Mehaaniline ülevaade diosmiinist põhjustatud neuroprotektsiooni ja mälu parandamise kohta intratserebroventrikulaarse kinoliinhappe roti mudelis: mitokondriaalsete funktsioonide ja antioksüdantide taaselustamine, 3. osa

2. Materjal ja meetodid

2.1. Katseloomad. .is uurimistööd lubas IAEC protokolli nr. ASCB/IAEC/14/20/145. AlbinoWistari rotte (kumbki sugu, 200 g kuni 250 g, vanuses 8 kuni 9 kuud) hoiti tüüpilise suurusega polüpropüleenist kuubikujulistes korpustes kunstliku temperatuuri (23 ± 2 kraadi), 12:12-tunnise pimeduse/valguse järjestustes ja õhuniiskus (40 ± 10%) loomahoones. Närilistele toideti standardset toitvat toiduainet (Ashirwad Manufacturers, Punjab) ja puhastatud vett vastavalt soovile.

Meeste ja naiste vahelised suhted ning mälu on alati palju tähelepanu äratanud. On hästi teada, et meessuguhormoonidel on oluline roll füüsilises arengus, tervise hoidmises ning seksuaalse arengu ja seksuaalfunktsiooni edendamises. Lisaks on hiljutised uuringud näidanud, et meessuguhormoonid on tihedalt seotud mäluga.

Uuringud on näidanud, et mehed täidavad teatud mäluülesannetes paremini kui naised. Näiteks mehed esinevad tavaliselt ruumimälus paremini kui naised ja põhjuseks on meessuguhormoonide mõju hipokampusele. Hipokampus on aju piirkond, mis töötleb ruumimälu. Meessuguhormoonid võivad soodustada hipokampuse talitlust, parandades seeläbi meeste ruumilise mälu võimet.

Naissuguhormoonidel on aga positiivne mõju ka mälule. Uuringud on leidnud, et naissuguhormoonid võivad soodustada mäluga seotud geenide ekspressiooni ajus ning suurendada neuronite arvu ja talitlust hipokampuses, parandades seeläbi naiste mälu. Lisaks võivad naissuguhormoonid leevendada stressi, pärssida närvirakkude surma, kaitsta aju neuroneid ja parandada veelgi naiste mälu.

See näitab, et nii mees- kui ka naissuguhormoonidel on positiivne mõju mälu parandamisele. Meestel ja naistel on erinev mälu, millest igaühel on oma eelised ja puudused, kuid see ei tähenda, et meestel oleks parem mälu kui naistel või et naistel oleks parem mälu kui meestel. Seetõttu ei tohiks me mälu mõõtjana kasutada sugu. Igaüks peaks andma täismängu enda kasuks ja parandama pidevalt oma mälu.

Lõpuks, olgu mehed või naised, peaksime pöörama tähelepanu oma füüsilisele tervisele ja vaimsele seisundile ning valima õige viisi oma mälu parandamiseks. Näiteks võib mälu paranemisele positiivselt mõjuda pidev uute asjade õppimine, regulaarsete eluharjumuste kujundamine ja emotsionaalse stabiilsuse säilitamine. Tehkem koostööd, et pidevalt uurida ja harjutada meetodeid mälu parandamiseks ja endale parema tuleviku loomiseks. On näha, et me peame oma mälu parandama. Cistanche võib oluliselt parandada mälu, sest Cistanche on traditsiooniline Hiina meditsiin, millel on palju ainulaadseid toimeid, millest üks on mälu parandamine. Cistanche'i efektiivsus tuleneb selles sisalduvatest erinevatest toimeainetest, sealhulgas parkhape, polüsahhariidid, flavonoidglükosiidid jne. Need koostisosad võivad mitmel viisil edendada aju tervist.

Klõpsake nuppu Tea 10 viisi mälu parandamiseks

Kõik loomkatsed viiakse läbi ainult CPCSEA, GOI, New Delhi juhiste kohaselt. Loomade hooldajaid ja käitlejaid pimestati loomade kohortide jaoks hõlbustatud erinevate ravirežiimide osas. Viidi läbi uurivad loomkatsed, mis õnnestusid vähemalt kahenädalase tutvumisaja jooksul.

