Metüüljasmonaat kutsub granaatõuna (Punica Granatum L.) lehtedes esile eristatavad hüdrolüüsitava tanniini, favonoidi ja fütooksülipiini reaktsioonid, 1. osa

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne:Taimedes toodetud metüüljasmonaat (MeJA) võib vahendada nende reaktsiooni keskkonnastressidele. Samuti on näidatud, et MeJA eksogeenne kasutamine aktiveerib signaaliülekande radu ja kutsub esile fütoaleksiini akumulatsiooni paljudes taimeliikides. Et mõista, kuidas granaatõunataimed reageerivad biokeemiliselt keskkonnastressidele, viidi MeJA-ga rakendatud granaatõunalehtedes läbi metaboliitide analüüs, mis näitas ainulaadseid muutusi hüdrolüüsitavates tanniinides, flavonoidides ja fütooksülipiinides. Lisaks tuvastasid näidis- ja MeJA-ga töödeldud granaatõunalehtede transkriptsiooni- ja reaalajas qPCR analüüsid erinevalt ekspresseeritud metaboolsed geenid ja transkriptsioonifaktorid, mis võivad olla seotudhüdrolüüsitavtanniini, flavonoidi ja fütooksülipiini radasid. Ainsa molekulaarne, biokeemiline ja bioinformaatiline iseloomustuslipoksügenaasPüsiva MeJA-indutseeritud ekspressiooniga näitas, et see on võimeline oksüdeerima polüküllastumata rasvhappeid, kuigi see ei asu rakualuses sektsioonis, kus toodeti mittejasmonaatseid (mitte-JA) fütooksülipiine. Need tulemused viitasid ühiselt sellele, et kuigi flavonoidide ja antotsüaniinide laiaulatuslik allasurumine on vähemalt osaliselt kontrollitud transkriptsiooni tasemel, siis mitte-JA indutseeritud biosünteesFütooksülipiinidei ole tõenäoliselt transkriptsiooniliselt reguleeritud. Üldiselt ei edenda granaatõunalehtede keskkonnamõjudele reageerimise parem mõistmine mitte ainult taimede tervist ja produktiivsust, vaid mõjutab ka inimeste tervist, kuna granaatõunataimedest toodetud viljad on rikkalikult toitainete allikas.

Märksõnad:Metüüljasmonaat.Flavonoid·Antotsüaniin · Rasvhape.Fütooksülipiin· Lipoksügenaas

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Sissejuhatus

Kui taimed on haavatud või rünnatud taimtoiduliste ja patogeenide poolt, toodavad ja eraldavad taimed metüüljasmonaati (MeJA), mida haavamata taimekuded ja naabertaimed tajuvad kaitsereaktsiooni aktiveerimiseks (Cheong ja Choi 2003). Lisaks on näidatud, et MeJA eksogeenne rakendamine taimele kutsub esile signalisatsiooniteid, samuti patogeneesiga seotud valkude ja kaitsekemikaalide, mida tuntakse fütoaleksiinidena, tootmist. Fenoolsed fütoaleksiinid, nt flavonoidid ja antotsüaniinid, on näidanud suurenenud akumuleerumist vastusena MeJA-ravile erinevates taimedes, nagu Arabidopsis thaliana, viinamari (Vitis vinifera), banaan (Musa acuminate), õun (Malus Domestica) ja punane vaarikas (Rubus idaeus). )(Pandey jt 2016; Portu jt 2015; De Geyteret al.2012; Shafiq jt 2011; Flo-res ja Ruiz del Castillo 2014). Flavonoidide ja antotsüaniinide biosüntees algab naringeniini kalkooni moodustumisega kumaroüül-CoA-st ja kolmest malonüül-CoA-molekulist, mida katalüüsib kalkoonsüntaas (CHS), ning sellele järgnev naringeniini kalkooni isomerisatsioon naringeniiniks kalkooni isoomiga (CHI-isomera). Naringeniini kasutatakse seejärel flavonoidide ja antotsüaniinide tuumade skelettide loomiseks, mida täiendavalt modifitseeritakse glükosüüli, metüüli, hüdroksüüli ja prenüüli funktsionaalrühmadega, et tekitada erinevaid struktuure ja funktsioone (Tian et al. 2008).

