Abstraktne

EesmärkUurida Cistanche fenüületanoolglükosiidide (CPhG) mehhanismi kaasasündinud immuunfunktsiooni, kasvaja kasvu ja kasvajarakkude apoptoosi kohta karvututel hiirtel, kellel on ravimiresistentne osteosarkoom.meetodidInimese osteosarkoomi MG-63 ravimiresistentne rakuliin loodi gradiendi kontsentreerimise meetodil ja konstrueeriti ravimresistentse osteosarkoomi karvutute hiirte mudel (kokku 36 hiirt, 6 rühma kohta). Mudelrühmale anti sondiga tavalist soolalahust; metotreksaadi (MTX) rühmale manustati intraperitoneaalselt MTX-i (20 mg/kg) iga kolme päeva järel; kombineeritud rühmale manustati intraperitoneaalselt MTX-i iga kolme päeva järel koos igapäevase sondiga keskmise annusega CPhG-dega (250 mg/kg); kõrge, keskmise ja väikese doosiga CPhG-de rühmadele manustati iga päev CPhG-sid vastavalt kõrgete (500 mg/kg), keskmiste (250 mg/kg) ja väikeste (125 mg/kg) annustega. Täheldati karvutute hiirte kasvaja suuruse muutusi, joonistati kasvaja keskmise mahu kõverad ajas ja arvutati kasvaja inhibeerimise määr; seerumi IL-2 ja TNF-tasemed karvututel hiirtel tuvastati ELISA abil; kasvajarakkude apoptoosi mõõdeti voolutsütomeetria abil; Western blot meetodit kasutati apoptoosiga seotud valkude Bcl-2, Bax ekspressiooni ja p-AKT, p-mTOR, p-PI3K ekspressiooni tuvastamiseks kasvaja kudedes.TulemusedVõrreldes mudelrühmaga vähenes kasvaja maht ja kaal kõigis ravirühmades oluliselt (P < 0,001); võrreldes mudelrühma ja MTX rühmaga suurenesid seerumi IL-2 ja TNF-tasemed karvutute hiirte puhul kõigis CPhG-rühmades ja kombinatsioonrühmas oluliselt (P < 0,01); võrreldes mudelrühmaga oli Baxi ekspressioon kõigis ravirühmades oluliselt ülesreguleeritud (P < 0,001) ning Bcl-2 ekspressioon suure ja keskmise annusega CPhG-de rühmas ja kombinatsioonirühmas oluliselt allareguleeritud (P < 0,001); võrreldes mudelrühma ja MTX rühmaga suurenes tuumori apoptoosi määr kõigi CPhG-rühmade ja kombineeritud rühma karvututel hiirtel märkimisväärselt, samas kui p-AKT, p-mTOR ja p-PI3K tasemed olid oluliselt langenud (P <0, 05).JäreldusCPhG-d võivad märkimisväärselt parandada immuunfunktsiooni karvututel hiirtel, kellel on ravimiresistentne osteosarkoomi, ja soodustada kasvajarakkude apoptoosi, reguleerides PI3K / AKT / mTOR signaalirada ning Bax ja Bcl-2 apoptootiliste valkude ekspressiooni, inhibeerides seeläbi tõhusalt kasvaja kasvu.

Võtmesõnadosteosarkoom;Cistanche fenüületanoolglükosiidid; MG-63; kasvajarakud; apoptoos; toimemehhanism; PI3K/AKT/mTOR signaalirada

 

CISTANCHE TUBULOSA EELISED

 

 

 

 

 

 

Osteosarkoom (OS)on väga pahaloomuline primaarne luukasvaja, mille esinemissagedus on kõrgeim noorukite primaarsete pahaloomuliste luukasvajate hulgas, millega kaasneb äärmiselt kõrge puude ja suremus. Praegu võib suurtes annustes metotreksaat (MTX) üksi või koos teiste kemoterapeutiliste ainetega pärast operatsiooni tõhusalt parandada OS-i patsientide ellujäämise määra [1]. Mõned OS-i patsiendid on aga ravimiresistentsuse tõttu keemiaravi suhtes tundlikud, mis põhjustab kasvaja progresseerumist. Lisaks on kasvajapatsientide T-lümfotsüütide alamrühmad sageli immuunsüsteemi tasakaalustamatuse seisundis ja keemiaravi võib lühiajaliselt veelgi süvendada immuunhäireid ja immuunsupressiooni [2]. Uuringud on näidanud, et inimese immuunvastuse tugevdamine võib OS-i bioloogiliste omaduste vaatenurgast parandada OS-i patsientide prognoosi [3]. Keemiaravi resistentsus on üks levinumaid ja lahendamatumaid probleeme, mis põhjustab OS-i patsientide ravi ebaõnnestumist ning immunosupressioon on samuti üks võtmetegureid, mis põhjustab kasvaja kiiret progresseerumist [4].

