MiR{0}}p tõhustab lihaste taastumist ja leevendab vananenud lihaste ja lihasdüstroofiat

Lisateabe saamiseks võtke ühendust oscar.xiao@wecistanche.com-ga

Parabioosi katsed viitavad sellele, et noorendamise ja vananemisega seotud molekulaarsed tegurid ringlevad veres. Siin näitame, et miR-199-3p, mis ringleb veres rakuvaba miRNA-na, on vanade hiirte veres noorte hiirtega võrreldes oluliselt vähenenud; ja miR-199-3p-l on võime tugevdada müogeenset diferentseerumist ja lihaste regeneratsiooni. MiR-199-miimikaid, mis varustavad miR-199-3p-d, manustamine eakatele hiirtele põhjustas lihaskiudude hüpertroofiat ja hilinenud lihasjõu kaotust. MiR-199 miimika süsteemne manustamine mdx hiirtele, mis on Duchenne'i lihasdüstroofia (DMD) tuntud loommudel, parandas märkimisväärselt hiirte lihasjõudu. Kokkuvõttes võib rakuvaba miR-199-3p veres avaldada vananemisvastast toimet, näiteks ahüpertroofilist toimet vananenud lihaskiududele, ja see võib olla potentsiaalne uudse RNA-ravina DMD ja vanusega seotud haiguste korral. Leiud annavad meile uusi teadmisi veres ringlevate miRNA-de kui vanusega seotud molekulide kohta.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Elutähtsad funktsioonid, nagu lihasjõud, närvisüsteemi toimimine, hingamisfunktsioon, kaitse infektsioonide vastu ja vastupanuvõime haigustele, langevad vananedes. Sellise funktsionaalse langusega seotud haigused ja talitlushäired sagenevad ja muutuvad vananevates ühiskondades peamisteks probleemideks. Vananemisega kaasnevad organismis mitmesugused muutused, nagu metaboolsed ja geeniregulatsiooni muutused-3; ja selliste muutuste uurimine võib aidata mõista vananemist ja pakkuda strateegiaid vananeva ühiskonna ees seisvate probleemide lahendamiseks. Vananemisega seotud biomolekulid (sh geenid) on tuvastatud ja need võivad olla kasulikud vananemisuuringutes; nt -galaktosidaasi ja plolnk4a ekspressioon on seotud rakkude vananemisega4-6 ning hiiremudelit, millel puudub klothogeen, tuntakse mitme fenotüübiga vananemismudelina, mis meenutab inimese enneaegset vananemist.

Parabioos on liit kahe inimese vahel, kellel on ühine veresoonkond ja mida saab eksperimentaalselt tekitada operatsiooniga8. Katsed parabioosiga, kus noored ja vanad närilised ühendati ühise veresoonkonna süsteemiga, näitasid, et noorte loomade vananemisprotsess kiirenes, samas kui vanad loomad noorendati9-12. Leiud viitavad tugevalt sellele, et teatud noorendamise ja vananemisega seotud tegurid on olemas ning vereringes veres ringlevad, kuid selliseid ringlevaid tegureid ei ole veel täielikult mõistetud3.

Cistanche on vananemisvastane toime

MikroRNA-d (miRNA-d) on 21-23-nukleotiidi pikkused väikesed mittekodeerivad RNA-d, mida töödeldakse pikematest transkriptidest (primaarsed miRNA-d) seedimise teel, mille tuumas on mikroprotsessorikompleks ja tsütoplasmas Dicer, ning inkorporeeritakse RNA-indutseeritud vaigistamiskompleks (RISC)14,15. RISC-s sisalduv MiRNA toimib geenivaigistamise vahendajana, kus miRNA-ga osaliselt komplementaarsete messenger-RNA-de (mRNA-de) translatsioon on inhibeeritud või miRNA-ga peaaegu komplementaarseid järjestusi kandvad mRNA-d. seeditudl4,15.Cistanche ekstrakti kiirgusvastane toimeSeega mängivad miRNA-d geeniregulatsioonis olulist rolli nende sihtgeeniekspressiooni pärssimise kaudu. Loomadest ja taimedest on leitud tuhandeid miRNA geene [vt microRNA andmebaasi (miRBase): http://www.mirbase.org/index.shtml]. Uuritud on miRNA-de ekspressiooniprofiili ning tuvastatud koe- ja arengufaasispetsiifiline miRNA-de ekspressioon ja haigusega seotud ekspressioon6-21. MiRNA-sid hõlmav geeniregulatsioon on tihedalt seotud erinevate elutähtsate funktsioonide ja elunähtustega, sealhulgas haigustega14,16,21-24

