Ligusticum Sinense'i risoomi melanogeneesi inhibiitorid B16-F10 melanoomirakkudes in vitro ja sebrakala in vivo

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Min-Chi Cheng 1,† , Tzong-Huei Lee 2,†, Yi-Tzu Chu 3, Li-Ling Syu 3, Su-Jung Hsu 4, Chia-Hsiung Cheng 5, Jender Wu 1,* ja Ching-Kuo Lee 1,3,6,*

Abstraktne:Hiina ravimtaime Ligusticum sinense risoomi on pikka aega kasutatud kosmeetikatoodetena.valgendamineja naha niisutamine iidses Hiinas. L. sinense risoomi antimelanogeensete komponentide uurimiseks viisime läbiantimelanogeneesanalüüsiga juhitud puhastamine, kasutades poolpreparatiivset HPLC-d, millega kaasneb spektroskoopiline analüüs aktiivsete komponentide määramiseks. Biotesti juhitud meetodi alusel eraldati ja identifitseeriti L. sinense metanooliekstraktide etüülatsetaadikihist 24 ühendit ning nende hulgas 5-[3-(4-hüdroksü{{ 7}}metoksüfenüül)allüül]ferulhape (1) ja cis-4-pentüültsükloheks-3-een-1,2-diool (2) olid uued ühendid. Kõigile puhastele isolaatidele viidi läbi antimelanogeneesi test, kasutades hiire melanoomi B16-F10 rakke. Esitatud on ühend 1 ja (3S,3aR)-neoknidiliid (8).antimelanogeneesaktiivsus IC50 väärtustega vastavalt 78,9 ja 31,1 uM, ilma ilmse tsütotoksilisuseta. Täiendavad uuringud näitasid, et ühend 8 näitas märkimisväärset pigmentatsioonivastast toimet sebrakala embrüotel (10-20 µM) võrreldes arbutiiniga (20 µM) ja ilma tsütotoksilisuseta inimese normaalsete epidermise keratinotsüütide suhtes. Need leiud viitavad sellele, et (3S,3aR)-neoknidiliid (8) on tugev antimelanogeenne ja mittetsütotoksiline looduslik ühend ning seda võib potentsiaalselt arendada naha-valgendaminekosmeetikavahend.

Märksõnad:Ligusticum sinense; risoom;antimelanogenees; B16-F10 melanoomirakk; sebrakala;pigmentatsioon

Klõpsake selleksCistanche tubulosa pulber melaniini pärssimiseks

Sissejuhatus

Melaniin on pruun-must pigment, mis vastutab peamiselt naha, juuste ja silmade värvi eest [1]. Melaniin on biopolümeer ja sisaldab kahte peamist inimnaha pigmentide klassi, pruunikasmust eumelaniini ja punakaskollast feomelaniini [1]. Melaniini biosüntees on keeruline mitmeastmeline protsess, mida nimetataksemelanogenees, mis on inimese naha füsioloogiline reaktsioon ultraviolettkiirguse (UV) kiirguse ja keskkonnasaasteainete kahjulike mõjude vältimiseks. Kuid liigne melanogenees võib põhjustada naha tumenemist ja ebanormaalne hüperpigmentatsioon põhjustab mitmesuguseid dermatoloogilisi probleeme, nagu tedretähnid, melasma, seniilsed lentigiinid ja isegi nahavähk [2].

Melaniini toodetakse membraaniga seotud organellides, mida nimetatakse melanosoomideks ja mis asuvad spetsiaalsetes rakkudes, mida nimetatakse melanotsüütideks. Melaniini süntees algab L-türosiini hüdroksüülimisest L-dihüdroksüfenüülalaniiniks (DOPA) ja sellele järgneb oksüdatsioon dopakinooniks. Neid kahte reaktsiooni katalüüsib kiirust piirav ensüüm türosinaas. Tioolainete puudumisel tsükliseerub dopakinoon leukodopakroomiks, millele järgneb rida oksüdeeritud redutseerimisreaktsioone, mis hõlmavad türosinaasiga seotud valku -2 (Tyrp-2), mille tulemusena tekib vaheühend dopakroom ja 5, 6-dihüdroksüindool{ {9}}karboksüülhape (DHICA). DHICA läbib järgneva oksüdatsiooni, mida katalüüsib Tyrp{10}}, ja polümerisatsiooni, moodustades eumelaniini. Dopakinoon konjugeerub ka tsüsteiini ja glutatiooniga, saades tsüsteinüüldopat ja glutationüüldopat, mis muudetakse järk-järgult feomelaniiniks [1].

Melanotsüüte ümbritsevad rakud, nagu keratinotsüüdid ja fibroblastid, osalevad nende reguleerimisesmelanogenees[3]. Pidev kokkupuude UV-kiirgusega kahjustab DNA-d inkeratinotsüüte ja viib proopiomelanokortiini (POMC) p53-vahendatud ülesreguleerimiseni. POMC läbib translatsioonijärgse lõhustamise, et toota melanotsüüte stimuleerivat hormooni (-MSH) ja endorfiini. Omakorda seondub -MSH melanokortiin 1 retseptoriga (MC1R) külgnevatel melanotsüütidel, mille tulemuseks on cAMP ülesreguleerimine. Kõrgenenud cAMP stimuleerib mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktori (MITF) ekspressiooni. Seejärel reguleerib MITF pigmentatsiooniensüümide, sealhulgas türosinaasi, Tyrp-1 ja Tyrp-2 transkriptsiooni. UV-käivitatud rada viib lõpuks melaniini sünteesini ja melanosoomide ülekandmiseni keratinotsüütidesse [4–6]. Lisaks välistele stiimulitele mõjutavad melaniini tootmist ka sisemised tegurid, nagu hormoonide muutus, geneetilised häired, põletikud ja vanus [3].