Rapamütsiini (mTOR) signaaliraja fosfatidüülinositool-3-kinaasi (PI3K) / proteiinkinaasi B (AKT) / imetajate sihtmärki peetakse inimese vähkkasvajate üheks kõige olulisemaks onkogeenseks rajaks. See rada on OS-is sageli üleaktiveeritud, mis võib põhjustada OS-i rakkude proliferatsiooni, invasiooni, metastaase ja angiogeneesi, inhibeerida apoptoosi ja viia veelgi OS-i resistentsuseni kemoterapeutiliste ravimite suhtes [5]. Uuringud on kinnitanud, et Cistanche fenüületanoolglükosiidid (CPhG-d), mis onCistanche deserticola, võib suurendada immuunfunktsiooni ja pärssida kasvaja kasvu hepatoomi kandvatel hiirtel [6].In vitrouuringud on näidanud, et CPhG-d võivad märkimisväärselt pärssida HepG2 hepatoomirakkude proliferatsiooni ja indutseerida nende apoptoosi [7]. Rakkude apoptoosi esilekutsumine on praeguste kasvajavastaste ravimite peamine mehhanism ja viimaste aastate OS-ravi uurimistöö koht. Nude hiirtel on anatoomias, füsioloogias ja bioloogias palju sarnasusi inimestega ning neil on siirdatud kasvajate puhul kõrge vastuvõetavus, mis võimaldab teatud heteroloogsete kasvajarakkude ksenotransplantatsiooni, mistõttu kasutatakse neid laialdaselt kasvajamudelite loomisel [8–9]. Selle uuringu eesmärk on konstrueerida ravimresistentse osteosarkoomi alasti hiiremudel, vaadelda CPhG-de mõju immuunfunktsioonile ja PI3K/AKT/mTOR rajale selles mudelis, samuti selle inhibeerivat toimet kasvaja kasvule ja farmakoloogilisele mehhanismile, et pakkuda viiteid kliinilise ravi ideede laiendamiseks ja operatsioonisüsteemi alusuuringuteks.

 

CISTANCHE TUBULOSA EELISED luude kasvule

 

MÜÜA CISTANŠ

Wecistanche'i tugiteenus - Hiina suurim tsistanšeksportija:
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/Tel:+86 15292862950

 

 

1 Materjalid ja meetodid

1.1 Katseloomad

Kolmkümmend kuus SPF-klassi karvutu hiirt (6–8 nädala vanused, kaaluga 19–25 g) osteti ettevõttelt Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd. loomasertifikaadiga nr 202367524. Selle katse kiitis heaks Loode-Minzu ülikooli laboratoorsete loomade eetikakomitee (Xbmu-3m-202306).

1.2 rakuliin

MG-63 rakku osteti Shanghais asuvast Hiina Teaduste Akadeemia rakupangast.

1.3 Ravimid ja reaktiivid

Veise loote seerum, kõrge glükoosisisaldusega DMEM sööde, 0,25% trüpsiin-EDTA, MTX (Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd., partii numbrid vastavalt PWL001, MA0212, MA0233-1, MB1156-1); CPhG-d (Shaanxi Senyuan Biotechnology Co., Ltd., partii number SY20231212605); anti-p-mTOR antikeha, anti-p-PI3K antikeha, anti-p-AKT antikeha, anti-Bcl-2 antikeha, anti-Bax antikeha (Hangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd., partii numbrid HA600094, HA721673, ET1607-73, ET1607-73, ET1702-03-3, ET1702-03-3, ET1702-03); ELISA komplektid TNF- ja IL-2 jaoks (Hangzhou Lianke Biotechnology Co., Ltd., partiinumbrid vastavalt EK282, EK202).

1.4 Instrumendid

CT14RD lauaarvuti kiire jahutustsentrifuug (Shanghai Tianmei Biochemical Instrument Co., Ltd.); SW-CJ-1FD puhas pink (Suzhou Purification Co., Ltd.); CO-5AC rakuinkubaator (Sanyo, Jaapan); AE31 pöördfluorestsentsmikroskoop (Xiamen Motic Industrial Group Co., Ltd.); RT-6100 mikroplaadi lugeja (Shenzhen Rayto Life Sciences Co., Ltd.); PowerPoc geelelektroforeesi süsteem, ChemiDoc™ geelkujutise analüsaator (Bio-Rad, USA).

 

1.5 Katsemeetodid

1.5.1 Inimese osteosarkoomi MG-63 ravimiresistentse rakuliini (MG-63/MTX) loomine

MG-63 rakku kultiveeriti logaritmilise kasvufaasini 80% rakkude konfluentsusega. Lisati eelnevalt ettevalmistatud rakukultuuri sööde, mis sisaldas 100 ng/ml MTX, ja söödet vahetati 48 tunni pärast. Kui rakud saavutasid uuesti 80% konfluentsuse, lisati sama kontsentratsiooniga MTX-i sisaldav sööde. Ülaltoodud samme korrati, et võimaldada MG-63 osteosarkoomirakkudel stabiilselt kasvada söötmes, mis sisaldas 100 ng/ml MTX. Seejärel suurendati MTX kontsentratsiooni söötmes järk-järgult samal meetodil, kasutades järjestikku 200 ng/mL, 500 ng/mL, 1000 ng/mL, 2000 ng/mL, 5000 ng/ml ja 10000 ng/mL. Pärast 5-kuulist kultiveerimist valiti järgmisteks katseteks osteosarkoomi ravimiresistentne rakuliin (MG-63/MTX), mis kasvas stabiilselt 10 000 ng/ml MTX-s.