MiRNA-d esinevad nii rakkudes kui ka sees25. Näiteks esinevad miRNA-d veres rakuvabade nukleotiididena ja ringlevad veresoonkonnas2627. Sellised rakuvabad miRNA-d (cf-miRNA-d) liidetakse väikestesse vesiikulitesse, mida nimetatakse rakuvälisteks vesiikuliteks, või seostatakse valkudega, saavutades seeläbi kaitse rakuväliste nukleaaside eest25, 28. Mõnede cf-miRNA-de olemasolu võib olla märkimisväärne; Näiteks on tuvastatud olulisi seoseid cf-miRNA-de ja teatud haiguste vahel26,27,29-31. Cf-miRNA-d võivad peegeldada muutusi füüsilises seisundis; seega võivad sellised miRNA-d olla potentsiaalsed biomarkerid nii elu säilitamise süsteemide kui ka haiguste jälgimisel.

Käesolev uuring viidi läbi, et uurida seoseid cf-miRNA-de ja vananemise vahel ning uuriti cf-miRNA-sid noorte ja vanade hiirte veres. Tulemused näitasid muutusi cf-miRNA-des noorte ja vanade hiirte veres. Selliste miRNA-de hulgas oli miR-199-3p märkimisväärselt vähenenud vananenud veres võrreldes noore verega. Huvitav on see, et miR-19-3p on võimeline suurendama lihaste diferentseerumist ja regeneratsiooni ning selle manustamine vanadele hiirtele tõi kaasa lihaskiudude laienemise. Kui miR-199-3p viidi Duchenne'i lihasdüstroofia (DMD) loommudel mdx hiirtele, paranes hiirte lihasjõud märkimisväärselt. Käesolev uuring annab uue ülevaate veres ringlevate cf-miRNA-de kohta vananemise, varjatud võime ja meditsiiniliste rakenduste osas.

Tulemused

Cell-free miRNAs in the blood of young and aged mice. We investigated cf-miRNAs in the blood of young (6-week-old) and aged (>23-kuused) C57BL/6J hiired, kes kasutavad DNA mikrokiibi vanusega seotud erinevuste tuvastamiseks. Cf-miRNA-de profiilis ilmnesid märkimisväärsed erinevused noorte ja vanade hiirte vahel, st tuvastati cf-miRNA-d, mis on kallutatud noorte ja vanade hiirte vere suhtes (tabel 1). Sellistest miRNA-dest esinesid müogeensed miRNA-d (nt miR-1 ja miR-133)1833 miRNA rühmas, mida leidub noores veres rohkesti; teisisõnu, müogeenseid miRNA-sid oli vananenud veres märgatavalt vähem (tabel 1).cistanche herbaMiRNA-de erinevust noore ja vana vere vahel kinnitati kvantitatiivse pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsiooniga (qRT-PCR; joonis la) ja reprodutseeriti edasi, kasutades plasmast eraldatud väikestest vesiikulitest (nn eksosoomidest) ekstraheeritud RNA allikaid. Täiendav joonis 1).

Seevastu rakukultuuri katsed näitasid, et noorte hiirte seerumil oli võime indutseerida müogeenset diferentseerumist ja see võime oli tugevam kui vanadel hiirtel (joonis 1b). Uuriti insuliinitaolist kasvufaktorit I (IGF-I), mis on peamine tegur, mis on võimeline veres müogeenset diferentseerumist esile kutsuma34,35; siiski ei täheldatud olulist erinevust noore ja vana vere vahel (joonis lc). Seega võivad müogeense diferentseerumisega olla seotud ka muud tegurid peale IGF-I noores veres.