Ida-Aasias loodab enamik naisi vältida naha ebaühtlast pigmentatsiooni ja taotleda naha heledamaks muutmist. Näiteks on kasutatud arbutiini, kojiinhapet, aselaiinhapet, askorbiinhapet ning valge mooruspuu ja lagritsajuure ekstrakti.valgendaminekosmeetikatoodete koostisained [7]. Tõhusa ja ennetava naha ärakasutaminevalgendamineLooduslikest allikatest pärit ained pakuvad kosmeetika valdkonnas suurt huvi, peamiselt suhtelise mittetoksilisuse ja vähemate kõrvalmõjude tõttu [7, 8]. Ligusticum sinenseOliv risoom. (Umbelliferae) on traditsioonilise hiina meditsiinina kasutatud juba 2000 aastat ja siiani on selle juured väga soovitatavad taimetee [9]. L. sinense, nimelt "Gaoben" hiina keeles, tuntud ka kui hiina lovage, kasutati tuule-külma väljutamiseks, valu ja reumaatilise artralgia leevendamiseks ning anemofrigiidse peavalu leevendamiseks. L. sinense'i peamine välispidine kasutamine on naha valgendamiseks ja niisutamiseks [10]. Praeguseks on L. sinense'is esinevad teatatud keemilised koostisosad terpenoidid, ftaliidi analoogid ja fenüülpropanoidglükosiidid [11–16]. On teatatud, et sellised koostisosad avaldavad arvukalt farmakoloogilisi toimeid. Näiteks teatati, et L. sinense juurtest ja risoomidest pärinevatel eeterlikel õlidel on valuvaigistav, rahustav ja antimikroobne toime [15,17]. Ligustiliid, peamine ftaliid, mida leidub laialdaselt Umbelliferae taimes, avaldas müomeetriumi laiendavat toimet ja vähendas põletikulist toimet. ja neurogeenne valu [18]. Knidiliid, teine ​​Umbelliferae taimes rohkesti leiduv ftaliidi, omab spasmolüütilist ja põletikuvastast toimet [19,20]. Varasemad uuringud on näidanud, et L. sinense ekstrakt pärsibmelanogeneeshiire melanoomi B16-F10 rakkudel [21]. Siiski ei teatatud melanogeneesi inhibeeriva aktiivsuse aktiivsetest komponentidest.

looduslikud koostisosad

Meie esialgses bioloogilises sõeluuringus leiti, et L. sinense metanooliekstraktid näitasidantimelanogeneesaktiivsus B16-F10 rakkudes, mille IC50 väärtus on 50 µg/mL [22], ja anti-alnogeneesi põhimõtted on siiani avalikustamata. Seega asusime uurima L. sinense risoomi aktiivset põhimõtet biotestipõhise meetodi abil, mis on viinud kahe uue ühendi 1 ja 2 eraldamiseni ja identifitseerimiseni koos 22 teadaoleva ühendiga 3–24. Selle artikli eesmärk oli ka uurida ühendite 1 ja 8 mõju B16-F10 melanoomirakkudele in vitro ja sebrakaladele in vivo, hinnata ohutust normaalse inimese epidermaalse keratinotsüütide MTT testiga ning kvantifitseerida 1 ja 8 L. sinense risoomi puhul. .

2. Tulemused ja arutelud

2.1. Isolatsioon ja struktuurne selgitamine

Püüdes isoleerida ja tuvastadamelanogeneesinhibiitoreid tõhusalt aktiivsetest fraktsioonidest, kasutasime biotestiga juhitud fraktsioneerimisstrateegiat. L. sinense risoomi metanooliekstrakt jaotati, et saada etüülatsetaat, n-butanool ja vees lahustuvad kihid. Seejärel testiti saadud kolme kihti melanogeneesivastase toime suhtes hiire melanoomi B16-F10 rakkudes. Hiire B16 melanoomirakk on tundlik, usaldusväärne ja teostatav platvorm suure hulga väikeste molekulide skriinimiseks.melanogeneesregulaatorid [23–25]. Kontsentratsioonidel 25–100 µg/ml näitas etüülatsetaadis lahustuv kiht kõige tugevamat inhibeerivat toimet, samas kui n-butanooli või vees lahustuvate kihtide puhul täheldati kerget inhibeerimist (joonis 1A), mida tõendab melaniini sisaldus lüüsitud aines. B16-F10 melanoomirakud (joonis 1B). Etüülatsetaadi kihi avatud kolonn eraldamine silikageelil, millele järgnes HPLC puhastamine, andis kaks varem teatamata keemilist üksust 1 ja 2 (joonis 2A) koos 22 tuntud ühendiga. Tuntud ühendeid iseloomustati kui eugenooli (3) [26], {{17} }hüdroksü-4-metüülatsetofenoon(4) [27], 3S*,3aR*,7aS*-3-butüülheksahüdroftaliid (5) [28], karvakrool (6) [29], skvaleen (7) [30 ],(3S,3aR)-neoknidiliid (8) [31], koniferüülalkohol 9-metüülester (9) [32], bergapteen (10) [33], metoksaleen (11) [34], metüülvanillaat ( 12) [35], 2,5-dihüdroksü-4-metüülatsetofenoon (13) [36], 2-metoksü-4-nitrofenool (14) [37], 2,{{ 55}}dimetoksüfenool (15) [38], falkarindiool (16) [39], (9Z)-heptadetseen-4, 6-diüün-1, 8-diool (17) ) [40], 3-O-(p-kumaroüül)ursoolhape (18) [41], pregnenoloon(19) [42], (9Z,11E,13R)-13-hüdroksüoktadeka{{79 }}, 11-dieenhape (20) [43], feruulhape (21) [44], koniferüülferulaat (22) [45], p-hüdroksüfenetüülferulaat (23) [46] ja vanil hape (24) [47].