 

 

1.5.2 Ravimiresistentset osteosarkoomi kandva alasti hiire mudeli loomine

Osteosarkoomi loommudel loodi kirjandusele tuginedes [10]. MG-63/MTX rakud valmistati rakususpensiooniks 4 × 10⁶/100 μL ja 100 μL süstiti subkutaanselt karvutute hiirte kaenlaalust, et jälgida kasvaja moodustumist.

1.5.3 Loomade rühmitamine ja sekkumine

Kasvajat kandvad karvuti hiired jaotati juhuslikult mudelrühma, MTX rühma, MTX kombineeritud CPhG-dega (MTX-CPhG) rühma, suure annusega CPhG-de (CPhGs-H) rühma, keskmise annusega CPhG-de (CPhGs-M) rühma ja väikese annusega CPhG-de (CPhGs-L) rühma, igas rühmas, kus on 6 hiirt. Sondiga alustati 6. päeval pärast modelleerimist. Mudelrühma hiirtele anti iga päev sondiga 10 μL/g tavalist soolalahust; MTX rühm sai intraperitoneaalselt 20 mg/kg MTX iga kolme päeva järel; MTX-CPhG-de rühm sai igapäevaselt sondiga 250 mg/kg CPhG-sid koos intraperitoneaalse süstiga 20 mg/kg MTX iga kolme päeva järel; CPhGs-H rühm sai igapäevaselt sondiga 500 mg/kg CPhG-sid; CPhGs-M rühm sai igapäevaselt sondiga 250 mg/kg CPhG-sid; CPhGs-L rühm sai igapäevaselt sondiga 125 mg/kg CPhG-sid. Kõiki karvutuid hiiri raviti pidevalt 15 päeva.

1.5.4 Kasvaja mahu ja kaalu mõõtmine ravimiresistentse osteosarkoomiga karvututel hiirtel

Igas rühmas vaadeldi ja registreeriti karvutute hiirte kasvaja mahtu ning joonistati kasvaja kasvukõverad. Kakskümmend neli tundi pärast viimast manustamist surmati hiired emakakaela dislokatsiooniga, kasvajad lõigati lahti ja kaaluti ning arvutati kasvaja inhibeerimise määr. Valemid on järgmised: Kasvaja maht=1/2 (pikk kasvaja läbimõõt × kasvaja lühike diameeter²) Kasvaja inhibeerimise määr=[(mudelrühma keskmine kasvaja kaal – ravirühma keskmine kasvaja kaal) / mudelrühma keskmine kasvaja kaal] × 100%

1.5.5 Seerumi IL-2 ja TNF-taseme tuvastamine ELISA abil

Iga rühma karvututelt hiirtelt ekstraheeriti seerum ning seerumi IL-2 ja TNF-tasemed tuvastati ELISA abil vastavalt tootja juhistele.

1.5.6 Kasvajarakkude apoptoosi tuvastamine voolutsütomeetria abil

Iga rühma kasvajakoed hakiti, jahvatati, filtreeriti, tsentrifuugiti ja punaseid vereliblesid lüüsiti, et valmistada üherakulisi suspensioone tsentrifuugitorudes. Rakkude kontsentratsioon reguleeriti väärtusele 1 × 106/ml, rakud resuspendeeriti 100 μL sidumispuhvris, lisati 5 μL AV-FITC ja PI, inkubeeriti pimedas 15 minutit, tsentrifuugiti, resuspendeeriti ja lisati 400 μL sidumispuhvrit. Pärast segamist tuvastati proovid voolutsütomeetria abil.

1.5.7 p-AKT, p-mTOR, p-PI3K ja apoptootiliste valkude Bcl-2, Bax tuvastamine Western blot meetodil

Iga rühma kasvajakoed peenestatakse ja pandi homogenisaatorisse, lüüsiti valgu lüüsipuhvriga ja homogeniseeriti. Pärast lüüsimist koguti supernatant tsentrifuugimisega kiirusel 12000 p/min. Elektroforeetiline geel valmistati valkude eraldamiseks, millele järgnes membraani ülekanne ja blokeerimine. Membraane inkubeeriti primaarsete antikehadega temperatuuril 4 kraadi üleöö, pesti ja inkubeeriti sekundaarsete antikehadega toatemperatuuril 1 tund. Pärast loksutil TBST puhvriga pesemist lisati arendamiseks ECL luminestsentslahust. Pärast fikseerimist viidi läbi geeli kujutise analüüs ja valguribade halli väärtusi analüüsiti Image J tarkvara abil.

1.6 Statistiline analüüs

Statistiline analüüs viidi läbi GraphPad Prism 7 ja SPSS 25.0 tarkvara abil. Mõõtmisandmed väljendati kui keskmine ± standardhälve (x ± s). Normaaljaotuse ja homogeense dispersiooniga rühmade võrdlemiseks kasutati ühesuunalist ANOVA-d ning mittenormaalse jaotuse andmete jaoks mitteparameetrilist testi. Kasvaja inhibeerimise määra analüüsimiseks kasutati paaris t-testi. P < 0,05 loeti statistiliselt oluliseks.