miR-199-3p on võimeline tugevalt esile kutsuma müogeenset diferentseerumist. Uurisime noores veres rohkete miRNA-de mõju müogeensele diferentseerumisele. Sünteetilised miRNA jäljendid viidi C2C12 rakkudesse, hiire müoblasti rakuliini, ja uuriti müogeensete diferentseerumismarkerite, müogeniini (Myog) ja müosiini raske ahela 1 (Myh1) geenide ekspressiooni. Tulemused olid ootamatud ja äratasid meie huvi: miR-199-3p, mis ennustati negatiivseks miRNA-ks vähese teabe tõttu müogeense diferentseerumise kohta, indutseeris märkimisväärselt Myog ja Myh1 ekspressiooni (joonis 2a, b). Lisaks oli miR-199-3p indutseerimine tugevam kui tavaliste müogeensete miRNA-de puhul: müosiini raske ahela ekspressioon miR-199-3p juuresolekul oli eriti märkimisväärne (joonis 2b, c).

MiR-199-3p ja müogeense diferentseerumise vahelise seose selgitamiseks uurisime rakulist ja ekstratsellulaarset (eksosomaalset) miR-199-3p-d müogeense diferentseerumise ajal ning ka miR-199-3p inhibiitorite mõju. diferentseerumise kohta. Endogeense (tsellulaarse) miR-199-3p ekspressioon oli pärast diferentseerumise algust ülesreguleeritud. Eksosomaalne miR-19-3p suurenes üks kord ja seejärel vähenes (täiendav joonis 2a). Inhibiitoriravi pärssis müogeensete diferentseerumismarkerite Myog, Myh1 ja kreatiinkinaasi (Ckm) ekspressiooni (täiendav joonis 2b).cistanche peenise kasvSeega näitavad leiud, et miR{0}}p osaleb müogeenses diferentseerumises.

miR{0}} jäljendite kujundamine. Kujundasime miR-199 miimikaid nii, et jäljendajad saaksid tõhusalt toota miR-199-3p funktsionaalse vahendajana (juhtahelana) geenide vaigistamisel. Disainitud miRNA miimikaid skriiniti ja miR199#4 valiti pädevaks miR-199 matkijaks (täiendav joonis 3). Seejärel kasutati miR199#4 nii in vivo kui ka in vitro katsetes.

miR-199-3p sihtgeenid müogeenses diferentseerumises. Müogeense diferentseerumise all olevate miR-199-3p sihtgeenide tuvastamiseks otsisime TargetScani andmebaasist kandidaatgeene ja keskendusime geenidele Lin28b ja Suz12, mis mõlemad ekspresseeruvad C2C12 müoblastides. Lin28b ja Suz12 omavad oletatavaid miR-199-3p sidumisjärjestusi nende 3' transleerimata piirkonnas (UTR; joonis 3a). Näitasime, et oletatavad järjestused on miR-19-3p autentsed sidumissaidid, kasutades lutsiferaasi reportergeene, mis kannavad sidumisjärjestusi ja vastavaid mittevastavaid järjestusi (joonis 3a, b). Oletatavaid sidumisjärjestusi kandvaid lutsiferaasi geene pärsisid oluliselt miR-199-3p [pLin28b-(81), pLin28-(983) ja pSuz12-(973)], samas kui mittesobivad järjestused, millel on alusasendusmutatsioonid seemne [pLin28b-(81)mut, piirkonnas, tühistasid selle supressiooniefekti [pSuz12-(973)mut]. pLin28-(983)mut ja kui miR-199 miimikaid viidi C2Cl2 rakkudesse, supresseeriti Lin28b ja Suz12 ekspressioon pidevalt (joonis 3c). Et hinnata, kas Lin28b ja/ või Suz12 aitab otseselt kaasa müogeensele diferentseerumisele, Lin28b ja Suz12 spetsiifiline inhibeerimine viidi läbi geenide vaigistamise teel, kasutades RNA interferentsi (RNAi; joonis 3d, e). Ootuspäraselt reguleeriti müogeensete diferentseerumismarkerite, nagu Ckm, Myh1 ja Myog, ekspressioon Lin28b ja Suz12 geeni vaigistamise all (joonis 3f, g).