Cistanche võib parandada immuunsust

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>75% sarnasus) ja ei sisalda signaalpeptiidi, samas kui II tüüpi LOX-idel on üldine madal järjestuste sarnasus (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

Granaatõun (Punica granatum L.) on spetsiaalne aiakultuur, mida hinnatakse selle viljades sisalduvate fenoolsete ühendite, näiteks flavonoidide, antotsüaniinide ja hüdrolüüsitavate tanniinide (HT) poolest, mis on saadud šikimaadi raja vaheühendist (Ono et al. 2016). ). Paljud uuringud on seni keskendunud granaatõuna fenoolide rollile inimeste stressi ja haiguste leevendamisel (Wu ja Tian 2017). Seevastu fenoolide ja muude fütokemikaalide funktsioonide kohta granaatõuna abiootiliste ja biootiliste tegurite eest (nt. haavad, patogeenid, MeJA esilekutsumine) lehtedes ja viljades. Kahes hiljutises aruandes hinnati koristuseelset MeJA-ravi granaatõuna viljade koristusjärgset kvaliteeti (Koushesh Saba ja Zarei 2019; Garcia-Pastor et al.2020). MeJA-ga töödeldud puuviljade, kuid mitte lehtede antotsüaanide, flavonoidide ja fenoolide kogusisaldust analüüsiti kollektiivselt spektrofotomeetriga. Ühes uuringus analüüsiti ka üksikuid antotsüaniine massispektromeetria abil (Garcia-Pastor et al.2020). Siiski jääb ebaselgeks, kuidas granaatõuna taimede kuded, kas lehed või viljad, reageerivad keskkonnamõjudele enne viljade moodustumist.

Granaatõunataimede ja keskkonnategurite vaheliste interaktsioonide lahkamise alustamiseks uurisime granaatõuna lehtede metaboolset vastust eksogeensele MeJA-rakendusele, kasutades kõrgjõudlusega vedelikkromatograafiat (HPLC) ja vedelikkromatograafia-elektropihustusionisatsiooni tandem-massispektromeetriat (LC-ESI-MS/MS). . MeJA-ga töödeldud granaatõuna lehtedes täheldati ainulaadseid muutusi HT-des, flavonoidides ja antotsüaniinides, samuti muutusi lipiidides, rasvhapetes ja fütooksülipiinides. Võrdlev transkriptoomianalüüs, mida kinnitas reaalajas qPCR analüüs, näitas, et HT, flavonoidide, antotsüaniinide ja fütooksülipiini metabolismis osalevad struktuursed ja/või regulatoorsed geenid ekspresseerusid erinevalt võlts- ja MeJA-ga töödeldud granaatõunalehtedes. Ainus LOX geen, millel oli MeJA-ga töödeldud lehtedes püsiv ülesreguleeritud ekspressioon, allutati edasisele molekulaarsele, biokeemilisele ja fülogeneetilisele iseloomustamisele.

materjalid ja meetodid

Kemikaalid

Glükogalliini ja pentagalloüülglükoosi standardid osteti ettevõttelt Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd (Shanghai, Hiina). LOX-testis kasutatud kemikaalid saadi järgmistelt müüjatelt: 3-(dimetüülamino)bensoehape (DMAB) (Adamas Reagent, Co., Ltd., Shanghai, Hiina), linoolhape (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 3-metüül-2-bensotiasolinoon (MBTH) ja hemoglobiin (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Hiina).

Taimsed materjalid

Granaatõuna puuvilju ja seemneid (Cv. Wonderful) pakkus heldelt Panzhihua Põllumajandus- ja Metsateaduste Akadeemia ning dr Binjie Ge tuvastas Shanghai Chenshani botaanikaaias. Vautšeri näidis (nr CSHO173966) deponeeriti Hiinas Shanghais asuvas Shanghai Chenshani botaanikaaia herbaariumis. Granaatõuna seemikuid kasvatati kontrollitud temperatuuriga kasvuruumis 6 nädalat temperatuuril 25 kraadi ja 16 tundi valguses/8 tundi pimedas. MeJA kontsentratsioon taimekudedele pihustamisel on väidetavalt vahemikus 100 kuni 250 μM (Ku et al.2014; Hickman et al.2017). Algselt rakendati granaatõuna lehtedele erinevaid MeJA kontsentratsioone, millest 200 μM MeJA põhjustas esialgses analüüsis märgatava metaboolse vastuse ja seda kasutati selles uuringus kirjeldatud metaboliitide ja geeniekspressiooni analüüside jaoks. Enne MeJA-ravi viidi pooled granaatõuna taimed teise sarnaste tingimustega kasvuruumi. Kui ühes kasvuruumis pritsiti taimi 200 μM MeJA-ga, siis teise kasvuruumi taimi pihustati veega (st näidistõrje). Kell 2-h,3-h,6- h,12-h,24-h, 30-h,36-h,48-h ja72-h pärast ravi, lahkub alates 3 ühendati 5 näidis- või MeJA-ga töödeldud taime, mis moodustavad ühe bioloogilise replikaadi. Proovi- ja MeJA-ravi katsete jaoks koguti kolm bioloogilist kordust; iga bioloogiline kordus jagati metaboliitide profiilide koostamiseks ja geeniekspressiooni analüüsiks alikvootideks.

