MTHFD2 on metaboolne kontrollpunkt, mis kontrollib efektorit ja reguleerivat T-rakkude saatust ja funktsiooni

Graafiline abstraktne

Autorid:

Ayaka Sugiura, Gabriela Andrejeva, Kelsey Voss, ..., Ashutosh K. Mangalam, Joshua D. Rabinowitz, Jeffrey C. Rathmell

Kirjavahetus:

jeff.rathmell@vumc.org

Põgusalt :

Nukleotiidide süntees on vajalik T-rakkude kiire proliferatsiooni toetamiseks. Sugiura jt. näitavad, et de novo puriini metabolism suunab T-rakkude diferentseerumist ja funktsiooni ning tuvastab MTHFD2 kui põletikuliste haiguste metaboolse kontrollpunkti ja terapeutilise sihtmärgi.

Esiletõstmised

• MTHFD2 on aktiveeritud CD4 T-rakkude jaoks kriitilise tähtsusega, et säilitada de novo puriini süntees

• Ebapiisav MTHFD2 soodustab Treg-rakkude sarnaseid fenotüüpe ja metabolismi Th17 rakkudes d MTHFD2 pärssimine pärsib mTORC1 signaaliülekannet ja muudab histooni metüülimist

• MTHFD2 võib olla suunatud kaitseks põletiku ja autoimmuunsuse eest in vivo

MTHFD2 on metaboolne kontrollpunkt, mis kontrollib efektorit ja reguleerivat T-rakkude saatust ja funktsiooni

Ayaka Sugiura,¹Gabriela Andrejeva,¹Kelsey Voss,¹Darren R. Heintzman,¹Xincheng Xu,⁵Matthew Z. Madden,¹Xiang Ye,¹Katherine L. Beier,¹Nowrin U. Chowdhury,²Melissa M. Wolf,²Arissa C. Young,¹Dalton L. Greenwood,¹Allison E. Sewell,¹Shailesh K. Shahi,³Samantha N. Freedman,³Alanna M. Cameron,⁴Patrik Foerch,⁴Tim Bourne,⁴Juan C. Garcia-Canaveras,⁵John Karijolitš,¹Dawn C. Newcomb,²Ashutosh K. Mangalam,³Joshua D. Rabinowitz,⁵ja Jeffrey C. Rathmell^1,6,*

¹Vanderbilti immunobioloogia keskus, patoloogia, mikrobioloogia ja immunoloogia osakond, Vanderbilti ülikooli meditsiinikeskus, Nashville, TN 37232, USA

²Vanderbilti ülikooli meditsiinikeskuse meditsiiniosakond, hematoloogia ja onkoloogia osakond, Nashville, TN 37232, USA

³Patoloogia osakond, Iowa ülikool, Iowa City, IA 52242, USA

⁴Sitryx Therapeutics Limited, Magdaleni keskus, Oxfordi teaduspark, Oxford, Ühendkuningriik

⁵Ludwigi vähiuuringute instituudi keemiaosakond, Princetoni filiaal, Lewis-Sigleri integreeriva genoomika instituut, Princetoni ülikool, Princeton, NJ 08544, USA6 Juhtkontakt

*Kirjavahetus: jeff.rathmell@vumc.org

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.10.011

KOKKUVÕTE

Antigeenne stimulatsioon soodustab T-rakkude metaboolset ümberprogrammeerimist, et vastata suurenenud biosünteesi-, bioenergeetilisele ja signaalimisnõuetele. Näitame, et ühe süsiniku (1C) metabolismi ensüüm metüleentetrahüdrofolaadi dehüdrogenaas 2 (MTHFD2) reguleerib de novo puriini sünteesi ja signaaliülekannet aktiveeritud T-rakkudes, et soodustada proliferatsiooni ja põletikuliste tsütokiinide tootmist. Patogeensetes T-abistaja-17 (Th17) rakkudes takistas MTHFD2 transkriptsioonifaktori FoxP3 ebanormaalset ülesreguleerimist koos supresseerimisvõime ebasobiva suurenemisega. MTHFD2 puudulikkus soodustas ka regulatiivset T (Treg) rakkude diferentseerumist. Mehhaaniliselt põhjustas MTHFD2 inhibeerimine puriinikogumite ammendumise, puriini biosünteetiliste vaheühendite kogunemise ja toitainete anduri mTORC1 signaaliülekande vähenemise. MTHFD2 oli kriitiline ka DNA ja histooni metüülimise reguleerimiseks Th17 rakkudes. Oluline on see, et MTHFD2 puudulikkus vähendas haiguse tõsidust mitmes in vivo põletikulise haiguse mudelis. MTHFD2 on seega metaboolne kontrollpunkt puriini metabolismi integreerimiseks patogeensete efektorrakkude signaaliülekandega ja on potentsiaalne terapeutiline sihtmärk 1C metabolismi radadel.

SISSEJUHATUS

Adaptiivse immuunvastuse efektiivne mobiliseerimine nõuab CD4 pluss T-rakkude tugevat aktiveerimist, et läbida kiire rakkude kasv ja proliferatsioon. See hõlmab metaboolset ümberprogrammeerimist, mida juhib toitainesensor mTORC1, kataboolsest puhkeolekust anaboolsesse kasvuolekusse, kus on suurenenud biosünteesi, bioenergeetika ja signaalimisvajadus. Sõltuvalt tsütokiini miljööst diferentseeruvad CD4 pluss T-rakud nii efektor- kui ka regulatiivseteks alamhulkadeks, millel on erinevad metaboolsed programmid, mis juhivad nende efektorfunktsioone (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Nende alamrühmade tasakaal on normaalse immuunsuse jaoks kriitiline, vältides samal ajal põletikulisi ja autoimmuunhaigusi. Näiteks hulgiskleroosi (MS) iseloomustab interleukiini -17 (IL- 17) tootvate T-abistaja-17 (Th17) rakkude arvu suurenemine ja supressiivsete regulatoorsete T (Treg) rakkude arvu vähenemine või ebatõhusus. (Dendrou et al., 2015). Nende T-rakkude alamrühmade spetsiifiliste metaboolsete programmide sihtimine pakub alternatiivset lähenemist immunoteraapiale.

Rakkude metabolismil põhinev ravi algas 1948. aastal, kui osutus folaadivastased kemoterapeutilised ained tõhusaks ägeda lümfoblastse leukeemiaga lastel (Farber et al., 1948). Folaat aitab kaasa ühe süsiniku (1C) metabolismile puriinide biosünteesiks, metüüldoonorite tekkeks ja rakkude redoks-tasakaalu säilitamiseks (Ducker ja Rabinowitz, 2017; Yang ja Vousden, 2016). Paljud ravimid, sealhulgas metotreksaat (MTX), fluorouratsiil (5-FU) ja merkaptopuriin (6-MP), on sellest ajast alates välja töötatud selle raja sihtimiseks. Kiiresti prolifereeruvad rakud, sealhulgas vähirakud ja aktiveeritud T-rakud, sõltuvad nendest DNA ja RNA sünteesi radadest. MTX-d kasutatakse endiselt autoimmuunhaiguste, nagu reumatoidartriidi (RA) raviks (Brown et al., 2016). Kuid sihitud ensüümide laia ekspressiooni tõttu on need raviained seotud tavaliste ja potentsiaalselt tõsiste kõrvaltoimetega. Huvipakkuvates rakupopulatsioonides selektiivselt oluliste metaboolsete ensüümide sihtmärkide tuvastamine võib viia ohutumate ja tõhusamate immunoteraapiate väljatöötamiseni.

1C metabolism hõlmab folaadi ja metioniini tsükleid koos üksikute süsinikuühikute ülekandmisega. Seriin toimib 1C doonorina tetrahüdrofolaadi (THF) aktiveerimiseks 5,10-metüleenTHF-ks koos glütsiini tootmisega. 5,10-metüleenTHF saab seejärel oksüdeerida NAD(P) abil, et tekitada puriini prekursor 10- formüülTHF. Alternatiivina saab 10-formüülTHF-i sünteesida formiaadist ja THF-ist ATP-st sõltuval viisil. Tsütosoolses rajas vahendab 10-fomüülTHF tootmist metüleenTHF dehüdrogenaas 1 (MTHFD1). MTHFD1 kadumine nälgib rakke tsütosoolset 10-formüülTHF-i, vähendades puriini biosünteesivõimet ja mutatsioonid MTHFD1-s põhjustavad tõsist kombineeritud immuunpuudulikkust (SCID) (Field et al., 2015). Mitokondriaalne rada tugineb mitokondriaalsele MTHFD2 ja MTHFD{17}}sarnasele (MTHFD1L).

Joonis 1. 1C metabolism ja MTHFD2 on aktiveeritud CD4-s ülesreguleeritud^plussT-rakud ja EAE kontekstis

(A) Nukleotiidide metabolismi liikide muutus in vitro diferentseeritud CD4-s^plussT-rakkude alamhulgad võrreldes naiivsete rakkudega, mõõdetuna massispektromeetriaga (n=3 bioloogilist kordust).

(B) Töövoog sihipärase CRISPR-sõeluuringu jaoks in vivo kopsupõletiku mudelis.

(C) gRNA arvukuse muutus 1C metabolismile suunatud in vivo CRISPR-sõeluuringust primaarses CD4-s^plussT-rakud (statistiline analüüs läbi MAGECK, n=3 bioloogilist replikatsiooni).

(D) punktis (C) tuvastatud geenide mRNA ekspressioon T-rakkude arengu ja aktiveerimise ajal (andmed ImmGen RNA-seq andmebrauserist).

(E) Punktis (C) tuvastatud geenide valgu ekspressioon naiivses ja aktiveeritud CD4-s^plussT-rakud (andmed immunoloogilisest proteoomiressursist [ImmPRes]).

(F) punktis (C) tuvastatud geenide mRNA ekspressioon näidustatud põletikuliste häiretega isikute täisveres võrreldes tervete kontrollisikutega (Aune et al., 2017). RA-MTX, RA MTX-ravi all; SLE, süsteemne erütematoosluupus; MS-Tx naiivne, varem ravimata MS diagnoosimise ajal; MS väljakujunenud, MS ravil ja haiguse remissioonil; n=3–8 doonorit.

(G) IHC, mis näitab CD3 ja MTHFD2 värvimist hiirte seljaaju cauda equina segmendis, kellel on sümptomaatiline EAE 2003 (ülemine; skaala riba, 100 mm) ja 4003 (alumine; skaala riba, 50 mm) suurendusel (andmed on tüüpilised kahest sõltumatust katsest).

(H ja I) MTHFD2 suhteline (H) keskmine fluorestsentsi intensiivsus (MFI) ja (I) mRNA ekspressioon CD4-s^plussSümptomaatilise EAE-ga hiirte põrna ja seljaaju T-rakud ja kontrollhiirte põrn (keskmine ± SD, ühesuunaline ANOVA, andmed esindavad kahte sõltumatut katset 6 bioloogilise kordusega).

(J) MTHFD2 mRNA ekspressioon diferentseerumata CD4-s^plussT-rakud 0, 5 ja 24 tundi pärast aktiveerimist anti-CD3 ja anti-CD28 antikehadega (keskmine ± SD, ühesuunaline ANOVA, n=3 bioloogilist replikatsiooni).