 

 

Joonis 1. MG-63 ja MG-63/MTX rakkude morfoloogiline võrdlus (×200)

2 tulemust

2.1 Osteosarkoomi MG-63 ravimiresistentne rakuliin (MG-63/MTX)

Algsed MG-63 rakud kasvasid kleepuvalt keskmise suurusega, enamasti spindlikujulised, mõnikord ebakorrapärased, suurte tuumade ja selgete tuumadega (joonis 1-A). MG-63/MTX rakud olid piklikud, spindlid või ebakorrapärased, ilmse pseudopoodiumiga (joonis 1-B).

2.2 Kasvaja kasvu võrdlus iga rühma hiirtel

Alates 6. sondimispäevast oli kasvaja maht ravirühmades oluliselt väiksem kui mudelrühmas. 21. päeval sondiga võrreldi igas rühmas kolme karvutu hiire kasvajaid (joonis 2-A). Kasvaja maht kõigis ravirühmades oli väiksem kui mudelrühmas (P < 0,001). Kasvaja maht CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L ja MTX-CPhGs rühmades oli väiksem kui MTX rühmas (P < 0,001). CPhG-rühmade hulgas vähenes kasvaja maht järk-järgult ravimi kontsentratsiooni suurenemisega ja erinevus mudelirühmast muutus olulisemaks (joonis 2-B). Tulemused näitasid, et CPhG-d võivad oluliselt pärssida kasvaja kasvu ravimiresistentsetel kasvajat kandvatel hiirtel ja inhibeeriv toime oli positiivses korrelatsioonis CPhG-de kontsentratsiooniga.

Võrreldes mudelrühmaga vähenes keskmine kasvaja kaal MTX, CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L ja MTX-CPhGs rühmades oluliselt (P < 0,001). Võrreldes MTX rühmaga suurenes kasvaja inhibeerimise määr CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L ja MTX-CPhGs rühmades oluliselt ning CPhGs-H, CPhGs-M ja CPhGs-L rühmades suurenes kasvaja inhibeerimise määr annusest sõltuval viisil ravimi kontsentratsiooni suurenemisega (tabeldatav).

2.3 CPhG-de mõju seerumi IL-2 ja TNF-i tasemele ravimresistentsetel kasvajat kandvatel karvututel hiirtel

Võrreldes mudelrühmaga tõusis seerumi TNF-i tase MTX-rühmas oluliselt (P <0,05) ning seerumi TNF- ja IL-2-tase MTX-CPhG-de rühmas (P <0,01). Lisaks oli seerumi TNF- tase CPhGs-H, CPhGs-M ja CPhGs-L rühmades oluliselt kõrgem kui mudelrühmas (P < 0,001), seerumi IL-2 tase CPhGs-M rühmas tõusis (P < 0,01) ja seerumi IL-2 tase tõusis CPhGs-H rühmades oluliselt (ChCPhs-P ja

 

Joonis 2. Tuumori mahtude võrdlus karvutute hiirte kasvajatega igas rühmas pärast sekkumist (x ± s, n=3, mm3)

Märkus: Mudelirühm; MTX rühm; CPhGs-L rühm; väikeses annuses Cistanche deserticola fenüületanooli koguglükosiidide rühm; CPhGs-M rühm; keskmise annusega Cistanche deserticola fenüületanooli koguglükosiidide rühm; CPhGs-H rühm; suurtes annustes Cistanche deserticola fenüületanooli koguglükosiidide rühm; MTX-CPhGs rühm; võrreldes mudelirühmaga, ***P<0.001; compared with the MTX group, ###P<0.001

Tabel 1. Cistanche fenüületanoidglükosiidide mõju kasvaja kaalule kasvajaga karvututel hiirtel (n=3)

Grupp	Kasvaja keskmine kaal (g)	Inhibeerimise määr (%)
Mudel	0.79 ± 0.04	-
MTX	0.49 ± 0.03	35.73 ± 4.61
CPhGs-L	0.33 ± 0.01	58.55 ± 4.02
CPhGs-M	0.31 ± 0.02	60.50 ± 0.98
CPhGs-H	0.28 ± 0.01	64.58 ± 1.77
MTX-CPhG-d	0.18 ± 0.01	75.77 ± 1.78

*Märkus. Grupil "Mudel" ei ole allikatabelis näidatud pärssimise määra (näidatud kui kriips). Soovi korral võin lisada ka olulisuse markerid (nt *, ## jne) allmärkustena täpselt nagu joonisel.

2.4 CPhG-de mõju kasvajarakkude apoptoosile ravimiresistentsetel kasvajat kandvatel karvututel hiirtel

Võrreldes mudelrühmaga suurenes kasvaja apoptoosi määr MTX ja CPhGs-L rühmades oluliselt (P <0,05) ning CPhGs-H, CPhGs-M ja MTX-CPhGs rühmades oluliselt (P <0,001). Võrreldes MTX rühmaga suurenes kasvaja apoptoosi määr CPhGs-H, CPhGs-M ja MTX-CPhGs rühmades (P < 0,001) (joonis 3, tabel 3). Ülaltoodud tulemused näitavad, et CPhG-d võivad soodustada kasvajarakkude apoptoosi ravimiresistentsetel kasvajat kandvatel karvututel hiirtel.

