Antioksüdantsete ensüümide, glutatioonperoksidaasi, tioolperoksidaasi ja katalaasi melaniini värvitustav toime

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Gyeongchan Jeon¹· Chinhan Kim²· Suurbritannia Min Cho²· Ee Taek Hwang³· Hyung Seo Hwang⁴· Jiho Min¹

Abstraktne

Melaniin on nahavärvi määramisel kõige olulisem tegur. Tehakse palju uuringuid, et lagundada nahas juba toodetud melaniiniühendeid ilu nimel. Selles uuringus uuriti kolme antioksüdandi ensüümi, glutatioonperoksidaasi (GPX), tioolperoksidaasi (TPX) ja katalaasi mõju melaniini värvuse vähendamisele lüsosomaalses fraktsioonis. Melaniini lahust töödeldi ensüümide ja vesinikperoksiidiga, seejärel lasti reageerida 48 tundi. GPX ja TPX muutsid melaniini värvituks ning nende vahel oli GPX tõhusam, kuid katalaas ei olnud efektiivne. GPX pärssis ka melaniini tootmist B16F10 melanoomirakkudes. GPX, mida leidub peaaegu kõigis mikroorganismides, mängib olulist rolli rakulises kaitsemehhanismis reaktiivsete hapnikuliikide poolt. Lisaks ei olnud see tsütotoksiline, kuid oli märkimisväärselt efektiivne melaniini värvi eemaldamisel. Seetõttu on bioloogilises ja mikrobioloogilises valdkonnas selle kasutamise võimalus nahka valgendavas kosmeetikas suur.

Märksõnad Melaniin · Glutatioonperoksidaas (GPX) · Tioolperoksidaas (TPX) · Katalaas · B16F10 · Lüsosoom

Cistanche on nahka valgendav koostisosa.

Sissejuhatus

Puhas nägu on tänapäeva inimese jaoks üks olulisi iluelemente, eriti aasialased on valgest nahast vaimustuses. Melaniiniühend on nahavärvi määramisel kõige olulisem tegur. Seda eristatakse musta või pruuni värvi eumelaniinist ja feomelaniinist, mille tulemuseks on roosa kuni punane toon [1]. Melaniini ühend sünteesitakse türosiini oksüdatsiooni teel melanotsüütide rakkudes, mida leidub epidermise basaalkihis; ja selle pigmendi peamine roll nahas on kaitsta pärisnahka, blokeerides kahjuliku ultraviolettkiirguse [2, 3]. Kui aga nahas on liiga palju melaniiniühendeid, muudab see naha tumedaks ja ebapuhtaks ning võib põhjustada hüperpigmentatsiooni, nagu melasma [4].

Nahahoolduskosmeetikaga on seotud palju uuringuid, mis neid probleeme lahendavad, kuid enamikul praegu väljatöötatud nahka valgendavatest kosmeetikatoodetest on funktsioon melaniini sünteesi pärssimiseks mitme mehhanismi kaudu, nagu näiteks türosiini oksüdatsiooni blokeerimine või UV-kiirgus, mis võib soodustada. melaniini süntees [5]. Nende toodete tõhususe saavutamiseks kulub kaua aega ja need ei ole tõhusad spetsiifiliste sümptomite, näiteks hüperpigmentatsiooni korral [6]. Praegu on tüüpiline juba valmistatud melaniini eemaldamise meetod laserravi [7]. Kui töötatakse välja materjalid, mis suudavad neid probleeme lahendada ilma selliste protseduurideta, on need bioloogilises ja kosmeetikavaldkonnas väga kasulikud.

Varasemates uuringutes püüdsime leida viisi, kuidas juba toodetud melaniiniühendeid värvi muuta. Lüsosoomi ja melaniini korrelatsiooni kohta on tehtud uuringuaruandeid. On väga tõenäoline, et diferentseeritud keratinotsüüdid lagundavad eriti väliseid melanosoome vastavalt autofagia põhifunktsioonidele, mis kontrollivad raku organellide hulka, või eemaldavad defektsed organellid, näiteks peroksisoomi [8]. Autofagiline tee tsütoplasmast lüsosoomideni mängib olulist rolli melanosoomide lagunemisel inimese epidermalkeratinotsüütides [9]. Need andmed näitavad, et lüsosoomi spetsiifilised ensüümid aitavad kaasa melaniini lagunemisele. Varem leidsime ensüümi melaniini värvust vähendavat aktiivsust lüsosomaalses fraktsioonis, kompleksis, mis sisaldab hüdrolüsaate, et lagundada jääkaineid ja rakujääke peroksisoomides ja lüsosoomides [10, 11]. Selles artiklis uuriti kolme valitud ensüümi, glutatioonperoksidaasi, tioolperoksidaasi, katalaasi, toimet lüsosomaalses fraktsioonis melaniini värvuse vähendamiseks. Need peroksidaasid kaitsevad reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) põhjustatud rakukahjustuste eest ja esinevad kõigis eukarüootides [12].

