Mehaaniline ülevaade diosmiinist põhjustatud neuroprotektsiooni ja mälu parandamise kohta intratserebroventrikulaarse kinoliinhappe roti mudelis: mitokondriaalsete funktsioonide ja antioksüdantide taaselustamine, 2. osa

2.8. Uudne objekti tuvastamise ülesanne (NORT).

Standardprotokolli järgisid Kumar ja Bansal [23]. NORT on kahjumlik ja mittevaenulik eksterotseptiivne arhetüüp, mida kasutatakse näriliste impulsiivse sondeerimise kaudu ärakasutava mälu töötüübi hindamiseks. Uuring viiakse läbi katusel olevas avatud vineerist risttahukakujulises anumas (80 cm × 42 cm × 62 cm), mis on paigutatud vaiksesse piirkonda ja mida valgustab 60 W LED, et hoida anumas ühtlast heledust.

Närilised on teatud tüüpi väikesed imetajad, kes elavad Maal. Nad elavad sageli rohumaadel, metsamaadel ja mujal. Nad elavad õrna elu ning on lühikesed ja armsad. Võrreldes teiste organismidega on närilistel mälu osas tugev eelis ja paljud uuringud on näidanud, et näriliste mälu ületab meie kujutlusvõimet.

Näriliste aju on väga paindlik, eriti kui nad tegelevad teabe salvestamisega seotud ülesannetega. Paljud katsed on näidanud, et näriliste mälu võib isegi ületada teiste suurte imetajate oma. Katse käigus andsid mõned teadlased närilistele, nagu hiired ja hamstrid, palju erinevaid kohti, objekte, sündmusi ja muud teavet ning seejärel jälgisid nende reaktsioone ja selle teabe töötlemist. Leiti, et need närilised toimisid mälus väga hästi ja mäletasid isegi palju erinevat teavet ja stseene, isegi paremini kui enamik inimesi.

Miks on närilistel parem mälu kui teistel loomadel? See on näriliste elukeskkonnast lahutamatu. Need väikesed loomad elavad sageli ohtlikus keskkonnas, seega peavad nad õppima kiiresti kohanema ja ellu jääma. Oma ellujäämise ja paljunemise säilitamiseks peavad närilised mõistma muutusi ümbritsevas keskkonnas ja teavet, näiteks teiste loomade ja taimede tegevustrajektoore. See eeldab neilt suurepärast vaatlus- ja mäluvõimet, et nad saaksid elukeskkonnaga paremini kohaneda.

Lisaks võivad nende mälu parandada ka näriliste elustiil ja käitumisharjumused. Mõned uuringud on näidanud, et närilistele meeldib koguda ja hoida esemeid, mis võivad edendada nende mälu ja ruumitaju. Lisaks meeldib närilistele teha ka mõningaid rutiinseid tegevusi, näiteks liikuda teatud marsruudil ja täita sama tüüpi ülesandeid. See rutiinne käitumine võib samuti aidata neil tugevdada nende mälu ja harjumuste kujundamise võimeid.

Bioloogilises maailmas on närilistel ainulaadne mälu ning neil on tugev vaatlus-, mälu- ja kohanemisvõime. Meie jaoks võib näriliste mälu vastata meie õppimis- ja mäluvõimetele. Närilistelt võime õppida, et seni, kuni oleme ettevaatlikud, jätkame õppimist ning kogume oma õpingutes ja elus kogunemist, võib meil olla ka sama suurepärane mälu ja harjumuste kujundamise võime kui närilistel. See näitab, et me peame oma mälu parandama ja Cistanche võib oluliselt parandada mälu, sest Cistanche suudab reguleerida ka neurotransmitterite tasakaalu, näiteks tõsta atsetüülkoliini ja kasvufaktorite taset, mis on mälu ja õppimise jaoks väga olulised. Lisaks võib Cistanche deserticola parandada verevoolu ja soodustada hapniku kohaletoimetamist, mis tagab aju piisava toitumise ja energia, parandades seeläbi aju elujõudu ja vastupidavust.