2.5 CPhG-de mõju p-AKT, p-mTOR ja p-PI3K ekspressioonile ravimiresistentsete kasvajat kandvate karvutute hiirte kasvajakudedes

Võrreldes mudelrühmaga vähenes p-AKT ekspressioon ravimiresistentsete karvutute hiirte kasvajakudedes MTX rühmas oluliselt (P < 0,001). P-AKT, p-mTOR ja p-PI3K ekspressioonitasemed karvutute hiirte kasvajakudedes MTX-CPhGs, CPhGs-H ja CPhGs-M rühmades olid oluliselt langenud (P < 0,001), p-AKT ekspressioon CPhGs-L rühmas vähenes oluliselt (P < 0,01 ekspressioon ja p-3 mKTOR vähenes) ja p-3 rohkem 0,001). Võrreldes MTX rühmaga olid ka p-AKT, p-mTOR ja p-PI3K ekspressioonitasemed karvutute hiirte kasvajakudedes MTX-CPhGs ja CPhGs-H rühmades oluliselt langenud (P < 0,001), p-AKT ekspressioon CPhGs-M rühmas oli oluliselt vähenenud (p < 0,05 ekspressiooni pPIK ja p-p-) 0,001), p-AKT ekspressioon CPhGs-L rühmas vähenes (P < 0,01) ning p-mTOR ja p-PI3K ekspressioon vähenes oluliselt (P < 0,001) (joonis 4-A kuni 4-D).

 

Tabel 2. Seerumi TNF- ja IL-2 ekspressioonitasemed igas rühmas (n=3)

Grupp	TNF- (pg/ml)	IL-2 (pg/ml)
Mudel	79.90 ± 3.60	28.36 ± 2.35
MTX	93.71 ± 2.86*	28.87 ± 1.60
MTX-CPhG-d	118.00 ± 3.78***###	40.92 ± 1.54***###
CPhGs-H	122.76 ± 2.97***###	45.03 ± 4.95***###
CPhGs-M	117.52 ± 3.60***###	41.44 ± 3.87***###
CPhGs-L	124.19 ± 8.37***###	44.77 ± 2.31***###

 

Märkused (nagu on näidatud joonisel):Mudel=mudelirühm; MTX=metotreksaadi rühm; CPhGs–L/M/H=madala/keskmise/suure annusega Cistanche fenüületanoidglükosiidide rühm; MTX-CPhGs=kombinatsioonirühm. Olulisus vs. mudel: * P<0.05P<0.05P<0.05, ** P<0.01P<0.01P<0.01, *** P<0.001P<0.001P<0.001. Significance vs. MTX: ### P<0.001P<0.001P<0.001.

2.6 CPhG-de mõju Bcl-2 ja Baxi ekspressioonile ravimiresistentsete kasvajat kandvate karvutute hiirte kasvajakudedes

Võrreldes mudelrühmaga suurenes Baxi ekspressioon ravimiresistentsete karvutute hiirte kasvajakudedes kõigis ravirühmades märkimisväärselt (P < 0,001), Bcl-2 ekspressioon MTX rühmas suurenes (P < 0,05) ja Bcl-2 ekspressioon MTX-CPhG-de, CPhGs-H ja CPhGs-M rühmades oli oluliselt vähenenud (0,0 P1). Võrreldes MTX rühmaga vähenes Bcl-2 ekspressioon CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L ja MTX-CPhGs rühmade kasvajakudedes oluliselt (P < 0,001) ning Baxi ekspressioon CPhGs-H ja CPhGs-M rühmades suurenes oluliselt (P < 0,0,0,4E) (Figure41). 4-F). Lisaks näitab see, et CPhG-d võivad soodustada kasvajarakkude apoptoosi ravimiresistentsetel kasvajat kandvatel karvututel hiirtel, reguleerides Bcl-2 ja Baxi ekspressiooni.

 

 

3 Arutelu

Keemiaravi resistentsus ja immunosupressioon OS-i patsientidel on OS-i kliinilise ravi kitsaskohad. Praegu on kasvajavastaste ravimite peamine mehhanism kasvajarakkude apoptoosi soodustamine, mis peegeldab otseselt keemiaravi efektiivsust; teisest küljest on keha immuunsus patsientidele tugev tagatis kemoterapeutikumide talumisel. Seetõttu on ülioluline uurida, kuidas tõhusalt soodustada ravimiresistentsete OS-rakkude apoptoosi ja vähendada keemiaravist põhjustatud immuunkahjustust.

Joonis 3. Kasvajakoerakkude apoptoosi määr igas hiirte rühmas (n=3, %)

Märkus: A. Mudelirühm; B. Metotreksaadi (MTX) rühm; C. Metotreksaat kombineerituna Cistanche deserticola fenüületanooli üldglükosiidide (MTX-CPhG) rühmaga; D. Cistanche deserticola fenüületanooli üldglükosiidide (CPhGs-H) suurte annuste rühm; E. Keskmise annusega Cistanche deserticola fenüületanooli üldglükosiidide (CPhGs-M) rühm; F. Cistanche deserticola fenüületanooli koguglükosiidide (CPhGs-L) madala annuse rühm.