Värvitu õlina saadud ühendi 1 valem oli C20H20O6, nagu tuletati13C NMR ja positiivsete ioonide HRESI-MS põhjal, mis näitas fragmendi iooni positiivse HRESI-MS juures m/z 357,1331 [M pluss H] pluss (arvutatud C20H21O6 jaoks, 357.1333). Selle IR-neeldumised 3444, 1633 ja 1509 cm-1 juures näitasid vastavalt hüdroksü-, olefiin- ja aromaatsete funktsionaalrühmade olemasolu. 1H NMR 1,1,3,4,5-tetraasendatud aromaatse osa [δH 7,07 (d, J=1,8 Hz, H-6) ja 7,22 (d, J=1,8 Hz, H-2)], ABX-tüüpi aromaatne funktsionaalsus [δH 6,69 (dd, J=7.9, 1,8 Hz, H-60) , 6,74 (d, J=7,9 Hz, H-50) ja 6,87 (d, J=1,8 Hz, H-20)], kaks trans- omavahel seotud olefiinsed prootonid [δH 6,33 (d, J=15,9 Hz, H-8) ja 7,56 (d, J=15,9 Hz, H-7) ], terminaalne allüülrühm [δH 4,99 (ddd, J=17,1, 1,8, 1,8 Hz, H-90a), 5,10, (br d, J=7,6 Hz , H-70), 5,15 (ddd, J=10.1, 1,8, 1,8 Hz, H-90b) ja 6,40 (ddd, J=17.1, 10,1 , 7,6 Hz, H-80)] ja täheldati kahte metoksüülresonantsi [δH 3,77 (s, 30-OCH3) ja 3,92 (s, 3-OCH3)]. Kakskümmend süsinikresonantsi, mis omistatakse seitsmele protoneerimata aromaatsele süsinikule [δC 126,7 (C-1), 131,2 (C-5), 135,3 (C-10), 146,1 (C{{116}). }), 148,6 (C-3), 147,2 (C-4) ja 148,2 (C-30)], üks hape karbonüül (δC 168,4, C{128}}), onemetiin (δC 48,2, C-70), kaheksa olefiinset metüüli [δC 108,9 (C-2), 113,2 (C-20), 115,6 (C-50), 116,1 (C) -8), 121,8 (C-60), 123,8 (C-6), 141,5 (C-80) ja 146,2 (C-7)], üks eksometüleen (δC 115,9, C-90) ja kaksmetoksüülid [δC 56,4 (30-OCH3) ja 56,6 (3-OCH3)] täheldati 13C NMR spektris koos DEPT spektriga 1 ( Tabel 1). 1. ühenduvus tuletati veel ristpiikidega δH5,10 (H-70)/δC 113,2 (H-20), 115,9 (H-90), 121,8 (H{{) 183}}), 123,8 (C-6), 131,2 (C-5), 135,3 (C-10), 141,5 (C-80) ja 147,2 (C{{ 198}}), δH 7,56 (H{201}})/δC 108,9 (C{201}}), 116,1 (C{207}}), 123,8 (C{210}}), 126,7 (C) -1) ja 168,4 (C-9), δH 3,77 (30-OCH3)/δC 148,2 (C-30) ja δH 3,92 (3-OCH3)/ δC 148,6 (C-3) HMBC spektris (joonis 2B), mida kinnitasid ka vastastikku korrelatsioonis olevad signaalid δH 3,77 (30-OCH3)/δH 6,87 (H-20 ) ja δH 3,92 (3-OCH3)/δH 7,22 (H-2) NOESY spektris (joonis 2B). Vastavalt sellele iseloomustati 1, nagu näidatud, ja selle nimeks oli 5-[3-(4-hüdroksü-3-metoksüfenüül)allüül]ferulhape. Meie teadmiste kohaselt oli 1, kus kaks C6–C3 ühikut olid ühendatud punktis C-70, uut tüüpi lignaani skelett.

Ühend 2 eraldati värvitu õlina molekulvalemiga C11H2{{20}}O2, mis tuletati positiivse iooniga HR-ESIMS, mis näitab [M pluss H] pluss iooni m/z juures 185,1501 (arvutatud C11H21O2 jaoks, 185.1541). Silmatorkavad neeldumised 2 IR-spektris 3445 ja 1660 cm−1 juures näitasid vastavalt hüdroksü- ja olefiinsete funktsionaalrühmade olemasolu. 1H NMR (tabel 2) koos COSY-spektriga 2 näitas kahte alifaatset ahelat δH 0,85–1,97 (–H2-7–H3-11) ja δH 1,66–5,44 (–H-3 –H-2–H-1–H2-6–H2-5–). Ülaltoodud määrangud kajastuvad ka DEPT spektritega toetatud 2 13C NMR-is, milles üks metüül (δC 14,2, C-11), kuus metüleeni [δC 22,7 (C-10), 26,3 (C{{) 45}}), 27,2 (C-5), 27,4 (C-8), 31,8 (C-9) ja 37,4 (C-7)], kolm metiini [δC Täheldati 67,1 (C-2), 69,2 (C-1) ja 121,0 (C-3)] ning ühte kvaternaarset süsinikku (δC 144,1, C{69}}). HMBC spektris 2 (joonis 2C) δH ristpiigid 5,44 (H-3)/δC 27,2 (C-5) ja 37,4 (C-7), δH 1,92– 2,01 ja 2,04–2,10 (H{90}})/δC144,1 (C{93}}) ja δH 1,97 (H{96}})/δC 144,1 (C{99}}) näitavad C {100}}–C-6 oli kaksiksidemega tsüklohekseeni fragment ∆3 juures ja C-7–C-11, küllastunud lineaarne alifaatne ahel, oli seotud C{{105} }}. Hüdroksürühma kandvate kiraalsete C-1 ja C-2 suhtelised konfiguratsioonid lähenesid karbinoüülprootonite H-1 (9,1, 4,2 Hz) ja H-2 (4,2 Hz) J väärtustega ), mis näitas, et H-1 ja H-2 olid vastavalt pseudoaksiaal- ja pseudoekvatoriaalsele orientatsioonile (joonis 2C). Seega tuletati 1,2-dihüdroksürühma suhteline konfiguratsioon 2-s cis-ks. Lõppkokkuvõttes selgitati ühendi 2 struktuur, nagu näidatud, ja see sai nimeks cis-4-pentüültsükloheks-3-een-1,2-diool.