Kõik uuringud loomadega viidi läbi vahemikus 0900- kuni 1600- tundi päevas.2.2. Ravimid ja kemikaalid. Diosmiin (DSM: 520-27-4), kinoliinhape (QA: 89-00-9) ja standardsed analüüdid hangiti firmast Merck (India).

Naatriumdivesinikfosfaat (NaH2PO4), naatriumhüdroksiid (NaOH), kahealuseline kaaliumfosfaat (K2HPO4), nitrobluetetrasool (NBT), fenasiinmetosulfaat (5-metüülfenasiiniummetüülsulfaat), etüleendiamiintetraäädikhape (EDTA{iinbovineesBSA), 5}}[4-(2-hüdroksüetüül)piperasiin-1-üül]etaansulfoonhape (HEPES), 1,2-bis[2-[bis(karboksümetüül) amino]etoksü]etaan (EGTA), riboflaviin, naatriumtsüaniid (NaCN), naatriumasiid (NaN3), tetranaatriumpürofosfaat, vesinikperoksiid (H2O2), NADH dinaatrium (DPNH), NADPH tetranaatrium (koensüüm II redutseeritud tetranaatriumhape), fosforisool, Foliin ja Ciocalteu fenool (FCR) ja sulfosalitsüülhappe (5-SSA) reaktiiv (HiMedia Laboratories, Maharashtra, India); diglütsiin, jää-äädikhape (CH3COOH), Ellmani reaktiiv (3-karboksü-4-nitrofenüüldisulfiid, DTNB), asabenseen (C5H5N) ja naatriumlaurüülsulfaat (SLS) (LobaChemie, Mumbai, India); 4,6-dihüdroksü-2-merkaptopürimidiin (2-TBA), dinaatriumkarbonaat (Na2CO3) ja (2-merkaptoetüül)trimetüülammooniumjodiidatsetaat (TCI kemikaalid, India); tsinksulfaat (ZnSO4), Rochelle'i sool (kaaliumnaatrium-L(+)-tartraat), 2-(1-naftüülamino)etüülamiindivesinikkloriid, dilämmastiknaatrium (NaNO2) ja p-aminobenseensulfoonamiid (SiscoResearch Laboratories, India ); kasutati butüülalkoholi (Fisher Scientific, India).2.3. Kinoliinhappe intratserebroventrikulaarne süstimine.

Loomadele tehti anesteesia, manustades intraperitoneaalselt (ip) ketamiini (90 mg/kg) ja ksülasiini (10 mg/kg) kokteili, kasutades steriilset süstevett. .ebody asetati pikali soojale soojenduspadjale ja stereotaksilise kirurgiainstrumendi kinnitusele asetati pea. Peanahk lõigati sagitaalsesse punkti ja kolju paljastati naha lahtitõmbamise teel.

Ükskõik milline kahest külgvatsakesest valiti meelevaldselt ja koljus oli parietaalluu puuris (stereotaksilised koordinaadid -0,8 mm anteroposterior bregmast, ±1,5 mm mediolateraalne sagitaalsest õmblusest ja ±3,6 mm dorsoventraalne parietaalsest luupinnast). ) puuriaugu tegemiseks [21].

Esimesel päeval valmistati kinoliinhappe (QA) lahus värskelt (240 nmol) PBS-is (Na+-K+ [PO4]2- puhverdatud soolalahus, pH 7,4) ja süstiti järk-järgult Hamiltoni mikrosüstlaga voolukiirusel 1 µl/min rottide vasakpoolses või paremas ajuvatsakeses 5–6 minuti jooksul süstemahuga 5 µl ICV-kandja [22].

Pärast kogu ravimi inokuleerimist ei nihutatud mikronõela 4–5 minuti jooksul, et võimaldada ravimi difusiooni tserebrospinaalvedelikus ja takistada selle tagasivoolu. .e ekvivalentne maht (10 µl) PBS-vehiikulit manustati ICV-ga identselt opereeritud shamratitele, kuid QA-d ei süstitud.

Pärast ravimi süstimist taastati augud liimimisainega (tsinkfosfaat, PYRAX®) ja teostati naha õmblemine. Saastumise (bakterite kasvu) vältimiseks kasutati Neosporin® pro re nata.