Metaboliitide profileerimise analüüs

Granaatõunalehed lüofiliseeriti, kaaluti ja jahvatati peeneks pulbriks, kasutades tsirkooniumoksiidi helmeid helmespeksjas (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, Saksamaa) 90ndatel sagedusel 30 Hz. HPLC analüüsi jaoks ekstraheeriti lehtede proovi 70% metanooliga 60 minutit ultraheliga töötlemisel ja tsentrifuugiti kiirusel 13, 000 pööret minutis 10 minutit. Supernatant kanti üle HPLC viaali, millest 30 μL süstiti pöördfaasi HPLC-sse (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ja analüüsiti eelnevalt kirjeldatud viisil (Wil-son et al. 2019). Metaboliidid tuvastati UV-kiirguse neeldumise teel lainepikkustel 254 nm, 280 nm, 320 nm ja 360 nm. Konstrueeriti -glükogaliini ja pentagalloüülglükoosi standardsed kalibreerimiskõverad; neid kasutati -glükogalliini ja pentagalloüülglükoosi retentsiooniaegadele ja neeldumisspektritele vastavate piikide alade teisendamiseks vastavateks kontsentratsioonideks.

LC-ESI-MS/MS analüüsi jaoks ekstraheeriti homogeniseeritud leheproov (100 mg) 1 ml 70% metanooliga 4 kraadi juures Covernight. Järgmisel päeval tsentrifuugiti metanooliekstrakti 10 °C juures. ,000×g 10 minutit ja supernatant juhiti enne CNWBOND Carbon-GCB SPE kasseti (ANPEL, Shanghai, Hiina) ja 022- μm süstalfiltri (ANPEL) läbi. metaboliitide analüüs.

Ekstrakti (2 μL) analüüsiti LC-ESI-MS/MS abil (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Jaapan; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ja pöördfaasi C1s kolonn (ACQUITY UPLC HSS T3, 1,8 m, 2,1 mm × 10 0 mm, Waters, Milford, MA, USA). Metaboliidid elueeriti lahustitega (A) veega, mis sisaldas 0,04 protsenti äädikhapet ja (B)atsetonitriil, mis sisaldab 0,04 protsenti äädikhapet gradiendiga 0-11 min, 95-5 protsenti A; 11-12 min, 5 protsenti A; 12-12,1 min ,5-95 protsenti A;12.1-15min, 95 protsenti A. Voolukiirust hoiti 0,4 ml min{28}}. Lineaarse ioonilõksu (LIT) ja kolmekordse kvadrupooli (QQQ) MS skaneeringud saadi positiivsete ja negatiivsete ioonide režiimides. Turbopihustusiooniallikat kasutati temperatuuril 500 °C ionisatsioonipingega 5500 V. Iooniallika gaas I, gaas I ja kardingaas seati vastavalt rõhule 55 psi, 60 psi ja 25 psi. Kokkupõrkegaas (lämmastik) määrati 5 psi peale. MRM-analüüsi jaoks optimeeriti deklastrimispotentsiaal (DP) ja kokkupõrkeenergia (CE) iga eelkäija-produkti ioonide ülemineku jaoks.

For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>=1 loeti oluliselt muudetuks.