2.2. Ühendite 1 ja 8 mõju melaniinisisaldusele -MSH-stimuleeritud B16-F10 rakkudes

L. sinense risoomi depigmentatsioonikomponentide kindlakstegemiseks viidi läbi kõik puhtad isolaadid.antimelanogeneesanalüüs B16-F10 melanoomirakkudes. Hiire melanoomi B16-F10 rakud on hästi väljakujunenud mudel antimelanogeensete põhimõtete avastamiseks ja neid on varasemates uuringutes laialdaselt kasutatud [48]. -Melanotsüüte stimuleeriv hormoon (-MSH) on peptiidhormoon, mis vastutab melanotsüütide poolt melaniini tootmise eest melanokortiini 1 retseptori aktiveerimise kaudu [49]. Selles uuringus stimuleeriti B16-F10 rakke -MSH-ga (100 nM) ja töödeldi samaaegselt iga ühendiga kontsentratsioonides 25, 50 või 100 µM. B16-F10 melanoomirakkude melaniinisisalduseks ilma ühendiga töötlemata määrati 100 protsenti. Arbutiin, tavaline nahkvalgendaminekosmeetikatoodetes, kasutati positiivse kontrollina. Nendest ühenditest inhibeerib 1 ja 8 -MSH-indutseeritud melaniini tootmist annusest sõltuval viisil. Ühendite 1 ja 8 IC50 väärtused olid vastavalt 78,9 ja 31,1 uM (joonis 3B). Ühendid 1 ja 8 efektiivsetes kontsentratsioonides ei näidanud MTT testile ilmset mõju (joonis 3A). MTT tulemused võivad tuleneda rakkude proliferatsiooni vähendamise ja rakkude elujõulisuse pärssimise kombineeritud mõjust vastavalt katsetingimustele. Need tulemused näitasid, et ühendite 1 ja 8 melanogeensed toimed ei olnud seotud rakusurma ega kasvu pärssimisega.

Kasutades HPLC-DAD meetodit, iseloomustati toorekstraktist (joonis 4) põhilisi efektiivseid koostisosi (1 ja 8), võrreldes puhta 1 (laborisüntees, andmed pole veel avaldatud) ja 8 (Sigma) retentsiooniajaga. standarditena. Kasutati põhilahuseid 1, 10, 20, 40, 60, 80 ja 100 µg/ml. Iga kontsentratsioon süstiti kolmes eksemplaris. Kuivatatud materjali ekstrakti sisalduse suhted 1 ja 8 määrati vastavate piikide pindalade lineaarse regressiooni abil 0,009% ja 0,15% (w/w).

2.3. Sebrakala pigmentatsioonianalüüs in vivo

Lisaks hinnata 8 mõju in vitroantimelanogenees, uuriti täiendavalt selle in vivo pigmentatsioonivastast võimet sebrakala pigmentatsioonitesti abil. Sebrakala on peetud soodsaks selgroogse mudelorganismiks tänu tema väiksusele, suurele viljakusele ning inimesele sarnastele geenijärjestele ja elundisüsteemidele. Lisaks muudab melaniini pigmentatsiooniprotsess selle pinnal, mis võimaldab hõlpsat vaatlemist, muuta sebrakala eriti kasulikuks mudeliks vivomelanogeensete inhibiitorite või stimulaatorite uurimiseks [50]. Selles uuringus kasutati positiivse kontrollina 20 mM arbutiini ja 20 uM arbutiini, et võrrelda ühendiga 8 samal kontsentratsioonitasemel. Pärast sebrakala embrüote inkubeerimist võimsuselt 7 hj kuni 72 hj oli ühendil 8 suurem pigmentatsiooni inhibeeriv toime kontsentratsioonidel 10 ja 20 uM võrreldes arbutiiniga (20 uM) (joonis 5). 20 uM ühendi 8 töötlemisel väheneb sebrakala pigmentatsioonitase märgatavalt umbes 31 protsenti; samas kui ühend 8 10 uM juures vähendab pigmentatsioonitaset 26,2 protsenti.