Kuna Lin28b on RNA-d siduv valk, mis on seotud miRNA-de3637 töötlemisega, uurisime Lin28b kaudu miR-19 miimika mõju müogeensele miRNA töötlemisele. Uuriti peamise müogeense miRNA miR-1 taset, kuna selle prekursori töötlemist reguleerib Lin28b37. Küpsenud miR-1 suurendas oluliselt miR-199-i miimikaga töötlemist (joonis 3h), mis viitab sellele, et miR-199-3p võib reguleerida miR-1 funktsionaalset ekspressiooni läbi supressiooni sihtmärgist Lin28b. Kokkuvõttes näitavad leiud, et miR-199-3p osaleb müogeenses diferentseerumises selle sihtgeenide Lin28b ja Suz12 allasurumise kaudu.

Lihaste regenereerimise tõhustamine miR199#4 abil lihaskahjustusega hiirtel.cistanche salsa eelisedUurisime miR-199 miimika (miR199#4) mõju in vivo lihasvigastuste mudelite abil (joonis 4a, b). Kaheksanädalastele C57BL / 6J hiirtele süstiti BaClz tibialis anterior (TA), et tekitada lihaste vigastusi, ja miR19#4 manustati kahjustatud kohtadesse 24 tundi hiljem. Kaks päeva pärast miR199#4 manustamist uuriti müogeensete markergeenide ekspressiooni. Myog ekspressioon suurenes märkimisväärselt ning müogeenset diferentseerumist 1 (Myod1) ja müogeenset tegurit 5 (Myf5) reguleeriti ka miR199#4 manustamisega (joonis 4c). Andmed on kooskõlas ülalkirjeldatud in vitro tulemustega (joonis 2).

Regenereeruvate lihaste immunohistokeemiline analüüs viidi läbi 9 päeva pärast miR199#4 manustamist. Uuriti regenereeruvate lihaskiudude (müokiudude) ristlõikepindu, mida iseloomustavad tsentraalsed tuumad (joonis 4b). MiR199#4-ga töödeldud regenereeruvate müokiudude keskmine ristlõikepindala oli suurem kui mittesummutava kontroll-RNA dupleksiga töödeldud kontrollmüofiibrite oma (nsCont; joonis 4d), kusjuures erinevus lähenes statistilisele olulisusele. Lisaks keskmisele ristlõike pindalale näitas ristlõike pindala suuruse järgi jagatud histogramm suurenenud müofiibrite arvu miR199#4 juuresolekul (joonis 4e).

MiR199#4 hüpertroofiline toime vananenud lihaskiududele. Uurisime miR199#4 mõju vanadele hiirtele (~ 24 kuu vanustele). Vanadel hiirtel vähenes noorte hiirtega võrreldes oluliselt lihaste miR-199-3p (joonis 5a), nagu ka vereringes cf-miR-19-3p. Me manustasime ealiste hiirte TA-lihastele miR199#4 ja 2 päeva hiljem uuriti TA-lihaseid immunohistokeemilise analüüsiga (joonis 5b). MiR199#4-ga töödeldud müokiudude keskmine ristlõikepindala oli oluliselt suurem kui nsContiga töödeldud kontrollmüokiudude oma (joonis 5c). Kooskõlas sellega näitas suuruse järgi jagatud histogrammi analüüs suurenenud müofiibrite arvu märgatavat suurenemist miR199#4 juuresolekul (joonis 5d).

Kuna veres ringlev cf-miR-199-3p on eakatel hiirtel vähenenud, sisestasime vanade hiirte ringlevasse verre saba kaudu miR199#4. Pärast miR19#4 intravenoosset manustamist uuriti ja analüüsiti müokiudude ristlõikepindala, nagu ülalpool kirjeldatud. Tulemused, nagu on näidatud joonisel 5e, on kooskõlas miR199#4 paikse manustamise tulemustega vananenud lihastele (joonis 5c, d).