Transkriptoomi analüüs

Kogu RNA ekstraheeriti granaatõuna lehtedest, kasutades TRIzol reagenti (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja kvantifitseeriti, kasutades Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). RNA proovide terviklikkust kontrolliti eraldamise teel agaroosgeelil (ilma nähtava lagunemiseta) ja OD20/28o suhte määramisega (vahemikus 1,8–2,2), kasutades Nanodrop2000. mRNA rikastamine kogu RNA-st viidi läbi, kasutades oligo (dT) magnethelmeid (Invitrogen). mRNA-Seq raamatukogud konstrueeriti Truseq RNA raamatukogu ettevalmistuskomplekti (Illumina, San Diego, CA, USA) abil. Transkriptoomianalüüs viidi läbi Illumina HiSeq4000-ga ja iga prooviteegi jaoks saadi 55-60 miljonit 150-bp paarisotsa lugemist (PE150).

Toorjärjestuse andmeid töödeldi, eemaldades nii adapterjärjestused kui ka short(<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS:GitHub. com/Joshi/sickle).Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1 ja kohandatud P väärtus<>

Reaalajas qPCR analüüs

Kogu RNA ekstraheeriti näidis- ja MeJA-ga töödeldud granaatõunalehtedest, kasutades RNAprep Pure Plant Kit (Tiangen Biotech Co., Ltd., Peking, Hiina). Pöördtranskriptsioon (RT) viidi läbi, kasutades kogu RNA-d ja PrimeScriptTM RT reaktiivikomplekti (Takara Bio Inc., Kusatsu, Jaapan). Kvantitatiivne PCR (qPCR) viidi läbi, kasutades komplekti TB GreenTM Premix Ex Taq TM(Tli RNaseH Plus) ( Takara) ja StepOnePlusi reaalajas PCR-süsteem (Ther-moFisher Scientific). Viidi läbi sulamiskõvera analüüs ja see näitas iga praimeripaari kohta ühte amplifikatsiooniprodukti. RT-qPCR analüüsi jaoks uuriti näidis- ja MeJA-ga töödeldud proovide jaoks kolme bioloogilist kordust ja igaüht kolme tehnilise kordusega. Geeniekspressiooni analüüsiti võrdleva C,(△AC) meetodi abil (Livak ja Schmittgen 2001) ning olulisuse tasemed määrati kahepoolse Studenti t-testi abil. Reaalajas qPCR analüüsi praimerite järjestused ja praimeripaaride amplifikatsiooniefektiivsused on näidatud tabelis S1.

Rekombinantsete valkude ekspressioon ja puhastamine ning ensüümanalüüsid

Pgr025417 avatud lugemisraam (kodeerib oletatavat LOX-i) sünteesiti optimaalseks koodonikasutuseks E. coli-s (Genewiz, Suzhou, Hiina) ja klooniti pET28a-sse. Rekombinantne plasmiid transformeeriti E. coli BL21-sse. (DE3) rakud. Ühest kolooniast alustati 5-mL Luria Bertani (LB) kultuuri 50 ug ml-ikanamütsiiniga ja inkubeeriti öö läbi 37 °C juures loksutades. Üleöö kasvatatud kultuuri kasutati 100- ml LB söötme inokuleerimiseks 50 ug ml-kanamütsiiniga ja lasti kasvada OD600 väärtuseni 0,5. Seejärel lisati valgu ekspressiooni indutseerimiseks isopropüül- -D-tiogalaktosiidi (IPTG) lõppkontsentratsioonini 0,1 mM. Pärast 18-tunnist inkubeerimist loksutamisega 16 kraadi juures koguti rakud tsentrifuugimisega. Rakupelletid resuspendeeriti lüüsipuhvris (50 mM NaH, PO, pH 7,4, 300 mM NaCl, 10 mM imidasool) ja homogeniseeriti raku lõhkujaga (Constant Systems Ltd, Northants, UK). Tema märgistatud valgud puhastati, kasutades Ni-NTA helmed (ThermoFisher Scientific) pesupuhvriga (50 mM NaH, PO, pH 7,4 300 mM NaCl, 25 mM imidasool) ja elueerimispuhvriga (50 mM NaH, PO, pH 7,4 300 mM NaCl, 500 mM) imidasool). Puhastatud valgud eraldati 10% SDS-PAGE geelil valgu puhtuse visualiseerimiseks. Puhastatud valkude kontsentratsioon määrati Bradfordi testiga (Bradford 1976).