(K) Suhteline MTHFD2 MFI 5 päeva jooksul pärast aktiveerimist CD4 pluss T-rakkude alamhulkades, normaliseeritud puhkerakkudele (keskmine ± SD, n=3 bioloogilist replikatsiooni). Vaata ka joonist S1. Statistiliselt olulised tulemused on märgistatud (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" protsent="">

MTHFD2 on üks enim indutseeritud ja üleekspresseeritud geene kõigis kasvajates (Nilsson et al., 2014). Kuigi embrüogeneesi ajal on MTHFD2-l laialdaselt ülesreguleeritud, on enamikus täiskasvanud kudedes vähe või üldse mitte (Nilsson et al., 2014). Vähivastases ravis (Zhu ja Leung, 2020) võib MTHFD2 inhibeerimine põhjustada suurenenud oksüdatiivset stressi (Ju et al., 2019; Wan et al., 2020), sõltuvust glütsiinist (Koufaris et al., 2016) ja ebapiisavat. puriinide süntees (Ben-Sahra et al., 2016; Pikman jt, 2016). MTHFD2 puudulikkus võib ka mTORC1 aktiivsust pärssida mitme mehhanismi kaudu, sealhulgas guaniini vähenemise ja sellele järgneva mTORC{15}}aktiveeriva GTPaasi Rheb inhibeerimise kaudu (Emmanuel et al., 2017). MTHFD2 defitsiit põhjustab ka puriinide sünteesiraja vaheühendite, sealhulgas adenosiinmonofosfaadi (AMP) analoogi 5-aminoimidasoolkarboksamiidribonukleotiidi (AICAR) akumulatsiooni (Ducker et al., 2016), mis võib aktiveerida AMP-aktiveeritud proteiinkinaasi (AMPK) mTORC1 pärssimiseks (Su et al., 2019).

Kuna 1C metabolism ühendab mitu toitaine sisendit ja on terapeutiliselt juhitav, uurisime 1C metabolismi rolli CD4-s^plussT-efektori (Teff) ja Treg-rakkude alamhulgad. Hiire primaarsete T-rakkude erapooletu in vivo CRISPR-Cas{1}-põhise sihitud sõeluuringuga tuvastasime MTHFD2 kui tabamuse, mis oli ka põletikuliste häiretega inimestel pidevalt ülesreguleeritud. Eelkõige kahjustas MTHFD2 puudulikkus Teffi rakkude proliferatsiooni ja funktsiooni. MTHFD2 puudulikkus soodustas ka ebanormaalset FoxP3 ekspressiooni ja supresseerivat aktiivsust Th17 rakkudes, soodustades samal ajal Treg-rakkude diferentseerumist. Neid toimeid seostati AICAR-i akumuleerumisega, puriinide kontsentratsiooni vähenemisega, mTORC1 signaaliülekande alareguleerimisega, suurenenud mitokondriaalse metabolismiga ning muutunud DNA ja histooni metüülimisega. In vivo oli MTHFD2 sihtimine kaitstud mitme põletikulise haiguse mudeli eest. Need andmed näitavad, et MTHFD2 toimib metaboolse kontrollpunktina Th17 ja Treg rakkudes ning tõstab esile selle ensüümi potentsiaali põletikuvastase immunoteraapia sihtmärgina.

TULEMUSED

1C metabolism ja puriinide süntees on CD4-s erinevalt aktiivsed^plussT-rakkude alamhulgad

Me oletasime, et nukleotiidide süntees võib CD4 puhul erineda^plussT-rakkude alamhulgad. CD4^plussT-rakud diferentseeriti in vitro Th1-, Th17- ja Treg-rakkudeks ning koguti 72 tunni pärast massispektromeetria jaoks. Nukleotiidiliikide kogused olid üldiselt kõigis alamrühmades kõrgemad, võrreldes naiivsete rakkudega (joonis 1A). Nimelt olid puriini sünteesi vaheühendid erinevalt rikkalikud, kusjuures Th17 rakkudes akumuleerusid kõige rohkem glütsiinamiidribonukleotiidi (GAR), 1- (fosforibosüül)imidasoolkarboksamiidi (SAICAR) ja AICAR-i (joonis S1A).

CD4 sõltuvuse testimiseks^plussT-rakud ensüümidel 1C metabolismis, teostasime primaarses CD4-s in vivo CRISPR-Cas{2}}põhise skriinimise^plussT-rakud (joonis 1B). Ehitati kohandatud juht-RNA (gRNA) raamatukogu, et sihtida ensüüme 1C metabolismis, koos tuberoosskleroosi kompleksiga 2 (TSC2) positiivse kontrollina ja mittesihtivate negatiivsete kontrollidega (NTC). CD4^plussT-rakud, mis eraldati ovalbumiini (OVA)-spetsiifilise T-raku retseptori (TCR) transgeensetest OT-II Cas9 topelttransgeensetest hiirtest, transdutseeriti selle raamatukoguga ja kanti intravenoosselt Rag1-sse.^{__ /__}võõrustajad. Seejärel immuniseeriti hiired kopsupõletiku esilekutsumiseks intranasaalse OVA-ga. Nende hiirte kopsudest kogutud T-rakud sekveneeriti ja sisendsageduste suhtes tehti kindlaks gRNA-de rikastamine või ammendumine. TSC2 gRNA-d rikastati, toetades selle valgu inhibeerivat rolli T-rakkudes. Seevastu PPAT, AHCY, MAT2A ja MTHFD1 gRNA-d vähenesid oluliselt ning GART, DHFR, DNMT1, MTRR, MTR, SHMT2 ja MTHFD2 gRNA-d vähenesid vähemal määral, mis näitab, et need geenid aitavad kaasa T-rakkude proliferatsioonile ja põletikulisele funktsioonile. in vivo (joonised 1C ja S1B).

Järgmisena uurisime ekraanilt tuvastatud geenide ekspressiooniprofiili. Kuigi kõik olid tümotsüütide arenemisel koordineeritult ülesreguleeritud, indutseeriti MTHFD2 mRNA ja valk kõige tugevamalt stimuleeritud perifeersetes T-rakkudes (joonised 1D ja 1E). Veelgi enam, erinevate põletikuliste ja autoimmuunhaigustega isikute täisverest pärinevas eraldi avaldatud RNA sekveneerimise (RNA-seq) andmekogumis (Aune et al., 2017) oli MTHFD2 järjekindlalt üleekspresseeritud mitme haigusseisundi, sealhulgas haavandilise koliidi, Crohni tõve korral. , tsöliaakia, RA, süsteemne erütematoosluupus (SLE), psoriaas, psoriaatiline artriit, Sjo¨ greni sündroom ja MS (joonis 1F). Nimelt oli hiljuti diagnoositud MS-ga isikutel MTHFD2 ekspressioon märkimisväärselt kõrgem võrreldes tervete doonorite või haiguse remissiooniga ravi saavate MS-ga isikutega (joonis S1C). Seega CD4^plussT-rakkude proliferatsioon ja ellujäämine sõltuvad teatud 1C metabolismi geenidest ning nende geenide ekspressioon erineb T-rakkude arengu, aktivatsiooni ja diferentseerumise etappide ning patoloogilise põletiku taustal.

Joonis 2. MTHFD2 puudulikkus kahjustab CD4^plussT-rakkude proliferatsioon ja funktsioon

(A–D) Proliferatsioon, mõõdetuna (A) CellTrace Violet (CTV) lahjenduse, (B) elujõulisuse, (C) CD25 ekspressiooni ja (D) TF ekspressiooniga CD4-s^plussT-rakkude alamhulgad, mida töödeldi MTHFD2i-ga 72 tundi pärast aktiveerimist (keskmine ± SD, ühesuunaline ANOVA, andmed esindavad kolme sõltumatut katset 9 bioloogilise kordusega).

MTHFD2 on kesknärvisüsteemi infiltreeruvas CD4-s kõrgelt reguleeritud^plussT-rakud eksperimentaalse autoimmuunse entsefalomüeliidi (EAE) ja aktiveeritud CD4 korral^plussT-rakud in vitro

MTHFD2 reguleerimist ei ole CD4 pluss T-rakkudes hästi kirjeldatud. MTHFD2 ekspressiooni mõõtmiseks põletikulistes kahjustustes in vivo, CD4^plussMüeliinispetsiifiliste TCR-i transgeensete 2D2 hiirte T-rakud aktiveeriti ja viidi üle Rag1-sse^{__ /__}hiired EAE esilekutsumiseks. Pärast seda, kui hiirtel hakkas ilmnema tagajalgade halvatus, analüüsiti seljaaju cauda equina segmenti immunohistokeemia (IHC) abil. Hiirtel, kes said 2D2 T-rakke, ilmnes MTHFD2 ja CD3 rikastumine^plussrakud, mis kontrollis puudusid (joonis 1G). Otseseks määramiseks, kas CD4^plussT-rakud reguleerisid MTHFD2 üles põletikulistes kahjustustes, analüüsimiseks koguti T-rakud hiirte põrnast ja seljaajust, kes allutati müeliini oligodendrotsüütide glükoproteiini (MOG) ja läkaköhatoksiini (PTX) poolt indutseeritud EAE mudelile. Kesknärvisüsteemi infiltreeruv CD4^plussT-rakud üleekspresseerisid MTHFD2 võrreldes sobitatud põrna CD4-ga^plussT-rakud kontroll- ja EAE hiirtelt, mõõdetuna voolutsütomeetria (joonis 1H) ja qRT-PCR (joonis 1I) abil. MTHFD2 ekspressiooni kineetika CD4-s^plussJärgmisena mõõdeti T-rakke in vitro. MTHFD2 mRNA tugev ülesreguleerimine tuvastati pärast 5-tunnist stimulatsiooni ja see hakkas vähenema 24 tunni pärast (joonis 1J), samas kui diferentseeritud CD4^plussT-rakkude alamrühmad saavutasid MTHFD2 valgu kõrgeima ekspressiooni 48 tundi pärast aktiveerimist (joonis 1K). Need andmed näitavad, et MTHFD2 on CD4-s ülesreguleeritud^plussT-rakud aktivatsiooniga in vitro ja põletikukohas in vivo.

CD4^plussT-rakkude alamrühmad vajavad aktiveerimiseks, proliferatsiooniks, ellujäämiseks ja tsütokiinide tootmiseks erinevalt MTHFD2

Järgmisena testisime MTHFD2 rolli CD4 pluss T-rakkude alamhulga aktiveerimisel, diferentseerumisel, proliferatsioonil ja funktsioonil. CD4^plussT-rakud aktiveeriti in vitro tsütokiinide juuresolekul Th1-, Th17- ja Treg-rakkude optimaalseks diferentseerumiseks ning kandja või MTHFD2 inhibiitori (MTHFD2i; DS18561882) juuresolekul (Kawai et al., 2019). 72 tunni pärast oli kõigil alamhulkadel vähenenud proliferatsioon (joonis 2A) ja elusate tsükliliste rakkude arv (joonised S2A ja S2B). Elujõulisus vähenes Th1 ja Th17 rakkudes (joonis 2B) ja aktiveerimine, mõõdetuna CD25 ekspressiooni järgi, vähenes kõigis alamrühmades (joonis 2C). Lineage-characterizing transkriptsioonifaktori (TF) ekspressioon vähenes Th1 rakkudes (T-bet^pluss), kuid Th17 rakkudes muutumatuna (ROR t^pluss) ja muutunud minimaalselt Tregi rakkudes (FoxP3^pluss) (Joonis 1D). Teff-rakkude funktsiooni mõõtmiseks stimuleeriti rakke uuesti 12-müristaat13-atsetaadi (PMA) ja ionomütsiiniga. Oluliselt vähem Th1 rakke ekspresseeris interferoon-g (IFNg) ja vähem Th17 rakke ekspresseeris IL-17, kui diferentseeriti MTHFD2i juuresolekul (joonis 2E). See ei olnud tingitud kahjustatud esialgsest aktiveerimisest, kuna need fenotüübid säilisid, kui ravimi kokkupuude viivitati 24 tundi pärast aktiveerimist, kuigi liini vanust iseloomustav TF ekspressioon ei muutunud selles seades (joonised S2C – S2F). Seega on maksimaalse CD4 jaoks vajalik MTHFD2^plussT-rakkude aktiveerimine, proliferatsioon, ellujäämine ja tsütokiinide tootmine.