Operatsioonijärgse sepsise vältimiseks manustati Orizoliini (Zydus Cadila), annuses 30 mg/kg (ip). Igale rotile võimaldati soe keskkond (37 ± 0,5 kraadi), et vältida operatsioonijärgset hüpotermiat. Igale rotile lubati pärast operatsiooni seitse päeva tasuta pooltahket toitu (puuri sees) ja vett ning majutati eraldi puuris (30 × 23 × 14 cm3).

2.4. Katseprotokoll. DSM-i süstiti rottidele annustes 5{4} ja 100 mg/kg kehakaalu kohta (bw) intraperitoneaalselt (ip), kasutades 0,5% dimetüülsulfoksiidi kandjat normaalses soolalahuses (annuse maht 5 ml/kg) [17].

Loomad jaotati juhuslikult 5 klastrisse üksikpimedas režiimis (n � 5): (i) võlts (S), (ii) QA, (iii) QA + DSM50, (iv) QA + DSM100 ja (v) QA + DNP. Rottidele tehti esimesel päeval intratserebroventrikulaarne QA (QA-ICV) või võltsoperatsioon.

DSM-i manustati 21 järjestikusel päeval iga päev 120 minutit pärast QA-ICV-d alates esimesest päevast. Selles uuringus kasutati standardravimina donepesiili (DNP) ja süstiti (annus 3 mg/kg, ip) QAICV-ga süstitud rottidele 21 järjestikuse päeva jooksul.

Thesham- ja QA kontrollrühmade loomadele manustati 1. kuni 21. päevani vehiikulit (steriilset 0,5% dimetüülsulfoksiidi normaalses soolalahuses annuses-mahus 5 ml/kg). Kogu uuring viidi läbi vastavalt joonisel näidatud skeemile Joonis 1.2.5. Liikumisaktiivsus.

Kõigis rotiklastrites dokumenteeriti keskmine lokomotoorne aktiivsus aktofotomeetri abil 5 minuti jooksul. Eraldi loom paigutati aktofotomeetrisse 3 minutiks aklimatiseerumiseks. Seejärel anti rottidele 5 minutit ja tulemused märgiti loendustena 5 minuti kohta [11].2.6. Rotarodi test.

In rodents, the rotarod test typically evaluates the equilibrium and muscle synchronization facets of sensorimotor functions. .e rats were presented to acquisition trials until their ability to run reached >60 sekundit, kui varras pöörleb üheksa pööret minutis (rpm).

Pärast omandamiskatseid paigutati silindrilisele võllile eraldi rott ja pöördekiirust suurendati konstantse 10-sekundilise vaheajaga 6 p / min (eelkiirus) kuni 30 p / min (lõppkiirus), ulatudes üle 50 sekundi. .e keskmine kukkumislatentsus (sekundites) pöörlevalt silindrilisest võllist esitati tulemustes.2.7.

Jalajälje analüüs. Rottidel jalajälje analüüsi tegemise põhimõte on kõnnakuhäirete hindamine.

Jälgede jaoks kasteti roti jalad nelja erinevat värvi mittetoksilise toiduvärvi sisse ja neil lasti joosta kaldus kõnniteel (70 cm × 10 cm × 8 cm). Lennuraja alus oli ümbritsetud valge tsellulooslehega. .e rotid motiveeriti raja lõpus hämarasse ülesmäge lõiku, et saada selgeid jalajälgi. Pärast katseid eemaldati igalt loomalt värv õrnalt leige veega. .e jalajäljed skanniti ja "sammu pikkus" mõõdeti standardse joonlaua abil. Sammu pikkus kvantifitseeriti, arvutades identse roti käpa järjestikuste paigutuste vahelise kauguse [11].

2.8. Uudne objekti tuvastamise ülesanne (NORT). Standardprotokolli järgisid Kumar ja Bansal [23].

ORT on kahjumlik ja mittevaenulik eksterotseptiivne arhetüüp, mida kasutatakse näriliste impulsiivse sondeerimise kaudu ärakasutatud töötüüpi mälu hindamiseks. Uuring viiakse läbi katusel olevas avatud vineerist risttahukakujulises anumas (80 cm × 42 cm × 62 cm), mis on paigutatud vaiksesse piirkonda ja mida valgustab 60 W LED, et hoida anumas ühtlast heledust.