LOX-testis kasutati linoolhapet substraadina kaheetapilises kolorimeetrilises meetodis koos väikeste modifikatsioonidega (Anthon ja Barrett 2008）). 500-μL reaktsioonisegu, sealhulgas 50 mM Na-fosfaat, pH 6, 10 mM DMAB, 0,5 mM linoolhape ja erinevad kogused puhastatud rekombinantseid valke (1,5 mg ml-), inkubeeriti. 25 kraadi juures 10 minutit. Reaktsioonisegule lisati teine ​​lahus (500 µl), mis sisaldas 0,2 mM MBTH ja 0,1 mg mL-hemoglobiini, mida inkubeeriti veel 5 minutit. Reaktsioon lõpetati 500 µl 1% (mass/maht) naatriumlaurüülsulfaadi lisamisega. Määrati valguse neeldumine lainepikkusel 598 nm.

Subtsellulaarne lokaliseerimine ja fülogeneetilised analüüsid

Märkustega granaatõuna genoomi (Qin et al. 2017) otsing tuvastas 1 l oletatava täispika LOX-i (786 aa kuni 970 aa), sealhulgas Pgr025413, Pgr020032, Pgr025418, Pgr02541gr1gr18, Pgr02541gr18,8 täispikk jada GenBank XP_031395793), Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 ja PgrO13780. Granaatõuna LOX-ide signaalpeptiidide subtsellulaarsed lokalisatsiooni- ja lõhustamiskohad ennustati rakenduse TargetP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/TargetP/) (Almagro Armenteros et al.2019) abil.

TF-i siduva saidi analüüs

TF-ide seondumiskohtade ennustamiseks saadi GenBankist 1000 aluspaari sihtgeenide ATG stardikoodonist ülesvoolu ja otsiti Eucalyptus Grandis TF-ide suhtes PlantRegMapis (versioon 5) (Tian et al. 2020). Seondumise läviväärtus saidi identifikatsioon määrati väärtusele P Väiksem kui le-4 või sellega võrdne.

Statistiline analüüs

Metaboliitide kvantifitseerimise, transkriptsiooni ja reaalajas qPCR andmete statistilist analüüsi kirjeldatakse vastavates jaotistes.

Tulemused

MeJA moduleerib rakkude signaaliülekannet ja metaboolseid radu granaatõuna lehtedes

Et mõista granaatõuna genoomi hõlmavat transkriptsioonilist reaktsiooni MeJA esilekutsumisele, granaatõuna lehtede transkriptoomid 2-h,6-h,24-h ja 72-h pärast MeJA või pilkupüüdvat ravi (igaüks kolme bioloogilise kordusega) analüüsiti (joonis S1). Iga transkriptoomi kohta saadi ligikaudu 55 miljonit töötlemata järjestuse lugemist (2 × 150 aluspaari paarisots), mille GC sisaldus oli umbes 52 protsenti ja Q30 väärtused olid vahemikus 91,6–95 protsenti (tabel S2). Kõigi transkriptoomide puhul kaardistati enam kui 96 protsenti puhastatud järjestuste lugemistest granaatõuna võrdlusgenoomiga (Qin et al. 2017) (tabel S3). Enamik kokkupandud transkripte olid alla 1000 aluspaari (34,3 protsenti), 1000 aluspaari – 2000 bp (32,9 protsenti) või 2000 bp – 3000 bp (18,1 protsenti) (tabel S4).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, kohandatud P<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="">

Shikimate ja HT raja geenid ja HT metaboliidid indutseeriti MeJA-ga töödeldud granaatõuna lehes Nagu selgus transkriptoomi ja KEGG raja rikastamise analüüsist, näitasid kolm shikimate biosünteesiraja geeni ülesreguleeritud ekspressiooni MeJA-ga töödeldud lehtedes võrreldes näidiskontrollidega temperatuuril {{3 }}h, sealhulgas 3-desoksü-D-arabinoos-heptulosonaat-7-fosfaadi süntaas (DAHPS), 3-dehüdrogenaadi süntaas (DHS) ja bifunktsionaalne 3-dehüdrogenaatdehüdraas/ šikimaadi dehüdrogenaas (DHQ/SDH; lühendatult SDH) (joonised S1b ja la). Eelkõige tuvastati kolm granaatõuna SDH isovormi, mis näitasid transkriptoomianalüüsis erinevat ekspressiooni: Pgr020271, Pgr019030 ja Pgr019029,