Klõpsake Teave mälu täiustamist

Silindri- (valge)-, püramiidi- (punane)- ja kuubikujulised (mustad) (12 cm kõrgused) puitesemed (identsete kolmikutena) olid tugevad ja piisavalt kaalukad, et muuta need näriliste poolt liikumatuks. NORT viidi läbi 16. päeval kolmes etapis (S): aklimatiseerumise (S1), omandamise (S2) ja uudse objekti äratundmise (retentsiooni) etapis (S3). S1 ajal tehti kolm järjestikust päeva enne katseid, et avastada rottide poolt anuma vaba põrandapõhja (5 minutit). Pärast S1 lõpetamist harjuti üksikut looma õppimisetapis (S2) mis tahes tahkete esemete komplektiga.

Kaksikulaadsed asjad paigutati 2 suvaliselt valitud laeva vastasnurka (9 cm kuni 11 cm vahe külgvallidest). Eraldi paigutati näriline anuma keskele kahe tahke eseme vastas ja tal lasti 5 minuti jooksul kaks sarnast eset avastada. Uurimistoiminguks peeti nina suunamist objekti lähedusse 2–3 cm või vähema kaugusel või esemega füüsilist kontakti koonuga.

Pärast S2 majutati närilist kodus, mille taga oli 60-minutiline katsetevaheline süvend (ITR).

Kõik S2-s pakutavad üksikud esemed vahetati teise tahke eseme vastu ja närilised esitati uuesti kahele esemele, st tuttava eseme koopiale ja erinevale esemele. leevendada tõenäolisi eelarvamusi, mille on õhutanud kiindumus teatud seadete või esemete vastu. Nõud ja tahked esemed pühiti pärast igat uurimist hoolikalt puhtaks (etüülalkohol 15% ja kuiv riie), et vältida lõhnajälgi. S2 ja S3 iga üksuse avastamiseks kulutatud periood dokumenteeriti stopperi abil. .e kestus, mis kulus S2-s (I1 � Ii1 + Ii2) kahe sobiva üksuse uurimisele ja S3-s kahe erineva üksuse, st tuttavate ja erinevate üksuste uurimisele kulutatud kestus (I2 � Ii3 + Ib) salvestati. Erineva üksuse uurimisele kulutatud kestuse ja tuttava üksuse uurimise kestuse (Ib–Ii3 � DI) varieeruvus näitab mälestusmälu säilimist.

DI (diskrimineerimisindeks) / S3 kestus(id) nii tuttava kui ka uue üksuse (muudetud DI) uurimisel parandab osalisust täieliku uurimise variatsioonide kaudu ja tähistab kalduvust erinevatele üksustele erinevalt tuttavatest {DI � (Ib–Ii3) )/(Ii3 + Ib)}. Mälumälu hinnati kvantifitseerides näriliste oskust S3-s tuttavaid/uudseid elemente välja tuua ja see märgiti DI-na (muudetud S3 üldise uurimisperioodi jaoks) [24].

2.9. MorrisWater Maze (MWM). Järgiti standardprotokolli, nagu on andnud Kumar ja Bansal [25]. MWM hindab ruumimälu ujumiskatsete abil, mille käigus närilised leiavad põgenemistee varjatud poodiumile.

Musta värvi ringikujulises mahutis (läbimõõt 2 m, kõrgus 0,6 m) oli vett (25 ± 1 kraadi) täidetud 0,3 m sügavusele. Veereservuaar eraldati päripäeva neljaks sarnaseks piirkonnaks (R1, R2, R3 ja R4), kasutades kahte nailonkiudu, mis on kinnitatud paagi ülemisele perimeetrile risti.

Vee alla (1 cm vee all) asetati reservuaari piirkonda R4 karikakra (10,5 cm × 10,5 cm). Karikakra koht püsis kogu omandamisperioodi vältel puutumatuna. Igale rotile tehti iga päev neli järjestikust omandamise vooru (5 minutit ITR). Näriline lasti õrnalt paagi seina vastas olevasse veehoidlasse, kusjuures asukoht varieerus iga üksiku katsega alates R1-R4, R2-R1, R3-R2 ja R{{ 13}}R3 vastavalt päevadel 1 kuni 4 ja veealuse poodiumi tuvastamiseks oli lubatud 120 sekundit. Närilised puhkasid poodiumil 20 sekundit.