Silindri- (valge)-, püramiidi- (punane)- ja kuubikujulised (mustad) (12 cm kõrgused) puitesemed (identsete kolmikutena) olid tugevad ja piisavalt kaalukad, et muuta need näriliste poolt liikumatuks. NORT viidi läbi 16. päeval kolmes etapis (S): aklimatiseerumise (S1), omandamise (S2) ja uudse objekti äratundmise (retentsiooni) etapis (S3).

S1 ajal tehti kolm järjestikust päeva enne katseid, et avastada rottide poolt anuma vaba põrandapõhja (5 minutit). Pärast S1 lõpetamist harjuti üksikut looma õppimisetapis (S2) mis tahes tahkete esemete komplektiga.

Kaksikulaadsed asjad paigutati 2 suvaliselt valitud laeva vastasnurka (9 cm kuni 11 cm vahe külgvallidest). Eraldi paigutati näriline anuma keskele kahe tahke eseme vastas ja tal lasti 5 minuti jooksul kaks sarnast eset avastada. Uurimistoiminguks peeti nina suunamist objekti lähedusse 2–3 cm või vähema kaugusel või esemega füüsilist kontakti koonuga.

Pärast S2 majutati närilist kodus, mille taga oli 60-minutiline katsetevaheline süvend (ITR).

Kõik S2-s pakutavad üksikud esemed vahetati teise tahke eseme vastu ja närilised esitati uuesti kahele esemele, st tuttava eseme koopiale ja erinevale esemele. leevendada tõenäolisi eelarvamusi, mille on õhutanud kiindumus teatud seadete või esemete vastu. Nõud ja tahked esemed pühiti pärast igat uurimist hoolikalt puhtaks (etüülalkohol 15% ja kuiv riie), et vältida lõhnajälgi. S2 ja S3 iga üksuse avastamiseks kulutatud periood dokumenteeriti stopperi abil. .e kestus, mis kulus S2-s (I1 � Ii1 + Ii2) kahe sobiva üksuse uurimisele ja S3-s kahe erineva üksuse, st tuttavate ja erinevate üksuste uurimisele kulutatud kestus (I2 � Ii3 + Ib) salvestati. Erineva üksuse uurimisele kulutatud kestuse ja tuttava üksuse uurimise kestuse (Ib–Ii3 � DI) varieeruvus näitab mälestusmälu säilimist.

DI (diskrimineerimisindeks) / S3 kestus(id) nii tuttava kui ka uue üksuse (muudetud DI) uurimisel parandab osalisust täieliku uurimise variatsioonide kaudu ja tähistab kalduvust erinevatele üksustele erinevalt tuttavatest {DI � (Ib–Ii3) )/(Ii3 + Ib)}. Mälumälu hinnati kvantifitseerides näriliste oskust S3-s tuttavaid/uudseid elemente välja tuua ja see märgiti DI-na (muudetud S3 üldise uurimisperioodi jaoks) [24].

2.9. MorrisWater Maze (MWM). Järgiti standardprotokolli, nagu on andnud Kumar ja Bansal [25]. MWM hindab ruumimälu ujumiskatsete abil, mille käigus närilised leiavad põgenemistee varjatud poodiumile.

Musta värvi ringikujulises mahutis (läbimõõt 2 m, kõrgus 0,6 m) oli vett (25 ± 1 kraadi) täidetud 0,3 m sügavusele. Veereservuaar jagati päripäeva neljaks sarnaseks piirkonnaks (R1, R2, R3 ja R4), kasutades kahte nailonkiudu, mis kinnitati paagi ülemisele perimeetrile risti.

Vee alla (1 cm vee all) asetati reservuaari piirkonda R4 karikakra (10,5 cm × 10,5 cm). Karikakra koht püsis kogu omandamisperioodi vältel puutumatuna.