Tabel 3. Kasvajakoe rakkude apoptoosi määr igas rühmas (n=3)

Grupp	Apoptoosi määr (%)
Mudel	14.47 ± 1.10
MTX	19.77 ± 1.32*
MTX-CPhG-d	29.21 ± 0.77***###
CPhGs-H	31.66 ± 1.93***###
CPhGs-M	30.13 ± 2.16***###
CPhGs-L	22.49 ± 3.02**

Märkused (nagu on näidatud joonisel):Mudel=mudelirühm; MTX=metotreksaadi rühm; CPhGs–L/M/H=madala/keskmise/suure annusega Cistanche fenüületanoidglükosiidide rühm; MTX-CPhGs=kombinatsioonirühm. Olulisus vs. mudel: * P<0.05P<0.05P<0.05, ** P<0.01P<0.01P<0.01, *** P<0.001P<0.001P<0.001. Significance vs. MTX: ### P<0.001P<0.001P<0.001.

 

 

Cistanche deserticolaomab farmakoloogilist toimet, mis soojendab neere ja täiendab essentsi, niisutab soolestikku, pärsib oksüdatsiooni ja parandab immuunsust. Zhang et al. [11] teatas 1988. aastal, et vesiekstraktCistanche deserticolavõib parandada immuunfunktsiooni ja stimuleerida immuunorganite, nagu tüümuse, arengut hiirtel. Järgnevin vivotäiendavad uuringud leidsid, etCistanchepolüsahhariididel oli kopsuvähi- ja sarkoomivastane toime [12]. Uuringud on näidanud, et CPhG-d, mis on peamine komponentCistanche deserticola, omab selliseid farmakoloogilisi toimeid nagu oksüdatsioonivastane, vananemisvastane, neuroprotektsioon, immuunsüsteemi tugevdamine, maksa kaitse ja spermatogeensete häirete ravi [13], samuti avaldab see kasvajavastast ja immuunsüsteemi tugevdavat toimet erinevatele pahaloomulistele kasvajatele, sealhulgas maksavähile, kopsuvähile, rinnavähile ja munasarjavähile [14]. Meie eelmine uuring näitas, etCistanche deserticolavõib soodustada ravimiresistentsete OS-rakkude apoptoosiin vitrovähendades MRP1 ja mutantsete P53 valkude ekspressiooni [15]. Selles uuringus leiti, et kasvaja maht ja kaal ravirühmades olid väiksemad kui mudelrühma omad ning kasvaja maht erinevates CPhG-de kontsentratsioonirühmades ja MTX-CPhG-de rühmas oli samuti väiksem kui MTX-rühmas, kusjuures kasvaja inhibeerimise määr oli suurem. See näitab, et CPhG-d võivad märkimisväärselt pärssida tuumori kasvu ravimiresistentsetel OS-i kasvajat kandvatel hiirtel ja inhibeeriv toime on positiivses korrelatsioonis CPhG-de kontsentratsiooniga, mis on põhimõtteliselt kooskõlas Hou jt uuringuga. [16] CPhG-de inhibeeriva toime kohta subkutaanselt siirdatud kasvajatele H22 hepatoomi kandvatel hiirtel.

Immuunfunktsioon on tihedalt seotud kasvaja esinemise ja arenguga. IL-2 on teatud tüüpi rakukasvufaktor immuunsüsteemis, mis võib parandada keha immuunfunktsiooni, soodustades T-rakkude proliferatsiooni ja diferentseerumist, ning toota kasvajavastase toimega immuunrakke [17]. TNF-il on kasvajavastane toime, seostudes retseptoritega, et kutsuda esile kasvajarakkude apoptoosi, tugevdada peremeesorganismi immuunfunktsiooni, toimida kasvaja veresoonte endoteelirakkudele, suurendada veresoonte läbilaskvust, kutsuda esile programmeeritud surma ning seejärel põhjustada kasvaja hemorraagiat ja nekroosi [18]. Seerumi IL-2 ja TNF-ekspressiooni analüüs iga rühma hiirtel näitas, et seerumi TNF- ja IL-2 ekspressioonitasemed erinevates CPhG-de kontsentratsioonirühmades ja MTX-CPhG-de rühmas kasvajaga mudelhiirtel olid oluliselt suurenenud. See viitab sellele, et CPhG-d võivad parandada immuunfunktsiooni ravimiresistentsetel OS-i kasvajat kandvatel hiirtel, reguleerides TNF- ja IL-2 ekspressiooni, inhibeerida ravimresistentsete osteosarkoomirakkude proliferatsiooni ja avaldada seega kasvajavastast toimet.

 

Joonis 4. P-mTOR, p-PI3K, p-AKT, Bcl-2 ja Bax valkude elektroforeesi tulemuste diagramm karvutute hiirte kasvajakoes (x ± s, n=3, mm3)

Märkus: Mudel, mudelirühm; MTX, metotreksaadi rühm; MTX-CPhG-d, metotreksaat kombineerituna Cistanche deserticola fenüületanooli glükosiidide rühmaga; CPhGs-L, väikeses annuses Cistanche deserticola fenüületanooli üldglükosiidide rühm; CPhGs-M, keskmise annusega Cistanche deserticola fenüületanooli koguglükosiidide rühm; CPhGs-H, suures annuses Cistanche deserticola fenüületanooli üldglükosiidide rühm; A. p-mTOR, p-PI3K, p-AKT, Bcl-2 ja Bax valkude Western blot tulemused; B. p-mTOR; C. p-PI3K; D. p-AKT; E. Bcl-2; F. Bax; Võrreldes mudelirühmaga * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001; Võrreldes MTX rühmaga, # P < 0,05, ## P < 0,01, ### P < 0,001.