Et teha kindlaks, kas muutused šikimaadi ja HT biosünteetiliste geenide transkriptide koguses võivad mõjutada nendest radadest pärinevate metaboliitide taset, ekstraheeriti fenoolsed metaboliidid lehtedest, mis koristati 24-h, 30-h. 36-h,48-h ja 72-h pärast MeJA või näidisrakendust ning analüüsitud HPLC-ga (joonis 2). Tuleb märkida, et need ajapunktid valiti selleks, et võtta arvesse aega, mis on vajalik valkude sünteesiks ja metaboliitide tootmiseks ja akumuleerumiseks pärast šikimaadi ja HT biosünteetiliste geenide täheldatud ekspressioonimuutusi 6- h. Kahe 4,57 minuti (piik 1) ja 24,98 minuti (piik 2) juures elueeritud kahe metaboliidi retentsiooniajad ja absorptsioonispektrid ühtisid vastavalt HT raja vaheühendite - glükogalliini ja Penta sulamite - glükoosi omadega (joonised la ja 2a). Mõlemad piigid näitasid olulisi muutusi integreeritud piikide pindalades mitmel ajahetkel (joonis 2b). Täpsemalt, tipp 1 suurenes MeJA-ga töödeldud lehtedel võrreldes näidiskontrollidega 30-h, 36-h ja 48-h (joonis 2b). Huvitav on see, et MeJA-ga töödeldud lehtede tipp 2 langes algul 24-h, kuid seejärel suurenes 30-h ja 36-h pärast, enne kui naasis näidiskontrollide tasemele 48-. h ja 72-h (joonis 2b).

MeJA-ga töödeldud granaatõuna lehtedes ilmnes enamiku flavonoidide ja antotsüaniinide sisalduse vähenemine, samuti suurenenud metüülitud flavoonide ja flavonoolide sisaldus

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; tabelid S5 ja S6). Erinevalt akumuleerunud metaboliitide puhul rikastati üldiselt taimede sekundaarses/spetsialiseerunud metabolismis osalevad metaboliidid (67 102-st), eriti fenoolühendid (63 102-st) (tabel S6).

Fenoolide hulgas ilmnes MeJA-ga töödeldud lehtedel paljude flavonoidide ja antotsüaniinide (42 ühendist 73-st) kooskõlastatud vähenemine (joonis 3; tabel S6). Huvitaval kombel suurenes MeJA-ga töödeldud lehtedes kolme mono- või di-O-metüülitud flavooni ja flavonooli, sealhulgas di-O-metüülkvertsetiin, krüsoberüül-O-heksosüül-O-heksosiidi ja 5-O-heksosiidi müük. (joonis 3; tabel S6). Mitmed flavonoidide ja antotsüaniiniradade vaheühendid, sealhulgas luteoliin, krüsoberüül, dihüdrokaempferool, dihüdrokvertsetiin, dihüdromürtsetiin, epikatehiin, delfinidiin ja pelargonidiin, olid tuvastatavad, kuid ei näidanud olulisi muutusi MeJA-ga töödeldud lehtedes (joonis 3; Table S5). Hüdroksütsiin-namoüülderivaadid, isoflavoonid ja kumariinid olid teiste fenoolide hulgas, mis näitasid MeJA indutseerimisel vähenenud akumuleerumist (tabel S6). Seevastu kahe fenoolhappe, 2,3-dihüdroksübensoehappe ja protokatehhhappe (3,4-dihüdroksübensoehappe) ning kumariini, 6-metüülkumariini sisaldus suurenes MeJA-ga töödeldud lehtedes (Tabel S6).

Kooskõlas suures osas vähenenud flavonoidide ja antotsüaniinidega MeJA-ga töödeldud granaatõunalehtedes on flavonoidide ja antotsüaniinide biosünteesi kahe võtmeensüümi transkriptid. Transkriptoomianalüüsi kohaselt vähenesid CHS(Pgr005566) ja CHI (Pgr025966) oluliselt 6-h ja 24-h pärast MeJA manustamist (joonis 4). CHS ja CHI ekspressiooni uurimiseks viidi läbi reaalajas qPCR analüüs täiendavate ajapunktidega, sealhulgas 2-h, 3-h, 6-h,12-h,{{ 11}}h,48-h ja 72-h (joonis 4). CHS-i transkriptid langesid MeJA-ga töödeldud lehtedel 3-h ja jäid oluliselt madalamaks kui näidises. kontrollib kuni 72-h, suurim langus on 12-h. Seevastu CHI ekspressiooni vähenemine oli märkimisväärne ainult 24-h, 48- ja 72-h pärast MeJA-ravi (joonis 4).

See artikkel on välja võetud artiklist Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9