2.4. Inimese epidermise naha ekvivalentide elujõulisuse test

Kosmeetikatoodete ohutus on tõsine probleem. Näiteks hüdrokinoon, tõhus nahka kergendav aine, on turult keelatud arvukate kõrvaltoimete ja võimaliku kantserogeense ohu tõttu tekkinud poleemika tõttu [7]. Kojihape, tugev türosinaasi inhibiitor, võib põhjustada kontaktdermatiiti ja potentsiaalset genotoksilisust [51,52]. Selleks, et hinnata ühendite 1 ja 8 ohutust inimese nahal, viisime läbi rakkude elujõulisuse testi inimese naha ekvivalentide (HSE) mudelil. HSE-d on kolmemõõtmelised kultuurisüsteemid, mis luuakse inimese keratinotsüütide külvamisel sobivale dermaalsele substraadile, mis on eelnevalt külvatud inimese fibroblastidega. HSE-d on füsioloogiliselt võrreldavad loodusliku nahaga ja pakuvad loomkatseteks sobivaid alternatiive. Kontrollitud kultiveerimistingimustes on HSE-d väga sarnased loodusliku koega, millest need pärinevad [53]. Selles uuringus viidi läbi Leideni epidermaalsete mudelite (LEM) normaalsete inimese epidermaalsete keratinotsüütide (NHEK) elujõulisuse testid. Ühendid 1 ja 8 ei mõjutanud rakkude elujõulisust kontsentratsioonidel 10–100 uM. Ühendi 1 rakkude elujõulisus on vastavalt 98 protsenti ja 106 protsenti kontsentratsioonidel 10 ja 100 uM. Ühendi 8 rakkude elujõulisus on kontsentratsioonidel 10 ja 100 uM vastavalt 97 protsenti ja 92 protsenti. Vastavalt sellele ei avaldanud ühendid 1 ja 8 tsütotoksilisust NHEK-de vastu Leideni epidermise mudelites kontsentratsioonidel alla 100 uM (joonis 6). Kuna 8 efektiivne kontsentratsioon on alla 100 µM, mis viitab sellele, et 8 võib olla nahale ohutuvalgendaminealla testitud kontsentratsiooni. Praktikas võidakse aga kosmeetikatooteid inimese nahale kanda pikka aega, mistõttu tuleb HSE peal testitavate ühendite pikemat katseperioodi läbi viia.

2.5. B16-Musculuse türosinaasi molekulaarse dokkimise uuring

Türosinaasi katalüüs on melaniini biosünteesi kiirust piirav etapp. Seega on türosinaasi inhibeerimine kõige levinum viis naha valgeduse saavutamiseks [54,55]. Et teha kindlaks, kas L. sinense allasurutudmelanogeneesB16-F10 rakkudes türosinaasi inhibeerimise kaudu viidi läbi 3D-pulgamudelid (joonis 7A) ja 2D-diagramm (joonis 7B) molekulaarse dokkimise kohta DS-tarkvara abil, mis paljastas ühendi 8 võimaliku inhibeerimismehhanismi hiirel (Mus). musculus) türosinaas. Näidati, et hiire türosinaasi aktiivne sait paiknes domeenis, mida ümbritsevad aminohapped His377, Asn378, His381, Gly389, Thr391, Ser394 koos kahe vase iooniga. CDOCKERi interaktsioonienergia ensüümi ja inhibiitori vahel oli –46,0067 kcal/mol. Simulatsiooni tulemused näitasid, et hüdrofoobsed aminohapped, sealhulgas Gly389, Asn 378, Thr391 Ser394, His 404 ja His192 katalüütilise saidi ümber moodustasid van der Waalsi jõud koos ühendiga 8. Lisaks moodustab 8 -laktooni fragmendi hapnikuaatom koos His31577 ja His2 vesiniksidemega. , samas kui selle karbonüülrühm moodustab koordinatsioonisidemed kahe vase iooniga. Samuti täheldati, et tsüklohekseeni tsükkel ja butaan avaldasid nõrka π-alküüli interaktsiooni vastavalt His381 ja His215-ga. Varasemad uuringud on näidanud, et L. sinense ekstrakt inhibeerib seene türosinaasi ja vähendab türosinaasi mRNA ekspressiooni B16-F10 rakkudes [21,56]. Kuna molekulaarne dokkimine näitas tugevat interaktsiooni hiire türosinaasi aktiivse domeeni ja ühendi 8 vahel, tehti seega ettepanek, et (3S,3aR)-neoknidiliid (8) avaldas melanogeneesivastast aktiivsust türosinaasi aktiivsuse nõrgenemise ja melaniini tootmise edasise vähenemise tõttu. Kuid lisaks türosinaasi inhibeerimisele on ka teised selle aluseks olevad mehhanismidantimelanogenees(3S,3aR)-neoknidiliidi (8) aktiivsust tuleb edasi uurida.

3. Materjalid ja meetodid

3.1. Kindral

HPLC-puhtusastmega lahustid, n-heksaan, etüülatsetaat, metanool ja atsetonitriil, osteti firmalt JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA). Etanool osteti firmalt Merck (Darmstadt, Saksamaa). -Melanotsüüte stimuleeriv hormoon (-MSH), dimetüülsulfoksiid (DMSO), fosfaatpuhverdatud soolalahus (PBS), 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2 ,5-difenüültetrasooliumbromiid (MTT) osteti ettevõttelt Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Avatud kolonnkromatograafia viidi läbi silikageelil (70–230 mešši, Merck, Darmstadt, Saksamaa). Eelkaetud silikageeliplaadid 60 F254 ja alumiiniumlehed RP-18 F254S TLC jaoks osteti firmalt Merck (Darmstadt, Saksamaa). Optilisi pöördeid mõõdeti JASCO P-1020 polarimeetriga (Jasco, Tokyo, Jaapan). 1H ja 13C NMR saadi Bruker Avance DRX-500 spektromeetriga (Bruker, Rheinstetten, Saksamaa). Madala eraldusvõimega ja kõrge eraldusvõimega massispektrid saadi, kasutades ABI API 4000 Q-TRAP ESI-MS (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) ja Q-Exactive Plus HR-ESI-MS (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) ), vastavalt. IR-spektrid registreeriti JASCO FT/IR 4100 spektromeetriga (Jasco, Tokyo, Jaapan).