Suutmatus platvormi tuvastada 120 sekundi jooksul viitas rottide käsitsi paigutamisele platvormile ja seejärel lubati neil platvormil olla 20 sekundit. Põgenemislatentsusaeg (ELT) on veehoidla varjatud karikaela avastamise kestus (ajad). Ruumiõpet tähistas päev esimene vs. päev neljas ELT.

Sondikatses (5. päev) uurisid närilised reservuaari 120 sekundit, kuid jäid poodiumilt ilma. .e registreeriti kogu veehoidlas (4 piirkonda) kulutatud keskmine kestus. Keskmist kestust R4-s (TSTQ: sihtkvadrandis kulutatud aeg) peidetud poodiumi uurimiseks loeti võrdlusmälu indeksiks. .paagi võrdlev seadistus laboris visuaalsete märkidena toimivate esemete suhtes ja uurija asend jäi häirimata [26].

2.10. Biokeemiliste parameetrite hindamine. Pärast käitumuslike uuringute lõpetamist koguti terve patsientide aju ja asetati see pulbristatud jääkuubikutele, millele järgnes jäänuste ja vere eemaldamiseks külmutamise steriliseeritud soolalahusega (isotooniline 308 mOsmol/l NaCl) vannitamine.

Kogu aju homogeniseerimine viidi läbi koheselt külmutuspuhvris (pH 7,4) koostisega 215 mM D-mannitooli, 20 mM 2-[4-(2-hüdroksüetüül). )piperasiin-1-üül]etaansulfoonhape, 1 mM 1, 2-bis[2-[bis(karboksümetüül)amino]etoksü]etaan, 75 mM sahharoosi ja 0,1% BSA. Homogenaati tsentrifuugiti 4 kraadi juures, kasutades jõudu 13000 × g 5 minutit. .e pellet lükati tagasi ja supernatant eraldati kaheks osaks ja fuugiti (4 kraadi) 13000 × g jõul 5 minutit. Toormitokondrite pellet eraldati ja tsentrifuugiti uuesti eralduspuhvris 1,2-bis[2-[bis(karboksümetüül)amino]etoksü]etaaniga 12 500 × g juures 11 minutit (4 kraadi). Nii saadud pooltahke sade, mis sisaldas saastamata mitokondreid, suspendeeriti uuesti eralduspuhvris (pH 7,4), mis sisaldas 75 mM sahharoosi, 20 mM 2-[4-(2-hüdroksüetüül)piperasiini-1- üül]etaansulfoonhape ja 215 mM D-mannitool [27].

Hiljem kasutati standardmeetodite abil biokeemiliste markerite määramiseks kogu aju homogenaadi mitokondriaalset fraktsiooni.

2.11. Mitokondriaalse kompleksi hindamine

2.11.1. NADH: ubikinooni oksüdoreduktaasi aktiivsus.

Kompleksi I (NADH dehüdrogenaasi) aktiivsuse määramine (nmol NADH oksüdeeritud/minutis/mg valku) määrati Kingi ja Howardi tehnikat järgides [28]. NAD+ eoksüdatiivse genereerimisega NADH-st kaasneb tsütokroom c redutseerimine. Testisegu koosnes tsütokroom c-st (10,5 mM), 2 mM diglütsiinipuhvris lahustatud 6 mM nikotiinamiidadeniinnukleotiidist (DPNH) ja diglütsiini puhvrist (0,2 M, pH 8,5).

Reaktsiooni käivitamiseks lisati analüüsilahusesse lahustuv mitokondriaalne fraktsioon. .e optilise tiheduse (OD) muutust λmax � 550 nm juures jälgiti 120 sekundit.2.11.2. Suktsinaat: ubikinooni oksidoreduktaasi aktiivsus.. suktsinaatdehüdrogenaasi (kompleks II) aktiivsuse määr kvantifitseeriti (nmol suktsinaadi oksüdeeritud / minut / mg valku), järgides Kingi [29] tehnikat.