Nende farmakoloogiliste mõjude geneetiliseks kinnitamiseks lõime Mthfd2^fl/flhiire tüvi ja ristati see Cd4- cre transgeensete hiirtega, et saavutada tingimuslik geneetiline deletsioon. Nagu oodatud, aktiveeriti CD4^plussMthfd2 T-rakud^fl/flCd4-cre plus (CD4^ΔMthfd2) hiirtel oli madalam MTHFD2 ekspressioon võrreldes Mthfd2 rakkudega^fl/flCd4-cre^pluss(metsiktüüpi [WT]) pesakonnakaaslased (joonis 2F). Algtasemel oli CD4DMthfd2 hiirtel CD4 veidi vähem^plussT-rakud põrnas võrreldes WT-ga (joonis 2G). In vitro aktiveerimisel ja diferentseerumisel CD4 rakkude arv ja elujõulisus^ΔMthfd2Th17 rakud ja vähemal määral Treg rakud olid märkimisväärselt madalamad (joonis 2H). Lisaks vähenes CD25 ekspressioon Th17 ja Treg rakkudes ning vähenes Th1 rakkudes (joonis 2I). Lõpuks CD4^ΔMthfd2Th1 ja Th17 rakkudel oli vastavalt madalam T-bet ja ROR t ekspressioon. FoxP3 Tregi rakkudes oli aga muutumatu (joonis 2J). Vaatamata muutustele TF ekspressioonis tekitasid diferentseeruvad Teffi rakud normaalses koguses tsütokiine (joonis 2K). Farmakoloogilise ja geneetilise lähenemisviisi tulemuste erinevused võivad olla tingitud ensüümi funktsioonide kadumise ajastusest ja täielikkusest arengu ajal ning võimalikest kompenseerivatest mehhanismidest.

MTHFD2i indutseerib FoxP3 ekspressiooni Th17 rakkudes ja suurendab Treg-rakkude diferentseerumist

Arvestades Teffi rakkude sõltuvust MTHFD2-st, testisime FoxP3 ja Treg rakkude MTHFD2i regulatsiooni. Eelkõige põhjustas MTHFD2i-ravi põhjustatud FoxP3 ebanormaalne ülesreguleerimine Th1-s ja silmatorkavamalt Th17-rakkudes annusest sõltuval viisil (joonis 3A). See juhtus ka siis, kui ravi lükati edasi 24 tundi pärast aktiveerimist (joonis 3B). Sarnast suundumust täheldati CD4DMthfd2 Th17 rakkudes (joonis 3C). See FoxP3 ülesreguleerimine oli funktsionaalne, kuna MTHFD2i-ga töödeldud Th17 rakud saavutasid CD8-ga koos kasvatamisel supresseeriva võime^plussT-rakud (joonis 3D). MTHFD2i võib seega soodustada FoxP3 ja Treg rakulaadseid fenotüüpe Th17 rakkudes. MTHFD2i suurendas ka indutseeritud Treg-rakkude diferentseerumist. Treg-rakud diferentseeriti MTHFD2i juuresolekul transformeeriva kasvufaktori b (TGF-b) kontsentratsioonide vahemikus. Igal testitud kontsentratsioonil, välja arvatud kõrgeim, suurenes FoxP3 ekspressioon MTHFD2i-ravi korral (joonised 3E ja 3F). Seda fenotüüpi säilitati ka hilinenud MTHFD2i raviga (joonis 3G).

Joonis 3. MTHFD2 puudulikkus kutsub esile FoxP3 ekspressiooni ja soodustab nihet oksüdatiivse fosforüülimise suunas

(A) FoxP3 ekspressioon MTHFD2i-ga töödeldud Th1 ja Th17 rakkudes 72 tundi pärast aktiveerimist (keskmine ± SD, ühesuunaline ANOVA, andmed esindavad kolme sõltumatut katset 9 bioloogilise kordusega).

(B) FoxP3 ekspressioon Th1 ja Th17 rakkudes aktiveeriti 24 tundi ja töödeldi seejärel vehiikuliga või 500 nM MTHFD2i-ga 48 tundi (keskmine ± SD, paaritu t-test, andmed esindavad kolme sõltumatut katset 9 bioloogilise kordusega).

(C) FoxP3 ekspressioon Th1 ja Th17 rakkudes WT ja CD4DMthfd2 pesakonnakaaslastest 72 tundi pärast aktiveerimist (keskmine ± SD, paaritu t-test, andmed esindavad kolme sõltumatut katset 9 bioloogilise kordusega).

(D) Supressioonianalüüs, mis mõõdab MTHFD2i-ga töödeldud Th17 rakkude ebanormaalset supresseerimisvõimet. Eeltöödeldud Th17 rakke kultiveeriti koos CTV-ga värvitud CD8 pluss T-rakkudega, et mõõta proliferatsiooni pärast aktiveerimist anti-CD3 ja anti-CD28 antikehadega (keskmine ± SD, ühesuunaline ANOVA, n=3 bioloogilist replikatsiooni) .

(E) FoxP3 ekspressioon Treg-rakkudes, mis on diferentseeritud TGF-b kontsentratsioonide vahemikuga ja töödeldud MTHFD2i-ga (keskmine ± SD, paaritu t-test, andmed esindavad kolme sõltumatut katset 9 bioloogilise kordusega).

(F) Voolutsütomeetria diagrammid punktis (E) esitatud andmete jaoks.

(G) FoxP3 ekspressioon Treg-rakkudes, mis aktiveeriti ja diferentseeriti TGF-b madalate kontsentratsioonidega 24 tundi ja seejärel töödeldi MTHFD2i-ga 48 tundi (keskmine ± SD, paaritu t-test, andmed esindavad kolme sõltumatut katset 9 bioloogilise kordusega kokku ).

(H) Seahorse XF Cell Mito stressitest, mis viidi läbi MTHFD2i-ga töödeldud Th17 ja Treg rakkudega (keskmine ± SD, n=3 bioloogilist replikatsiooni).(I) Basaalne ECAR, basaalne OCR, max OCR ja basaalne OCR/ECAR suhe mõõdetuna (H) (keskmine ± SD, paaritu t-test, andmed esindavad kahte sõltumatut katset kokku 6 bioloogilise kordusega). Statistiliselt olulised tulemused on märgistatud (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p protsenti 0,001).

Tregi rakkudel on suurem mitokondriaalne metabolism kui Th17 rakkudel (Michalek et al., 2011). MTHFD2i ravi metaboolsete tagajärgede kindlaksmääramiseks hinnati Th17 ja Treg rakke rakuvälise voo analüüsidega. MTHFD2i suurendas Th17 rakkude basaalset ja maksimaalset hapnikutarbimise määra (OCR), mis näitab nihet mitokondriaalse hingamise suunas (joonis 3H). Seevastu Th17 ja Treg rakkudel oli MTHFD2i-ravi korral vähenenud basaalne ekstratsellulaarne hapestumise määr (ECAR), mis viitab glükolüüsi vähenemisele (joonis 3I). OCR-i ja ECAR-i põhisuhe suurenes märkimisväärselt Th17 ja Treg rakkudes, kuna MTHFD2i nihutas metaboolset programmi glükolüüsilt oksüdatiivse fosforüülimise suunas. Need andmed näitavad, et MTHFD2i suurendab FoxP3 ekspressiooni Th17 rakkudes ja madala TGF-b tingimustes diferentseeritud Treg rakkudes ning nihutab Th17 rakud rohkem Treg rakulaadsele metabolismile.

MTHFD2 puudulikkus inimese CD4 pluss T-rakkudes vähendab Th17 rakkude proliferatsiooni ja elujõulisust, suurendades samal ajal FOXP3 ekspressiooni ja summutades mTORC1 aktiivsust

Et testida ülaltoodud leidude tõlgitavust inimese rakkudesse, CD4^plussTervete doonorite perifeersest verest eraldatud T-rakud diferentseeriti in vitro Th1-, Th17- ja Treg-rakkudeks ning neid töödeldi alates aktiveerimise hetkest kandja või MTHFD2i-ga. Proliferatsioon vähenes märkimisväärselt MTHFD2i-ga töödeldud Th17 ja Treg rakkudes (joonis 4A) ning Th17 rakkudel ilmnes ka suurenenud apoptoos (joonis 4B). Th17 rakkude proliferatsiooni vähenemine võeti kokku geneetilise lähenemisviisiga, kasutades väikest segavat RNA-d (siRNA) (joonised 4C ja S2G). Sarnaselt hiirerakkudega oli FOXP3 ekspressioon kõrgem MTHFD2i-ga töödeldud inimese Th17 rakkudes ja kõrgem MTHFD2i-ga töödeldud inimese Treg rakkudes (joonised 4D ja S2H). Arvestades, et mTORC1-AMPK telg on Th17 ja Treg rakkude diferentseerumise jaoks kriitiline, mõõdeti ka mTORC1 sihtribosomaalse valgu S6 (fosfo-S6) fosforüülimist. See näitas mTORC1 aktiivsuse vähenemist Th17 rakkudes MTHFD2i või siMTHFD2-ga (joonis 4E). Seega saab proliferatsioonivõime kadumise ja FOXP3 ekspressiooni indutseerimise Th17 ja Treg rakkudes kokku võtta inimese primaarses CD4^plussT-rakud.

Joonis 4. MTHFD2 puudulikkus kahjustab proliferatsiooni ja indutseerib FOXP3 ekspressiooni inimese Th17 rakkudes

(A) Proliferatsioon, mõõdetuna CTV lahjendusega inimese CD4 pluss T-rakkude alamhulkades, keda töödeldi vehiikuliga või 2 mM MTHFD2i-ga 72 tundi pärast aktiveerimist anti-CD3 ja anti-CD28 antikehadega (paaritud t-test, andmed esindavad kolme sõltumatut katset 5-ga). –6 tervet doonorit).

(B) Anneksiin V abil mõõdetud apoptoos inimese CD4 pluss T-rakkudes, mida töödeldi MTHFD2i-ga 72 tundi (paaritud t-test, andmed esindavad kolme sõltumatut katset 5–6 terve doonoriga).

(C) Ki-67 ekspressioon inimese CD4 pluss T-rakkudes, mis on transdutseeritud NTC või siMTHFD2-ga (paaritud t-test, andmed esindavad kolme sõltumatut katset 4 terve patsiendi doonoriga).

(D) FOXP3 ekspressioon inimese CD4 pluss T-rakkudes, mida töödeldi MTHFD2i-ga 72 tundi (paaritud t-test, andmed esindavad kolme sõltumatut katset 6–10 terve doonoriga).

(E) Muutus fosfo-S6 ekspressioonis inimese CD4 pluss T-rakkudes, mida töödeldi MTHFD2i-ga 72 tundi või transdutseeriti siMTHFD2-ga (keskmine ± SD, ühe proovi t-test, andmed esindavad kolme sõltumatut katset 4–6 terve doonoriga). Statistiliselt olulised tulemused on märgistatud (* p < 0.{{10}}5,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" protsent="">

T-rakud tuginevad MTHFD2 ensümaatilisele funktsioonile ja fenotüüpe saab päästa tootega

MTHFD2 on vajalik mitokondriaalse formiaadi kogumi säilitamiseks puriinide sünteesiks (Ma et al., 2017), kuid sellel võib olla ka mitteensümaatiline roll. Olulist ensümaatilist aktiivsust toetades viis MTHFD2i-ravi CD4 pluss T-rakkude alamhulkades söötmest formiaadi kompenseeriva omastamiseni (joonis 5A). Formiaadi sünteesiks kasutatav 1C-ühik saadakse seriini muundamisel glütsiiniks ja rakusisene seriin akumuleerub, samas kui glütsiin vähenes MTHFD2i-raviga kõigis alamrühmades (joonis 5B). Metioniini kontsentratsioonid tõusid samuti veidi, mis viitab metioniini tsükli pärssimisele. Arvestades, et seriin-glütsiini konversioonietapp on MTHFD2-st ülesvoolu, nagu oodatud, ei päästetud neid muutusi formiaadi lisamisega söötmesse.

Joonis 5. MTHFD2i mõju T-rakkude alamhulkadele päästis eksogeenne formiaat

(A) Formaadi omastamine mõõdetuna 1H-magnetresonantsspektroskoopia (MRS) abil CD4 pluss T-rakkude alamhulkades, mida on töödeldud vehiikuliga või 500 nM MTHFD2i-ga 72 tundi pärast aktiveerimist (keskmine ± SD, paaritu t-test, andmed esindavad kahte sõltumatut katset kokku 6 bioloogilise kordusega).