Tuleb märkida, et lihasvigastuste mudeli ja vanade hiirte suurenenud lihaskiududes on erinevusi. Tsentraalseid tuumasid on näha regenereeruvates lihaskiududes (joonis 4b), kuid selliseid müokiude ei tuvastatud eakatel hiirtel, keda raviti miR199#4-ga (joonis 5b). See viitab sellele, et pärast ravi miR199#4-ga võivad vanadel hiirtel olemasolevad lihaskiud suureneda. Hüpoteesisime, et ealiste hiirte müofiberi suurenemises võib osaleda ka teine ​​mehhanism, mis erineb lihaste regenereerimisest, ja pakkusime välja lihaste atroofia raja kaasamise.cistanche tubulosa dosage redditAtroginl ja MuRFI geenid on tihedalt seotud lihaste atroofiaga38 ja nende ekspressioonitase on märkimisväärselt kõrgem vananenud lihastes võrreldes noorte lihastega (joonis 6a). Uurisime Atroginli ja MuRFI taset vanade hiirte lihastes pärast miR199#4 süsteemset manustamist. Atroginl ja MuRFI vähenesid märkimisväärselt erinevates lihastes miR19#4 manustamisega (joonis 6b), mis viitab sellele, et lihaste atroofia raja mahasurumine miR199#4 poolt võib põhjustada müofiberi laienemist eakatel hiirtel.

MiR199#4 aeglustab vananenud hiirte lihasjõu kaotust. Huvitav on miR199#4 mõju lihaste funktsioonile eakatel hiirtel. Haardetugevuse test viidi läbi vanadel hiirtel enne ja pärast miR199#4 süsteemset manustamist. Katse viidi läbi topeltpimedalt; RNA süsti ja 100-protsendilise haardekatse viisid läbi erinevad katsetajad, ilma i teavet jagamata. C57BL/6 hiirtel (80-nädala vanustel) isastel hiirtel tehti haardetesti, seejärel süstiti neile 1 nädal hiljem intravenoosselt miR199#4 ja nsCont ning testiti uuesti haardevõimet. Lihasjõu muutus pärast miR199#4 süstimist oli MiR199#4 parandab mdx hiirte lihasjõudu. Kuna miR199#4 mõjutab lihaseid positiivselt, viisime läbi katse, et hinnata miR199#4 manustamise mõju mdx hiirtele, mis on tuntud DMD loomamudel32. Kaheksanädalastele mdx hiirtele süstiti veeni miR199#4 (1,6 mg/kg) kaks korda (1-nädalane intervall) ja haardekatse viidi läbi 1 nädal pärast viimast manustamist. Katse viidi läbi topeltpimedalt, nagu on näidatud joonisel 7. Tulemused (joonis 8a) näitavad miR199#4-ga ravitud mdx hiirte lihasjõu olulist paranemist võrreldes nsContiga ravitud mdx hiirtega. Lisaks täheldati miR199#4-ga ravitud mdx hiirte veres olulist kreatiinkinaasi (CK) aktiivsuse ja rakuvaba miR-1 vähenemist (joonis 8b, c), mis on võimalikud haiguse tunnused. parandamine.

Ravimi kohaletoimetamise reagendina on atelokollageen viskoosne ja raskesti käsitletav ning atelokollageeniga ravitud hiirtel näis kandja tõttu negatiivset mõju. Seega otsisime atelokollageenile alternatiive, et parandada oma ravimite kohaletoimetamise süsteemi (DDS) ja leidsime DC-CHOL/DOPE katioonsed liposoomid uue DDS-reaktiivina, mis on atelokollageeniga võrdne või parem (täiendav joonis 4). MiR199#4 ravimite jaotus katioonsete liposoomidega näitas, et manustatud miR19#4 viidi lihasesse ja imendus järjekindlalt suurtes kogustes maksas (täiendav joonis 5). Lihasesse tarnitud ekstratsellulaarne miR199#4 võib toimida vahendajana geenide vaigistamisel ja aidata kaasa lihasjõu parandamisega seotud geeniregulatsioonile.

Püüdsime tuvastada biomolekule, mis on seotud paranemisega pärast miR199#4 manustamist. Erinevaid DMD-ga seotud polüpeptiide uuriti Western blot analüüsiga; selles uuringus ei tuvastatud aga paranemisega seotud selgeid signaale (täiendav joonis 6). Me käsitleme seda punkti järgmises jaotises.

Arutelu

Biomolekulid muutuvad vananedes kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt--3. Selliste muutuste tabamine ja nende uurimine on vananemise mõistmiseks üliolulised ning võivad paljastada strateegiaid vananevate ühiskondade probleemide lahendamiseks. Parabioosiuuringud, milles noored ja vanad loomad on ühendatud ühise veresoonkonna süsteemiga, on andnud olulisi teadmisi vananemise ja noorendamise kohta9-l2. Leiud viitavad kindlalt sellele, et noores ja vanemas tsirkuleerivas veres on vastavalt noorendavaid ja vananevaid tegureid. Varasemad uuringud teatasid mitmesugustest molekulidest, mis on seotud noorendamise ja vananemisega, kuid tulemused on vastuolulised3.