3.2. Taimsed materjalid

L. sinense Oliv kuivatatud risoom. osteti ettevõttelt Sheng Chang Pharmaceutical Co., Ltd., Taoyuan, Taiwan.

3.3. Isolatsioon ja struktuurne selgitamine

Kuivatatud L. sinense risoom (9,9 kg) purustati ja ekstraheeriti metanooliga (40 L × kolm korda), mis filtriti ja aurustati, et saada must jääk (1758 g). See jääk suspendeeriti seejärel H2O-s (3{48}} L) ja jaotati kolm korda järjest võrdse mahu etüülatsetaadi ja n-BuOH-ga. Iga kiht kontsentreeriti alandatud rõhul, et saada EtOAc (415 g), n-BuOH (147 g) ja H2O (896 g) kihid. Seejärel segati kuivatatud etüülatsetaadi kiht (25{{100}} g) 375 g silikageeliga ja kanti konditsioneeritud avatud kolonni, mis oli täidetud 3550 g silikageeliga ja elueeriti etapiviisiliselt. gradiendi meetod n-heksaani, etüülatsetaadi ja metanooli segudega. Iga 500 ml koguti ühe fraktsiooni jaoks ja analüüsiti TLC abil. Seejärel ühendati kõik fraktsioonid vastavalt TLC analüüsi tulemustele kaheksaks osaks I–VIII, mis lahustati uuesti minimaalses mahus n-heksaani-etüülatsetaadi segudes, mida kasutati järgnevas HPLC süsteemis. Osa II, mida elueeriti n-heksaani-etüülatsetaadiga (95:5), puhastati poolpreparatiivse HPLC-ga (Hibar® Fertigäute, 10 × 250 mm), kasutades eluendina n-heksaani-etüülatsetaati (96:4) voolukiirusel. 3 ml/min, et saada 6 (4,2 mg, tR=19,8 min), 3 (6,1 mg, tR=21,2 min), 5 (32 mg, tR=23 0,5 min) ja 7 (79 mg, tR=28,0 min). Sama osa puhastati poolpreparatiivse HPLC-ga (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm), kasutades heksaani-etüülatsetaati (99). :1) eluendina voolukiirusel 3 ml/min, et saada ühend 4 (36 mg, tR=32,5 min). Osa III, mida elueeriti n-heksaani-etüülatsetaadiga (90:10), puhastati: poolpreparatiivne HPLC (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm), kasutades eluendina n-heksaani-atsetooni (95:5) voolukiirusel 3 ml/minto, annab 8 (1,7 g, tR=19). 3 min). Osa IV, mida elueeriti n-heksaani-etüülatsetaadiga (80:20), puhastati poolpreparatiivse HPLC-ga (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm), kasutades eluendina n-heksaani-etüülatsetaati (85:15) voolukiirusel. 3 ml/min, et saada 15 (19 mg, tR=24,4 min), 12 (11 mg, tR=26,9 min), 9 (25 mg, tR=33). ,8 min), 10 (31 mg, tR=37,0 min), 11 (24 mg, tR=42,5 min). Sama osa puhastati samas kolonnis, kasutades eluendina n-heksaani-etüülatsetaati (78:22) voolukiirusel 3 ml/mint, et saada 14 (10 mg, tR=20,1 min) ja 13 ( 22 mg, tR=24,6 min). Sama osa puhastati samas kolonnis, kasutades eluendina n-heksaani-etüülatsetaadi-atsetooni (80:10:10) voolukiirusel 3 ml/mint, et saada ühend 20 (25 mg, tR=13.2 min. ), 17 (15 mg, tR=16,3 min), 18 (28 mg, tR=18,5 min), 16 (132 mg, tR=21,8 min) ja 19 (39 mg, tR=25,6 min). Osa V, mida elueeriti n-heksaani-etüülatsetaadiga (60:40), puhastati poolpreparatiivse HPLC-ga (Hibar®Fertigäute, 10 × 250 mm), kasutades eluendina n-heksaani-etüülatsetaadi-atsetooni (68:27:5). voolukiirusel 3 ml/min, et saada 21 (5,3 g, tR=10,2 min), 23 (63 mg, tR=20,0 min), 22 (84 mg, tR { {164}},0 min) ja 24 (33 mg, tR=26,5 min). Sama osa puhastati poolpreparatiivse HPLC-ga (Hibar® Fertigäute, 10 × 250 mm), kasutades eluendina n-heksaani-etüülatsetaati (72:28) voolukiirusel 3 ml/min, et saada ühend 2 (24 mg, tR).=24,3 min). N-heksaani-etüülatsetaadiga (40:60) elueeritud osa VI puhastati poolpreparatiivse HPLC-ga (Hibar® Fertigäute, 10 × 250 mm), kasutades voolukiirusel eluendina n-heksaani-etüülatsetaati (53:47). 3 ml/min, et saada 1 (47 mg, tR=13,2 min).

3.4. Spektroskoopilised andmed

{{0}}[3-(4-Hüdroksü-3-metoksüfenüül)allüül]ferulhape (1): värvitu õli; [ ]25D pluss 5,6◦(c 0.12, CH3OH);IR (puhas) νmax 3444, 2935, 1633, 1509, 1434, 1376, 1267, 1153; positiivne ESI-MS m/z 357,2 [M pluss H] pluss; positiivne HRESI-MS m/z 357,1331 [M pluss H] pluss (arvutatud C20H21O6 jaoks, 357,1333); 1H ja 13C NMR andmeid vt tabel 1. Cis-4-pentüültsükloheks-3-een-1,2-diool (2): värvitu õli; [ ]22D-20,3◦(c 0,20, CH3OH); IR (puhas) νmax 3445, 2919, 1660, 1455, 1371, 1225, 1084; ESIMS m/z 185,2 [M pluss H] pluss; HRESI-MS m/z 185,1501 [M pluss H] pluss (arvutatud C11H21O2 jaoks, 185,1541); 1H ja 13C NMR andmed vaata tabelist 2.

3.5. HPLC-DAD analüüs

Kromatograafilised analüüsid viidi läbi Hitachi HPLC süsteemiga, mis koosnes L{{0}}pumbast, L-7200 automaatsest proovivõtturist, L-7455 detektorist ja D-7000 süsteemihalduri andmehõive tarkvarast ,XBridgeTM C18 kolonnis (pikkus 250 mm, siseläbimõõt 4,6 mm, osakeste suurus 5 um; Waters). Liikuv faas koosnes H2O-st (lahusti A) ja CH3CN-st (lahusti B). Voolukiirus oli 1,0 ml/min. Elueerimisprogramm oli järgmine: isokraatne 2 protsendi B (0–5 min), 2–20 protsendi B (5–25 min), 20–90 protsendi B (25–30 min) ) ja isokraatne 90 protsendi B-ga (30–35 min). Süstimismaht oli 10 l. UV-nähtav spekter registreeriti 240 nm juures.