(B) Seriini, glütsiini ja metioniini kontsentratsioonide muutus CD4 pluss T-rakkudes, mida töödeldi 500 nM MTHFD2i või 500 nM MTHFD2i pluss 1 mM formiaadiga 4–6 tundi võrreldes kandjaga, mõõdetuna massispektromeetria abil (keskmine ± SD, n { {8}} bioloogilist replikatsiooni).

(C) Elusrakkude arv, elujõulisus ja CD25 ekspressioon MTHFD2i-ga töödeldud CD4 pluss T-rakkudes, mis on päästetud 1 mM formiaadi või 60 mM adeniini ja guaniini puriini lahusega 72 tundi pärast aktiveerimist (keskmine ± SD, ühesuunaline ANOVA, andmed on esindab kolme sõltumatut katset 9 bioloogilise kordusega).

(D) Elusrakkude arv, elujõulisus ja CD25 ekspressioon CD4 pluss T-rakkudes WT või CD4DMthfd2 pesakonnakaaslastest, kes päästeti formaadi või puriinidega 72 tunni jooksul pärast aktiveerimist (keskmine ± SD, ühesuunaline ANOVA, n=3 bioloogilist replikatsiooni ).

Järgmisena testisime, kas formiaadi või adeniini ja guaniini puriini lahuse lisamine võib päästa puuduliku ensümaatilise funktsiooni ja pöörata tagasi MTHFD2 puudulikkuse mõju allavoolu. Tõepoolest, 1 mM formiaat taastas MTHFD2i-ga töödeldud rakkudes proliferatsiooni, elujõulisuse ja aktivatsiooni (joonis 5C). Puriini lisamine päästis proliferatsiooni kõigis alamrühmades ja aktivatsiooni Th1 ja Th17 rakkudes, kuid mitte elujõulisuse kõigis alamrühmades ja aktivatsiooni Treg rakkudes. Formaat päästis ka CD4 proliferatsiooni, elujõulisuse ja aktivatsiooni^ΔMthfd2T-rakud (joonis 5D). Kahjustatud tsütokiinide tootmine MTHFD2i-ga töödeldud Th1 ja Th17 rakkudes muudeti formiaadi või puriini lisamisega vehiiklikogustele (joonis 5E). Eelkõige päästis FoxP3 ebanormaalne ülesreguleerimine Th17 rakkudes puriini lisamisega, kuid mitte formiaadi lisamisega, samas kui formiaadi ja puriini lisamine vähendasid FoxP3 ekspressiooni algtasemeni Treg-rakkudes, mis olid diferentseeritud TGF-b madala kontsentratsiooniga (joonis 5F). Näib, et MTHFD2i fenotüübid sõltuvad mitokondriaalse formiaadi või puriini kogumite MTHFD2 säilitamisest.

MTHFD2 reguleerib mTORC1 aktiivsust ning DNA ja histooni metüülimist CD4-s^plussT-rakud

Immortaliseeritud vähirakkudes võib MTHFD2 puudulikkus põhjustada puriini sünteesi vaheühendite GAR, SAICAR ja AICAR akumuleerumist, mis on 10- formüülTHF-vahendatud formüülimisetappidest ülesvoolu (Ducker et al., 2016). CD4^plussT-rakkude alamrühmi kultiveeriti 72 tundi enne kokkupuudet MTHFD2i-ga 4–6 tundi. See lühike ajavahemik valiti selleks, et vältida kõrvalmõjusid, sealhulgas kompenseerivaid muudatusi. Mööduv MTHFD2i-ravi põhjustas GAR-i, SAICAR-i ja AICAR-i kuhjumise kõigis alamrühmades (joonis 6A). See efekt päästeti täielikult 1 mM formiaadi lisamisega, toetades MTHFD2 ensümaatilist rolli. MTHFD2i ammendas ka nukleotiide ja nukleoaluseid, sealhulgas guaniini, ning Th17 ja Treg rakkudes päästeti formiaat (joonis 6B).

Joonis 6. MTHFD2i tulemuseks on puriinide sünteesi vaheühendite akumuleerumine, summutatud mTORC1 aktiivsus ning muutunud DNA ja histooni metüülimine

(A) GAR, SAICAR ja AICAR kontsentratsioonide muutus CD4 pluss T-rakkudes, mida on töödeldud 500 nM MTHFD2i või 500 nM MTHFD2i pluss 1 mM formiaadiga 4–6 tundi võrreldes kandjaga, mõõdetuna massispektromeetriaga (keskmine ± SD, üks- viis ANOVA, n=3 bioloogilist kordust).

(B) Nukleotiidide metabolismi liikide muutus Th17 ja Treg rakkudes, mida töödeldi MTHFD2i-ga koos formaadiga või ilma 4–6 tundi, võrreldes kandjaga, mõõdetuna massispektromeetriaga (n=3 bioloogilist kordust).

(C) Fosfo-S6, S6, Rheb, fosfo-ACC, ACC, HIF-1a ja b-aktiini immunoblot CD4 pluss T-rakkudes, mida on töödeldud MTHFD2i-ga koos formaadiga või ilma selleta 72 tundi pärast aktiveerimist (andmed) kolme sõltumatu katse esindaja n=3 bioloogilise kordusega).

(D) TCA tsükli metaboliitide muutus Th17 rakkudes, mida töödeldi MTHFD2i-ga koos formaadiga või ilma 6 tundi, võrreldes vehiikuliga, mõõdetuna massispektromeetriaga (keskmine ± SD, ühesuunaline ANOVA, n=3 bioloogilist replikatsiooni).

(E) H3K27me3 ja IgG kontrollsuhte soojuskaardid ±10- kb piirkondades UCSC teadaolevate geenide promootorite ümber MTHFD2i-ga töödeldud Th17 ja Treg rakkudes, mõõdetuna CUT&RUN meetodil (andmed on koondatud 3 bioloogilisest kordusest).

(F) Foxp3 lookuse keskmise DNA metüülimise sageduse soojuskaart CpG saidi järgi vehiikuliga või 500 nM MTHFD2i-ga töödeldud Th1 ja Th17 rakkudes ning WT või CD4DMthfd2 pesakonnakaaslaste nTreg rakkudes (Moodi test, n=3 bioloogilist replikatsiooni).

(G) Punkti (F) tabeleerimine proksimaalse promootori, distaalse promootori ja TSDR abil (paaritud t-test). Vaata ka jooniseid S3 ja S4. Statistiliselt olulised tulemused on märgistatud (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" protsent="">

AICAR ja nukleotiidid on mTORC1-AMPK telje väljakujunenud regulaatorid (Emmanuel et al., 2017; Kim et al., 2016). Tõepoolest, fosfo-S6 ekspressioon vähenes MTHFD2i-raviga kõigis alamrühmades ja taastati täielikult formiaadi lisamisega (joonised 6C ja S3A). GTP-d siduv valk Rheb, mTORC1 kohustuslik aktivaator, võib olla tundlik rakusisese guaniini kättesaadavuse suhtes (Emmanuel et al., 2017) ja Rheb ekspressiooni summutati MTHFD2i-raviga (joonised 6C ja S3B). AICAR on adenosiini analoog ja AMPK aktivaator (Rae ja Mairs, 2019; Su et al., 2019). Kuid 72 tundi pärast aktiveerimist ei muutunud AMPK või selle sihtmärkide, atsetüülkoensüüm A(CoA) karboksülaasi (fosfo-ACC) ja Unc-51-sarnaselt autofaagiat aktiveeriva kinaasi (fosfo-ULK1) fosforüülimine MTHFD2i-ravi korral. (Joonised 6C, S3C ja S3D). mTORC1 aktiivsus soodustab Th17 ja nõrgendab Treg-rakkude diferentseerumist osaliselt HIF-1a-sõltuva glükolüütilise metabolismi indutseerimise kaudu (Shi et al., 2011). Kooskõlas sellega vähenes HIF-1a ekspressioon MTHFD2i-ga töödeldud ja CD4DMthfd2 Th17 rakkudes (joonised 6C, S3E ja S3F). Neid mTORC1 aktiivsuse muutusi ei seostatud TCR-i signaalimise puudujääkidega, mõõdetuna Nur77 ekspressiooniga koos uuesti stimulatsiooniga ja ilma (joonis S3G). Signaalimuundur ja transkriptsiooni 3 (STAT3) aktiivsuse aktivaator, mis on Th17 rakkude arengu jaoks kriitiline, ei muutunud või suurenes MTHFD2i-ravi korral mõõdukalt (joonis S3H). MTORC1 aktiivsuse vähenemine ja üleminek glükolüüsilt oksüdatiivse fosforüülimise suunas MTHFD2i-raviga viitasid muutustele trikarboksüülhappe (TCA) tsükli metaboliitide suhtelises arvukuses. MTHFD2i vähendas märkimisväärselt suktsinaadi ja fumaraadi kontsentratsiooni, kuid formiaat päästis selle (joonis 6D).

TCA metaboliidid on teadaolevad DNA ja histooni demetülaaside inhibiitorid (Su et al., 2016) ning suktsinaadi ja fumaraadi kogumi ammendumine võib toetada hüpometüleeritud olekut. H3K27 tri-metüülimist (H3K27me3) kogu genoomis mõõdeti CUT&RUN (lõhustamine sihtmärkide all ja vabanemine nukleaasi abil) sekveneerimisega (Skene ja Henikoff, 2017). Tõepoolest, MTHFD2i-ga töödeldud Th17 rakud vähendasid H3K27me3 võrreldes kandjaga (joonised 6E ja S4A). DNA metüülimist Foxp3 lookuses mõõdeti ka bisulfaadi sekveneerimisega, et teha kindlaks, kas diferentsiaalne metüülimine aitas kaasa MTHFD2i indutseeritud FoxP3 ülesreguleerimisele. Kuigi mitme CpG lookuse metüülimise sagedus erines kandja ja MTHFD2i tingimustes, ei olnud Treg rakuspetsiifilises demetüleeritud piirkonnas (TSDR) märgatavat mustrit. Samuti ei esinenud erinevusi WT ja CD4DMthfd2 hiirtest eraldatud nTreg rakkude (CD4 pluss CD25 pluss) vahel (joonis 6F), kuigi iga rikastatud populatsiooni puhtus oli madal (joonis S4B). Siiski vähenes MTHFD2i-ga töödeldud Th17 rakkudes võrreldes kandjaga oluliselt DNA metüülimise sagedus Foxp3 proksimaalse promootori piirkonnas (joonis 6G), mis näitab transkriptsiooni võimalikku paranemist MTHFD2i-ga.

Lisaks rakusisese formiaadi kogumi säilitamisele aitab MTHFD2 aktiivsus kaasa raku redoks-tasakaalu saavutamisele NAD muundamise kaudu^plussNADH-le ja NADP-le^plussNADPH-le (Shin et al., 2017) ning transsulfuratsiooniraja ja sellele järgneva glutatiooni sünteesi toetamine. MTHFD2i-ga töödeldud Th17 rakkudel oli NAD kontsentratsioon vähenenud^pluss, NADH, NADP^plussja NADPH, mis päästeti formaadiga (joonis S4C). Siiski, NAD^pluss/NADH ja NADP^pluss/NADPH suhted ei muutunud kõigis tingimustes. See koos muutuste puudumisega rakulistes reaktiivsetes hapnikuliikides (ROS) ja mitokondriaalses superoksiidis (joonis S4D) viitab sellele, et muutused redoksolekus ei ole tõenäoliselt MTHFD2i fenotüübi peamine tegur.