 

AKT fosforüülimine PI3K/AKT/mTOR signaalirajas võib otseselt või kaudselt reguleerida mitmeid apoptoosiga seotud tegureid, nagu Bcl-2 perekond, X-seotud apoptoosivalgu inhibiitor (XIAP), hiire topeltminut 2 (MDM-2) ja Bcl-2-ga seotud X-valk] (Bax). Ebanormaalselt aktiveeritud PI3K/AKT/mTOR signaalirada võib membraanitransporterite ABCB1 ja ABCC1 ekspressiooni ülesreguleerida, vähendades seeläbi kemoteraapia efektiivsust ja vahendades operatsioonisüsteemi resistentsust kemoterapeutiliste ravimite suhtes [20]. Mitmesugused traditsioonilise hiina meditsiini monomeerid võivad soodustada operatsioonisüsteemi rakkude apoptoosi, inhibeerides PI3K/AKT/mTOR signaalirada, nagu protsüanidiin B2, kvertsetiin, luteoliin jaLactarius deliciosuspolüsahhariidid [21]. Selles uuringus leiti, et MTX üheainsa toime korral vähenes p-AKT valgu ekspressioon märkimisväärselt, samas kui p-mTOR ja p-PI3K valgu ekspressioon ei näidanud olulist erinevust, mis näitab, et MTX mõjutab PI3K/AKT/mTOR signaalirada ravimiresistentsete kasvajat kandvate karvutute hiirte kasvajakudedes vähe. Siiski oli p-AKT, p-mTOR ja p-PI3K valkude ekspressioon ravimiresistentsete OS-i kasvajat kandvate karvutute hiirte kasvajakudedes erinevates CPhG-de kontsentratsioonirühmades ja MTX-CPhG-de rühmas madalam kui mudelrühmas ja samuti oluliselt madalam kui MTX-rühmas, mis näitab, et CPhG-del on märkimisväärne inhibeeriv toime ravimiresistentsete signaalraja / PIm3 signaali / AKTOS-rajale. rakud. Kasvajarakkude apoptoosi voolutsütomeetria tuvastamine näitas, et kasvaja apoptoosi määr igas rühmas suurenes pärast ravimi sekkumist märkimisväärselt. Baxi ja Bcl-2 valgu ekspressiooni tuvastamine näitas, et Baxi ekspressioon ravimiresistentsete OS-i kasvajat kandvate karvutute hiirte kasvajakudedes erinevates CPhG-de kontsentratsioonirühmades ja MTX-CPhG-de rühmas suurenes märkimisväärselt, samas kui Bcl-2 ekspressioon MTX-CPhG-, CPhGs-H- ja CPhG-rühmade mudelhiirte kasvajakudedes vähenes oluliselt. See viitab sellele, et teatud CPhG-de kontsentratsioon võib soodustada ravimiresistentsete OS-rakkude apoptoosiin vivoinhibeerides PI3K/AKT/mTOR signaalirada, reguleerides alla Bcl-2 ekspressiooni ja üles reguleerides Baxi ekspressiooni.

Kokkuvõtteks võib öelda, et CPhG-d võivad soodustada ravimiresistentsete OS-rakkude apoptoosi ja pärssida kasvaja kasvuin vivo, ja selle mehhanismi saab saavutada PI3K / AKT / mTOR signaaliraja inhibeerimise ja Bcl-2 ja Baxi ekspressiooni reguleerimisega. Samal ajal võivad CPhG-d parandada immuunfunktsiooni ravimiresistentsetel OS-i kasvajat kandvatel hiirtel, reguleerides üles TNF- ja IL-2 ekspressioonitasemeid, avaldades seeläbi sünergistlikku kasvajavastast toimet. Selle kliinilise rakenduse potentsiaal vajab siiski täiendavat uurimist ja uurimist.

 