Meie in vitro rakukultuuri katsed, milles kasutati noori ja vananenud seerumeid, on sarnased parabioosikatsetega (joonis lb) ja leidsime ringlevast verest miR-199-3p, mis muutub vanusega; leiti, et miRNA väheneb märkimisväärselt vananenud veres (tabel 1 ja joonis la). Lisaks väheneb lihaste (tsellulaarne) miR-199-3p ekspressioon märkimisväärselt vananenud lihastes võrreldes noorte lihastega (joonis 1). 5a); seega võib cf-miR-199-3p veres korreleerida lihaste miR-199-3p-ga. MiR-199-3p ekspressiooni vähenemist vananemisega täheldatakse ka reesusmakaaki luuüdist pärinevates mesenhümaalsetes tüvirakkudes39. Seetõttu võib raku miR{10}p ekspressioon olla vanusega seotud kontrolli all. Erinevalt miR-19-3p-st jääb raku müogeensete miRNA-de, nagu miR-1 ja miR-133 ekspressioon noortes ja vananenud lihastes muutumatuks (joonis 5a), kuid tase nende ekstratsellulaarsete miRNA-de hulk veres on eakatel hiirtel märgatavalt vähenenud (joonis la). Erinevus miR-199-3p ja müogeensete miRNA-de (miR-1 ja-133) vahel võib peegeldada erinevusi cf-miRNA töötlemises ja/või cf-miRNA-de vanusega seotud kontrollis nende vahel. . Selle erinevuse selgitamiseks tuleb tulevikus teha täiendavaid uuringuid.

Varasemad uuringud näitasid, et miR{0}}p osaleb oma sihtgeenide allasurumise kaudu erinevates rakufunktsioonides ja elutähtsates nähtustes; nt võib miRNA soodustada endoteeli tipurakkude proliferatsiooni ja migratsiooni ning moduleerida vastavalt puberteedi algust sihtmärgiks oleva semaforiin-3A geeni40 allareguleerimise ja sihtgeenide (Cdc42, Map3k2, Map3k4 ja Taok1), mis on seotud p38MAPK rajaga41. Käesolevas uuringus leiti, et miR{11}}p osaleb müogeenses diferentseerumises selle sihtgeenide Lin28b ja Suz12 allasurumise kaudu (joonis 3). Lin28b on RNA-d siduv valk ja pärsib miRNA-de küpsemist, sealhulgas miR-1, mis on lihaspetsiifiline miRNA ja soodustab müogeneesi37. Lin28b pärssimine miR-19-3p poolt põhjustab küpsenud miR-1 suurenemist (joonis 3), mis võib võimaldada müogeensel diferentseerumisel edasi liikuda.

Suzl2 on polükombi repressiivse kompleksi 2 (PRC2) põhiallüksus, mis osaleb kromatiini42 represseerimises. PRC2 geeniregulatsioon osaleb tüvirakkude säilitamises, embrüonaalses arengus, rakkude proliferatsioonis ja diferentseerumises, sealhulgas müogeenses diferentseerumises sellistest lookustest diferentseerunud müotorudes43. Geeni vaigistamine Suz12 vastu RNAi poolt põhjustab müogeense geeniekspressiooni tugevnemist (joonis 3). Müogeenset diferentseerumist põhjustab ka zeste homolog 2 (Ezh2) valgu, teise PRC2 põhisubühiku, võimendaja supressioon44. Need leiud viitavad sellele, et PRC2 moodustumise pärssimine selle põhisubühikute pärssimisest võib vallandada lihaste diferentseerumiseks genoomse seisundi. Seega võib Suz12 pärssimine miR-199-3p poolt indutseerida müogeenset diferentseerumist. Kokkuvõttes võib miR-19-3p mängida olulist rolli müogeenses diferentseerumises, pärssides kahte sõltumatut rada, mis hõlmavad Lin28b ja Suzl2, mis mõlemad on seotud müoblastide diferentseerumata oleku säilitamisega.