MTHFD2 puudulikkus in vivo vähendab mitmete põletikuliste haiguste raskust

Järgmisena testiti MTHFD2 efektiivsust terapeutilise sihtmärgina in vivo T-rakkudest sõltuva viivitatud tüüpi ülitundlikkuse (DTH) mudelis. Hiired immuniseeriti ja nakatati kõrvas võtmeaugu hemotsüaniiniga (KLH), et kutsuda esile kohalik põletik ja neid raviti suukaudse kandja või MTHFD2i-ga. Ravi ei näidanud ilmset toksilisust, kuna loomad säilitasid oma kehakaalu (joonis S5A). Oluline on see, et kõrva paksus ja kaal suurenesid DTH kontrollhiirtel, kuid mitte inhibiitoriga ravitud loomadel, mis näitab kaitset põletiku eest pärast MTHFD2i-ravi (joonised 7A, 7B ja S5B). KLH-spetsiifiline immunoglobuliin G (IgG) vähenes ka inhibiitori suurima annuse korral, mis näitab potentsiaalset mõju, mis laieneb B-rakkude funktsioonile (joonis 7C).

Joonis 7. MTHFD2 sihtimine in vivo vähendab haiguse tõsidust DTH, EAE ja IBD mudelites

(A ja B) Kõrva (A) suhteline paksus ja (B) biopsia kaal 1 0 päeva pärast KLH-d CFA-ga immuniseerimisega ja 3 päeva pärast KLH-ga nakatamist DTH (ühesuunaline ANOVA) esilekutsumiseks. Hiiri raviti kaks korda päevas suukaudse 0, 100 või 300 mg/kg MTHFD2i-ga (keskmine ± SEM, n=8 bioloogilist kordust).

(C) KLH-spetsiifilised IgG kontsentratsioonid KLH-indutseeritud DTH 10. päeval (keskmine ± SEM, Kruskal-Wallise test, n=8 bioloogilist replikatsiooni).

(D) Keskmine kliiniline skoor aja jooksul WT ja CD4DMthfd2 pesakonnakaaslastel, keda immuniseeriti MOG-ga koos CFA ja PTX-ga, et esile kutsuda EAE (keskmine ± SEM, mitu Mann-Whitney testi, andmed esindavad kahte sõltumatut katset, millest igaühel oli 5 bioloogilist kordust).

(E) Rakkude arv ja CD4 pluss T-rakkude esinemissagedus EAE hiirte seljaajus haiguse tipptasemel (keskmine ± SEM, paaritu t-test, andmed esindavad kahte sõltumatut katset 9 bioloogilise kordusega).

(F) CD25 ja CD44 ekspressioon EAE hiirte seljaaju CD4 pluss T-rakkudes (keskmine ± SEM, paaritu t-test, n=4 bioloogilist replikatsiooni).

(G ja H) (G) T-panus pluss , RORgt pluss , FoxP3 pluss , FoxP3 pluss /T-panus pluss suhe, FoxP3 pluss /RORgt pluss suhe ja (H) IL-17 pluss , IFNg rakkude arv pluss ja IL-17 pluss IFNg pluss CD4 pluss T-rakud EAE hiirte seljaajust (keskmine ± SEM, paaritu t-test, andmed esindavad kahte sõltumatut katset 9 bioloogilise kordusega).

(I) H&E, anti-CD3 IHC ja Luxol Fast Blue (LFB) värvumine müeliini suhtes immuniseerimata WT hiire seljaajus ning WT ja CD4DMthfd2 pesakonnakaaslastel, kellel on EAE haiguse tipus (2003. aasta suurendus, esindab 5 bioloogilist replikatsiooni ).

(J) Kehakaalu muutus Rag1 aja jooksul^__/__hiirtele süstiti IBD koliidi esilekutsumiseks ip WT või CD4DMthfd2 naiivseid CD4 pluss T-rakke (keskmine ± SEM, mitu t-testi, n=8 bioloogilist replikatsiooni).

(K ja L) (K) kogu CD4 pluss T-rakkude ja (L) T-bet pluss , RORgt pluss ja FoxP3 pluss CD4 pluss T-rakkude arv IBD hiirte MLN-idest (keskmine ± SEM, paaritu t test n { {4}} bioloogilist replikatsiooni). Vaata ka jooniseid S5 ja S6. Statistiliselt olulised tulemused on märgistatud (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" protsent="">

Samamoodi oli kahekordne MTHFD1 / 2 inhibiitor LY345899 (Gustafsson et al., 2017) tõhus haiguse leevendamisel EAE mudelis. EAE indutseeriti MOG ja PTX-ga ning hiiri raviti iga päev DMSO või LY345899 intraperitoneaalse (ip) süstimisega. Inhibiitoriravi vähendas oluliselt haiguse tõsidust ja kumulatiivset kliinilist skoori võrreldes kandjaga (joonised S5C ja S5D). Hiired surmati 26. päeval ja immuunprofiilide koostamiseks koguti seljaajusse infiltreeruvad rakud. Nimelt oluliselt vähem CD45^pluss, CD4^plussja CD8^plussrakud imbusid LY345899--ravitud hiirte seljaajusse (joonised S5E–S5G). ROR t sageduses muutusi ei toimunud^plussvõi FoxP3^plussrakud infiltreeruva CD4 hulgas^plussT-rakud (joonis S5H). Siiski vähenes IFNg pluss IL-17 pluss rakkude sagedus ja suurenes IL-17 pluss rakkude arv (joonis S5I), mis viitab võimalikule üleminekule vähem patogeensele fenotüübile.

T-rakkude sisemise sõltuvuse otseseks testimiseks MTHFD2-st in vivo kasutati WT ja CD4DMthfd2 pesakonnakaaslastel kolme erinevat mudelit: EAE, põletikuline soolehaigus (IBD) ja allergiline hingamisteede haigus. EAE indutseeriti uuesti MOG ja PTX-ga ning sarnaselt inhibiitori eksperimendiga oli CD4DMthfd2 hiirtel haiguse raskusaste 26 päeva jooksul oluliselt vähenenud (joonis 7D). Eraldi kohort surmati haiguse tipus 15. päeval pärast T-rakkude fenotüüpimise indutseerimist (joonised S6A ja S6B). Kuigi CD4^plussvõi CD8^plussT-rakkude arv põrnas ei muutunud (joonis S6C), CD4 pluss T-rakkude infiltratsioon seljaajusse vähenes märkimisväärselt (joonis 7E). CD4DMthfd2 hiirte seljaaju infiltreeruvatel CD4 pluss T-rakkudel oli CD25 ekspressioon sarnane WT-ga, kuid CD44 ekspressioon vähenes, mis viitab osaliselt kahjustatud aktivatsioonile (joonis 7F). T-panuse numbrid^pluss, ROR t plus ja FoxP3 plus rakud (joonis 7G), samuti IL-17 plus ja IFNg pluss rakud (joonis 7H) vähenesid ka CD4DMthfd2 hiirte seljaajus WT suhtes. Eelkõige olid FoxP3 plusi ja T-bet plus ja RORgt plus rakkude suhted CD4DMthfd2 hiirtel kõrgenenud võrreldes WT-ga haiguse tipus, peegeldades in vitro leide suurenenud FoxP3 ekspressioonist koos MTHFD2 puudulikkusega (joonis 7G). Kuigi TF-i ekspresseerivate rakkude sagedus infiltreeruvate rakkude seas oli üldiselt suurem, ei muutunud tsütokiini ekspressiooni sagedus (joonised S6D ja S6E). Ilma EAE ja WT ja CD4 kontrollhiirte seljaaju histoloogia^ΔMthfd2EAE-ga hiirtel ilmnes WT hiirte seljaaju rakulisuse ja CD3 positiivsuse suurenemine, mis oli seotud demüelinisatsiooniga, nagu näitab Luxol Fast Blue värvimine (joonis 7I). Need muutused puudusid no-EAE kontrollis ja CD4-s^ΔMthfd2hiired.

Järgmisena testiti MTHFD2 rolli IBD ja allergiliste hingamisteede haiguste mudelites. WT ja CD4DMthfd2 naiivsed CD4 pluss T-rakud viidi IBD algatamiseks üle Rag1 / retsipientidele. Kuigi hiired, kes said WT-rakke, hakkasid IBD edenedes kaalust alla võtma, jätkasid CD4DMthfd2 T-rakkude retsipiendid kehakaalu suurenemist (joonis 7J). Käärsoole tühjendavates põrnades (joonis S6F) ja mesenteriaalsetes lümfisõlmedes (MLN) leiti oluliselt vähem CD4DMthfd2 T-rakkude arvu ja sagedust (joonised 7K ja S6G). MLN-ides vähenes ka T-bet plus, ROR t plus ja FoxP3 plus CD4DMthfd2 T-rakkude arv, kuid FoxP3 pluss rakkude sagedus suurenes (joonised 7L ja S6H). Siiski ei olnud sellel hilisel ajahetkel FoxP3 / T-bet ja FoxP3 / RORgt rakkude arvu suhetes MLN-ides erinevusi (joonis S6I). Sarnaselt MTHFD2 leidudele in vivo hingamisteede põletiku CRISPR-ekraanil (joonis 1C) ilmnes, et CD4DMthfd2 hiirtel, kellel oli Alternaria põhjustatud allergiline hingamisteede haigus, vähenes neutrofiilide arvukus bronhoalveolaarses loputusvedelikus (BALF), kuigi seda ei täheldatud. muutusi täheldati BALF-i lümfotsüütide, eosinofiilide ja makrofaagide arvus (joonis S7A).

Lõpuks testiti MTHFD2i mõju üldisele immuunaktiivsusele. OVA-spetsiifiline OT-II CD45.2^plussCD4^plussT-rakud viidi adoptiivselt üle CD45.1-sse^plusshiired, keda seejärel immuniseeriti subkutaanselt OVA emulsiooniga koos täieliku Freundi adjuvandiga (CFA) ja töödeldi iga päev suukaudse vehiikuliga või MTHFD2i-ga. Kehakaal ei muutunud kõigis tingimustes (joonis S7B). Ülekantud OT-II CD laiendamine45.2^plussimmuniseeritud MTHFD2i-ga töödeldud hiirtel hilinesid rakud veidi, kuid jõudsid vehiikulite arvuni 7. päevaks (joonised S7C–S7E). Kuid IFNg pluss rakkude sagedus vähenes LN-de äravoolus (joonis S7F). Need andmed näitavad, et in vivo MTHFD2i-ravi võimaldab pärast ägedat stimulatsiooni antigeenispetsiifilist T-rakkude laienemist, kuigi põletikuliste tsütokiinide tootmist on nõrgenenud.

ARUTELU

T-rakkude aktiveerimine, diferentseerumine ja funktsioon nõuavad sobivat metaboolset ümberprogrammeerimist, et rahuldada rakkude suurenenud nõudlust energia, biosünteetiliste ehitusplokkide ja signaalimolekulide järele. Selles uuringus uurisime 1C metabolismi funktsiooni primaarsetes CD4 pluss T-rakkudes. Kasutades in vivo primaarsete T-rakkude CRISPR-põhiste sõeluuringute ja geeniekspressiooniandmete kombinatsiooni, tuvastati MTHFD2 kui potentsiaalne sihtmärk põletikuvastaste ravimeetodite jaoks. MTHFD2 inhibeerimine või puudulikkus põhjustas üldiselt CD4 pluss T-rakkude proliferatsiooni vähenemise. Eelkõige seostati seda FoxP3 ekspressiooni ja supresseeriva funktsiooni indutseerimisega Th17 rakkudes ning Treg-rakkude suurenenud diferentseerumisega. Need andmed viitavad sellele, et MTHFD2 võib toimida metaboolse kontrollpunktina Th17-Treg-rakkude teljel, kusjuures MTHFD2i-ravi õmbleb tasakaalu patogeensest fenotüübist põletikuvastasemale fenotüübile. Tõepoolest, MTHFD2 inhibeerimine või geneetiline puudulikkus leevendas haiguse tõsidust mitmes autoimmuunsuse ja ülitundlikkuse in vivo mudelis.