Igale rotile tehti iga päev neli järjestikust omandamise vooru (5 minutit ITR). Näriline lasti õrnalt paagi seina vastas olevasse veehoidlasse, kusjuures asukoht varieerus iga üksiku katsega alates R1-R4, R2-R1, R3-R2 ja R{{ 7}}R3 vastavalt 1. kuni 4. päeval ja veealuse poodiumi tuvastamiseks oli lubatud 120 sekundit. Närilised puhkasid poodiumil 20 sekundit.

Suutmatus platvormi tuvastada 120 sekundi jooksul viitas rottide käsitsi paigutamisele platvormile ja seejärel lubati neil platvormil olla 20 sekundit. Põgenemislatentsusaeg (ELT) on veereservuaaris peidetud karikaela avastamise kestus (id).

Ruumiõpet tähistas päev esimene vs. päev ELT. Sondikatses (5. päev) uurisid närilised reservuaari 120 sekundit, kuid jäid poodiumilt ilma. .e registreeriti kogu veehoidlas (4 piirkonda) kulutatud keskmine kestus. Keskmist kestust R4-s (TSTQ: sihtkvadrandis kulutatud aeg) peidetud poodiumi uurimiseks loeti võrdlusmälu indeksiks. .paagi võrdlev seadistus laboris visuaalsete märkidena toimivate esemete suhtes ja uurija asend jäi häirimata [26].

2.10. Biokeemiliste parameetrite hindamine. Pärast käitumuslike uuringute lõpetamist koguti terve patsientide aju ja asetati see pulbristatud jääkuubikutele, millele järgnes jäänuste ja vere eemaldamiseks külmutamise steriliseeritud soolalahusega (isotooniline 308 mOsmol/l NaCl) vannitamine.

Kogu aju homogeniseerimine viidi läbi koheselt külmutuspuhvris (pH 7,4) koostisega 215 mM D-mannitooli, 20 mM 2-[4-(2-hüdroksüetüül). )piperasiin-1-üül]etaansulfoonhape, 1 mM 1, 2-bis[2-[bis(karboksümetüül)amino]etoksü]etaan, 75 mM sahharoosi ja 0,1% BSA. Homogenaati tsentrifuugiti 4 kraadi juures, kasutades jõudu 13000 × g 5 minutit. .e pellet lükati tagasi ja supernatant eraldati kaheks osaks ja fuugiti (4 kraadi) 13000 × g jõul 5 minutit. Toormitokondrite pellet eraldati ja tsentrifuugiti uuesti eralduspuhvris 1,2-bis[2-[bis(karboksümetüül)amino]etoksü]etaaniga 12 500 × g juures 11 minutit (4 kraadi). Nii saadud pooltahke sade, mis sisaldas saastamata mitokondreid, suspendeeriti uuesti eralduspuhvris (pH 7,4), mis sisaldas 75 mM sahharoosi, 20 mM 2-[4-(2-hüdroksüetüül)piperasiini-1- üül]etaansulfoonhape ja 215 mM D-mannitool [27].

Hiljem kasutati standardmeetodite abil biokeemiliste markerite määramiseks kogu aju homogenaadi mitokondriaalset fraktsiooni.2.11. Mitokondriaalse kompleksi hindamine.

2.11.1. NADH: ubikinooni oksüdoreduktaasi aktiivsus. Kompleksi I (NADH dehüdrogenaasi) aktiivsuse määramine (nmol NADH oksüdeeritud/minutis/mg valku) määrati Kingi ja Howardi tehnikat järgides [28]. NAD+ eoksüdatiivse genereerimisega NADH-st kaasneb tsütokroom c redutseerimine. Testisegu koosnes tsütokroom c-st (10,5 mM), 2 mM diglütsiinipuhvris lahustatud 6 mM nikotiinamiidadeniinnukleotiidist (DPNH) ja diglütsiini puhvrist (0,2 M, pH 8,5).

Reaktsiooni käivitamiseks lisati analüüsilahusesse lahustuv mitokondriaalne fraktsioon. .e optilise tiheduse (OD) muutust λmax � 550 nm juures jälgiti 120 sekundit.

2.11.2. Suktsinaat: ubikinooni oksidoreduktaasi aktiivsus.. suktsinaatdehüdrogenaasi (kompleks II) aktiivsuse määr kvantifitseeriti (nmol suktsinaadi oksüdeeritud / minut / mg valku), järgides Kingi [29] tehnikat.