3.6. Rakukultuur

B16-F10 hiire melanoomirakud (CRL6475) osteti toiduainetööstuse uurimis- ja arendusinstituudist (FIRDI, Hsinchu, Taiwan). Rakke kultiveeriti 90% Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), millele oli lisatud 10% veise loote seerumit (FBS, Sigma, St. Louis, MO, USA) ja 1% penitsilliini-streptomütsiini lahuse külvikolvid CO2 inkubaatoris, mille niisutatud atmosfäär sisaldab 5 protsenti CO2 õhus temperatuuril 37 ◦C. Kultuurikeskkonda vahetati iga kahe päeva järel. Rakud koguti trüpsiiniga, kui need olid ligikaudu 85% konfluentsed, loendati hemotsütomeetriga (Neubauer Improved., Marienfeld, Saksamaa) ja külvati sobival arvul rakukultuuriplaatide süvenditesse edasisteks katseteks.

3.7. Rakkude elujõulisuse test

Erinevate ekstraktide ohutuse määramiseks määrati rakkude elujõulisus pärast ekstraktidega töötlemist MTT testiga. See meetod põhineb 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) redutseerimisel formasaaniks mitokondriaalsete ensüümide toimel. elujõulistes rakkudes [57]. Moodustunud formazaani kogus on võrdeline olemasolevate elujõuliste rakkude arvuga ja seda saab mõõta spektrofotomeetriliselt. Lühidalt, 100 nM melanotsüüte stimuleeriva hormooniga (-MSH) eeltöödeldud rakud, mis külvati tihedusega 1 × 104 rakku süvendi kohta 12-süvendiga plaadile, jäeti ööseks kleepuma. Seejärel lisati igasse süvendisse puhtad isolaadid või arbutiin ja inkubeeriti veel 72 tundi. Seejärel märgistati töödeldud rakud 3 tunni jooksul MTT värvireagendiga (Applichem, Taani) PBS-is (2 mg/ml). Formasaani sade lahustati DMSO-ga ja kontsentratsioonid mõõdeti 570 nm juures mikroplaadilugejas. Rakkude elujõulisus arvutati järgmise valemi abil: rakkude elujõulisus ( protsenti )=(A proov/A kontroll) × 100, kus A proov ja A kontroll on neeldumised segust koos uuritava proovi lisamisega või ilma, vastavalt.

3.8. Melaniini sisalduse analüüs

Melaniini sisaldust mõõdeti nii, nagu eelnevalt kirjeldatud, väikeste muudatustega [58]. B16-F10 melanoomirakud külvati 1 × 104 rakku süvendi kohta 3 ml söötmes 6-süvendiga kultiveerimisplaatidel ja inkubeeriti üleöö, et võimaldada rakkudel kinnituda. Rakke eksponeeriti erinevate kontsentratsioonidega (25, 50 ja 100 uM) puhaste isolaatide või arbutiiniga 72 tundi 100 nM -MSH juuresolekul. Töötlemise lõpus pesti rakke PBS-ga ja lüüsiti 150 µL 1 N NaOH-ga (Merck, Saksamaa), mis sisaldas 10 protsenti DMSO-d, 1 tund temperatuuril 80 °C. Neeldumist 405 nm juures mõõdeti mikroplaadilugejaga. B16-F10 melanoomirakkude melaniinisisalduseks ilma ühendiga töötlemata määrati 100 protsenti ja ühendiga töödeldud rakkude melaniinisisaldus arvutati kontrollrühma suhtes.

3.9. Sebrakala pigmentatsioonianalüüs in vivo

Loomade kasutamise protokolli on läbi vaadanud ja heaks kiitnud Taipei Meditsiiniülikooli institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee (IACUC/IACUP) (nr LAC{0}}). Meetodid viidi läbi kooskõlas asjakohaste seadustega ja heakskiidetud juhised. Metsikut tüüpi sebrakala embrüod koguti Taipei Meditsiiniülikooli Zebrafish Core Facility'st. Sebrakala embrüo fenotüübipõhine hindamine viidi läbi vastavalt eelmisele uuringule, vähese muudatusega [50]. Embrüoid inkubeeriti temperatuuril 28 °C 1% etanooliga kontrollainena ja ühendite erineva kontsentratsiooniga 7 hj (pärast viljastamist) kuni 72 hjj. Et hinnataanti-melanogeneesmelanogeensete modulaatorite mõju sebrakala arenguprotsessile, sebrakala pigmentatsiooni analüüsiti 72 hj juures. Embrüod paigaldati 1% madala sulamistemperatuuriga agaroosi (Bioshop Canada, Burlington, ON, Kanada) ja jäädvustati ZEISS Stemi508 stereomikroskoobiga (ZEISS, Oberkochen, Saksamaa). Piltide pikslite mõõtmise analüüs viidi läbi ImageJ Fidži paketi abil. Analüüsiti pigmentatsiooniandmete kvantifitseerimist (ala sebrakala silmade all) ja võrreldi kontrollrühmaga.