MiR-199-3p mõju müogeensele diferentseerumisele on näidatud ka in vivo (joonis 4). Lihaskahjustus käivitab lihaste taastumise tõttu rakkude proliferatsiooni ja diferentseerumise. MiR199#4, mis varustab miR-199-3p-d, kasutuselevõtt kahjustatud kohtadesse suurendas lihaste regeneratsiooni ja laiendas regenereeruvaid müofibereid (joonis 4). Müogeense geeni ekspressioon oli miR199#4 ravi korral pidevalt ülesreguleeritud (joonis 4). Praktilisest vaatenurgast võib miR199#4 olla efektiivne ja kasulik kirurgilise ravi jaoks.

Kui miR199#4 manustati eakatele hiirtele, kellel puudus vereringe miR-199-3p, ilmnesid hiirtel märkimisväärselt laienenud müofiibrid (joonis 5) ja lihasjõu vähenemine vananemisega (joonis 7). Eakate hiirte laienenud müofiibrid erinevad regenereeruvatest müofiibridest, mis suurenevad miR199#4 juuresolekul; esimene on tuletatud juba olemasolevatest müofiibridest ja teine ​​on neo-müofiibridest (vastsündinud müofiibrid). Seega on lihaskiudude laienemisel erinevad sõltumatud mehhanismid. Meie uuring viitab sellele, et (i) esimesel juhul põhjustab Atroginli ja MuRFI pärssimisest tingitud lihaste atroofia pärssimine miR199#4 raviga vananenud müofiibrite suurenemist ja (ii) teisel juhul sihtgeenide, Lin28b, supressiooni. ja Suz12, põhjustab regenereeruvate müofiiberite suurenemist. Kokkuvõttes võivad erinevad (mitu) miR-19-3p poolt reguleeritud geenid olla erinevates olukordades seotud lihaste hüpertroofiaga. Leiud viitavad ka sellele, et miR-199-3p-l võib olla lihastele vähemalt vananemisvastane toime ja et miR199#4, mis varustab miR-199-3p-d, võib olla potentsiaalne uudse RNA-ravimina vanusega seotud lihashaiguste korral. nagu sarkopeenia.

Tuginedes miR199#4 kõrgele efektiivsusele lihastele, manustati miR199#4 mdx hiirtele, mis on hästi tuntud DMD mudel, ja saavutasime märkimisväärsed tulemused: miR199#4 süsteemne manustamine parandas hiirte lihasjõudu ~20 protsenti ( joonis 8a). Et mõista lihasjõu taastumise mehhanismi, püüdsime tuvastada biomolekule, mida miR-199-3p parandas (või mõjutas). Kuid välja arvatud vere CK ja cf-miR-1 (joonised 8b, c) paranemised, ei suutnud me selliseid parandusi molekulaarsel tasemel tuvastada. See tuvastamisraskus võib olla tingitud keerulisest rakupopulatsioonist, mis koosneb regenereeruvate ja lõhustavate lihasrakkude segust mdx hiirtel. Isegi kui miR199#4 tulemuseks on paranemine, varjab kompleksse rakupopulatsiooni põhjustatud kõrge taustmüra paranemise tõendeid. Selle probleemi lahendamiseks tuleb läbi viia ulatuslikumad uuringud, kasutades homogeenset lihasrakkude populatsiooni, mis on saadud mdx-hiirtelt või keskendudes erinevatele kudedele, sealhulgas lihastele.

Kuigi miR199#4 lihasjõu taastumise molekulaarne mehhanism jääb teadmata, on miR19#4 annus lihasjõu parandamiseks tähelepanuväärne. Kahekordne ~1,6 mg/kg miR199#4 manustamine parandas mdx hiirte lihasjõudu. Efektiivne annus näib olevat madalam kui antisenss-oligonukleotiidide oma eksonite vahelejätmiseks mutantsete düstrofiinigeenide vastu in vivo45-47. Põhjus, miks miR199#4 suudab selliste väiksemate annuste juures lihasjõudu parandada, võib olla tingitud selle erinevast toimemehhanismist võrreldes antisenss-oligonukleotiididega. MiR19#4 toimemehhanism on katalüütilise geeni vaigistamine. Seevastu antisenss-oligonukleotiidide mehhanism põhineb füüsilisel hübridisatsioonil. Seetõttu võivad ravimi efektiivsuse näitamiseks sobivate annuste erinevused olla tingitud erinevatest toimemehhanismidest.