Merevaikhappe oksüdatsiooni käivitab näidiselektronide vastuvõtja kaaliumtsüanoferraat (K3Fe(CN)6). .e analüüsisegu, mis koosnes merevaikhappest (0,63 M), 1% BSA-st, K3Fe(CN)6-st (0.036 M) ja Na+-K+ [PO4]2- puhver (0,23 M, pH 7,6). Reaktsiooni käivitamiseks lisati analüüsilahusesse lahustuv mitokondriaalne fraktsioon. .e muutust OD-s λmax � 420 nm juures jälgiti 120 sekundit.2.12. Oksüdatiivse stressi biomarkerite määramine2.12.1. iobarbituurhappega reaktiivsed ained (TBARS).

TBARS-i (nmol valgu mg kohta) [30] hindamiseks analüüsikombinatsioon (lõppkogus ~4 ml), mis sisaldab 0.10 ml homogeniseeritud aju, 1,51 ml 4,{{ 7}}dihüdroksü-2-merkaptopürimidiini (0,8%), 200 µl SLS-i (8,18%), 1,49 ml jää-äädikhapet (21%, pH 3,51) ja 0,71 ml deioniseeritud vett kuumutati veevannis 96 kraadi juures. 60 minutit.

Butüülalkoholi/asabenseeni (5,1 ml) suhe 15:1 lisati analüüsilahusesse, mida tsentrifuugiti 4, 000 × gvõimsusel (10 minutit) ja supernatant eraldati.

Topeltkiire UV1700 spektrofotomeetriga (Shimadzu, Jaapan) hinnati kromofoori malondialdehüüdi-4, 6-dihüdroksü-2-merkaptopürimidiini OD lainepikkusel (λmax � 532 nm) ja ε1 × 56ｿ. 4,6-dihüdroksü-2-merkaptopürimidiini aduktide arvutamiseks kasutati 105/M/cm (molaarne ekstinktsioonikoefitsient).

2.12.2. Vähendatud glutatiooni (Lc-glutamüül-L-tsüsteinüülglütsiini) tase. L-glutatiooni (GSH) sisalduse hindamiseks rakendati Ellmani [31] protseduuri. Testi segu, mis hõlmas homogenaati (1,1 ml) ja 1 ml 4% 2-hüdroksü-5-sulfobensoehapet (5-SSA), tsentrifuugiti (4 kraadi) 11 minutit võimsusel 2500 × g .

Hiljem 2,8 ml Na+-K+[PO4]2- puhvrit (51,2 mM, pH 7,77) ja {{10}},21 ml 3-karboksü{{13 }}nitrofenüüldisulfiid (0,12 mM, pH 7,89) segati ülalpool eraldatud supernatandiga (0,12 ml).

Tripeptiid (µmolGSH valgu mg kohta) kvantifitseeriti kahekiirelise UV1700 spektrofotomeetriga (λmax � 412 nm). rakendadesε � 1,36 × 104/M/cm.2.12.3.

Glutatioonperoksidaasi aktiivsus. Glutatioonperoksidaasi (GPx) aktiivsust (EC 1.11.1.9) hinnati Mohandase et al. tehnikat rakendades. [32]. .eanalyze segu, mis koosnes 100 µl 10% homogenaadist, 100 µl naatriumasiidist (1,11 mM), 100 µl EDTA-st (1,13 mM), 40 µl glutatioon-disulfiid-reduktorist (GSR, 1 IU/ml) (EC1.8.1.7), 10 µl H2O2 (0,28 mM), 40 µl Lc-glutamüül-L-tsüsteinüülglütsiini (1,2 mM), 100 µl koensüüm II redutseeritud tetranaatriumsoola (0,22 mM) ) ja 0,12 M 1,49 ml Na+-K+ [PO4]2-puhvrit (pH 7,4) kogu koguses 2000 µl. .e koensüüm II-ga redutseeritud tetranaatriumi kadu λmax � 340 nm juures dokumenteeriti temperatuuril 25 kraadi. GPx kiirus arvutati kui nmol oksüdeeritud NADPH/minutis/mg valku, kasutades ε � 6,22 × 103/M/cm.

For more information:1950477648nn@gmail.com