3.10. Elujõulisuse test normaalsetel inimese epidermaalsetel keratinotsüütidel

Kõik Leideni ülikooli meditsiinikeskuse dermatoloogia osakonnas kasutatavad tervete doonorite primaarsed inimese naharakud eraldatakse üleliigsest koest, mis on kogutud vastavalt Hollandi ravilepingu artiklile 467 ja Hollandi biomeditsiini föderatsiooni inimkudede õige kasutamise koodeksile. Teadusseltsid. Vastavalt artiklile 467 võib üleliigseid kudesid kasutada, kui patsient ei ole vastuväiteid esitanud. See tähendab, et patsient, kellele tehakse plastiline kirurgia, on uuringust hästi informeeritud. Ükski autoritest ei osalenud koeproovide võtmisel. Inimkudedega töötamisel järgiti Helsingi deklaratsiooni põhimõtteid.

Ühe naissoost isendi värsket imetaja vähenenud naha ülejääki kasutati inimese normaalsete epidermaalsete keratinotsüütide (NHEK) eraldamiseks, nagu eelnevalt kirjeldatud [59]. Leidenepidermaalsete mudelite (LEM) NHEK-e inkubeeriti üleöö sukeldatud tingimustes keratinotsüüdis. Nelja päeva jooksul jäeti veise loote seerum järk-järgult välja ja LEM-ides olevaid NHEK-e kasvatati õhu-vedeliku liideses seerumivabalt seitse päeva, samal ajal kui söödet värskendati kaks korda nädalas. Elujõulisuse testid viidi läbi, lisades 0,5 ml 1 mg/ml MTT-d igale NHEK-ile LEM-is 3 tunniks pärast 24-tunnist kokkupuudet testühenditega 1, 8 ja DMSO-ga (negatiivne kontroll). sadestunud sinine formataani produkt ekstraheeriti rakkudest 2 tunni jooksul 0,5 ml isopropanooli süvendiga. Formasaani kontsentratsiooni mõõdeti OD määramisega 570 nm juures, kasutades aTecan Infinite F50 mikroplaadilugejat.

3.11. Statistiline analüüs

Kõik meie uuringu andmed saadi katsete keskmistena, mis viidi läbi vähemalt kolmes korduses ja väljendati keskmisena ± SD (standardhälve). Statistiline analüüs viidi läbi õpilase t-testiga. Tulemuste statistiline olulisus määrati p < 0.05="" (*)="" ja="" p="">< 0,01="">

3.12. B16-Musculuse türosinaasi molekulaarse dokkimise uuring

3.12.1. Homoloogia modelleerimine

Kuna Mus musculus türosinaasi jaoks pole praegu saadaval kolmemõõtmelisi struktuure, on homoloogiamodelleerimine kõige kindlam meetod tundmatu valgu kolmemõõtmeliste struktuuride ennustamiseks, mis põhineb eeldusel, et tundmatu valgu struktuur on sarnane mõne homoloogse referentsi teadaolevate struktuuridega. valgud. Ostsime Mus musculus türosinaasi aminohappejärjestuse riiklikust biotehnoloogia teabekeskusest. valgujärjestuse andmebaas. Päringuvalgu Mus musculustyrosinase homoloogvalgu matriitsi tuvastas Phyre2 (valgu homoloogia/analog Y Recognition Engine V 2.0) [60]. 446 jääki (81 protsenti Mus musculuse järjestusest ) on modelleeritud 100,0-protsendilise usaldusväärsusega ühe kõrgeima punktisumma saanud malliga esialgse eelarveprojekti koodina: dokkimisarvutusuuringute retseptoriks valiti c5m8pA.

3.12.2. Ligandi-valgu interaktsiooni analüüs

Mus musculuse türosinaasi sidumissait määrati inimtürosinaasi (PDB 5M8M) kuue aminohappejäägi põhjal ja sidumistaskus on kaks vaske. Seetõttu määrati sidumissaidi sfäär. Seejärel valmistati ühendi 8 3D-struktuur ette ja optimeeriti energia minimeerimisega, mis dokiti programmi CDOCKER abil Mus musculus tyrosinase sidumistaskusse ja dokkimiskäikude arvuks määrati inhibiitori jaoks 50. Kõik muud parameetrid määrati Ligand-Protein Interaction analüüsi vaikeväärtusteks, kasutades BioviaDiscovery Studio v.4.0 (Accelrys Software Inc., San Diego, CA, USA). Lõpuks valiti 50 dokkimiskonformatsiooni hulgast kõrgeima CDOCKERi energiaskooriga parim, et uurida dokitud ühendi sidumisviisi Mus musculus türosinaasi aktiivses kohas.

4. Järeldused

Käesolevas uuringus võtsime kasutusele biotesti juhitud meetodi, kasutades B16-F10 rakke melanogeneesivastaste koostisosade eraldamiseks L. sinense risoomi ekstraktidest. Määrati aktiivseteks koostisosadeks 5-[3-(4-hüdroksü-3-metoksüfenüül)allüül]ferulhape (1) ja (3S,3aR)-neoknidiliid (8). HPLC analüüsi kohaselt moodustab ühendi 8 sisaldus 0,15 protsenti toorekstraktist. Theantimelanogenees8 aktiivsust kontrolliti nii in vitro B16-F10 rakkude kui ka in vivo sebrakala testidega. Kõik need leiud viitasid sellele, et 8 võib vähemalt anda põhjuse L. sinense'i potentsiaalile selle suure tõhususe ja koguse tõttu. . Rakkude elujõulisuse andmed B16-F10 rakkude ja NHEK kohta näitavad lihtsalt, et 8 võib potentsiaalselt välja töötada melanogeneesivastase ainena. Molekulaarse dokkimise tulemuste põhjal arvati, et 8 toimemehhanism antimelanogeneesile on türosinaasi aktiivsuse pärssimine; see aga tuleb veel kinnitada. Meie leid näitas, et ühend 8 on eksponeeritudanti-melanogeneesmõju ja ohutus in vitro, in vivo ja ex vivos uuringute kaudu, kuid depigmentatsiooni efektiivsust ja bioohutust inimese nahal tuleb tulevikus hinnata ja kinnitada kliiniliste katsetega.