Reaktiivsed hapniku liigid (ROS) moodustuvad rakkudes normaalse hapniku metabolismi loomuliku kõrvalsaadusena ja neid võib suurendada keskkonnastress. Tugevalt genereeritud ROS võib rakke kahjustada. ROS-i kahjulikud mõjud rakule on järgmised [12, 13]: DNA või RNA kahjustus, polüküllastumata rasvhapete oksüdatsioon lipiidides, aminohapete oksüdatsioon valkudes ja spetsiifiliste ensüümide oksüdatiivne deaktiveerimine kofaktorite oksüdatsiooni teel. Rakud neutraliseerivad. ROS antioksüdatsioonisüsteemi abil, et vältida selliseid koekahjustusi. Selles süsteemis on ainevahetuse käigus tekkiv superoksiidanioon väga laastav; kuigi superoksiiddismutaas (SOD) muudab selle vesinikperoksiidiks, on vesinikperoksiid siiski reaktiivne. Vesinikperoksiid muudetakse katalaasi abil H2O-ks ja seda kasutatakse glutatioonist glutatioonist glutatioondisulfiidi (GSSG) tootmiseks GPX-i katalüüsil. TPX töötab sarnaselt GPX-ga [13].

Selles uuringus uuriti kolme antioksüdandi ensüümi, GPX, TPX ja katalaasi melaniini värvitustavat toimet. Selle tulemusena vähendasid GPX ja TPX tõhusalt melaniini värvi. Nende hulgas ei olnud GPX-l tsütotoksilisust melaniini värvitustava toime optimaalse kontsentratsiooni juures ja see inhibeeris tõhusalt melaniini sünteesi. Seetõttu annab see tõendeid selle kohta, et GPX mängib olulist rolli lüsosomaalse fraktsiooni melaniini värvitustamise mehhanismis, mitte ainult antioksüdantset aktiivsust, ja pakub ühe ensüümina uue valgendava kosmeetilise aine potentsiaali.

Materjalid ja meetodid

Peroksidaaside ja peroksidaasi aktiivsuse test

Kolme peroksidaasi (glutatioonperoksidaasi, tioolperoksidaasi ja katalaas) kontsentratsioon määrati testikomplektiga (Peroxidase assay kit, D2PD-100, QuantiChromTM), mis osteti ettevõttest Bioassay Systems. Glutatioonperoksidaas 2 (GPX2, NBP1-78,824, Novus) ja tioolperoksidaas (TPX,NBP1-78,805, Novus) osteti ettevõttelt Novus ja Catalase (9001-05-2, Sigma-Aldrich) ) osteti firmalt Sigma-Aldrich.

Selles testikomplektis kasutatakse H2O2 ja elektronidoonorvärvi, mis moodustab peroksidaasi käigus resorufiini. Analüüs viidi läbi toatemperatuuril (RT) ja värvi intensiivsust mõõdeti lainepikkusel 57{3}} nm. Peroksidaasidel lasti toatemperatuuril 10 minutit reageerida elektronidoonorvärviga 0,6% vesinikperoksiidiga. Pärast reaktsiooni lisati stoppreaktiiv ja proovi neeldumine mõõdeti mikroplaadi spektrofotomeetria abil. Tegevus arvutati järgmiselt:

Peroksidaasi aktiivsus=RSAMPLE −RBLANK × [Resorufiin](𝜇M) × Reaktsiooni maht(𝜇L)RRESORUFIN −RH2 O t(min) Proovi maht(𝜇L)

(U/L). Üks ühik (U) ensüümi katalüüsib analüüsitingimustes 1 μmooli resorufiini teket minutis. Siin on RSAMPLE, RBLANK, RRESORUFIN ja RH2O vastavalt proovi, proovi tooriku, resorufiini ja vee neeldumine; ja n on proovi lahjendustegur. Selle testi [Resorufin] väärtus on 50 µM. Reaktsiooni maht on 100 μL ja proovi maht selles uuringus on 10 μL.