1C metabolism koosneb seriini-glütsiini metabolismist, folaadi tsüklist ja metioniini tsüklist ning on kesksel kohal mitmes protsessis, sealhulgas de novo puriini süntees, metüüldoonori genereerimine ja redoksregulatsioon (Yang ja Vousden, 2016). 1C metabolism on tugevalt seotud TCR-i stimulatsiooniga (Tan et al., 2017) ja see on vajalik T-rakkude laienemise toetamiseks (Ma et al., 2017). Folaadi tsükkel on jaotatud tsütosoolseteks ja mitokondriaalseteks komponentideks. Tsütosoolis muundab MTHFD1 omavahel 5, 10-metüleenTHF, 10-formüülTHF ja formiaat. Mitokondrites viivad samad reaktsioonid läbi MTHFD2 ja MTHFD1L. Neid saadud vaheühendeid kasutatakse de novo puriini sünteesi formüülimisetappide toetamiseks. MTHFD1 ja MTHFD2 võivad redoksolekut moduleerida ka NAD(H) ja NADP(H) genereerimise kaudu (Ducker ja Rabinowitz, 2017). Kuigi mõned rakutüübid on mitokondriaalse raja düsfunktsiooni tingimustes paindlikud tsütosoolsele allikale üleminekul (Ducker et al., 2016), on varem välja pakutud, et T-rakud sõltuvad peamiselt mitokondriaalsest rajast, et pakkuda 1C ühikuid ja redutseerivaid liike (Ron- Harel jt, 2016). Samuti on näidatud, et T-rakud sõltuvad seriini omastamisest ja in vivo immuunvastuseid saab moduleerida toidu seriinikogustega. Seriini nälgimise mõju vahendab puriini biosünteesi piiramine isegi tervete päästeteede juuresolekul ja sellest saab mööda minna glütsiini ja formiaadi pakkumisega (Ma et al., 2017). Meie andmed täiendavad neid leide ja osutavad MTHFD2-le kui kriitilisele regulaatorile, mis mõjutab CD4^plussT-rakkude proliferatsioon ja diferentseerumine.

Ehhanikosiid

Kuigi 1C metabolism mängib rakkude metabolismis suurt rolli, leidsime, et mõned funktsioonid olid T-rakkude alamhulkade valimisel erinevad. Kõik inimese ja hiire T-rakud prolifereerusid vähemal määral MTHFD2 puudulikkusega, mis näitab MTHFD2 jagatud funktsiooni toetada T-rakkude kasvu ja jagunemist. MTHFD2 puudulikkuse mõju T-rakkude diferentseerumisele ja efektorfunktsioonile erines aga igas testitud alamrühmas. Th1-rakkudel oli vähenenud diferentseerumine T-bet indutseerimise ja tsütokiinide tootmise vähenemisega. Th17 rakkudel oli ka muutunud diferentseerumine ja vähenenud tsütokiinide tootmine. Kuigi ROR t ei muutunud, reguleerisid MTHFD2-puudulikud Th17 rakud Treg raku TF FoxP3 üles ja said võime pärssida aktiveeritud CD8 pluss T-rakkude proliferatsiooni. Tregi rakkudel oli madala TGF-b tingimustes suurenenud diferentseerumine. Nüüd on hästi teada, et kõigil neil alarühmadel võivad olla erinevad metaboolsed nõuded (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Meie andmed näitavad, et MTHFD2 on valikuliselt vajalik ka Teff-rakkude jaoks, edendades samal ajal Treg-rakkude saatust ja funktsiooni. Tähelepanuväärne on, et need tulemused erinevad GLUT1, GLS või ASCT2 puudustest, mis kahjustavad või muudavad Teff-rakkude diferentseerumist, avaldades samal ajal tagasihoidlikku mõju Treg-rakkude diferentseerumisele või Th17 transdiferentseerumisele Treg-rakkudeks (Johnson et al., 2018; Macintyre et al. ., 2014; Nakaya et al., 2014).

Need erinevad T-rakkude saatused näivad olevat sõltuvad MTHFD2 ensümaatilisest aktiivsusest, kuna MTHFD2 puudulikkuse tagajärjed päästeti formiaadi või puriini nukleoalustega. Kuigi me ei leidnud MTHFD2 puudulikkusega muutunud redokstasakaalu olulist mõju, näib muutunud de novo puriini süntees olevat kriitiline. MTHFD2i-ravi põhjustas puriinide, eriti guaniini kontsentratsiooni vähenemist, indutseerides samal ajal puriini sünteesi vaheühendite GAR, SAICAR ja AICAR akumulatsiooni. Need vahesaadused vajavad edasiseks biosünteesiks formüülimist ja mõju päästeti, kui söötmele lisati MTHFD2--st saadud metaboliitformiaat, mis toetas MTHFD2i sihtmärgiks olevat biokeemilist mehhanismi. DNA ja RNA sünteesi toetav de novo nukleotiidide süntees on T-rakkude proliferatsiooni jaoks hädavajalik (Que´me´ neur et al., 2003, 2004). Seega näib, et mehhanismi komponent, mille abil MTHFD2i kahjustab T-rakkude laienemist, näib olevat ebapiisav nukleotiidide genereerimine.

Flavonoid

Piisavate nukleotiidide sünteesimata jätmine võib efektor-T-rakke pärssida mitme mehhanismi kaudu. AMPK ja mTORC1 on metaboolse ümberprogrammeerimise peamised tõukejõud, millel on üldiselt vastandlikud rollid Teffi ja Tregi rakkudes (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Näitame, et MTHFD2i ravi T-rakkudes tõi kaasa adenosiini analoogi ja AMPK aktivaatorina märkimisväärse metaboliidi AICAR ägeda akumuleerumise (Rae ja Mairs, 2019; Su et al., 2019). Siiski ei olnud tõendeid AMPK aktiivsuse suurenemise kohta valitud ajahetkedel. See võib kajastada AMPK täiendavat reguleerimist, kuid AICARil võib olla ka AMPK-st sõltumatuid mõjusid (Dembitz et al., 2019). mTORC1 on tundlik ka puriinide kontsentratsioonide suhtes, kuna guaniini vähenenud saadavus pärsib mTORC1 aktivaatori Rheb aktiivsust (Emmanuel et al., 2017; Hoxhaj et al., 2017). AICAR akumuleerumine ja mTORC1 aktiivsuse vähenemine võib seega kaasa aidata MTHFD2i-ga töödeldud Th1 ja Th17 rakkude tekkele ja Treg rakkude suurenenud tekkele. MTORC1 signaaliülekande pärssimine võib samuti kaasa aidata metaboolse programmi üleminekule glükolüüsilt mitokondriaalsele hingamisele ja TCA metaboliitide arvukuse muutumisele MTHFD2i-ga töödeldud Th17 rakkudes. mTORC1 rada mängib keskset rolli anaboolse metabolismi edendamisel ja võib juhtida TF ATF4 akumuleerumist, mis omakorda võib indutseerida MTHFD2 ekspressiooni (Ben-Sahra et al., 2016).

Ainevahetusvoog on seotud epigeneetilise regulatsiooniga, kuna metaboliidid aitavad kaasa paljudele epigeneetilistele modifikatsioonidele (Sharma ja Rando, 2017), sealhulgas 1C metabolismile, et genereerida universaalne metüüldoonor S-adenosüülmetioniin (SAM) valkude ja DNA metüülimiseks. Süsiniku jälgimise katsed aktiveeritud T-rakkudes viitavad aga sellele, et glükoosist pärinevast ja eksogeensest seriinist saadud 1C-ühikud ei aita oluliselt kaasa metioniini tsüklile ja metüülimisele (Ma et al., 2017). Metaboolne voog võib samuti mõjutada metüülimise mustreid TCA metaboliitide, sealhulgas alfa-ketoglutaraadi, fumaraadi ja suktsinaadi arvukuse muutuste kaudu. Täpsemalt, fumaraat ja suktsinaat inhibeerivad DNA ja histooni demetülaase (Su et al., 2016). Kooskõlas nende metaboliitide ammendumisega MTHFD2i-ga töödeldud Th17 rakkudes vähenes H3K27me3 laialdaselt kogu genoomis ja DNA metüülimine vähenes spetsiifiliselt Foxp3 proksimaalses promootoris, mis võib aidata kaasa transdiferentseerumise fenotüübile. Th17 rakkude transdiferentseerumise fenotüüpi ei päästnud formiaadi lisamine, mis näitab, et FoxP3 regulatsioonile aitavad tõenäoliselt kaasa täiendavad rajad, näiteks teiste nukleotiidide kontsentratsiooni tuvastavate mehhanismide aktiivsuse kaudu.

Akteosiid (verbaskosiid)

Samuti on teatatud, et MTHFD2 mängib mitteensümaatilisi rolle, mis võivad kaasa aidata selle ensüümi põletikueelsele toimele. Vähirakkudes võib MTHFD2-l olla tuumafunktsioonid, mis paiknevad koos DNA replikatsioonisaitidega, et soodustada rakutsükli progresseerumist (Gustafsson Sheppard et al., 2015). Hiire tüvirakkudes on näidatud, et MTHFD2 moduleerib DNA parandamist, et säilitada genoomset stabiilsust (Yue et al., 2020). Neerurakulise kartsinoomi korral on leitud, et MTHFD2 on mRNA metüülimise kaudu metaboolse ümberprogrammeerimise jaoks ülioluline (Green et al., 2019). Kuigi need MTHFD2 rollid ei välista üksteist meie leidudega, viitab formiaadi võime päästa paljusid MTHFD2 puudulikkuse fenotüüpe T-rakkudes, et MTHFD2 ensümaatiline aktiivsus on T-rakkude proliferatsiooni ja saatuse peamine tõukejõud.

MTHFD2 on vähivastastes seadetes suures osas peetud ravimi sihtmärgiks. See võib olla ka paljutõotav põletikuvastane sihtmärk ja pakkuda vähem kõrvaltoimeid võrreldes praegu saadaolevate folaatidega, kuna enamikus täiskasvanud kudedes on madal ekspressioon. Näiteks üks MTX sihtmärk, DHFR, ekspresseerub ulatuslikult täiskasvanud kudedes (Nilsson et al., 2014). Seetõttu võib MTX-i seostada mitmesuguste kõrvaltoimetega, sealhulgas seedetrakti toksilisusega. Lisaks on MTX toimemehhanism vaatamata selle ulatuslikule ajaloole endiselt halvasti mõistetav (Cronstein ja Aune, 2020). MTHFD2 kõrgelt reguleeritud ekspressioon ja tsütosoolse MTHFD1 raja redundantsi potentsiaal võivad põhjustada spetsiifiliste rakupopulatsioonide selektiivset sõltuvust MTHFD2-st. Meie leiud tuvastavad MTHFD2 kui CD4 kriitilise metaboolse kontrollpunkti^plussT-rakud. Kuigi vähirakkude bioloogia ja kiiresti prolifereeruvate T-rakkude bioloogia kattuvad ulatuslikult, leiame, et CD4 pluss T-rakkude alamhulgad näitavad rakkude diferentseerumise ja funktsiooni moduleerimise kaudu täiendavat tundlikkust. On tõenäoline, et MTHFD2 sihtimine vähiravis võib piirata kasvajavastast immuunsust. Kuid sellised sätted nagu kolorektaalne kartsinoom, kus Th17-rakkude poolt vahendatud põletik soodustab haigusi, võivad MTHFD2-ga hästi sobida. T-rakkude tundlikkus MTHFD2is võib olla tõhus immunoteraapia vorm CD4 tingimustes^plussT-rakkudest põhjustatud põletik peale vähi ja põhjustab vähem kõrvaltoimeid kui praegu saadaolevad raviained.