Viited

1 Zhang C, Hu J, Zhu K et al. Tsementeeritud megaproteeside ellujäämine, tüsistused ja funktsionaalsed tulemused kõrge astme osteosarkoomi korral põlve ümber [J]. Int Orthop, 2018, 42 (4): 927–938. DOI:10.1007/s00264-018-3770-9.2 Liu Q, Xu R, Xu X jt. T-lümfotsüütide alamrühmade omadused ja tähtsus osteosarkoomi hiirte perifeerses veres [J]. Transl Cancer Res, 2022, 11(6):1503-1509. DOI:10.21037/tcr22-264.3 Wu W, Jing DD, Cao L jt. Osteosarkoomi [J] immunoteraapia praegune seisund ja väljavaated. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2022, 49(7):721–726. DOI:10.3971/j.issn.1000-8578.2022.21.1281.4 Wang CZ, Liu YF, Zhang XQ jt. Immuunrakkude kasvajavastast toimet reguleeriva astragalosiidi Ⅳ mehhanismi uurimise edusammud [J]. Hiina traditsioonilise hiina meditsiini arhiiv, 2024, 42(11):145-149. DOI:10.13193/j.issn.1673-7717.2024.11.029.5 Zhang J, Yu XH, Yan YG jt. PI3K/Akt signaaliülekanne osteosarkoomi korral [J]. Clin Chim Acta, 2015, 444:182-192. DOI:10.1016/j.cca.2014.12.041.6 Hu Q, You SP, Liu T jt. Cistanche [J] maksavähivastase toime uurimine. Carcinogenesis, Teratogenesis & Mutagenesis, 2018, 30(3):194-199. DOI:10.3969/j.issn.1004-616x.2018.03.006.7 Qi XX, You SP, He ZX jt. Cistache deserticola fenüületanoolglükosiidi mõju HepG2 rakkude proliferatsioonile ja apoptoosile in vitro [J]. Xinjiangi meditsiiniülikooli ajakiri, 2021, 44(9):1041-1047. DOI:10.3639/j.issn.1009-5551.2021.09.012.8 Panaampon J, Sasamoto K, Kariya R jt. NK-rakkudeta karvutute hiirte loomine ja nende kasutamine inimese kasvaja ksenotransplantaatide jaoks [J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2021, 22(4):1069-1074. DOI:10.31557/APJCP.2021.22.4.1069.9 Yu CB, Sun P, Zhang XW jt. Pankreasevähi ksenotransplantaadi loommudel uuring karvututel hiirtel [J]. Progress in Modern Biomedicine, 2012, 12(9):1648-1650. DOI:10.13241/j.cnki.pmb.2012.09.017.10 Xu XR, Wang N, Sun MM jt. Erinevad mõjud osteosarkoomi mudelhiirtel, kellel on nõelravi ühes punktis ja akupunktide ühilduvus [J]. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2020, 35(5):2271-2276. DOI:10.13241/j.cnki.pmb.2012.09.017.11 Zhangi peakorter, Zhang AX, Du NS jt. Cistanche deserticola mõju hiirte immuunfunktsioonile [J]. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine, 1988, (12):736-737, 710. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-ZZXJ198812019.htm.12 Zhang HQ, Xu AH, Li DD. Cistanche polüsahhariidide farmakoloogiline toime kasvajatele ja kasvajat kandvatele hiirtele [J]. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine, 1997, (S1):155-156, 294. https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=mg_qcPBBapnmsDqon66yc8-zI2VqwJgixywPNSnAl0qboPnZqB4FNuT0bsHSSvs0Dn72KJV2Lcy_9 -S-Wcbp5ClislhRETaTYT6KGBMKP3_EreGXg3-BH52Itk0rqWiNksajNxzld06uvdfRzCDj-utLfgfANyySxJMHM-g==&ühine platvorm=&uniplatform=}NZKPT1{0}keel}{1{0} Xue HY, Jiao CY, Yao J. Cistanches Herba[J] glükosiidide farmakoloogiliste mõjude praegune seis. The Chinese Journal of Clinical Pharmacology, 2018, 34 (4): 486-488. DOI:10.13699/j.cnki.1001-6821.2018.04.026.14 Tang Y, Wu JQ. Cistanche deserticola [J] fenüületanoidglükosiidide kasvajavastane toime. Current Biotechnology, 2023, 13(3):399-405. DOI:10.19586/j.2095-2341.2023.0040.15 Xu W, Ding JX, Xie XW jt. Cistanche deserticola mõju kemoteraapiaresistentsetele osteosarkoomirakkudele ning MRP1 ja P53 [J] ekspressioonile. Li-shizheni traditsioonilise hiina meditsiini ajakiri, 2021, 32(3):551-554. DOI:10.3969/j.issn.1008-0805.2021.03.11.16 Hou XT, Liu T, Su DQ. Cistanche deserticola fenüületanoolglükosiidide kasvajavastane toime H22 kasvajat kandvatele hiirtele [J]. Journal of Toxicology, 2021, 35(3):231-235, 240. DOI:10.16421/j.cnki.1002-3127.2021.03.010.17 Zhang XY, Wang D, Fu CX jt. Teadustöö edusammud kasvajate ravis interleukiin-2[J]-ga. Oncology Progress, 2024, 22(6):581-585, 618. DOI:10.11877/j.issn.1672-1535.2024.22.06.01.18 Gao SY, Li D. Tuumorinekroosifaktori ja vähi uurimise edusammud[J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2020, 36(9):1209–1213. DOI:10.3969/j.issn.1001-1978.2020.09.006.19 Zhou H, Hai GF, Zhang T jt. PI3K/AKT/mTOR raja ja selle sihtmärgiks olevate inhibiitorite uurimise edenemine vähiravis [J]. China Pharmaceuticals, 2023, 32(5):127–135. DOI:10.3969/j.issn.1006-4931.2023.05.030.20 Liu YJ, Cao YH, Kuang R. Tuumori mitme ravimiresistentsuse mehhanismi ja traditsioonilise hiina meditsiini pöördumise mehhanismi uurimise edenemine[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2024, 59(7):561-570. DOI:10.11669/cpj.2024.07.001.21 Yang HD, Li N, Xie XW jt. Hiina meditsiini monomeerid osteosarkoomi ravis, reguleerides PI3K / Akt / mTOR signaalirada: ülevaade [J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2023, 29(3):254-262. DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.20221527.