Melaniini värvitustamine glutatioonperoksidaasi (GPX), tioolperoksidaasi (TPX) ja katalaasi poolt

Melaniini lahus sisaldab {{0}},1 mM PBS-i (fosfaatpuhverdatud soolalahus, pH: 7,0) ja melaniinipulbrit (Synthetic, Sigma), mis valmistati türosiini oksüdeerimisel vesinikperoksiidiga. Melaniinisisaldust mõõdeti neeldumise järgi 450 nm juures. Melaniini kontsentratsiooni määramiseks valmistati standardkõver sünteetilise melaniini autentsest standardist (R2=0.999, andmeid pole näidatud).

Melaniini värvimuutuse kontrollimiseks reageeriti toatemperatuuril 100 ppm melaniinilahust, mis sisaldas (50 kuni 1000) μU/L peroksidaase (GPX, TPX, katalaas) 1 mM vesinikperoksiidiga, ja seda mõõdeti iga päev. Melaniini värvitustamise väärtus määrati, lahutades algväärtusest reaktsioonijärgse melaniini kontsentratsiooni.

Cistanche pärsib melaniini sünteesi.

Rakukultuur

B16F10 hiirte melanoomirakud (KCLB 80008) osteti Korea rakuliini pangast (KCLB, Seoul, Korea). Rakke kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM), mis sisaldas 4500 mg/l glükoosi, 4 mM l-glutamiini, 1 mM naatriumpüruvaati, millele lisati 10 protsenti veiseloote seerumit (FBS), 20 mM HEPES-i, 1 protsenti penitsilliini, ja rakke inkubeeriti 37 kraadi juures niisutatud tingimustes, mis sisaldas 5 protsenti CO2. Söödet vahetati iga 2 päeva järel (d) ja rakud koguti trüpsiini/EDTA lahuse abil.

Rakkude elujõulisuse test (MTT test)

Glutatioonperoksidaasi toksilist toimet B16F10 melanoomirakkudele kinnitas MTT-test, üldmeetod, mida kasutatakse proovi mõju määramiseks kleepunud raku elujõulisusele. Selles analüüsis kasutatakse 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiidi (MTT), mida saab mitokondrite abil redutseerida formataaniks ensüüm elujõulises rakus. 3 × 103 rakku külvati süvendi 96-plaadi süvendisse ja inkubeeriti 24 tundi. Seejärel lisati igasse süvendisse proov ja inkubeeriti 72 tundi. Pärast seda vahetati sööde 0,5 mg/ml MTT-d sisaldava vastu ja inkubeeriti 2 tundi. Järgmisena eemaldati MTT värvaine reaktiiv ja tekkinud formazaan lahustati DMSO-s 30 minutit. Lõpuks mõõdeti formasaani kontsentratsioonid lainepikkusel 570 nm, kasutades mikroplaadi spektrofotomeetriat. Rakkude elujõulisus arvutati järgmiselt: rakkude elujõulisus (protsent)=(proov – tühi)/(Akontroll – tühi)*100.

cistanche hindi keeles

Melaniini sisalduse analüüs

3 × 105 B16F10 rakku külvati süvendi kohta 6-süvendiga plaadile ja inkubeeriti 24 tundi, et kleepuda. Iga süvendi sööde vahetati sööde, mis sisaldas erinevat kontsentratsiooni ensüümi ja 10 nM -MSH, seejärel inkubeeriti 72 tundi. Pärast seda pesti kõiki süvendeid DPBS puhvriga ja koguti 0,5% trüpsiini/EDTA lahuse abil. Tsentrifuugimisega saadud rakupelleteid lüüsiti 200 µl 1 N NaOH-ga, mis sisaldas 10 protsenti DMSO-d, 1 tund 80 kraadi juures. Lõpuks mõõdeti lüüsitud melaniini sisaldust neeldumise järgi 450 nm juures. Ensüümi melaniini tootmise inhibeerimise efektiivsus määrati positiivse kontrolliga võrreldes, kasutades 100 mg/ml arbutiini.