Õppetöö piirangud

Selles uuringus kasutatud MTHFD2i IC50 väärtus on 0,0063 mM MTHFD2 ja 0,57 mM MTHFD1 puhul; seetõttu ei saa välistada MTHFD2 ja MTHFD1 topeltinhibeerimise väiksemaid sihtmärgiväliseid mõjusid. Arvestades, et ebanormaalset FoxP3 ülesreguleerimist Th17 rakkudes ei päästetud formiaadi pakkumisega, kuid mTORC1 aktiivsus päästis, vajab selle fenotüübi aluseks olev mehhanism täiendavat uurimist. Lisaks viidi kõik in vivo mudelid läbi MTHFD2i-ravi või geneetilise ablatsiooniga alates haiguse esilekutsumisest ja T-rakkude fenotüüpimine viidi läbi ühel ajahetkel. Et paremini iseloomustada MTHFD2 puudulikkuse mõju haiguse patogeneesile, peaksid edasised uuringud hõlmama aja jooksul tehtud katseid T-rakkude populatsioonide järjestikuse iseloomustamisega, et teha lõplikult kindlaks, kas CD4 ja T-rakkude alamhulgad on in vivo erinevalt mõjutatud. Lõpuks, et parandada selle uuringu asjakohasust kliinilistes rakendustes, tuleks testida pärast haiguse algust alustatud MTHFD2i-ravi efektiivsust.

TÄHTE ★ MEETODID

Üksikasjalikud meetodid on esitatud selle paberi veebiversioonis ja hõlmavad järgmist.

• VÕTMERESSURSIDE TABEL

• RESSURSSI SAADAVUS

• B Juhtkontakt

• B Materjalide saadavus

• B Andmete ja koodide kättesaadavus

  
  

• EKSPERIMENTAALNE MUDEL JA AINED

• B Hiired B Inimese T-rakud

• B rakuliinid

  
  

• MEETOD ANDMED

• B In vitro hiire CD4^plussT-rakkude aktiveerimine ja diferentseerumine

• B Th17 rakkude supressiooni test

• B In vitro inimese CD4^plussT-rakkude kultiveerimise tingimused

• B CRISPR skriining B Massispektromeetria metaboomika

• B Prootoni tuumamagnetresonantsspektroskoopia (1H-MRS)

• B Immunoblotanalüüs

• B CUT&RUN B EpigenDx suunatud NextGen vesiniksulfitiidi järjestamine

• B In vivo EAE mudelid IHC ja voolutsütomeetria jaoks

• B In vivo LY345899 ravi EAE mudelis

• B In vivo DS18561882 ravi DTH mudelis B In vivo IBD mudel WT ja CD4-ga^ΔMthfd2pesakonnakaaslased

• B In vivo allergilise hingamisteede haiguse mudel WT ja CD4-ga^ΔMthfd2pesakonnakaaslased

• B In vivo DS18561882 ravi OVA immuniseerimismudelis

  
  

• KVANTIFITSEERIMINE JA STATISTILINE ANALÜÜS

LISATEAVE

Täiendav teave on saadaval veebis aadressil https://doi.org/10.1016/j. immuunsus.2021.10.011.

TUNNUSTUS

Täname Rathmelli labori liikmeid sellesse projekti kaasaaitamise eest. Täname Thomas Aune'i RNA-seq andmete esitamise eest ja J. Coolsi (VIB) pMx-U6-gRNA-GFP konstrukti pakkumise eest. Täname Max R. Van Belkumi MTHFD2 qPCR praimerite kavandamise eest. Täname Nello Mainolfifit, Vipin Surit, Adam Friedmani ja Mark Manfredit ettevõttest Raze Therapeutics, Inc. (Boston, MA) Raze 1459 ühendi pakkumise eest, mida kasutati leidude kinnitamiseks (andmeid pole näidatud). Diagrammid loodi BioRenderiga. Tunnustame Leica Bond RX tõlkepatoloogia ühisressurssi, mida toetab NCI/NIH vähikeskuse toetus 5P30 CA68485-19 ja jagatud instrumentide stipendium S10 OD023475-01A1. Seda tööd toetasid William E. Paul Distinguished Innovator Award Lupus Research Alliance'ile (JCR), R01s DK105550 (JCR), HL136664 (JCR ja DCN), CA217987 (JCR), AI153167 (JCR), AI137075 (AKM-ile), T32 DK101003 (KV) ja T32 GM007347 (AS-ile).

AUTORI KAASALAD

AS, GA ja JCR kavandasid uuringu. AS, GA, KV, DRH, XX, MZM, XY, KLB, NC, MMW, ACY, DLG, AES, SKS, SNF, AMC, PF, TB ja JCG-C. uuringu läbi viinud. AS, GA, XY, JK, DCN, AKM, JDR ja JCR analüüsisid andmeid. AS ja JCR kirjutasid töö koos teiste autorite kaastööga.

HUVIDE DEKLARATSIOON

JCR on Sitryx Therapeuticsi asutaja, teadusliku nõuandekogu liige ja aktsionär; Caribou Biosciences teadusliku nõuandekogu liige ja aktsionär; NirogyTherapeuticsi teadusliku nõuandekogu liige; on viimase 3 aasta jooksul konsulteerinud Mercki, Pfizeri ja Mitobridge'iga; ja on saanud uurimistööd firmadelt Incyte Corp., CalitheraBiosciences ja Tempest Therapeutics. JDR on Raze Therapeuticsi, Torani, Serien Therapeuticsi ja Farber Partnersi kaasasutaja ja aktsionär ning nõustaja ja aktsionär ettevõtetes Agios Pharmaceuticals, Kadmon Pharmaceuticals, Bantam Pharmaceuticals, Colorado Research Partners, RafaelHoldings, The Barer Institute, LEFT. ta on saanud Pfizerilt ja Rafaelilt konsultatsioonitasusid ja teadusraha ning on Princetoni ülikooli patentide leiutaja. AMC, PF ja TB on ettevõtte Sitryx Therapeutics töötajad.

KAASAMINE JA MITMEKESISUS

Töötasime selle nimel, et tagada sooline tasakaal mitteinimesest subjektide valikul. Üks või mitu selle artikli autorit identifitseerivad end teaduses alaesindatud etnilise vähemusega. Tsiteerides selle töö jaoks teaduslikult olulisi viiteid, töötasime aktiivselt ka soolise tasakaalu edendamise nimel oma viidete loendis. Selle töö autorite loend sisaldab kaastöölisi uuringu läbiviimise asukohast, kes osalesid andmete kogumises, kujundamises, analüüsis ja/või töö tõlgendamises.

VIITED

Anderson, GR, Winter, PS, Lin, KH, Nussbaum, DP, Cakir, M., Stein, EM, Soderquist, RS, Crawford, L., Leeds, JC, Newcomb, R. jt. (2017). Terapeutilise koostöö maastik KRAS-i mutantsete vähivormide puhul paljastab kasvaja evolutsiooni kontrollimise põhimõtted. Cell Rep. 20, 999–1015.

Aune, TM, Crooke, PS, 3., Patrick, AE, Tossberg, JT, Olsen, NJ ja Spurlock, CF, 3. (2017). Pikkade mittekodeerivate RNA-de ekspressioon autoimmuunsuses ja seos võimendaja funktsiooni ja autoimmuunhaiguste riski geneetiliste variantidega. J. Autoimmun. 81, 99–109.

Bantug, GR, Galluzzi, L., Kroemer, G. ja Hess, C. (2018). T-rakkude metabolismi spekter tervises ja haigustes. Nat. Rev. Immunol. 18, 19–34. Ben-Sahra, I., Hoxhaj, G., Ricoult, SJH, Asara, JM ja Manning, BD (2016). mTORC1 indutseerib puriini sünteesi mitokondriaalse tetrahüdrofolaadi tsükli juhtimise kaudu. Teadus 351, 728–733.

Brown, PM, Pratt, AG ja Isaacs, JD (2016). Metotreksaadi toimemehhanism reumatoidartriidi korral ja biomarkerite otsimine. Nat. Rev. Reumatol. 12, 731–742.

Buck, MD, O'Sullivan, D. ja Pearce, EL (2015). T-rakkude metabolism juhib immuunsust. J. Exp. Med. 212, 1345–1360.

Cantor, JR, Abu-Remaileh, M., Kanarek, N., Freinkman, E., Gao, X., Louissaint, A., Jr., Lewis, CA ja Sabatini, DM (2017). Füsioloogiline keskkond taastab rakkude ainevahetust ja paljastab kusihappe kui endogeense UMP süntaasi inhibiitori. Cell 169, 258–272.e17.

Cronstein, BN ja Aune, TM (2020). Metotreksaat ja selle toimemehhanismid põletikulise artriidi korral. Nat. Rev. Reumatol. 16, 145–154.

Dembitz, V., Tomic, B., Kodvanj, I., Simon, JA, Bedalov, A. ja Visnjic, D. (2019). Ribonukleosiid AICAr kutsub esile müeloidse leukeemia diferentseerumise, aktiveerides ATR / Chk1 pürimidiini ammendumise kaudu. J. Biol. Chem. 294, 15257–15270.

Dendrou, CA, Fugger, L. ja Friese, MA (2015). Hulgiskleroosi immunopatoloogia. Nat. Rev. Immunol. 15, 545–558.

Ducker, GS ja Rabinowitz, JD (2017). Ühe süsiniku ainevahetus tervises ja haigustes. Lahtri metab. 25, 27–42.

Ducker, GS, Chen, L., Morscher, RJ, Ghergurovich, JM, Esposito, M., Teng, X., Kang, Y. ja Rabinowitz, JD (2016). Tsütosoolse ühe süsiniku voo ümberpööramine kompenseerib mitokondriaalse foolhappe raja kadumise. Lahtri metab. 23, 1140–1153.

Emmanuel, N., Ragunathan, S., Shan, Q., Wang, F., Giannakou, A., Huser, N., Jin, G., Myers, J., Abraham, RT ja Unsal-Kacmaz, K (2017). Puriini nukleotiidide saadavus reguleerib mTORC1 aktiivsust Rheb GTPaasi kaudu. Cell Rep. 19, 2665–2680.

Farber, S., Diamond, LK, Mercer, RD, Sylvester, RF ja Wolff, JA (1948). Foolhappe antagonisti 4-aminopteroüülglutamiinhappe põhjustatud ägeda leukeemia ajutised remissioonid lastel. N. Ingl. J. Med. 238, 787–793.

Field, MS, Kamynina, E., Watkins, D., Rosenblatt, DS ja Stover, PJ (2015). Uued teadmised raske kombineeritud immuunpuudulikkuse metaboolsetest ja toitumisfaktoritest. Haruldane Dis. 3, e1112479.

Fuseini, H., Yung, JA, Cephus, JY, Zhang, J., Goleniewska, K., Polosukhin, VV, Peebles, RS, Jr. ja Newcomb, DC (2018). Testosteroon vähendab kodutolmulesta põhjustatud 2. tüüpi ja IL-17A-vahendatud hingamisteede põletikku. J. Immunol. 201, 1843–1854.

Govindaraju, V., Young, K. ja Maudsley, AA (2000). Prootoni NMR keemilised nihked ja aju metaboliitide sidestuskonstandid. NMR Biomed. 13, 129–153.

Green, NH, Galvan, DL, Badal, SS, Chang, BH, LeBleu, VS, Long, J., Jonasch, E. ja Danesh, FR (2019). MTHFD2 seob RNA metüülimise metaboolse ümberprogrammeerimisega neerurakulise kartsinoomi korral. Oncogene 38, 6211–6225.

Gustafsson, R., Jemth, A.-S., Gustafsson, NMS, F€ arnega˚rdh, K., Loseva, O., Wiita, E., Bonagas, N., Dahllund, L., Llona-Minguez, S., H€ aggblad, M., et al. (2017). Tekkiva vähi sihtmärgi MTHFD2 kristallstruktuur kompleksis substraadipõhise inhibiitoriga. Cancer Res. 77, 937–948.

Gustafsson Sheppard, N., Jarl, L., Mahadessian, D., Strittmatter, L., Schmidt, A., Madhusudan, N., Tegne´r, J., Lundberg, EK, Asplund, A., Jain, M ja Nilsson, R. (2015). Folaadiga seotud ensüüm MTHFD2 on tuumavalk ja soodustab rakkude proliferatsiooni. Sci. Vabariik 5, 15029.