Mehhanism, mille abil elundid, kuded või rakud miRNA-sid ringlevasse verre vabastavad, pole veel täielikult teada ning ebaselge on ka selliste miRNA-de vabanemise vanusega seotud regulatsioon. Käesolev uuring näitas, et müogeensed cf-miR-NA-d, sealhulgas cf-miR-199-3p, ringlevad veresoonkonnas ja vähenevad vananedes. Sellised cf-miRNA-d võivad esineda eksosoomides, st need on eksosomaalsed miRNA-d.

Müogeensed miRNA-d osalevad müogeenses diferentseerumises, lihaste regenereerimises ja lihaste homöostaasi säilitamises33. Varasemad uuringud teatasid, et müogeensed miRNA-d, nagu miR-1 ja miR-133, suurenesid veres vastusena füüsilisele treeningule4849. Nende aruannete põhjal võivad aktiivsed noored hiired vabastada verre rohkem müogeenseid miRNA-sid kui vanad aeglaselt liikuvad hiired ja sellised ekstratsellulaarsed miRNA-d, sealhulgas cf-miR-199-3p, võivad autokriinse toime kaudu aidata kaasa lihaste homöostaasi säilitamisele noortel hiirtel. . Kuid ekstratsellulaarse (eksosomaalse) miRNA tase ei ole alati korrelatsioonis raku miRNA tasemega ning müogeensete miRNA-de ja miR{7}}p-s on täheldatud erinevusi noorte ja eakate hiirte vahel (joonised la ja 5a) ning hiirte perioodil. müogeenne diferentseerumine (täiendav joonis 2a). Seega on teise võimalusena mõeldav, et eksosoomide moodustumise vanusega ja diferentseerumisega seotud reguleerimine võib mõjutada cf-miRNA tootmist; täpsemalt võib noorte ja vanade hiirte eksosoomide moodustumises esineda erinevusi. Nende hüpoteeside kontekstis on vaja täiendavaid uuringuid, et selgitada välja müogeensete miRNA-de vanusega seotud vabanemine verre.

Peale vabastamismehhanismi võivad cf-miRNA-d käivitada lihaste aktiveerimise ja lihaste pärssimise, kui noored müogeensed cf-miRNA-d, mis sisaldavad cf-miR-199-3p-d, voolavad noorest veresoonkonnast parabioosi tõttu vananenud vereringesüsteemi. atroofia vanuse poolel; seda kontseptsiooni toetavad tõendid eakatelt hiirtelt, kellele selles uuringus süstiti veeni miR19#4 (joonised 5-7). Cf-miRNA-d veres võivad olla seotud vanusega seotud homöostaatilise funktsiooniga ja võivad kujutada endast muutunud homöostaasi. Kui sellised cf-miRNA-d on ektoopiliselt olemas, näiteks kui noores veres olevad cf-miRNA-d kantakse üle vananenud vereringesüsteemi, võivad mõned cf-miRNA-d avaldada vananevale poolele noorendavat toimet, st neil võib olla vananemisvastane toime. Seevastu cf-miRNA-d vananenud veres võivad tähendada vananemisega muutunud homöostaasi. Kui sellised cf-miRNA-d viiakse nooresse vereringesse, võivad mõned cf-miRNA-d vallandada vananemisega seotud halvenemise ja põhjustada noore poole enneaegset vananemist. Vananenud veres märkimisväärselt suurenenud Cf-miRNA-d esindavad kandidaate, mis vajavad vananemise mõistmiseks ja ennetamiseks üksikasjalikku mehhaanilist analüüsi.

Kokkuvõtteks võib öelda, et meie praegune uuring on andnud uusi teadmisi cf-miRNA-de kui vanusega seotud molekulide kohta ja paljastanud uue uurimissuuna, et selgitada seost vananemise ja rakuvabade funktsionaalsete RNA-de, sealhulgas cf-miRNA-de vahel.

See artikkel on välja võetud saidist KOMMUNIKATSIOONI BIOLOOGIA|(2021) 4:427|https://doi.org/10.1038/s42003-021-01952-2|www.nature.com/commsbio