Tulemused

Glutatioonperoksidaasi (GPX), tioolperoksidaasi (TPX) ja katalaasi peroksidaasi aktiivsus

See uuring on laiendusuuring lüsosomaalse fraktsiooniga töötlemise rakendamisest melaniiniühendite värvitustamiseks in vitro ja in vivo. Eelmises uuringus leidsime, et Hela rakkudest, S. cerevisiae, kanamunast eraldatud lüsosomaalne fraktsioon vähendab melaniini värvust jamelaniini värvitustamise efektiivsust seostati lüsosomaalse fraktsiooni membraaniga mitteseotud mikrosomaalse fraktsiooni, sealhulgas lüsosoomide ja peroksisoomide peroksidaasi aktiivsusega. Peroksidaaside melaniini värvust vähendava toime kinnitamiseks valiti kolm peroksidaasi: glutatioonperoksüdaas (GPX), tioolperoksüdaas (TPX) ja katalaas. Need ensüümid mängivad olulist rolli rakkudes reaktiivsete hapnikuliikide põhjustatud oksüdatiivse stressi vähendamisel [14].

Nende ensüümide aktiivsus määrati analüüsikomplektiga (Peroxidase assay kit, D2PD-100, QuantiChrom™). See meetod põhines elektronidoonorvärvi oksüdatsioonil, mis moodustab peroksüdaasi reaktsiooni käigus roosa värvi [15]. Peroksidaasi aktiivsust väljendati järgmiste ühikute abil: 1 ühik=1 U=1 µmooli resorufiini moodustumine minutis analüüsitingimustes. Tabelis 1 on kokku võetud kolme peroksidaasi, GPX, TPX ja katalaasi aktiivsus ja kontsentratsioon.

Glutatioonperoksidaasi (GPX), tioolperoksidaasi (TPX) ja katalaasi melaniini värvitustamise aktiivsus

Peroksüdaaside melaniini värvitustamise efekti kinnitamiseks töödeldi 100 ppm melaniini lahust 1 mM vesinikperoksiidiga ja iga peroksidaasi kontsentratsiooniga (50 kuni 1000) µU/L. Proovidel reageeriti 2 päeva toatemperatuuril, seejärel võrreldi esialgse kontsentratsiooniga. Joonis 1 näitab melaniini vähenemist 48 tunni pärast. Joonisel 1 on näidatud tõendid selle kohta, et TPX-l ja GPX-il on melaniini värvitustamise aktiivsus. Katalaas ei mõjutanud melaniini värvust (joonis 1a). TPX oli efektiivne melaniiniühendite värvitustamisel ja tõhusus oli parim, kui seda töödeldi kontsentratsiooniga 1 µU/mL (joonis 1b). GPX-l oli ka melaniini värvust vähendav aktiivsus, mis oli parim kontsentratsioonil 0,2 µU/ml ja vähenes järk-järgult kõrgemate kontsentratsioonide korral (joonis 1c). See väärtus näitab 175 protsenti paremat melaniini värvi vähenemist, võrreldes ainult vesinikperoksiidiga töödeldud kontrolliga. GPX oli kontsentratsiooni ja peroksidaasi aktiivsuse osas tõhusam kui TPX. 0,2 µU/mL GPX ja 1 mM vesinikperoksiidi töötleminemelaniini lahus kaotas värvi 13 protsenti 100 ppm melaniinist 4 päeva jooksul (joonis 1).2). Kuid ei GPX ega TPX ei näidanud vesinikperoksiidi puudumisel värvi vähendamise efekti (andmeid pole näidatud).

Tabel 1 Spetsiifilised andmed ensüümide, glutatioonperoksidaasi 2, tioolperoksidaasi ja katalaasi kohta

Glutatioonperoksidaasi (GPX) ja H2O2 mõju B16F10 rakkude elujõulisusele

GPX mõju B16F10 melanoomirakkude elujõulisusele kinnitati MTT testiga enne melaniini sünteesi inhibeerimise testi. Ravimiseks sobiva vesinikperoksiidi kontsentratsiooni leidmiseks hinnati tsütotoksilisust 72 tunni jooksul erinevatel kontsentratsioonidel vesinikperoksiidiga töötlemisel. Kontsentratsioonil 0,1 mM ei olnud H2O2 rakkudele toksilisust 72 tunni jooksul, samas kui kontsentratsioonil üle 1 mM täheldati suurt toksilisust. (joonis 3a). Seejärel hinnati GPX-i mõju rakkude ellujäämisele 0,1 mM vesinikperoksiidi juuresolekul, mis ei olnud tsütotoksiline. GPX ei avaldanud tsütotoksilisust B16F10 rakkudele alla kontsentratsiooni 0,5 μU/ml, mis oli efektiivne melaniini värvimuutuse uuringutes (joonis 3b).