Merevaikhappe oksüdatsiooni käivitab näidiselektronide vastuvõtja kaaliumtsüanoferraat (K3Fe(CN)6). .e analüüsisegu, mis koosnes merevaikhappest (0,63 M), 1% BSA-st, K3Fe(CN)6-st (0.036 M) ja Na+-K+ [PO4]2- puhver (0,23 M, pH 7,6). Reaktsiooni käivitamiseks lisati analüüsilahusesse lahustuv mitokondriaalne fraktsioon. .e variatsiooni OD-s λmax � 420 nm juures jälgiti 120 sekundit.

2.12. Oksüdatiivse stressi biomarkerite määramine2.12.1. iobarbituurhappega reageerivad ained (TBARS). TBARS-i (nmol valgu mg kohta) [30] hindamiseks homogeniseeriti analüüsikombinatsioon (lõppkogus ~4 ml) aju, 1,51 ml 4, 6-dihüdroksü-2-merkaptopürimidiini (0,8%), 200 µl SLS-i (8,18%), 1,49 ml jää-äädikhapet (21%, pH 3,51) ja 0,71 ml deioniseeritud vett veevannis kuumutamine 96 kraadi juures 60 minutit.

Analüüsitavale segule lisati 15:1 butüülalkoholi/asabenseeni suhe (5,1 ml), mida tsentrifuugiti 4, 000 × gvõimsusel (10 minutit) ja supernatant eraldati. Topeltkiire UV1700 spektrofotomeetriga (Shimadzu, Jaapan) hinnati kromofoori malondialdehüüdi-4, 6-dihüdroksü-2-merkaptopürimidiini OD lainepikkusel (λmax � 532 nm) ja . 4,6-dihüdroksü-2-merkaptopürimidiini aduktide arvutamiseks kasutati 105/M/cm (molaarne ekstinktsioonikoefitsient).

2.12.2. Vähendatud glutatiooni (Lc-glutamüül-L-tsüsteinüülglütsiini) tase. L-glutatiooni (GSH) sisalduse hindamiseks rakendati Ellmani [31] protseduuri. Testi segu, mis hõlmas homogenaati (1,1 ml) ja 1 ml 4% 2-hüdroksü-5-sulfobensoehapet (5-SSA), tsentrifuugiti (4 kraadi) 11 minutit võimsusel 2500 × g .

Hiljem 2,8 ml Na+-K+[PO4]2- puhvrit (51,2 mM, pH 7,77) ja {{10}},21 ml 3-karboksü{{13 }}nitrofenüüldisulfiid (0,12 mM, pH 7,89) segati ülalpool eraldatud supernatandiga (0,12 ml). Tripeptiid (µmolGSH valgu mg kohta) kvantifitseeriti kahekiirelise UV1700 spektrofotomeetriga (λmax � 412 nm). rakendadesε � 1,36 × 104/M/cm.

2.12.3. Glutatioonperoksidaasi aktiivsus. Glutatioonperoksidaasi (GPx) aktiivsust (EC 1.11.1.9) hinnati Mohandase et al. tehnikat rakendades. [32]. .eanalyze segu, mis koosnes 100 µl 10% homogenaadist, 100 µl naatriumasiidist (1,11 mM), 100 µl EDTA-st (1,13 mM), 40 µl glutatioon-disulfiid-reduktorist (GSR, 1 IU/ml) (EC1.8.1.7), 10 µl H2O2 (0,28 mM), 40 µl Lc-glutamüül-L-tsüsteinüülglütsiini (1,2 mM), 100 µl koensüüm II redutseeritud tetranaatriumsoola (0,22 mM) ) ja 0,12 M 1,49 ml Na+-K+ [PO4]2- puhvrit (pH 7,4) kogu koguses 2000 µl. .e koensüüm II-ga redutseeritud tetranaatriumi kadu λmax � 340 nm juures dokumenteeriti temperatuuril 25 kraadi.

GPx kiirus arvutati kui nmol oksüdeeritud NADPH/minutis/mg valku, kasutades ε � 6,22 × 103/M/cm.