Hoxhaj, G., Hughes-Hallett, J., Timson, RC, Ilagan, E., Yuan, M., Asara, JM, Ben-Sahra, I. ja Manning, BD (2017). MTORC1 signaalivõrk tunneb muutusi raku puriini nukleotiidide tasemes. Cell Rep. 21, 1331–1346.

Johnson, MO, Wolf, MM, Madden, MZ, Andrejeva, G., Sugiura, A., Contreras, DC, Maseda, D., Liberti, MV, Paz, K., Kishton, RJ jt. (2018). Th17 ja Th1 rakkude diferentseerumise selge reguleerimine glutaminaasist sõltuva ainevahetusega. Lahter 175, 1780–1795.e19.

Ju, H.-Q., Lu, Y.-X., Chen, D.-L., Zuo, Z.-X., Liu, Z.-X., Wu, Q.-N., Mo, H.-Y., Wang, Z.-X., Wang, D.-S., Pu, H.-Y. jt. (2019). Redoks-homöostaasi moduleerimine MTHFD2 inhibeerimisega kolorektaalse vähi korral: mehhanismid ja terapeutilised tagajärjed. J. Natl. Cancer Inst. 111, 584–596.

Kawai, J., Toki, T., Ota, M., Inoue, H., Takata, Y., Asahi, T., Suzuki, M., Shimada, T., Ono, K., Suzuki, K., et al. (2019). Tugeva, selektiivse ja suu kaudu saadava MTHFD2 inhibiitori (DS18561882) avastamine koos in vivo kasvajavastase toimega. J. Med. Chem. 62, 10204–10220.

Kim, J., Yang, G., Kim, Y., Kim, J. ja Ha, J. (2016). AMPK aktivaatorid: toimemehhanismid ja füsioloogilised tegevused. Exp. Mol. Med. 48, e224.

Koufaris, C., Gallage, S., Yang, T., Lau, C.-H., Valbuena, GN ja Keun, HC (2016). MTHFD2 pärssimine MCF-7 rinnavähirakkudes suurendab glükolüüsi, sõltuvust eksogeensest glütsiinist ja tundlikkust folaadi vähenemise suhtes. J. Proteome Res. 15, 2618–2625.

Li, W., Xu, H., Xiao, T., Cong, L., Love, MI, Zhang, F., Irizarry, RA, Liu, JS, Brown, M. ja Liu, XS (2014). MAGECK võimaldab oluliste geenide tugevat tuvastamist genoomi ulatusega CRISPR / Cas9 knockout ekraanidelt. Genome Biol. 15 554.

Ma, EH, Bantug, G., Griss, T., Condotta, S., Johnson, RM, Samborska, B., Mainolfifi, N., Suri, V., Guak, H., Balmer, ML jt. (2017). Seriin on efektor-T-rakkude laienemise jaoks oluline metaboliit. Lahtri metab. 25, 345–357.

Macintyre, AN, Gerriets, VA, Nichols, AG, Michalek, RD, Rudolph, MC, Deoliveira, D., Anderson, SM, Abel, DE, Chen, BJ, Hale, LP jt. (2014). Glükoosi transporter Glut1 on CD4 T-rakkude aktiveerimise ja efektorfunktsiooni jaoks selektiivselt oluline. Lahtri metab. 20, 61–72.

Michalek, RD, Gerriets, VA, Jacobs, SR, Macintyre, AN, MacIver, NJ, Mason, EF, Sullivan, SA, Nichols, AG ja Rathmell, JC (2011). Tipptasemel: erinevad glükolüütilised ja lipiidide oksüdatiivsed metaboolsed programmid on olulised efektor- ja regulatoorsete CD4 pluss T-rakkude alamhulkade jaoks. J. Immunol. 186, 3299–3303.

Nakaya, M., Xiao, Y., Zhou, X., Chang, J.-H., Chang, M., Cheng, X., Blonska, M., Lin, X. ja Sun, S.-C . (2014). Põletikulised T-rakkude vastused sõltuvad aminohappe transporteri ASCT2 glutamiini omastamise hõlbustamisest ja mTORC1 kinaasi aktiveerimisest. Immuunsus 40, 692–705.

Nilsson, R., Jain, M., Madhusudhan, N., Sheppard, NG, Strittmatter, L., Kampf, C., Huang, J., Asplund, A. ja Mootha, VK (2014). Metaboolne ensüümi ekspressioon tõstab esile MTHFD2 ja mitokondriaalse folaadi raja võtmerolli vähi korral. Nat. Commun. 5 3128.

Palmer, LD, Maloney, KN, Boyd, KL, Goleniewska, AK, Toki, S., Maxwell, CN, Chazin, WJ, Peebles, RS, Jr., Newcomb, DC ja Skaar, EP (2019). Kaasasündinud immuunvalk S100A9 kaitseb T-abistaja rakkude tüüpi 2-vahendatud allergilise hingamisteede põletiku eest. Olen. J. Respir. Cell Mol. Biol. 61, 459–468.

Pikman, Y., Puissant, A., Alexe, G., Furman, A., Chen, LM, Frumm, SM, Ross, L., Fenouille, N., Bassil, CF, Lewis, CA jt. (2016). MTHFD2 sihtimine ägeda müeloidse leukeemia korral. J. Exp. Med. 213, 1285–1306.

Que´ me´ neur, L., Gerland, L.-M., Flacher, M., Ffrench, M., Revillard, J.-P. ja Genestier, L. (2003). Rakutsükli, proliferatsiooni ja primaarsete T-lümfotsüütide ellujäämise diferentsiaalne kontroll puriini ja pürimidiini nukleotiidide abil. J. Immunol. 170, 4986–4995.

Que´ me´ neur, L., Beloeil, L., Michallet, M.-C., Angelov, G., Tomkowiak, M., Revillard, J.-P. ja Marvel, J. (2004). De novo nukleotiidide biosünteesi piiramine häirib kloonide laienemist ja diferentseerumist efektor- ja mälu-CD8 T-rakkudeks. J. Immunol. 173, 4945–4952.

Rae, C. ja Mairs, RJ (2019). AMPK aktiveerimine AICAR-i poolt sensibiliseerib eesnäärmevähi rakud kiiritusravi suhtes. Oncotarget 10, 749–759.

Ron-Harel, N., Santos, D., Ghergurovich, JM, Sage, PT, Reddy, A., Lovitch, SB, Dephoure, N., Satterstrom, FK, Sheffer, M., Spinelli, JB jt. (2016). Mitokondriaalne biogenees ja proteoomide ümberkujundamine soodustavad ühe süsiniku ainevahetust T-rakkude aktiveerimiseks. Lahtri metab. 24, 104–117.

Shahi, SK, Freedman, SN, Murra, AC, Zarei, K., Sompallae, R., Gibson Corley, KN, Karandikar, NJ, Murray, JA ja Mangalam, AK (2019). Prevotella histicola, inimsoole kommensaal, on hulgiskleroosi loommudelis sama tugev kui COPAXONE. Esiosa. Immunol. 10 462.

Shalem, O., Sanjana, NE, Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA, Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL, Root, DE, Doench, JG ja Zhang, F. (2014). Genoomi skaala CRISPR-Cas9 knockout sõelumine inimese rakkudes. Teadus 343, 84–87.

Sharma, U. ja Rando, ELT (2017). Metaboolsed sisendid epigenoomi. Lahtri metab. 25, 544–558.

Shi, LZ, Wang, R., Huang, G., Vogel, P., Neale, G., Green, DR ja Chi, H. (2011). HIF1alfa-sõltuv glükolüütiline rada korraldab metaboolse kontrollpunkti T H17 ja Treg rakkude diferentseerumiseks. J. Exp. Med. 208, 1367–1376.

Shin, M., Momb, J. ja Appling, DR (2017). Inimese mitokondriaalne MTHFD2 on kahe redoks-kofaktori spetsiifiline metüleentetrahüdrofolaadi dehüdrogenaas / metüültetrahüdrofolaadi tsüklohüdrolaas. Vähk Metab. 5, 11.

Skene, PJ ja Henikoff, S. (2017). Tõhus suunatud nukleaasistrateegia DNA sidumissaitide kõrge eraldusvõimega kaardistamiseks. eLife 6, e21856.

Su, C.-C., Hsieh, K.-L., Liu, P.-L., Yeh, H.-C., Huang, S.-P., Fang, S.-H., Cheng, W.-C., Huang, K.-H., Chiu, F.-Y., Lin, I.-L. jt. (2019). AICAR kutsub esile apoptoosi ning pärsib migratsiooni ja invasiooni eesnäärmevähi rakkudes AMPK/mTOR-sõltuva raja kaudu. Int. J. Mol. Sci. 20, 1647.

Su, X., Wellen, KE ja Rabinowitz, JD (2016). Metüleerimise ja atsetüülimise metaboolne kontroll. Curr. Arvamus. Chem. Biol. 30, 52–60.

Tan, H., Yang, K., Li, Y., Shaw, TI, Wang, Y., Blanco, DB, Wang, X., Cho, J.-H., Wang, H., Rankin, S. jt. (2017). Integreeriv proteoomika ja fosfoproteoomika profileerimine paljastab T-rakkude aktiveerimise aluseks olevad dünaamilised signaalivõrgud ja bioenergeetika rajad. Immunity 46, 488–503.

Toffalini, F., Kallin, A., Vandenberghe, P., Pierre, P., Michaux, L., Cools, J. ja Demoulin, J.-B. (2009). Liitvalgud TEL-PDGFR ja FIP1L1-PDGFR pääsevad ubikvitineerimisest ja lagunemisest. Haematologica 94, 1085–1093.

Wan, X., Wang, C., Huang, Z., Zhou, D., Xiang, S., Qi, Q., Chen, X., Arbely, E., Liu, C.-Y., Du, P. ja Yu, W. (2020). Tsisplatiin inhibeerib SIRT3-deatsetüülimist MTHFD2, et häirida raku redoks-tasakaalu kolorektaalse vähi rakkudes. Cell Death Dis. 11 649.

Wang, L., Xing, X., Chen, L., Yang, L., Su, X., Rabitz, H., Lu, W. ja Rabinowitz, JD (2019). Peak annotatsiooni- ja kontrollimootor sihtmärgita LC-MS metaboloomika jaoks. Anal. Chem. 91, 1838–1846.

Yang, M. ja Vousden, KH (2016). Seriini ja ühe süsiniku metabolism vähi korral. Nat. Rev. Cancer 16, 650–662.

Yue, L., Pei, Y., Zhong, L., Yang, H., Wang, Y., Zhang, W., Chen, N., Zhu, Q., Gao, J., Zhi, M., et al. (2020). Mthfd2 moduleerib mitokondriaalset funktsiooni ja DNA parandamist, et säilitada hiire tüvirakkude pluripotentsus. Tüvirakkude aruanded 15, 529–545.

Zhu, Z. ja Leung, GKK (2020). Rohkem kui metaboolne ensüüm: MTHFD2 kui vähivastase ravi uudne sihtmärk? Esiosa. Oncol. 10 658.

TÄHTE ★ MEETODID

VÕTMERESSURSIDE TABEL

RESSURSSI SAADAVUS

Juhtkontakt

Täiendav teave ning ressursside ja reaktiivide taotlused tuleb suunata juhtkontaktile dr Jeffrey Rathmell (jeff.rathmell@vumc.org) ja need täidetakse pärast asjakohase MTA täitmist.

Materjalide saadavus

Selles uuringus loodud plasmiidid ja hiireliinid tehakse nõudmisel kättesaadavaks pärast vastava MTA läbimist.

Andmete ja koodide kättesaadavus

CUT&RUN sekveneerimisandmed on deponeeritud GEO-sse ja on avaldamise kuupäeva seisuga avalikult kättesaadavad (GSE180356). Selles dokumendis esitatud mikroskoopiaandmeid ja originaalseid Western blot kujutisi jagab juhtkontakt nõudmisel. Mis tahes lisateavet, mis on vajalik käesolevas dokumendis esitatud andmete uuesti analüüsimiseks, saab nõudmise korral juhtkontaktilt.

Immuunsuse saamiseks klõpsake Cistanches