Joonis 1Suhteline melaniini värvuse vähenemine võrreldes ainult vesinikperoksiidi töötlemisega.

Glutatioonperoksidaasi (GPX) ja H2O2 mõju melaniini sünteesile B16F10 melanoomirakkudes

Uurisime GPX-i, mis oli kõige tõhusam melaniini värvitustamisel, mõju melaniini sünteesile melanotsüütides. Joonisel 4 on näidatud melaniini sisaldus B16F10melanoomirakkudes, mida töödeldi iga prooviga 72 tundi. Ravi 0,05 μU/mL GPX-ga ja 0,1 mM H2O2-ga indutseeris melanogeneesi enim 43% pärssimise võrreldes kontrolliga (ainult ravi -MSH-ga). See oli 153 protsenti kõrgem kui positiivne kontroll (ravi arbutiini ja -MSH-ga) ja 22 protsenti kõrgem kui vesinikperoksiidi puhul ilma ensüümita, samas kui GPX-i ravi ei näidanud melaniini dramaatilist vähenemist vesinikperoksiidi puudumisel, toetab ka seda seisukohta. (andmeid pole näidatud). Selle tulemusena pärssis GPX melaniiniühendite tootmist, kuid melaniini sünteesi rakkudes mõjutas rohkem GPX vesinikperoksidetaan.

Arutelu

Selles uuringus leidsid meie teadlased rakkudes oksüdatiivset stressi vähendavate antioksüdantsete ensüümide GPX, TPX ja katalaasi optimaalse kontsentratsiooni ja mõju melaniiniühendite värvitustamisele. Sünteesitud melaniiniühendeid kasutavate ekstratsellulaarsete katsete tulemusena on GPX-l ja TPX-l melaniini värvitustav toime, Catalasedoes aga mitte. On teateid, et mõnede seente ligniini lagundavad ensüümid, nagu lakkaas, ligniini peroksidaas, võivad melaniini lagundada vesinikperoksiidi juuresolekul [16–18]. Selle uuringuga kinnitati, et antioksüdantsüümid, mida leidub kõigis eukarüootides ja ei ole ligniini lagundavad ensüümid, neil on melaniini värvitustav toime. Kuigi GPX ja TPX võivad samuti vähendada melaniini värvi vesinikperoksiidi juuresolekul, on neil ensüümidel võimalus toimida lüsosomaalse fraktsiooni melaniini värvitustamise mehhanismi peamise komponendina.

GPX-i, mis oli kõige tõhusam melaniini värvi vähendamiseks in vitro, töödeldi B16F10 melanoomirakkudega, et määrata selle mõju melaniini sünteesile. B16F10 melanoomirakkudes ei olnud GPX tsütotoksiline kontsentratsioonides, mis olid efektiivsed melaniiniühendite värvitustamisel, ja koos töödeldud vesinikperoksiidi kontsentratsioon oli 0,1 mM, ilma toksilisuseta. Vesinikperoksiidi töötlemine pärssis oluliselt melaniini sünteesi ja GPX-ga töötades oli efektiivsus parem, samas puudus ravimi kontsentratsioonist sõltuvus. Kuna vesinikperoksiidi tarbivad ensüümid kiiresti, võib tõlgendada, et mida kõrgem on töödeldava ensüümi kontsentratsioon, seda vähem pärsib vesinikperoksiid melaniini sünteesi. Seda seisukohta toetab ka asjaolu, et GPX-i ravi ei näidanud melaniini dramaatilist vähenemist vesinikperoksiidi puudumisel (andmeid pole näidatud). Selle tulemusena pärssis GPX melaniiniühendite tootmist, kuid melaniini sünteesi rakkudes mõjutas rohkem GPX vesinikperoksidetaan. Need tulemused viitavad sellele, et antioksüdantsed ensüümid indutseerivad melanosoome seedivates autofagia mehhanismides.

cistanche tabletid

Lisateabe saamiseks klõpsake siin.

Järeldus

Meie uuring näitab, et glutatioonperoksüdaas (GPX) ja tioolperoksüdaas (TPX) aitavad kaasa melaniini värvimuutusele ja GPX inhibeeris tõhusalt melaniini sünteesi. Tulemused toetavad hüpoteesi, et antioksüdantsed ensüümid indutseerivad melanosoome seedivates autofagia mehhanismides degradatsiooni. Kindla järelduse tegemiseks võib olla vajalik uuring melanosoomi seedimise mehhanismi kohta naharakkudes, keratinotsüütides ja melanotsüütides.