2.12.4. Superoksiidi dismutaasi aktiivsus. SOD (EC1.15.1.1) toime kiirust (ühikut mg valgu kohta) arvestati Kakkar et al. protseduuriga. [33]. .e reaktsioonisegu hõlmas 0,3 ml homogenaati, 100 µl 5-metüülfenasiiniummetüülsulfaati (197 µM) ja 1,3 ml naatriumdifosfaati, kasutades 200 µl -nikotiinamiidadeniindinukleotiidi (DPNH) (780 ja DPNH) peatati 60 sekundit hiljem, kasutades selles segus 1 ml glacial CH3COOH.

Tekkinud kromogeeni kogus arvutati, märkides värvitugevuse λmax� 56{{10}} nm juures.2.12.5. Katalaasi aktiivsus. Katalaasi (EC1.11.1.6) toime kiiruse hindamiseks võetakse analüüsitud segu (3{28}} ml) OD erinevus (λmax � 24{24}} nm), mis sisaldab 50 µl uuritavat proovi, 1,22 ml H2O2. (0,03 M) Na+-K+ [PO4]2- puhvris (pH 7,91, 0,06 M) ja 1,63 ml 0,06 M Na+-K+ [PO4]{{33} } puhvrit (pH 7,1). Katalaasi aktiivsus (µmol H2O2 lagunemist minutis aju valgu mg kohta) arvutati, kasutades ε � 43,6/M/cm [34].

2.12.6. Terve nitritite tase. .e Sastry jt tehnika.[35] rakendati kogu aju nitritite (μmolper mg ajuvalgu) hindamiseks. Katseklaasides, mis sisaldasid 100 µl uuritavat proovi, 145 mg vase-kaadmiumi amalgaami, 500 µl H2CO3 puhvrit (pH 8,89), 0,44 M 100 µl NaOH ja 119,8 mM tsentrifuugiti 50 µl 40 4SO juures. 10 minutit ja üleliigne ülemine vedelik (supernatant) eraldati.

Griessi kemikaal (50 µl) lisati 100 µl üleliigsesse vedelikku. Pärast 60-minutilist inkubeerimist märgiti kahekiirelise UV1700 spektrofotomeetri (Shimadzu) abil OD (λmax � 548 nm lainepikkus). Kavandati tüüpiline dilämmastikhappe naatriumi kõver (0,02–0,2 mM) ja kogu nitrit võrdsustati.

2.12.7. Valkude üldsisalduse määramine. Üldine valgu tase (mg/ml homogenaadi kohta) arvutati veise seerumi albumiini ebatüüpilise kõverusgraafiku abil, mille lahuse tugevus oli vahemikus 0,3 kuni 3,8 mg/ml. Uurimiskombinatsioon korraldati 250 µl homogenaadi, 5,1 ml Lowry reagendi, Na+-K+ [PO4]2- puhvriga (900 µl) ja 1,1 N 500 µl FCR-iga. OD erinevust täheldati lainepikkusel λmax � 650 nm [36].

2.13. Aju sektsioonide histopatoloogia. Gravitatsiooniga toidetud difusiooniseadet kasutades difundeeriti rotid intrakardiaalselt (vasaku vatsakese kaudu) 10% neutraalse puhverdatud formaldehüüdi (10% NBF) lahusega ja anesteseeriti ägedalt. Hipokampus ja kortikaalsed sektorid sukeldatakse fiksaatorisse (10:1 fiksaator: koeproportsioon), nimelt 10% NBF-i üheks nädalaks (4 kraadi), millele on lisatud 0,04% naatriumasiidi (pH 7,4).

Etüülalkoholi (70%) kasutati 4 kraadi juures hoitud fikseeritud koeportsjonite pakkimislahusena. Õhukeste osade (8, 0 μm) saamiseks kasutati mikrotoomi lõikurit (pöörlemistüüp), mis seejärel värviti värvaine hematoksüliini ja eosiiniga (H&E). slaidid muudeti püsivaks DPX-vaigu abil, mis hiljem kaeti kaanega ja kontrolliti läbi optilise mikroskoobi (binokli) 40-kordse suurendusega.

2.14. Statistiline analüüs. Kvalifitseeritud eksperimenteerija pimestas loomade rühmadele antud mitmesugused ravimirežiimid, uuris ja hindas andmeid. Kõrvalekalded ei olnud andmetes pragmaatilised (Grubbi test) ning Kolmogorovi-Smirnovi test ja Levene test kinnitasid vastavalt muutujate normaaljaotust ja dispersiooni homogeensust (HOV p > 0.05, Levene test).

Muidu ebavõrdse dispersiooni korral (HOV p < {{0}}.05, Levene test), Welchi ANOVA (p < 0.05, F'-statistika) ja Rakendada saab Games – Howelli post hoc teste. Normaalselt jaotunud muutujate keskmisi kontrolliti ja seostati kahesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) ühesuunaliste või korduvate mõõtmistega. ANOVA puhul on tulemused F-statistikas olulised (p < 0,05), kasutati mitut võrdlustesti, nimelt Tukey HSD (aus oluline erinevus) või Bonferroni. Statistiliseks olulisuseks loeti p < 0,05 ja tulemused esitati kui keskmine ± keskmise standardviga (SEM).

3. Tulemused

3.1. DSM-i tulemused kehamassi (g), dieedi ja vee kohta QA-ICV-ga manustatud rottide allaneelamine. Kehakaalu, sööta ja vee allaneelamist analüüsiti kord nädalas, alates päevast 1. Märkimisväärne kehamassi (g), sööda ja vee tarbimise vähenemine (p < 0,001) 7., 14. ja 21. päeval oli pragmaatiline rottidel, kellele manustati 1. päeval QA-ICV süsti, võrreldes tošami kolleegidega. (Joonis 2).

DSM (100 mg/kg) annustamine põhjustas kehakaalu olulise tõusu (7. päev < 0.05, 14. päev < {{14} }.01, 21. päev p < {{20}},001), sööt (7p < 0,05, 14. päev p < 0,01, 21. päev p < 0,001) ja vee tarbimine (7. päev p < 0,01, 14. päev p < 0,05) rottidel QA-ICV vastu.

DSM (50 mg/kg) vähendas oluliselt ka QA-ICV poolt käivitatud kehakaalu langust (päev 21 p < 0.05) ja söödatarbimist (7. päev p <) 0.{{20}}1) rottidest, võrreldes rottidega, kes said QA-ICV süsti. QA-ICV ja DNP-ga töödeldud rotid näitasid kehamassi (g) olulist suurenemist (päev 7p < 0.05, päev 14 p < 0,001, päev 21 p < 0,001), sööt (päev 7p < 0,001, päev 14 p < 0,01, päev 21 p < 0,001) ja veetarbimine (päev 7, 14, 21 p < 0,01) võrreldes rottidega, kes jäid kokku puutuma üksiku QA-ICV-ga.

3.2. DSM-i mõju liikumisele, motoorika koordinatsioonile ja rottide kõnnakule QA-ICV suhtes. Selles uuringus ei mõjutanud QA-ICV ega ravimite ravi loomade lokomotoorset aktiivsust.

QA rühm ei kujutanud aktofomeetriaaparaadis olulist muutust 5 minuti keskmises loenduses võrreldes võltsrühmaga (joonis 3 (a)). Rottide sensormotoorse jõudluse ja kõnnaku hindamiseks kasutati Rotarodi ja jalajälje analüüsi.

Tulemused näitasid, et QA-ICV takistas oluliselt (p < 0.001) rottide motoorset koordinatsiooni (joonis 3(b)) ja kõnnakut (joonis 3(c)), mis kajastub pöörlevalt võllilt kukkumise latentsusaja vähenemises. ja rottide sammupikkus jalajälje analüüsis võrreldes tošami kolleegidega.

QA + DSM50 ja QA + DSM100 rühmad näitasid langeva latentsuse (p < 0,05, p < 0,01) ja sammu pikkuse (p) märkimisväärset suurenemist < 0,05, p < 0,001) QA rühma suhtes.

DNP-ravi nõrgendas oluliselt QA-ICV-d ja vähendas langemise latentsust (p < 0.001) ja sammu pikkust (p < 0,001) võrreldes rottidega, kellele manustati. QA-ICV üksi. Lisaks näitas ravi DSM-iga (100 mg/kg) olulist paranemist (p < 0,01) võrreldes DSM-iga (50 mg/kg) rottidel, kellele tehti QA-ICV.

For more information:1950477648nn@gmail.com