projekti jaoks oluliste laboriinstrumentide jaoks.

Huvide konflikt FF, IR, PA ja AWO on klamüüdiavastaste vaktsiinide patenditaotluse kaasleiutajad [WO2014146663A1]. Kõik õigused on määratud Statens Serum Institutile, Taani mittetulunduslikule valitsusasutusele. Ülejäänud autorid kinnitavad, et uuring viidi läbi ilma igasuguste äriliste või finantssuhete puudumisel, mida võiks tõlgendada potentsiaalse huvide konfliktina.

Väljaandja märkus Kõik selles artiklis esitatud väited on ainult autorite väited ja ei pruugi esindada nende sidusorganisatsioonide või väljaandja, toimetajate ja arvustajate väiteid. Väljaandja ei garanteeri ega kinnita ühtegi toodet, mida selles artiklis võidakse hinnata, või väiteid, mille võib esitada selle tootja.

Viited

1. Newman L, Rowley J, Vander Hoorn S, Wijesooriya NS, Unemo M, Low N jt. Ülemaailmsed hinnangud nelja ravitava sugulisel teel leviva nakkuse levimuse ja esinemissageduse kohta 2012. aastal, mis põhinevad süstemaatilisel ülevaatel ja ülemaailmsel aruandlusel. PLoS One (2015) 10 (12): e0143304. doi: 10.1371/journal.pone.0143304

2. Longbottom D, Coulter LJ. Loomade klamüüdioosid ja zoonootilised tagajärjed. J Comp Pathol (2003) 128(4):217–44. doi: 10.1053/jcpa.2002.0629

3. Haggerty CL, Gottlieb SL, Taylor BD, Low N, Xu F, Ness RB. Chlamydia trachomatis'e suguelundite infektsiooni tagajärgede oht naistel. J Infect Dis (2010) 201 Suppl 2:S134–55. doi: 10.1086/652395

4. Dodet B. Tõhusate sugulisel teel levivate vaktsiinide väljatöötamise praegused takistused, väljakutsed ja võimalused: vaktsiinitootjate, biotehnoloogiaettevõtete ja rahastamisagentuuride seisukoht. Vaktsiin (2014) 32(14):1624–9. doi: 10.1016/ j.vaccine.2013.08.032

5. Brunham RC, Kuo CC, Cles L, Holmes KK. Peremeesorganismi immuunvastuse korrelatsioon Chlamydia trachomatise kvantitatiivse taastumisega inimese endotserviksist. Infect Immun (1983), 39(3):1491-4. doi: 10.1128/iai.39.3.{10}}.1983

6. Cotter TW, Meng Q, Shen ZL, Zhang YX, Su H, Caldwell HD. Peamiste välismembraani valgu-spetsiifiliste immunoglobuliini a (IgA) ja IgG monoklonaalsete antikehade kaitsetõhusus Chlamydia trachomatise suguelundite infektsiooni hiiremudelis. Infect Immun (1995) 63 (12): 4704–14. doi: 10.1128/iai.63.12.{11}}.1995

7. Johansson M, Schon K, Ward M, Lycke N. Uuringud knockout hiirtega näitavad, et klamüüdiavastane kaitse nõuab TH1 rakke, mis toodavad IFN-gamma: kas see kehtib inimeste kohta? Scand J Immunol (1997), 46(6):546–52. doi: 10.1046/j.{11}}.1997.d01-167.x

8. Gondek DC, Olive AJ, Stary G, Starnbach MN. CD4 pluss T-rakud on vajalikud ja piisavad, et tagada kaitse Chlamydia trachomatis'e nakkuse eest hiire ülemistes suguelundites. J Immunol (2012), 189(5):2441–9. doi: 10.4049/ jimmunol.1103032

9. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Wijburg OL, Beagley KW. Intra- ja ekstra-epiteeli sekretoorse IgA hindamine klamüüdiainfektsioonide korral. Immunology (2014), 143 (4): 520–30. doi: 10.1111/imm.12317

10. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Blumberg RS, Beagley KW. Erinevad tulemused pärast intratsellulaarsetele ja rakuvälistele klamüüdiaantigeenidele suunatud IgG transtsütoosi. Immunol Cell Biol (2014) 92(5):417–26. doi: 10.1038/icb.2013.110

11. Olsen AW, Follmann F, Erneholm K, Rosenkrands I, Andersen P. Kaitse Chlamydia trachomatis'e infektsiooni ja ülemiste suguelundite patoloogiliste muutuste vastu vaktsiini poolt soodustatud neutraliseerivate antikehade poolt, mis on suunatud peamise välismembraani valgu VD4-le. J Infect Dis (2015) 212 (6): 978–89. doi: 10.1093/infdis/jiv137

12. Nguyen N, Guleed S, Olsen AW, Follmann F, Christensen JP, Dietrich J. Th1/Th17 T-rakkude koe-residentide immuunsus suurendab kaitset, kuid ei ole vajalik vaktsiinistrateegias Chlamydia trachomatis'ega suguelundite infektsiooni vastu. Front Immunol (2021) 12:790463. doi: 10.3389/fifimmu.2021.790463

Küsi lisa:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: pluss 86 15292862950

Lisage ostukorvi lisa tsistanche:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop