Fc-retseptorite vahendatud immuunsuse mehhanismid ja sihtmärgid malaaria sporozoiitide vastu

Tugevalt kaitstud vaktsiin hõlbustab oluliselt malaaria eliminatsiooni saavutamist ja säilitamist. Antikehade vahendatud immuunsuse mehhanismide mõistmine on ülimalt oluline kõrge efektiivsusega vaktsiinide väljatöötamiseks. Siin tuvastame humoraalse immuunsuse võtmerollid Fc-retseptori (Fc R) interaktsioonide ja sporosoiitide opsoonilise fagotsütoosi korral.

Me tuvastame neutrofiilide olulise peamise rolli sporosoiitide fagotsüütilise kliirensi vahendamisel perifeerses veres, samas kui monotsüütidel on väike roll. Antikehad soodustavad ka looduslikku tapjarakkude aktiivsust. Mehhaaniliselt näivad antikehade interaktsioonid Fc RIII-ga olulised, kusjuures Fc RIIa on samuti vajalik maksimaalse aktiivsuse saavutamiseks. Kõik tsirkumsporosoiidi valgu piirkonnad on sporosoiitide vastaste funktsionaalsete antikehade sihtmärgid ja N-terminaalsetel antikehadel on mõnes testis suurem aktiivsus. Funktsionaalsed antikehad tekivad aeglaselt pärast loomulikku kokkupuudet malaariaga, mis esineb mõnel kokkupuutunud täiskasvanul, kuid laste seas harva. Meie leiud näitavad immuunsuse sihtmärke ja mehhanisme, mida saaks vaktsiini kavandamisel ära kasutada, et maksimeerida efektiivsust.

Malaaria on endiselt suur ülemaailmne terviseprobleem, kuna P. falciparum malaaria põhjustab igal aastal ~219 miljonit kliinilist juhtumit ja 435 surmajuhtumit1. Vaatamata rahvusvahelistele tõrjepüüdlustele on malaariakoormus viimastel aastatel püsinud muutumatuna1. Malaaria tõrjeks ja kõrvaldamiseks on suur vajadus ülitõhusa vaktsiini järele, mida rõhutavad veelgi suurenevad teated malaariavastaste ravimite resistentsuse ja insektitsiidide resistentsuse kohta1. Maailma Terviseorganisatsioon ja rahastamispartnerid seadsid eesmärgiks töötada aastaks 2030 välja vaktsiin, mille efektiivsus on suurem või võrdne 75%ga2, mille saavutamine on osutunud keeruliseks3,4. Tugevamat kaitsvat immuunvastust tekitavate strateegiate väljatöötamiseks on vaja paremini mõista immuunsust vahendavaid mehhanisme.

Immuunsuse parandamine igapäevaelus nõuab heade eluharjumuste säilitamist. Magamamineku ja ärkamise ajakava koostamine ja järgimine võib soodustada ööpäevarütmi normaalset toimimist. Vältige kõrge kalorsusega pühadetoite ja vältige happeliste või vürtsikate toitude söömist, mis võivad raskendada seedimist. Valige kerge õhtusöök värskete toodetega. Piirata elektroonikaseadmete kasutamist. Unetsükleid ja unekvaliteeti muutes võib ekraanivalgus meelitada meid mitu korda öösel ärkama. Vältige rasket treeningut varaõhtul. Soovitatav on vähemalt kaks tundi. Treening stimuleerib adrenaliini vabanemist ja tõstab pulssi, mis aktiveerib meie une. Lisaks saame alla neelata ka Cistanche deserticola. Cistanche deserticola polüsahhariidid ja verbaskosiid võivad tugevdada immuunsust. Cistanche deserticola polüsahhariidid ja verbaskosiid võivad suurendada südame- ja ajukoe ensüümi aktiivsust ning tugevdada kõhukelmerakkude fagotsüütilist funktsiooni ja lümfotsüütide proliferatsioonivastust.

Klõpsake, millal võtta cistanche

Malaariaga nakatumine saab alguse nakatunud Anopheles sääsehammustusest, mille käigus nakatatakse sporosoidid pärisnahasse5. Seejärel rändavad sporosoidid veresoontesse, ringlevad vereringes maksa ja tekitavad hepatotsüütides infektsiooni. Sporosoidid on malaariavaktsiinide esmatähtis sihtmärk, sest sporozoitide puhastamine peatab nakkuse enne kliinilise malaaria tekkimist3. Loommudelites ja vaktsiinikatsetes tehtud uuringud on näidanud, et antikehad on sporosoiitide vastase immuunsuse peamine vahendaja (vaadatud viites 3). Siiski ei mõisteta hästi seda, kuidas antikehad sporosoitide puhastamiseks ja nakkuste vältimiseks mehhaaniliselt toimivad ning funktsionaalsete antikehade spetsiifilisi sihtmärke. Nendes küsimustes on vaja uusi teadmisi, et hõlbustada tõhusamate vaktsiinide väljatöötamist.

Circumsporosoite valk (CSP) on sporosoiitide6 pinnal kõige levinum valk ja inimese antikehade6 peamine sihtmärk. CSP-põhised vaktsiinid on praeguseks edestanud teisi vaktsiini antigeene, kuigi efektiivsus jääb alla optimaalse3. Kõige arenenum malaariavaktsiin RTS, S, põhineb CSP kärbitud vormil (sisaldab ainult keskmist korduspiirkonda ja C-terminaalset piirkonda) ning saavutas kliinilise malaaria vastu tagasihoidliku efektiivsuse (29–36 protsenti) III faasi kliinilises uuringus7. CSP keskset korduvat piirkonda peetakse oluliseks antikeha sihtmärgiks ja järelikult on antikehade potentsiaalset tähtsust mittekorduvate piirkondade suhtes alauuritud8, kuid see võib olla oluline. C-terminaalse piirkonna antikehi seostati kaitsega RTS- ja S-vaktsiiniuuringutes lastel9.

Antikehade funktsionaalsete mehhanismide osas on enamik avaldatud uuringuid keskendunud CSP keskse korduva piirkonna antikehade otsesele inhibeerivale aktiivsusele, mis võib inhibeerida sporosoiitide liikuvust ja hepatotsüütide invasiooni in vitro 10–17. Muude potentsiaalselt oluliste immuunsuse mehhanismide ja sihtmärkide kohta on vähe teada.

Peamine immunoloogiline mehhanism, mida üha enam tunnustatakse viiruslike ja bakteriaalsete patogeenide 18–21 vastase immuunsuse puhul, on antikehade võime interakteeruda erinevate rakutüüpide Fc retseptoritega (Fc R), mis põhjustab opsoonilist fagotsütoosi või otsest tsütotoksilisust. Sporosoidi antigeenide vastastes antikehades domineerivad tavaliselt IgG1 ja IgG3 alamklassid13, millel on tugev potentsiaal suhelda Fc Rs22-ga. Siiski on praegu vähe teada nende potentsiaalsete mehhanismide kohta sporosoitide immuunsuses. Peamiste fagotsüütiliste rakutüüpide hulka kuuluvad monotsüüdid ja neutrofiilid (vastavalt 2–10 protsenti ja 45–70 protsenti perifeersetest valgeverelibledest).

Lisaks fagotsütoosile võivad neutrofiilid ja looduslikud tapjarakud (NK) rakke tappa ka antikehast sõltuva rakulise tsütotoksilisuse (ADCC)23,24 kaudu ning nii monotsüütidel kui neutrofiilidel on ka laiem immuunmõju aktivatsioonimarkerite, tsütokiinide, ja kemokiinid (vaadatud viidetes 25–27).

Fc R ekspressioonimustrid erinevad monotsüütide ja neutrofiilide vahel, mis mõjutab nende funktsioone immuunsuses. Kuna sporosoidid kujutavad endast esimest sammu malaariainfektsiooni algatamisel, puutuvad sporosoidid potentsiaalsete fagotsüütiliste rakkudega tavaliselt puhke- või homoeostaatilises olekus, mitte aktiveeritud olekus.

Puhkefaasi monotsüüdid ekspresseerivad valdavalt FcRI ja FcRIIa, kusjuures väike alamhulk ekspresseerib Fc RIIIa28, samas kui puhkefaasi neutrofiilid ekspresseerivad FcRIIa ja Fc RIIIb29 ning madalal tasemel Fc RIIIa30 (mis on funktsionaalselt oluline). Antikehade ja erinevate Fc R-de vaheliste spetsiifiliste interaktsioonide hindamine on seetõttu oluline, et mõista erinevate fagotsüütide potentsiaalset rolli immuunsuses. IgG alamklass, glükosüülimine ja epitoobi spetsiifilisus võivad igaüks mõjutada interaktsioone erinevate Fc Rs22-ga.

Sporosoididele suunatud Fc R-vahendatud mehhanismide määratlemine võib paljastada teadmisi, mida saaks kasutada sporosoidipõhiste vaktsiinide kaitsetõhususe suurendamiseks. Selles uuringus paljastame immuunrakkude spetsiifiliste Fc R-ide poolt vahendatud sporozoitide vastase immuunsuse olulised mehhanismid ja sihtmärgid. Töötame välja meetodid, et mõõta antikehade ja spetsiifiliste Fc R-ide vahelisi interaktsioone ning tuvastada spetsiifilisi antikeha omadusi, antigeenseid sihtmärke ja Fc R-sid, mis on olulised optimaalse funktsionaalse aktiivsuse jaoks. Lisaks kvantifitseerime funktsionaalsete Fc R-sõltuvate antikehavastuste omandamist lastel ja täiskasvanutel, kes on loomulikult malaariaga kokku puutunud. Meie leiud näitavad olulisi immuunmehhanisme sporosoiitide vastu ning pakuvad välja strateegiad ja antigeensed sihtmärgid ülitõhusa malaariavaktsiini väljatöötamiseks.

Tulemused

Sporosoiitide opsoonilist fagotsütoosi vahendavad valdavalt perifeerses veres neutrofiilid.

Fc R-vahendatud mehhanismide olulisuse uurimiseks sporosoiitide vastu tegime esmalt opsoonilise fagotsütoosi testid, kasutades diferentseerumata THP-1 rakuliini (pro-monotsüütilised rakud) standardtingimustes 31, 32 (täiendav joonis 1A). Sporosoiitide opsoniseerimiseks kasutasime Keenia täiskasvanute seerumi antikehi, kes elavad piirkonnas, kus on suur malaaria leviku intensiivsus ja millel on märkimisväärne kliiniline immuunsus malaaria ja CSP33 vastaste antikehade suhtes. Opsoniseeritud P. falciparum sporosoiite fagotsüteerisid tõhusalt THP-1 rakud kontsentratsioonist sõltuval viisil vähese fagotsütoosiga, kasutades malaaria varem mittesaanud doonorite (Melbourne'i elanikud) antikehi (täiendav joonis 1B). Üksikute seerumite poolt vahendatud opsooniline fagotsütoos oli väga reprodutseeritav (r=0.925, P < 0.001; täiendav joonis 1C).

Opsoonilise fagotsütoosi analüüsi jaoks suure hulga elujõuliste sporosoiitide genereerimisega seotud väljakutsete ületamiseks kasutasime sporosoiitide opsoonilise fagotsütoosi asendusmeetmena täispika CSP-ga kaetud fluorestseeruvaid helmeid, mis on peamine sporosoiitidel ekspresseeritud antigeen. Erinevate Keenia täiskasvanute antikehaproovidega opsoneeritud CSP-ga kaetud helmed fagotsüteeriti tõhusalt THP-1 rakkude poolt ja CSP-ga kaetud helmeste opsooniline fagotsütoos oli tugevas korrelatsioonis P. falciparum sporosoiitide opsoonilise fagotsütoosiga (r {{4). }}.831, P=0.0015, täiendav joonis 1D). Seetõttu pakkusid CSP helmed tõhusa platvormi antikehade vahendatud opsoonilise fagotsütoosi mehhanismide ja sihtmärkide uurimiseks.

Seejärel uurisime rakutüüpe, mis vahendavad opsoonilist fagotsütoosi terve leukotsüütide testis värske verega, kasutades algselt CSP helmeid, mis olid opsoniseeritud polüklonaalse küüliku antikehaga CSP vastu. Huvitaval kombel oli fagotsütoosi kiirus (fagotsütoositud helmeste arv raku kohta) palju suurem neutrofiilide kui monotsüütide puhul (joonis 1A, B). Kuna me kvantifitseerisime fagotsütoosi määra, ei ole neutrofiilide suurem aktiivsus lihtsalt seletatav nende suurema arvukusega võrreldes monotsüütidega. Opsooniline fagotsütoos suurenes antikehade kontsentratsiooni suurenedes ja neutrofiilide kõrgemat suhtelist aktiivsust võrreldes monotsüütidega täheldati antikehade kontsentratsioonide ja helmeste ja rakkude suhete vahemikus. Neutrofiilide suurem fagotsütoosi aktiivsus kinnitati värskelt isoleeritud elussporosoiitide abil (kasutasime transgeenseid P. berghei sporosoite, mis ekspresseerivad P. falciparum CSP-d, mis asendab endogeenset P. berghei CSP geeni12, millele viidatakse kui PfCSP-P. berghei). Keenia malaariaga kokkupuutunud doonorite antikehadega opsoniseeritud sporosoiitide opsoonilist fagotsütoosi vahendasid valdavalt neutrofiilid, kus monotsüütide fagotsütoos oli madal, ja neutrofiilid, millel oli suurem fagotsütoosi määr (joonis 1C). Tegime ka analüüse, et võimaldada fagotsütoosi jaoks pikemat aega (kuni 60 minutit), kuid me täheldasime siiski palju suuremat fagotsütoosi neutrofiilide poolt võrreldes monotsüütidega (täiendav joonis 2A).

Monotsüütide populatsiooni edasine analüüs näitas, et suurem osa fagotsütoosist oli klassikalise alarühma (CD14 kõrge CD16-; joonis 1D ja täiendav joonis 2B-D) poolt. Oma leidude toetamiseks näitasime lisaks, et puhastatud neutrofiilid võivad tõhusalt fagotsütoosida antikehadega opsoniseeritud P. falciparum sporosoiite (joonis 1E). CSP-spetsiifiliste antikehade kahanemine rekombinantse CSP-ga eelinkubeerimisel vähendas sporosoiitide fagotsütoosi 70 protsenti võrreldes ammendumata prooviga (joonis 1F ja täiendav joonis 3). Kasutasime täiendavat lähenemisviisi, et saada tõendeid CSP kui omandatud funktsionaalsete antikehade sihtmärgina inimese immuunsuses, testides korduvate sporosoidiinfektsioonidega kokkupuutunud isikult eraldatud mAb (MGG4)34. mAb indutseeris sporosoiitide olulise fagotsütoosi, samas kui mitteimmuunsete inimese antikehade või anti-CSP MAb (2A10) kasutamisel, mis oli muteeritud Fc piirkonnas, et inhibeerida Fc R interaktsioone (joonis 1G), esines fagotsütoosi vähe.

Sporosoiitide opsoonilises fagotsütoosis osalevate Fc retseptorite määratlemine.

Opsoniseerisime terved P. falciparum sporosoidid ja CSP helmed Keenia täiskasvanute antikehadega ja mõõtsime neutrofiilide opsoonilist fagotsütoosi spetsiifiliste Fc R-d blokeerivate antikehade juuresolekul. Neutrofiilidel oli nii CSP helmeste kui ka P. falciparum sporosoiitide opsooniline fagotsütoos oluliselt madalam Fc RIIa või Fc RIII blokaatorite juuresolekul (joonis 2A, B ja täiendav joonis 4A), mis viitab sellele, et mõlemad retseptorid olid olulised.

Eelkõige oli Fc RIII blokaad P. falciparumi sporozoitide või CSP helmeste fagotsütoosi pärssimisel kõige tõhusam, Fc RIIa blokaadi toime nõrgem. Fc RI blokeerimine ei mõjutanud neutrofiilide opsoonilist fagotsütoosi. Blokeerivate antikehade kontsentratsiooni tiitrimine näitas, et olime saavutanud iga Fc R blokaadi maksimaalse efekti (täiendav joonis 4B).

Seetõttu kombineerisime Fc RIIa ja Fc RIII blokeerivad antikehad ning leidsime, et see inhibeerib fagotsütoosi rohkem kui kummagi blokeeriva antikeha kasutamine, mis viitab veelgi mõlema Fc R tüübi tähtsusele optimaalse fagotsütoosi jaoks (joonis 2B). Need tulemused on kooskõlas Fc Rs ekspressiooniga puhke neutrofiilidel, mis ekspresseerivad valdavalt Fc RIIa ja Fc RIIIa/b, kuid millel puudub Fc RI35 (täiendav joonis 2C). Fc RIII tähtsus CSP helmeste ja sporosoiitide opsoonilise fagotsütoosi vahendamisel võib osaliselt seletada monotsüütide suhteliselt madalat aktiivsust, kuna peamised monotsüütide alamrühmad ekspresseerivad pinnal vähe Fc RIIIa aktiveerimata olekus ja ei ekspresseeri Fc RIIIb35. THP-1 rakke kasutatakse laialdaselt monotsüütide fagotsütoosi mudelina ja need ekspresseerivad kõrgelt Fc RI36, mis on seotud monomeerse IgG-ga (samas, kui neutrofiilide poolt ekspresseeritud Fc RIIa ja Fc RIII seonduvad ainult immuunkompleksidega).

Sellest lähtuvalt avastasime, et THP-1 rakkude opsoonilist fagotsütoosi standardtingimustes (mis sisaldas ainult 10 protsenti FCS-i ja ei sisalda inimese seerumit) inhibeeris tugevalt Fc RI blokaator, kuid Fc RIIa blokeerija inhibeeris seda piiratud ulatuses ja mitte ühtegi Fc-ga. RIII blokeerimine (joonis 2C). See viitas sellele, et interaktsioon IgG ja Fc RI vahel oli eriti oluline THP-1 rakkude jaoks, mis on neutrofiilide puhul täheldatud kontrastsed tulemused. Seetõttu muutsime standardset THP-1 testi, et muuta see füsioloogiliselt asjakohasemaks, lisades analüüsikeskkonda inimseerumi.

Täiendava 2,5% inimese seerumi juuresolekul (nagu seda kasutati kogu leukotsüütide ja neutrofiilide analüüsides) esines opsoonilist fagotsütoosi palju vähem (joonis 2D), arvatavasti inimese seerumis esineva mitteimmuunse monomeerse inimese IgG seondumise tõttu. Fc RI-le. Need leiud võivad veelgi selgitada primaarsete monotsüütide madalat fagotsüütilist aktiivsust, mida täheldati kogu leukotsüütide analüüsis inimese seerumi juuresolekul; veise IgG (esineb FCS-is) ei seo inimese Fc RI37.

Arvestades Fc RIII näilist tähtsust, mõõtsime ADCC testides täiendavalt CSP-vastaste antikehade funktsiooni Kenya täiskasvanute seas, kuna Fc RIII interaktsioonid mängivad võtmerolli ADCC vahendamisel NK-rakkude kaudu. Testisime Kenya täiskasvanute kohorti (Kanyawegi kohorti) proovide valikut, et esindada kõrge, keskmise ja madala reageerimisvõimega (n=31) testis ADCC reporterrakuliini, mis ekspresseerib ainult Fc RIIIa. Keenia täiskasvanute seas looduslikult omandatud antikehadel oli märkimisväärne aktiivsus, samas kui Melbourne'i malaaria varem mittesaanud doonorite antikehadel ei olnud (joonis 2E, F). Need leiud viitavad sellele, et CSP-vastased antikehad võivad samuti soodustada ADCC aktiivsust Fc RIIIa kaasamise kaudu. Seejärel testisime primaarsete NK-rakkude aktiivsust värskes veres, kasutades väljakujunenud degranulatsioonianalüüsi 38. NK-rakkude inkubeerimine koos Keenia täiskasvanud antikehade poolt opsoniseeritud CSP-helmestega viib primaarsete NK-rakkude degranulatsioonini (joonis 2G, H). Aktiivsus varieerus testitud proovide lõikes ja korreleerus oluliselt Fc RIII seondumisega (r=0.538, P=0.002, joonis 2H), kuid nõrgalt korreleerus IgG ja CSP-ga (r {{10} }.127, P=0.489, n=31).

Fc RIII ja Fc RIIa otsene seondumine antikeha-antigeeni kompleksidega.

Töötasime välja Fc R-sidumise testid, kasutades Fc RIIa ja Fc RIII, mida ekspresseeriti ja puhastati dimeeridena, et nad saaksid suhelda antigeeni-antikeha kompleksidega39. Keenia täiskasvanutel oli kõrge CSP-vastaste antikehade levimus ja ulatus, mis võisid interakteeruda Fc RIIa ja Fc RIII dimeeridega (joonis 3A). Üldiselt loeti 67,3 ja 61,5 protsenti proovidest (n=104) Fc RIIa ja Fc RIII seondumise suhtes positiivseks. Kuigi mõlema Fc R seondumisel oli proovide vahel tugev positiivne korrelatsioon (r=0.71, P< 0.0001, n = 104) (Fig. 3B), some individual samples demonstrated high binding to one FcγR and low binding to the other. Furthermore, the ability of antibodies to CSP to promote direct binding of FcγRIII was significantly correlated with ADCC tested by the ADCC reporter cell line (r = 0.405, P = 0.022, Fig. 2F) and primary NK cells (r = 0.538, P = 0.002, Fig. 2H). FcγRs occur in populations as different alleles40. 

Seetõttu testisime IgG-vahendatud seondumise osas Fc RIIa (R131, H131) ja Fc RIII (F158, V158) erinevaid alleele39. Avaldatud andmed näitavad, et need alleelid on meie uuringupopulatsioonis levinud41. CSP-vastased antikehad soodustasid tõhusalt Fc RIIa ja Fc RIII mõlema alleeli seondumist. Erinevate alleelide vahel esines kõrge korrelatsioon Fc R seondumises; rho=0.8371 Fc RIIa jaoks ja rho=0.78 Fc RIII jaoks (joonis 3C, D).

Funktsionaalsete antikehade sihtmärgiks olevad CSP piirkonnad.

Meie varasemad andmed näitasid, et CSP oli fagotsütoosi soodustavate inimese antikehade oluline sihtmärk (joonis 1F, G). Seetõttu uurisime järgmisena CSP erinevaid piirkondi funktsionaalsete antikehade sihtmärkidena malaariaga kokkupuutunud inimestel, kasutades kolme CSP konstruktsiooni: (i) sünteetilist peptiid, mis esindab NT piirkonda (mis ei sisaldu RTS, S vaktsiinis) (ii). ) sünteetiline peptiid, mis esindab korduspiirkonda (NANP kordused), (iii) rekombinantne valk, mis esindab CT piirkonda. Iga konstruktsioon kaeti eraldi fluorestseeruvatele helmestele (küllastuskontsentratsioonidel) ja opsoneeriti Kenya seerumite kogumiga. Antikehad soodustasid tõhusalt iga konstruktiga kaetud helmeste neutrofiilide fagotsütoosi (joonis 4A).

Seejärel hindasime looduslikult omandatud antikehi CSP piirkondade vastu nende võime osas soodustada Fc RIIa ja Fc RIII seotust. Inimese antikehad seondusid iga CSP piirkonnaga piisava tihedusega, et soodustada Fc RIIa ja Fc RIII seondumist (joonis 4B). Kuna IgG seondumise kogutase varieerus erinevate CSP konstruktide lõikes (täiendav joonis 5), standardisime Fc RIIa ja Fc RIII seondumise IgG reaktiivsuse taseme suhtes (nimetatakse Fc R-sidumise efektiivsuseks). Meie andmed näitasid, et NT piirkonna antikehadel oli suurem potentsiaal kaasata Fc R-e kui tsentraalsetel kordus- ja CT piirkondadel (aktiivsus oli NT piirkondade puhul oluliselt kõrgem võrreldes CT või NANP piirkondadega, P < 0,001 iga võrdluse korral) .

Lisaks hindasime erinevate piirkondade olulisust funktsionaalsete antikehade sihtmärkidena, kasutades fagotsütoosianalüüsides spetsiifiliste piirkondade ja tervete sporosoiitide vastu genereeritud antikehi. Esmalt kinnitasime, et küüliku CSP-vastased antikehad võivad soodustada sporosoiitide fagotsütoosi. Nende antikehadega opsoniseeritud P. falciparumi sporozoidid andsid kõrge fagotsütoosiindeksi (40,5 protsenti) võrreldes kontrolliga (joonis 4C). Seejärel tuvastasime, et P. falciparum CSP (mAb 2H8, hiire IgG2a alamklass)33 vastane teadaolev mAb soodustas olulist fagotsütoosi (17,4 protsenti, joonis fig 4D), mis oli suurem kui negatiivse kontroll-mAb 3D11 puhul. sihib P. berghei CSP-d, millel ei ole NANPrepeati epitoopi (joonis 4D). NANP-korduspiirkond kodeerib immunodominantset epitoopi, samas kui NT ja CT piirkondade tähtsusest antikehade sihtmärkidena on teada palju vähem.

Antikehade rolli täpsemaks määratlemiseks CT ja NT piirkondades ning komplementaarsete andmete täiendamiseks, kasutades inimese antikehi, genereerisime iga piirkonna jaoks küüliku polüklonaalsed antikehad (täiendav joonis 6) ja kasutasime neid antikehi transgeense PfCSPP opsoniseerimiseks. berghei sporosoidid neutrofiilide fagotsütoosi jaoks. Küüliku polüklonaalsed antikehad nii CT kui ka NT piirkondade vastu soodustasid tõhusalt PfCSP-P fagotsütoosi. berghei sporosoidid (joonis 4E). Kuna vaktsineeritud küüliku seerumite IgG kontsentratsioon CT-s ja NT-s erines (täiendav joonis 6), hindasime fagotsütoosi efektiivsust ja antikehi IgG tasemete suhtes (arvutati fagotsütoosi aktiivsuse jagamisel ELISA abil määratud IgG reaktiivsusega). See näitas, et N-terminaalse piirkonna antikehade fagotsütoosi efektiivsus oli oluliselt kõrgem kui CT antikehadel.

Kuna NT piirkonna antikehad olid väga tõhusad Fc R-i aktiveerimisel ja opsoonilise fagotsütoosi soodustamisel, teostasime NT piirkonna vastaste küüliku polüklonaalsete antikehade epitoobi kaardistamise, kasutades kattuvat peptiidide massiivi (joonis 4F ja täiendav joonis 6D). Epitoopide kaardistamiseks sobis peptiidide massiiv, kuna NT piirkond on eeldatavasti struktureerimata ega sisalda tsüsteiine (PlasmoDB, https://plasmodb.org/plasmo/app/ record/gene/PF3D7_0304600). Antikehad reageerisid peptiididega, mis katsid 21-aa piirkonda (DDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQ), mis on N-terminaalse piirkonna ja NANP/NVPD korduspiirkonna vahelise ristmiku lähedal.

Fc R interaktsioone ja opsoonilist fagotsütoosi soodustavate antikehade omandamine loomuliku kokkupuute kaudu.

Analüüsime seerumiproove, mis koguti malaariaga kokkupuutunud väikelaste ja täiskasvanute rühmast, kes elasid Lääne-Keenias piirkonnas, kus malaaria leviku intensiivsus on kõrge (Chulaimbo piirkonnast, täiendav tabel 1). Sellises olukorras esineb suurem osa malaaria haigestumusest ja suremusest vanematel lastel<5 years. 

Seevastu täiskasvanutel on tugev immuunsus, mida näitab sümptomaatiliste malaariaepisoodide puudumine, kuigi võib esineda asümptomaatiline parasiteemia42. Mõõdeti CSP-spetsiifiliste antikehade võimet suhelda Fc RIIa ja Fc RIII-ga ning soodustada neutrofiilide poolt CSP helmeste opsoonilist fagotsütoosi (joonis 5-D). Iga funktsionaalse aktiivsusega antikehade üldine levimus oli neutrofiilide fagotsütoos 16% (95% CI, 9,19, 26,38%), Fc RIIa seondumine 20% (95% CI, 12,28, 30,84%) ja Fc RIII seondumisprotsent 14. (95 protsenti CI, 8,19, 24,85 protsenti). Neutrofiilide IgG reaktiivsuse tase CSP, Fc R seondumise ja opsoonilise fagotsütoosi suhtes oli väikelaste seas madal ja suurenes vanusega oluliselt.

Seevastu eluaegse kokkupuutega täiskasvanud olid omandanud lastega võrreldes oluliselt kõrgemad funktsionaalsed antikehad. Samuti hindasime antikehi, mis soodustasid verestaadiumi merosoiitide fagotsütoosi, mille esinemissagedus ja tase oli väikelaste seas oluliselt kõrgem kui funktsionaalsete CSP-antikehadega (joonised 5B, E, F). See toetab kontseptsiooni, et looduslikult omandatud immuunsus sporosoiitide suhtes omandatakse palju aeglasemalt ja selle tekkeks on vaja oluliselt rohkem kokkupuudet, võrreldes vere staadiumi immuunsusega. Uurisime, kas täiskasvanute kõrgem funktsionaalne aktiivsus tuleneb ainult CSP-spetsiifilise IgG kõrgemast kontsentratsioonist või peegeldab ka täiskasvanute antikehade kõrgemat funktsionaalset potentsiaali. Analüüsisime antikehade funktsionaalset aktiivsust IgG reaktiivsuse suhtes CSP suhtes; selleks jätsime väga madala IgG-ga isikud CSP-st välja (alla mediaan-OD 0,140) ja arvutasime iga indiviidi funktsionaalse aktiivsuse IgG taseme suhtes.

Huvitaval kombel näitas see, et suhteline fagotsütoosi efektiivsus oli täiskasvanutel oluliselt kõrgem kui lastel (joonis 5G) (Mann-Whitney test, P=0.022). Lisaks esines oluline korrelatsioon vanuse ja Fc R sidumise efektiivsuse vahel (r=0.354, P=0.031 Fc RIIa seondumisel ja r=0.572 Fc RIII seondumisel, P < 0,001).

Opsooniline fagotsütoos neutrofiilide poolt korreleerus Fc R seondumise ja tsütofiilsete IgG alamklassidega

Laiendasime oma analüüsi suuremale immuunsüsteemiga täiskasvanute rühmale Lääne-Keenias (Kanyawegi kohort, n=104), kes on suure malaaria leviku intensiivsusega piirkonnas kokku puutunud eluaegse malaariaga. Põhjendasime, et suurel osal neist täiskasvanutest on tõenäoliselt CSP-vastased funktsionaalsed antikehad, mis hõlbustab funktsionaalse opsoonilise fagotsütoosi aktiivsust määravate antikehafaktorite ja spetsiifilisuse analüüsi. Tõepoolest, paljud proovid näitasid olulist fagotsütoosi ja FcR sidumisaktiivsust. Iga funktsionaalse aktiivsusega antikehade levimus oli neutrofiilide fagotsütoos 47,1 protsenti (95 protsenti CI, 37,6, 56,9 protsenti), Fc RIIa seonduvus 67,3 protsenti (95 protsenti CI, 57,6, 75,8 protsenti) ja Fc RIII protsent (seondumine 95 protsenti 61 protsenti). , 51,7, 70,5 protsenti).

Opsooniline fagotsütoos neutrofiilide poolt oli olulises korrelatsioonis Fc RIIa seondumisega (r {{0}}.50, P < 0.001) ja Fc RIII seondumine (r=0.43, P < 0,001) (joonis 6A). Mitme muutujaga regressioonianalüüs näitas, et Fc RIII oli neutrofiilide opsoonilise fagotsütoosiga seotud peamine tegur (regressioonikoefitsient=10,15, P < 0,001, tabel 1), samas kui Fc RIIa oli vähem oluline. Varem oleme teatanud, et CSP-vastased antikehad selles täiskasvanute kohordis on valdavalt IgG1 ja IgG3, madalama IgG2 tasemega ja väga vähe IgG433. IgG1 ja IgG3 on peamised alamklassid, mis interakteeruvad Fc RIIa ja Fc RIII-ga, et soodustada fagotsütoosi, ning IgG2 aktiivsus on nõrk. Keenia täiskasvanute seas oli neutrofiilide fagotsütoos oluliselt positiivses korrelatsioonis IgG1 (r=0.32, P < 0,001), IgG2 (r=0.26, P=0.007) ja teistega. tugevalt IgG3-ga (r=0,50, P < 0,001) (joonis 6B, C, täiendav joonis 7 ja täiendav tabel 2).

Korrelatsiooni IgG4-ga ei täheldatud (r=0.09, P = 0.365), kuigi IgG4 tase oli madal. Mitmemõõtmelise regressiooni korral oli IgG3 märkimisväärselt seotud neutrofiilide fagotsütoosiga, mis viitab sellele, et see on selle aktiivsuse peamine vahendaja (täiendav tabel 3). Lisaks oli nii Fc RIIa kui ka Fc RIII seondumine märkimisväärselt korrelatsioonis IgG ja IgG alamklasside, peamiselt IgG1 ja IgG3 kogutasemega (täiendavad tabelid 2 ja 3). Üldiselt olid kõrge fagotsütoosi aktiivsusega proovid (määratletud kui keskmisest kõrgemad) oluliselt kõrgemad Fc RIIa ja Fc RIII seondumise ning IgG3 tasemed ning oluliselt kõrgemad IgG tasemed kõigis CSP piirkondades võrreldes madala fagotsütoosiga proovidega. aktiivsus (joonis 6D, E).

Sarnased tähelepanekud leiti Chulaimbo laste ja täiskasvanute kohordis. Opsooniline fagotsütoos korreleerus oluliselt Fc R seondumisega ning IgG1 ja IgG3, korrelatsioon oli tugevam Fc RIII ja IgG3 puhul (täiendavad tabelid 4 ja 5). Rakendasime neid analüüse RTS, S vaktsiini faasi 1/2a kliinilises uuringus. See näitas, et neutrofiilide poolt opsoonilist fagotsütoosi soodustavad antikehad ja Fc RIII ja Fc RIIa seondumine olid kaitstud isikute hulgas kõrgemad kui kaitsmata subjektid43.

Arutelu

Pakume tulemusi, mis määratlevad sporosoitide antikehade poolt vahendatud immuunsuse mehhanismid ja sihtmärgid interaktsioonide kaudu immuunrakkudes ekspresseeritud spetsiifiliste Fc R-idega. Meie leiud toetavad neutrofiilide võtmerolli sporosoiitide kliirensis veres, mida vahendavad Fc RIIa ja Fc RIII interaktsioonid IgG1 ja IgG3-ga, mis on suunatud peamisele sporosoidi antigeenile CSP, millele lisanduvad monotsüütide (klassikaline alamhulk) ja NK-rakud. Kasutades terveid sporosoite ja antigeeniga kaetud helmeid, tegime kindlaks, et täisvere fagotsütoos oli valdavalt neutrofiilide poolt, vastandades monotsüütidega täheldatud madalat aktiivsust. Me määratlesime peamised mehhanismid, mis on seotud spetsiifiliste Fc R-de blokeerimisega rakupindadel ja FcR dimeeride kasutamisega antigeeni-antikeha komplekside sidumiseks.

See tuvastas Fc RIIa ja Fc RIII tähtsuse ning andmed viitavad eriti Fc RIII tähtsusele. Me määratlesime selle funktsionaalse mehhanismi antikehade sihtmärgid, kasutades antikehi CSP erinevate piirkondade, erinevate helmestega kaetud CSP piirkondade ja P. falciparum CSP ekspresseerivate kimäärsete P. berghei sporozoiitide vastu. Me tuvastasime, et CSP on nende funktsionaalsete antikehade peamine sihtmärk ja kõik kolm CSP piirkonda võivad olla suunatud antikehade poolt, et siduda Fc R ja soodustada fagotsütoosi.

Täpsemalt, NT piirkonna antikehadel oli märkimisväärne aktiivsus paljudes erinevates analüüsides, andes potentsiaalse juhtpositsiooni vaktsiini väljatöötamiseks, kuna NT piirkond ei sisaldu CSP-põhistes vaktsiinides RTS, S (praegu rakendusuuringutes) või R21. (2. faasi katsetes). Lisaks tegime kindlaks, et looduslikult omandatud antikehad olid võimelised soodustama sporosoiitide opsoonilist fagotsütoosi. Funktsionaalsete antikehade omandamine sõltus vanusest ja opsoonilise fagotsütoosi aktiivsuse kõrgemat taset ja Fc RIIa ja Fc RIII seondumist täheldati ainult täiskasvanute, kuid mitte väikelaste proovide puhul. Funktsionaalne aktiivsus korreleerus IgG1 ja IgG3 alamklassidega.

Neutrofiilide kõrgem fagotsütoosi aktiivsus, kuid monotsüütide väga madal aktiivsus võib olla seotud erinevate Fc R-de olemasolu ja kasutamisega; neutrofiilidel oli suurem fagotsütoosi määr, mis ei olnud lihtsalt seletatav neutrofiilide suurema arvukusega võrreldes monotsüütidega. Huvitav on see, et Fc RIIa või Fc RIIIa/b blokeerimine pärssis neutrofiilide fagotsütoosi aktiivsust, mis viitab sellele, et fagotsütoosi jaoks on vajalikud mõlemad retseptorid, mida toetas suurema inhibeerimise saavutamine Fc RIIa ja Fc RIII vastaste blokeerivate antikehadega, mida kasutati kombinatsioonis. Fc RI blokeerimine ei mõjutanud neutrofiilide fagotsütoosi. Mitmed tähelepanekud viitasid Fc RIII suuremale tähtsusele; sporosoidide fagotsütoosi pärssimine oli üldiselt suurem Fc RIII blokaadi tõttu ja Fc RIII seondumine antikehadega oli mitmemõõtmelises analüüsis rohkem korrelatsioonis fagotsütoosiga kui Fc RIIa.

Fc RIIIb, mis on GPI-ga ankurdatud, on kõige levinum neutrofiilidel ekspresseeritud Fc RIII tüüp, kuid hiljutised uuringud on teatanud, et neutrofiilid ekspresseerivad ka Fc RIIIa30, millel on rakusisese signaaliülekande jaoks transmembraanne ja tsütoplasmaatiline domeen. Fagotsütoosi korral võib intratsellulaarne signaaliülekanne toimuda Fc RIIIa või Fc RIIa kaudu, kusjuures oluline on ka seondumine Fc RIIIb-ga, nagu näitavad meie tulemused. Kui Fc RIII ja Fc RIIa toimivad fagotsütoosi korral koos, võib see selgitada, miks oli Fc RIIa piiratud aktiivsus monotsüütide fagotsütoosis. NK-rakud ekspresseerivad Fc RIIIa ja me tegime kindlaks, et CSP-vastased antikehad võivad soodustada NK aktiveerimist interaktsiooni kaudu Fc RIIIa-ga. See võib viia sporosoiitide hukkumiseni ja põletikueelsete tsütokiinide vabanemiseni44.

Kuid NK-rakud sisaldavad ainult 1–5 protsenti veres leiduvatest leukotsüütidest, mis viitab sellele, et neil on sporosoiitide vastase immuunsuse puhul vähem oluline roll kui neutrofiilidel, mis moodustavad 50–70 protsenti leukotsüütidest. Sporosoidid puutuvad kokku ka naha makrofaagide ja maksa Kupfferi rakkudega, mis võivad hõlmata täiendavaid Fc R-vahendatud kliirensi mehhanisme ja õigustada tulevastes uuringutes uurimist, kuid nende rakkude suhteline sagedus ja nende Fc Rs ekspressioon erineb vere fagotsüütidest. .

Olemasolevad uuringud malaaria antikehade poolt vahendatud opsoonilise fagotsütoosi kohta on suures osas kasutanud mudelina THP-1 rakuliini, kasutades standardtingimusi FCS-iga (kuid mitte inimese seerumit). Nendes tingimustes leidsime, et Fc RI blokaad inhibeeris tõhusalt fagotsütoosi, kuid Fc RIIa või Fc RIII blokeerimisega täheldati minimaalset inhibeerimist. Hiljutises uuringus teatati, et THP-1 rakkude opsooniline fagotsütoos ei olnud korrelatsioonis kaitsega RTS, S faasi I/IIa uuringus malaaria varem mittesaanud täiskasvanutel45. Näitasime, et inimese seerumis võib mittespetsiifiline IgG vähendada ka THP-1 rakkude fagotsütoosi aktiivsust, kuna inimese plasmas esinev monomeerne IgG inhibeerib Fc RI interaktsioone, samas kui veise monomeerne IgG ei seo inimese Fc RI-d. Need leiud koos viitavad sellele, et THP-1 rakud ei ole ideaalne mudel sporosoiitide vastase opsoonilise fagotsütoosi uurimiseks.

Me tuvastasime, et kõik kolm CSP piirkonda võivad olla suunatud antikehadele, mis seovad Fc RIIa ja Fc RIII, et soodustada sporosoiitide fagotsütoosi neutrofiilide poolt, omistades seeläbi nende piirkondade antikehadele funktsioone, mida pole varem teatatud. Tuleb märkida, et NT piirkonna antikehade aktiivsus oli märkimisväärne, nagu on näha fagotsütoosi testides, milles kasutati antigeenidega kaetud helmestega inimese antikehi, sporosoiitide fagotsütoosi erinevatesse piirkondadesse tõstetud küüliku antikehade poolt ja Fc R seondumist inimese antikehadega. Need leiud viitavad sellele, et lisaks tsentraalsete kordus- ja CT-piirkondade kaasamisele võib vaktsiini kavandamisel olla väärtuslikum keskendumine NT-piirkonnale. Praegused juhtivad vaktsiinid ei sisalda NT piirkonda3,46. Kaardistasime antikehaepitoobid 21-aa piirkonnaga, mis on NT ja keskse korduspiirkonna vahelise ristmiku lähedal, kuid ei sisalda hiljuti kirjeldatud ühendusepitoopi34 ja erineb I piirkonna epitoobist, mis on koht N-terminaalne lõhustumine hepatotsüütide invasiooni ajal 47, 48.

Meie tähelepanekud, et malaariaga kokkupuutel omandatud antikehad võivad soodustada neutrofiilide Fc R-vahendatud fagotsütoosi, toetavad veelgi kontseptsiooni, et see on mehhanism, mis esineb in vivo inimestel, kellel tekib kõrge immuunsus. Suure malaaria leviku korral Keenias on need funktsionaalsed antikehad väga madalad väikelastel, kellel on kõige suurem risk nakatuda ja raske malaaria, kuid esinevad täiskasvanutel. Varasemad uuringud selles populatsioonis näitasid, et täiskasvanute hulgas oli kõrge CSP-vastaste antikehade tase seotud täiskasvanute nakatumise riski vähenemisega49. Seevastu valdavalt lastest koosnev kohort ei leidnud seost Malis, kus malaaria leviku intensiivsus oli madalam kui meie uuringupopulatsioonis50. Huvitaval kombel varieerus iga Fc R seostumisaktiivsuse suhteline tase indiviidide vahel märkimisväärselt, mis tõenäoliselt mõjutab fagotsütoosi aktiivsust. Spetsiifilise Fc R seondumise variatsioone mõjutavad IgG alamklassi profiilid, antikehade sihtmärgiks olevad epitoobid ja IgG glükosüülimine22. IgG1 ja IgG3 domineerisid omandatud IgG alamklasside hulgas ja korreleerusid Fc R-ga seondumise aktiivsusega.

Selles uuringus kohandasime antigeeniga kaetud mikrosfääride kasutamist, et uurida P. falciparumi sporosoiitide peamise immuunsihtmärgi CSP vastaste antikehade opsoonilist fagotsütoosi. Selle lähenemisviisi eeliseks on see, et see ületab väljakutsed, mis on seotud suurte sporosoiitide koguste genereerimisega immunoloogilisteks analüüsideks, mida on raske saavutada suurte populatsiooniuuringute ja kliiniliste uuringute puhul. CSP-ga kaetud helmestega mõõdetud opsoonilise fagotsütoosi tase oli tugevas korrelatsioonis puutumatute sporosoiitide abil mõõdetud tasemega. See platvorm võimaldas meil ka eristada funktsionaalsete antikehade vastuseid igale CSP piirkonnale. Samuti kinnitasime fagotsütoosi, kasutades külmsäilitatud sporosoite (elujõulisus> 85 protsenti 51) ja värskelt dissekteeritud sporosoite.

Varasemad uuringud on näidanud, et sporosoiitide vastased antikehad võivad potentsiaalsete immuunmehhanismidena pärssida sporosoiitide liikuvust, rakkude läbimist ja hepatotsüütide invasiooni. Praegu puuduvad aga järjekindlad tõendid selle kohta, et need mehhanismid on kliinilistes uuringutes korrelatsioonis Plasmodium'i infektsiooni vastase kaitsega3. Loomade passiivse immuniseerimise mudelites võib kõrge IgG tase CSP-le kaitsta eksperimentaalse infektsiooni eest3,4. Siiski ei ole vaktsiinist indutseeritud antikehad kliinilistes uuringutes52–56 veel saavutanud sarnast kõrget kaitsetaset, mis on säilinud aja jooksul. RTS, S indutseerib väga kõrgeid CSP IgG tasemeid, kuid pakub ainult tagasihoidlikku kaitset53, 56, mis viitab sellele, et kõrgema funktsionaalse kaitseaktiivsusega antikehade genereerimiseks on vaja teisi strateegiaid 3, 4. Meie andmed annavad ülevaate antikehade suuresti alauuritud immuunmehhanismist sporosoiitide fagotsüütilises kliirensis ja viitavad sellele, et Fc-vahendatud mehhanismide kasutamine võib olla strateegia tugevama immuunsuse loomiseks kõrgema kaitsetaseme saavutamiseks. Seda on võimalik saavutada vaktsiinistrateegiatega, mis optimeerivad IgG alamklassi vastuseid, vähendavad IgM-i, mis võib pärssida Fc R interaktsioone, ja parandavad spetsiifiliste funktsionaalsete epitoopide sihtimist. Neid edusamme on võimalik saavutada spetsiifiliste vaktsiiniadjuvantide ja immunogeeni disaini abil. Fc R interaktsioone antigeenidega seotud IgG-ga võib mõjutada ka epitoopide tihedus ning epitoopide ruumiline orientatsioon ja paigutus57,58. Struktuuribioloogia lähenemisviisid võivad olla väärtuslikud selle mõistmiseks ja vaktsiinide kujundamisel. Samuti on võimalik, et CSP erinevad piirkonnad vahendavad immuunsust erinevate immuunmehhanismide kaudu.

Seda on näidatud gripi hemaglutiniini puhul, kusjuures Fc R-vahendatud mehhanismid on olulised konserveerunud varrepiirkonna antikehade jaoks, kuid vähem olulised peapiirkonna tüvespetsiifiliste antikehade jaoks18, 21.

Tulevased uuringud, mis uurivad nende funktsionaalsete antikehade esilekutsumist ja nende seost kaitsega, on õigustatud RTS-i, S-i ja teiste CSP-põhiste vaktsiinide II ja III faasi uuringutes. Oleme läbi viinud esialgse uuringu RTS, S56 I/IIa faasi katses. See näitas, et RTS, S vaktsineerimine indutseerib tõepoolest CSP-vastaseid antikehi, mis soodustavad Fc RIIa ja Fc RIII seondumist, samuti fagotsütoosi neutrofiilide poolt. Oluline on see, et need funktsionaalsed aktiivsused olid oluliselt kõrgemad malaariainfektsiooni eest kaitstud isikute seas, võrreldes nendega, kellel tekkis infektsioon43. Kuigi CSP on inimese omandatud immuunsuse, sealhulgas funktsionaalsete antikehade sihtmärk, on praegu piiratud arusaam võimalikest erinevustest looduslikult omandatud ja vaktsiinist põhjustatud immuunsuses sporosoitide vastu. Nende erinevuste edasine uurimine võib paljastada olulisi teadmisi vaktsiinide väljatöötamiseks.

Kokkuvõtlikult võib öelda, et meie uuringud on määratlenud Fc R-vahendatud immuunsuse peamised mehhanismid ja sihtmärgid vere sporosoiitide vastu. Meie leiud viitavad neutrofiilide olulisele rollile sporosoiitide fagotsüütilises kliirensis, määratlesid Fc RIIa ja Fc RIII olulised rollid ning määrasid CSP selle funktsionaalse aktiivsuse peamiseks sihtmärgiks. Monotsüüdid aitavad kaasa ka fagotsütoosile, kuid neil on madalam aktiivsus, ja antikehad võivad samuti soodustada NK-rakkude ADCC aktiivsust Fc RIIIa kaasamise kaudu. Immuunsust vahendavate mehhanismide mõistmine ja määratlemine on tõhusamate vaktsiinide väljatöötamise võimaldamiseks ülioluline. Tulevased uuringud peaksid uurima, kui tõhusalt tekitavad kliinilistes uuringutes praegused vaktsiinid nende funktsionaalsete aktiivsustega antikehi. Nende teadmiste kasutamine vaktsiini väljatöötamisel võib olla tõhus strateegia tugeva immuunvastuse tekitamiseks, mis tagab kõrgema kaitse taseme malaaria vastu.

meetodid

Uurige populatsioone ja eetikaavaldust.

Keenias Kisumu maakonnas Kanyawegi alampiirkonnas elavate malaariaga kokkupuutunud tervete asümptomaatiliste täiskasvanute plasma (n=104, vanusevahemik 18–79; 26,9 protsenti meestest) koguti 2. augustil007. (Kanyawegi kohort)59; ühelgi osalejal ei olnud malaaria sümptomeid ja 46,15 protsendil oli asümptomaatiline P. falciparum parasiteemia (tuvastatud mikroskoopiaga). Keenias Kisumu maakonnas Chulaimbo alamrajoonis elavate tervete, asümptomaatiliste väikelaste ja täiskasvanute plasma (n=75, laste vanusevahemik 0,3–5,9 aastat, täiskasvanute vanusevahemik 19,6–69,2 aastat; 55 protsenti naisi). kogutud veebruaris–märtsis 2007 (Chulaimbo kohort)42; Kohordi üksikasjad on kokku võetud täiendavas tabelis 1. Ülekande intensiivsus oli vere kogumise ajal suhteliselt kõrge (asümptomaatilise parasiteemia esinemissagedus lastel vanuses alla 10 aasta oli 70–80 protsenti)60. Tervetelt mees- ja naissoost täiskasvanud inimestelt koguti verd, et kasutada neid tervete leukotsüütide, neutrofiilide, monotsüütide ja NK analüüsides.

Eetika heakskiit saadi Alfredi haigla inimuuringute ja eetikakomiteelt (protokoll 385-18), Clevelandi ülikoolihaiglate inimuuringute institutsionaalselt läbivaatamisnõukogult Case Western Reserve'i ülikoolile, USA (protokoll 02-04-04) ja Keenia Meditsiiniuuringute Instituudi eetikakontrolli komitee (protokoll SSC867). Kõigilt uuringus osalejatelt või nende vanematelt või seaduslikelt eestkostjatelt saadi kirjalik teadlik nõusolek.

Antigeenid.

Selles uuringus kasutatud antigeenid põhinesid kõik P. falciparum CSP (geeni ID PF3D7_0304600; www.plasmodb.org) 3D7 võrdlusjärjestusel. Rekombinantne täispikk CSP osteti Sanariast (Sanaria, Rockville, USA).

Valku ekspresseeriti Pichia pastorises, alustades aminohappejäägist 50 ja see sisaldab (NANP) 22 kordust ja (NVPD) 4 kordust. CSP C-otsa piirkond (CT) ja CSP N-terminaalse piirkonna ja C-otsa piirkonna liit (N pluss C) genereeriti rekombinantsete valkudena, kasutades HEK293F rakke (ostetud ettevõttest Invitrogen, Austraalia). CSP N-terminaalne piirkond (aminohape 19-104, NT) loodi sünteetiliste peptiididena ja CSP keskne korduspiirkond (NANP) genereeriti sünteetiliste peptiididena (NANP×15) samuti LifeTeini (LifeTein, NJ, USA).

Antikehade genereerimine erinevate CSP valkude vastu.

teostas Walter Eliza Halli Instituudi antikehade rajatis; heakskiidu andis Walter ja Eliza Halli instituudi loomaeetika komitee (viide: 2020.019, 2014.009). Lühidalt, küülikuid (n=2) vaktsineeriti ühega järgmistest antigeenidest: täispikk CSP, N pluss C rekombinantne valk ja NT peptiid. Iga küülik sai kolm annust antigeeni (200 µg/doosi kohta), mida manustati koos Freudi adjuvandiga päeval 0, päeval 28 ja päeval 56. Küüliku seerumid koguti pärast kolmandat vaktsineerimist päeval 68 ja küüliku IgG puhastati A-valguga. - positiivne valik. Algselt testiti küüliku anti-N pluss C IgG ja näidati, et see tunneb valdavalt ära CSP C-terminaalse piirkonna, mitte N-terminaalse piirkonna (täiendav joonis 6A). Kinnitati, et küüliku anti-NT IgG tunneb ära CSP N-terminaalse piirkonna (täiendav joonis 6B). Nii NT kui ka CT antikehad reageerisid täispika CSP-ga (täiendav joonis 6C). Monoklonaalne antikeha (mAb) MGG434, mis eraldati indiviidist pärast korduvat nakatamist nõrgestatud sporosoididega, ekspresseeriti ja puhastati rekombinantse IgG1 antikehana HEK293 rakkudes, kasutades väljakujunenud lähenemisviise. MAb testiti spetsiifilisuse kinnitamiseks rekombinantse CSP suhtes. Anti-CSP mAb 2A1061 ekspresseeriti LALA mutatsioonidega Fc piirkonnas62, et inhibeerida Fc R interaktsioone kontrollantikehana.

PBMC, neutrofiilide ja tervete leukotsüütide eraldamine perifeersest verest.

Perifeerse vere mononukleaarsed rakud (PBMC) ja neutrofiilid eraldati perifeersest verest, kasutades eelnevalt kehtestatud meetodeid 63, 64. Lühidalt, tervete doonorite perifeerne veri eraldati Ficolli gradienttsentrifuugimise abil. Buffy kihid, mis sisaldavad PBMC-sid, ja RBC pellet, mis sisaldavad neutrofiile, koguti eraldi. PBMC isoleerimiseks pesti Buffy kihist kogutud rakke neli korda PBS -1% NCS-ga 4 kraadi juures. Seejärel resuspendeeriti PBMC-d RPMI 1640-10 protsenti veiseloote seerumis (FCS) ja hoiti jääl. Neutrofiilid rikastati dekstraani segmenteerimisega RBC pelletist pärast Ficolli gradiendi tsentrifuugimist, millele järgnes hüpotooniline lüüs63.

Terved leukotsüüdid eraldati täisverest esialgse rikastamise teel dekstraani segmenteerimisega, millele järgnes hüpotooniline lüüs. Eraldatud neutrofiilid ja terved leukotsüüdid reguleeriti väärtuseni 5 × 105 neutrofiili / ml või 5 × 106 fagotsüütide (monotsüüdid ja neutrofiilid) / ml ja seejärel resuspendeeriti RPMI1640-s, millele oli lisatud 10 protsenti FCS-i ja 2, 5 protsenti kuumusega inaktiveeritud inimese seerumit. Rakud fenotüüpiti Fc R ekspressiooni jaoks, kasutades antikehi Fc RI (kloon 10.1 BD Bioscience, 1:50), Fc RIIa (kloon 8.26, BD Bioscience, 1:25) ja Fc RIII (kloon 3G8 BD Bioscience, 1:50) vastu. . Monotsüütide alamhulkade määramiseks kasutati ka CD14 vastaseid antikehi (kloon M5E2, BD Bioscience, 1:20).

THP-1 rakkude hooldus.

THP{{0}} promonotsüütilise rakuliini rakke (allikas ATCC) hoiti RPMI-s-1640 koos 0,002 mol/L L-glutamiiniga, 0,01 mol/L HEPES-iga ja 10 protsenti vasikaloote seerumit (FCS). Rakkude tihedust jälgiti hoolikalt ja hoiti vahemikus 1 × 105 kuni 1 × 106 rakku / ml. Rakke passeeriti iga 6 päeva järel või siis, kui rakkude tihedus lähenes väärtusele 1 × 106 rakku/ml.

P. berghei sporozoitide kultuur ja isoleerimine.

Anopheles stephensi sääski toideti Swiss Websteri hiirtel, kes olid nakatunud P. berghei ANKA parasiidiliini12 ekspresseeriva kimäärse CSP-ga. Süljenäärmed lõigati lahti 18–22 päeva pärast nakkuslikku verejahu ja homogeniseeriti PBS-is. Sporosoidid lasti läbi 70- μm koesõela (Falcon) ja loendati hemotsütomeetriga.

P. falciparumi merosoiitide kultiveerimine ja isoleerimine.

P. falciparumi D10 liini säilitati RPMI-HEPES-is, millele oli lisatud 0,5 protsenti Albumaxi (Life Technologies) ja 0,18 protsenti NaHCO3-ga. Kultuure hoiti alla 10 protsendi parasiteemia ja sünkroniseeriti sorbitooliga töötlemisega. Merosoidid isoleeriti varem avaldatud meetoditega 32. Lühidalt öeldes rikastati nakatunud erütrotsüütide skisondi staadiumi magnetpuhastusega ja jätkati kultiveerimist söötmes, millele oli lisatud transepoksüsuktsinüül-L-leutsüülamido(4-guanidino)butaani (E64, Sigma). -Aldrich) 8 tundi, enne kui küpsed skisontid lastakse läbi 12-μm filtri, et vabastada merosoiidid. Merosoidid reguleeriti väärtuseni 5 × 107/ml opsoonilise fagotsütoosi testi jaoks või 1 × 107 / ml ELISA plaadi katmiseks Fc R-ga seondumise testi jaoks.

Antigeenide kovalentne sidumine fluorestseeruvate latekshelmestega.

Amiiniga modifitseeritud fluorestseeruvaid latekshelmeid suurusega 20-µm (Sigma-Aldrich) pesti kaks korda 400 µl PBS-ga ja tsentrifuugiti 2000 × g juures 3 minutit. Helmestele lisati 8-protsendiline glutaaraldehüüd PBS-s ja inkubeeriti rullikul öö läbi 4 kraadi juures. Pärast PBS-ga pesemist lisati helmestele 1 mg/ml rekombinantset CSP-d ja inkubeeriti keerises 6 tundi. Seejärel tsentrifuugiti helmeid ja resuspendeeriti 200 µl etanoolamiinis ja inkubeeriti 30 minutit keerises, et kustutada kõik ülejäänud amiinirühmad. Seejärel pesti helmeid PBS-s ja blokeeriti 1% BSA-ga üleöö temperatuuril 4 kraadi. Antigeeniga kaetud helmeid hoiti 20 minutit ultraheliga töötlevas veevannis temperatuuril 4 kraadi, et vähendada agregatsiooni, ja seejärel reguleeriti väärtuseni 5 × 107 bead/ml. Helmeid hoiti 4 kraadi juures 0,1% SDS ja 0,02% NaN3 juuresolekul.

Opsoonilised fagotsütoosi testid.

Opsoonilised fagotsütoosi testid viidi läbi erinevatel eesmärkidel muutuvates seadetes, nagu on kirjeldatud allpool ja täiendavas tabelis 6.

P. falciparumi ja P. berghei sporosoiitide opsooniliseks fagotsütoosiks isoleeritud rakkude abil saadi PATHMVI (Samaria, Rockville, USA) külmsäilitatud P. falciparum sporozoidid ja neid säilitati vedelas lämmastikus ning sulatati 37 kraadi juures 40 sekundit, nagu kirjeldatud punktis. tootja kasutusjuhend. Selles uuringus kasutati ka värskelt dissekteeritud P. berghei sporosoiite, mida oli transfekteeritud PfCSP12 ekspresseerimiseks. Sama lähenemisviisi kasutati katsetes P. falciparumi ja P. berghei sporosoiitide puhul. Sporosoite värviti 10 µg/ml etiidiumbromiidiga 1 tund jääl, millele järgnes kolm pesemist RPMI-HEPES-iga. Opsoniseerimiseks inkubeeriti 50,000 sporosoiiti 1 ul testitava seerumiga 1 tund jääl, millele järgnes koosinkubeerimine 5000 neutrofiiliga kontsentratsioonil 5 × 105 rakku/ml RPMI-s-1640 millele on lisatud 10 protsenti FCS-i ja 2,5 protsenti kuumusega inaktiveeritud inimese seerumit, mis pärinevad malaariast varem mittesaanud Melbourne’i doonoritelt. Samuti lisati täiendav 1 ui testitavat seerumit, et võtta arvesse neutrofiilide lisamisest tingitud mahu muutust ja säilitada sama testitava antikeha kontsentratsioon fagotsütoosi ajal.

Fagotsütoosi tekkeks lasti koosinkubeerida 15 minutit 37 kraadi juures 5% CO2 inkubaatoris. Fagotsütoosi aktiivsuse peatamiseks tsentrifuugiti rakke 4 kraadi juures ja pesti külma PBS-ga -1 protsenti NCS–0,04 protsenti NaN3 (FACS puhver). Fagotsütoosi tase kvantifitseeriti voolutsütomeetria abil (FACS CantoII, BD Biosciences) ja analüüsiti FlowJo tarkvara (versioon 10) abil. Andmed esitati fagotsütoosiindeksina (PI), mis määratleti fagotsütoositud sporosoididega neutrofiilide (täiendav joonis 4A) või THP-1 rakkude (täiendav joonis 1A) osakaaluna. Kanyawegi ja Chulaimbo kohortiga tehtud katsete jaoks standardiseeriti PI veelgi suhtelise fagotsütoosiindeksina (RPI), mis määratleti PI protsendina iga proovi kohta positiivse kontrolli suhtes. Kõigisse testidesse kaasati negatiivsete kontrollidena opsoniseerimata sporosoidid. Standardsed neutrofiilide fagotsütoosi testid hõlmasid 2,5% inimese seerumit malaariaga mitte kokku puutunud doonoritelt. Standardsed THP-1 fagotsütoosi testid viidi läbi, kasutades väljakujunenud meetodeid, mis sisaldavad 10 protsenti FCS-i.

Antigeeniga kaetud helmeste või merosoiitide fagotsütoosi jaoks, kasutades isoleeritud rakke, kohandati fagotsütoosianalüüs varem avaldatud meetoditest modifikatsioonidega 32. Lühidalt, 1 × 106 antigeeniga kaetud fluorestseeruvat latekshelmest või merosoiiti opsoniseeriti seerumiproovidega 1 tund. Helmeid või merosoite pesti kolm korda RPMI -1640-ga enne koosinkubeerimist 1 × 105 neutrofiiliga fagotsütoosi jaoks. Fagotsütoosil lasti tekkida 20 minutit helmeste puhul või 10 minutit merosoiitide puhul 37 kraadi juures ja rakke pesti seejärel FACS puhvriga 300 x g ja 4 kraadi juures 4 minutit. Fluorestseeruvaid helmeid või merosoite sisaldavate neutrofiilide osakaalu hinnati voolutsütomeetria abil (FACS CantoII, BD Biosciences) ja analüüsiti FlowJo tarkvara abil (täiendav joonis 4A). Mõnes testis kasutati THP-1 rakuliini standardtingimustega, mis sisaldasid 10 protsenti FCS-i; teistes analüüsides kasutati võrdluseks täiendavalt 2,5 protsenti inimese seerumit, mis pärinesid varem malaariast mittesaanud Melbourne’i doonoritelt.

Antigeeniga kaetud helmeste või P. berghei sporozoiitide fagotsütoosiks, kasutades täisvere leukotsüütide preparaate, opsoniseeriti CSP-ga kaetud helmed küüliku polüklonaalse antikehaga, mis oli tekitatud CSP vastu. Fagotsütoos viidi läbi, inkubeerides opsoniseeritud helmeid täisvere leukotsüütide kogufraktsiooniga, mis sisaldas 1 × 106 fagotsüüti (monotsüüte ja neutrofiile) 20 minuti jooksul 37 kraadi juures 5% CO2 inkubaatoris. Need katsed viidi läbi, kasutades opsoniseerimiseks muutuvaid antikehade kontsentratsioone või muutuvaid helmeste ja fagotsüütide suhteid. P. berghei sporosoitide opsoonilise fagotsütoosi testimiseks täisleukotsüütide preparaatidega opsoniseeriti 5 × 105 sporosoiiti malaariaga kokkupuutunud Keenia täiskasvanud seerumite kogumiga lahjenduses 1:100, millele järgnes koosinkubeerimine tervete leukotsüütidega, mis sisaldasid 5 × 104 fagotsüüti. Rakke tsentrifuugiti 4 kraadi juures 4 minutit, et peatada fagotsüütiline aktiivsus, ja erinevad fagotsüüdid (monotsüüdid ja neutrofiilid) märgistati edasiseks analüüsiks fluorestseeruva konjugeeritud antikehadega. Monotsüüdid märgistati anti-CD14-Alexa647-ga (MφP9 BD Bioscience, 1:33) ja anti-CD16- BV421-ga (3G8 BD Bioscience, 1:20) ning neutrofiilid märgistati anti-CD66bAPC-ga. -H7 (G10F5 BD Bioscience, 1:33).

FACS analüüsi jaoks valiti fagotsütoositud helmed PEhigh ja FSChigh populatsioonidena. Monotsüütide ja neutrofiilide poolt fagotsütoositud helmeid eristati veelgi, kasutades CD14 ja CD66b värvimist. Monotsüütide ja neutrofiilide poolt fagotsütoositud helmeste arv arvutati fluorestsentsi intensiivsuse põhjal (täiendav joonis 8). Seda arvu standardiseeriti veelgi, kasutades fagotsüütide (monotsüütide ja neutrofiilide) koguarvu ja väljendati helmestena 100 fagotsüütide kohta, mis esindab erinevate rakutüüpide fagotsütoosi kiirust.

Opsoonilise fagotsütoosi inhibeerimiseks Fc retseptorite blokeerimise või CSP antikehade kahanemise kaudu blokeeriti erinevad Fc R-d, kasutades spetsiifilisi blokeerivaid antikehi. Fc RI blokeeriti 50 µg/ml blokeeriva antikehaga (mAb 10.1 Merck), Fc RIIa blokeeriti 50 µg/ml blokeeriva antikehaga (mAb IV.3), Fc RIII blokeeriti 50 µg/ml blokeeriva antikehaga (mAb 3G8) . THP-1 rakke ja neutrofiile töödeldi iga Fc R blokaatoriga vastavalt 4 kraadi juures 30 minutit enne koosinkubeerimist CSP-ga kaetud latekshelmestega, mis on opsoniseeritud immuunsete täiskasvanute seerumiga. Fagotsütoosi test viidi läbi nagu eespool mainitud. Et hinnata CSP-vastaste antikehade rolli omandatud inimese antikehade poolt vahendatud fagotsütoosi soodustamisel, eelinkubeeriti Kenya täiskasvanud seerumi kogumit 30 minutit rekombinantse CSP ja NT piirkonna peptiidiga kontsentratsioonis 20 ug/ml, et seonduda CSP-spetsiifiliste ainetega. antikehi enne kasutamist fagotsütoosi testides.

Kogu IgG ja IgG alamklasside mõõtmine ELISA abil.

Rekombinantsete valkude kogu IgG ja IgG alamklassid mõõdeti ELISA abil, nagu eelnevalt kirjeldatud33. Lühidalt, CSP kaeti kontsentratsioonis 1 µg/ml 96-süvendiga Maxisorp mikrotiiterplaatidel (NUNC, Roskilde, Taani) ja inkubeeriti üleöö 4 kraadi juures. Plaate pesti PBS-ga, mis sisaldas 0,05 protsenti Tween20 (PBS-Tween) ja blokeeriti PBS-ga -1 protsenti BSA-ga 37 kraadi juures 2 tundi. Inimese seerum või küüliku IgG lahjendati soovitud kontsentratsioonini ja lisati plaatidele kahes eksemplaris. Kogu IgG tuvastamiseks kasutati HRP-ga konjugeeritud kitse anti-inimese IgG-d lahjenduses 1:2500, millele järgnes värvi arendamiseks ABTS substraat. Reaktsioon peatati 1% SDS-iga ja neeldumist mõõdeti 405 nm juures. IgG alamklassi tuvastamiseks kasutati inimese IgG1, IgG2, IgG3 ja IgG4 mAb-sid lahjenduses 1:1000, millele järgnes HRP-ga konjugeeritud kitse hiirevastane IgG lahjenduses 1:2500. Lõpuks kasutati värvi arendamiseks 3,3',5,5'-tetrametüülbensidiini (TMB, Life Technologies) substraati ja reaktsioon peatati 1 M H2SO4-ga. Neeldumist mõõdeti 450 nm juures. Positiivse kontrollina kasutati Kenya täiskasvanute seerumi kogumit, millel oli kõrge IgG-reaktiivsus CSP suhtes.

NT piirkonna antikehade epitoopide kaardistamine.

Sünteesiti massiiv, mis sisaldas 70 biotinüülitud 15-meeri peptiidi, mis esindavad CSP (tüvi 3D7/NF54) lineaarset järjestust (Mimotopes, Austraalia). Igal peptiidil oli lühike SGSG speisser CSP peptiidijärjestuse ja biotiini märgise vahel (mis lisati immobiliseerimise hõlbustamiseks) ja 12 aa kattuvus peptiidide vahel. Antikehade analüüsid viidi läbi, kasutades eelnevalt kehtestatud lähenemisviise65,66; 50 ul peptiide süvendi kohta lisati ELISA plaatidele, mis olid eelnevalt kaetud 1 ug/ml streptavidiiniga (Sigma-Aldrich). Peptiidide seondumise küllastumine saavutati ja seda kinnitati biotiini sidumissaitide jääkide kvantifitseerimisega streptavidiinil, kasutades biotiin-HRP-d. millele järgneb blokeerimine 10-protsendilise piimaga ja pesemine PBS-iga 0,05-protsendilise Tweeniga. Igasse süvendisse lisati CSP NT piirkonna vastu tõstatatud küüliku polüklonaalne IgG kontsentratsioonis 1:500. Küüliku IgG seondumise tase tuvastati HRP-konjugeeritud kitse küülikuvastase IgG-ga (Millipore, 1:2500) ja kvantifitseeriti, kasutades TMB substraati.

Fc retseptoriga seondumise test.

Fc-retseptoriga seondumise test kohandati varem avaldatud meetoditest väikeste muudatustega39. Lühidalt, 5{{20}} ul rekombinantset CSP-d kontsentratsiooniga 1 ug/ml kaeti Maxisorp™ plaatidele ja inkubeeriti öö läbi temperatuuril 4 °C, millele järgnes kolm pesemist PBS-Tweeniga. Seejärel blokeeriti plaadid 200 ul 1% BSA-PBS-ga temperatuuril 37 kraadi 2 tundi, millele järgnes kolm pesemist PBS-Tweeniga. Seerumiproovid lahjendati suhtega 1:50 PBS-BSA-ga ja 50 ul igast proovist lisati plaatidele kahes eksemplaris ja inkubeeriti toatemperatuuril 2 tundi, millele järgnes kolm pesemist PBS-Tweeniga. Igasse süvendisse lisati 50 mikroliitrit biotiiniga konjugeeritud rekombinantseid lahustuvaid Fc RIIa H131 ektodomeeni dimeere (0,2 ug/ml) või Fc RIII V158 ektodomeeni dimeere (0,1 ug/ml) ja inkubeeriti 37 kraadi juures 1 tund PBS-iga, millele järgnes kolm pesemist. - Tween. Mõne analüüsi jaoks kasutati Fc RIIa R131 alleeli ja Fc RIII F158 alleeli samas kontsentratsioonis. Sellele järgnes sekundaarne HRP-ga konjugeeritud streptavidiin (Thermo Fisher Scientific, 1:10, 000) PBS-BSA-s temperatuuril 37 kraadi 1 tund, millele järgnes kolm pesemist PBS-Tweeniga.

Lõpuks lisati ensümaatilise reaktsioonivõime mõõtmiseks 20 minutiks 50 ul TMB vedelat substraati. Reaktsioon peatati 50 ul 1 M H2SO4 lahusega. Seondumistaset mõõdeti optilise tihedusena 450 nm juures. Positiivse kontrollina kasutati malaariaga kokkupuutunud Keenia täiskasvanutelt saadud kombineeritud inimese IgG-d (1:100) ja küüliku polüklonaalset IgG-d CSP-le (1:500). Negatiivse kontrollina kasutati naiivsete Melbourne'i täiskasvanute individuaalseid seerumeid (1:50).

Fc-retseptoriga seondumise test kohandati varem avaldatud meetoditest väikeste muudatustega39. Lühidalt, 5{{20}} ul rekombinantset CSP-d kontsentratsiooniga 1 ug/ml kaeti Maxisorp™ plaatidele ja inkubeeriti öö läbi temperatuuril 4 °C, millele järgnes kolm pesemist PBS-Tweeniga. Seejärel blokeeriti plaadid 200 ul 1% BSA-PBS-ga temperatuuril 37 kraadi 2 tundi, millele järgnes kolm pesemist PBS-Tweeniga. Seerumiproovid lahjendati suhtega 1:50 PBS-BSA-ga ja 50 ul igast proovist lisati plaatidele kahes eksemplaris ja inkubeeriti toatemperatuuril 2 tundi, millele järgnes kolm pesemist PBS-Tweeniga. Igasse süvendisse lisati 50 mikroliitrit biotiiniga konjugeeritud rekombinantseid lahustuvaid Fc RIIa H131 ektodomeeni dimeere (0,2 ug/ml) või Fc RIII V158 ektodomeeni dimeere (0,1 ug/ml) ja inkubeeriti 37 kraadi juures 1 tund PBS-iga, millele järgnes kolm pesemist. - Tween. Mõne analüüsi jaoks kasutati Fc RIIa R131 alleeli ja Fc RIII F158 alleeli samas kontsentratsioonis. Sellele järgnes sekundaarne HRP-ga konjugeeritud streptavidiin (Thermo Fisher Scientific, 1:10, 000) PBS-BSA-s temperatuuril 37 kraadi 1 tund, millele järgnes kolm pesemist PBS-Tweeniga. Lõpuks lisati ensümaatilise reaktsioonivõime mõõtmiseks 20 minutiks 50 ul TMB vedelat substraati. Reaktsioon peatati 50 ul 1 M H2SO4 lahusega. Seondumistaset mõõdeti optilise tihedusena 450 nm juures. Positiivse kontrollina kasutati malaariaga kokkupuutunud Keenia täiskasvanutelt saadud kombineeritud inimese IgG-d (1:100) ja küüliku polüklonaalset IgG-d CSP-le (1:500). Negatiivse kontrollina kasutati naiivsete Melbourne'i täiskasvanute individuaalseid seerumeid (1:50).

Antikehast sõltuva rakuvahendatud tsütotoksilisuse test.

Valitud seerumiproovide ADCC-d indutseerivat aktiivsust hinnati, kasutades ADCC Reporter Bioassay komplekti (Promega, kat. nr G7010) vastavalt tootja juhistele koos järgmiste muudatustega. CSP-ga kaetud helmed opsoneeriti inimese seerumiga lahjenduses 1:50. Reporterrakud plaaditi 72,000 rakku süvendi kohta koos CSP-ga kaetud fluorestseeruvate helmestega suhtega 10:1. Pärast 6-tunnist inkubeerimist lisati kemoluminestsentssubstraat ja luminestsents tuvastati ja kvantifitseeriti ligikaudu iga 5 minuti järel 40 minuti jooksul (CLARIOstar, BMG LabTech). Esitatud andmed registreeriti umbes 30 minutit pärast kemoluminestsentssubstraadi lisamist.

ADCC tase kinnitati ka primaarsetes NK-rakkudes, kasutades varem avaldatud meetodit 38. Lühidalt, NK-rakke sisaldavaid PBMC-sid kultiveeriti RPMI1640-s, millele oli lisatud 10 protsenti FCS-i ja 100 RÜ/ml interleukiini-2 (IL{{5). }}) üleöö. CSP-ga kaetud helmed opsoneeriti inimese seerumiga lahjenduses 1:50, seejärel kultiveeriti koos krunditud PBMC-dega anti-CD107a-AF647 (H4A3, BD Bioscience) juuresolekul 1 tund. Seejärel lisati kaaskultuurile brefeldiin A (Sigma-Aldrich) ja valgu transpordi inhibiitor (BD Bioscience) kontsentratsioonides vastavalt 5 ug/ml ja 1/1500 ning inkubeerimist jätkati 3 tundi. Pärast inkubeerimist tsentrifuugiti rakke 300 × g juures 4 minutit 4 kraadi juures ja värviti anti-CD3-APC-H7 (SK7, BD Bioscience, 1:33), anti-CD56- PE-Cy7 (B159, BD Bioscience, 1:33) ja anti-CD16-BV421 (3G8, BD Bioscience, 1:20). NK-rakud määratleti kui CD3−, CD56 pluss lümfotsüüdid ja ADCC tase kvantifitseeriti CD107a värvimisega NK-rakkude protsendina voolutsütomeetria abil (LSR Fortessa X{50}}, BD Bioscience) (täiendav joonis 9).

Andmete analüüs.

Statistilised analüüsid viidi läbi, kasutades Prism versiooni 7 (GraphPad Software Inc) ja STATA versiooni 13.1 (StataCorp). Statistika test ja P väärtused on näidatud jooniste legendides. Fagotsütoosi, Fc R seondumise ja IgG tasemete vahelisi seoseid hinnati Spearmani korrelatsioonikoefitsientide ja mitme lineaarse regressioonimudeli abil. Fagotsütoosi tasemete, Fc R seondumise ja IgG tasemete erinevusi vanuserühmades ja erinevates opsoniseerimistingimustes hinnati ühesuunalise ANOVA abil koos mitme võrdlusega.

Antikehade funktsionaalsete aktiivsuste hindamiseks, sõltumata kogu IgG tiitrist CSP suhtes, arvutati FcR seondumise ja fagotsütoosi efektiivsus FcR seondumise tasemena või opsoonilise fagotsütoosi tasemena IgG reaktiivsuse suhtes CSP suhtes. Spearmani korrelatsiooni ja Mann-Whitney testi kasutati antikehade funktsionaalse efektiivsuse analüüsimiseks lastel ja täiskasvanutel. Kahesuunalist ANOVA-d kasutati neutrofiilide ja monotsüütide opsoonilise fagotsütoosi võrdlemiseks kogu leukotsüütide testides. Kruskal-Wallise test ja Mann-Whitney test viidi läbi andmete jaoks, mida tavaliselt ei jaotatud. Kõik statistilised analüüsid viidi läbi kahepoolsete testidena. Proovid klassifitseeriti antikehade suhtes positiivseteks, kui reaktiivsus oli suurem kui malaariale mitte puutunud kontrollide väärtuste keskmine pluss 3 standardhälvet.

Aruandluse kokkuvõte.

Lisateavet uurimistöö kavandamise kohta leiate selle artikliga seotud loodusuuringute aruandluse kokkuvõttest.

Andmete kättesaadavus.

Arvude genereerimiseks kasutatud andmed on autorite nõudmisel saadaval. Käesoleva töö koostamisel analüüsitud ning jooniste ja tabelitena esitatud andmebaasid on mõistliku taotluse korral ja vastavate eetikakomiteede kokkuleppel (kliiniliste andmete jaoks) kättesaadavad vastavalt autorilt. P. falciparumi järjestused saadi avalikust andmebaasist aadressil PlasmoDB.org.

Saabunud: 2. september 2019; Vastu võetud: 24. veebruar 2021.

Viited

1. Maailma Terviseorganisatsioon. World Malaria Report 2018 (Maailma Terviseorganisatsioon, 2018).

2. Maailma Terviseorganisatsioon, malaaria vaktsiinitehnoloogia tegevuskava (World Health Organization, 2018).

3. Beeson, JG et al. Väljakutsed ja strateegiad tõhusate ja pikaajaliste malaariavaktsiinide väljatöötamiseks. Sci. Tõlk. Med. 11, eaau1458 (2019).

4. Cockburn, IA & Seder, RA Malaaria ennetamine: immunoloogilistest kontseptsioonidest tõhusate vaktsiinide ja kaitsvate antikehadeni. Nat. Immunol. 19, 1199–1211 (2018).

5. Choumet, V. et al. Mittenakkuslike ja nakkavate Anopheles gambiae veretoitmise visualiseerimine naiivsetel ja süljega immuniseeritud hiirtel. PLoS ONE 7, e50464 (2012).

6. Nussenzweig, V. & Nussenzweig, RS Malaariaparasiitide tsirkumsporozoite valgud. Cell, 42, 401-403 (1985).

7. Partnerlus, RCT RTS, S/AS01 malaariavaktsiini tõhusus ja ohutus imikutele ja lastele kordusannusega või ilma Aafrikas: 3. faasi lõpptulemused, individuaalselt randomiseeritud kontrollitud uuring. Lancet 386, 31–45 (2015).

8. Dups, JN, Pepper, M. & Cockburn, IA Antikehade ja B-rakkude vastused Plasmodium sporozoididele. Ees. Microbiol. 5, 625 (2014).

9. Dobano, C. et al. Antikehade kontsentratsioon ja aviidsus erinevate Circumsporosoite epitoopide suhtes on korrelatsioonis RTS, S/AS01E malaariavaktsiini efektiivsusega. Nat. Commun.

10, 2174 (2019). 10. Stewart, MJ, Nawrot, RJ, Schulman, S. & Vanderberg, JP. Plasmodium berghei sporosoidi invasioon blokeeritakse in vitro sporosoiiti immobiliseerivate antikehadega. Nakata. Immun. 51, 859–864 (1986).

11. Mishra, S., Nussenzweig, RS & Nussenzweig, V. Antibodies to Plasmodium circumsporozoite protein (CSP) inhibeerivad sporosoidi raku läbimise aktiivsust. J. Immunol. Methods 377, 47–52 (2012).

12. Triller, G. et al. Looduslike parasiitidega kokkupuude kutsub esile kaitsvaid inimese malaariavastaseid antikehi. Immunity 47, 1197–1209 e1110 (2017).

13. Hoffman, SL et al. Immuunsus malaaria ja Plasmodium falciparum'i circumsporosoite valgu vastaste looduslikult omandatud antikehade suhtes. N. Ingl. J. Med. 315, 601–606 (1986).

14. Foquet, L. et al. Vaktsiini poolt indutseeritud monoklonaalsed antikehad, mis on suunatud Circumsporosoite valgule, hoiavad ära Plasmodium falciparum'i nakatumise. J. Clin. Uurige. 124, 140–144 (2014).

15. Przysiecki, C. et al. Meningokoki välismembraani valgukompleksiga konjugeeritud Plasmodium falciparum korduvpeptiidiga immuniseeritud hiirtel ja reesusmakaakidel esile kutsutud sporosoiiti neutraliseerivad antikehad. Ees. Rakkude nakatamine. Microbiol. 2, 146 (2012).

16. Flores-Garcia, Y. et al. Antikehade poolt vahendatud kaitse plasmoodiumsporosoitide vastu algab naha inokuleerimiskohast. mBio 9, e02194–02118 (2018).

17. Aliprandini, E. et al. Tsütotoksilised tsirkumsporosoidivastased antikehad on suunatud malaaria sporosoididele peremeesorganismis. Nat. Microbiol. 3, 1224–1233 (2018).

18. DiLillo, DJ, Tan, GS, Palese, P. & Ravetch, JV Laialdaselt neutraliseerivad hemaglutiniini varre spetsiifilised antikehad nõuavad in vivo gripiviiruse eest kaitsmiseks FcgammaR interaktsioone. Nat. Med. 20, 143–151 (2014).

19. Hessell, AJ et al. Fc-retseptor, kuid mitte komplemendi sidumine, on oluline HIV-vastase antikeha kaitsmisel. Nature 449, 101–104 (2007).

20. Bournazos, S. et al. Laias laastus neutraliseerivad HIV--1-vastased antikehad vajavad in vivo aktiivsuseks Fc efektorfunktsioone. Cell 158, 1243–1253 (2014).

21. Mullarkey, CE et al. Laialdaselt neutraliseerivad hemaglutiniini varre-spetsiifilised antikehad kutsuvad esile immuunkomplekside tugeva fagotsütoosi neutrofiilide poolt Fc-sõltuval viisil. mBio 7, e01624–01616 (2016).

22. Irani, V. et al. Inimese IgG alamklasside molekulaarsed omadused ja nende mõju nakkushaiguste vastaste terapeutiliste monoklonaalsete antikehade kujundamisele. Mol. Immunol. 67, 171–182 (2015). 23. Nauseef, WM & Borregaard, N. Neutrofiilid tööl. Nat. Immunol. 15, 602–611 (2014).

24. Kolaczkowska, E. & Kubes, P. Neutrofiilide värbamine ja funktsioon tervise ja põletiku korral. Nat. Rev. Immunol. 13, 159–175 (2013).

25. Gordon, S. Fagotsütoos: immunoloogiline protsess. Immunity 44, 463–475 (2016).

26. Scapini, P. & Cassatella, MA Inimese neutrofiilide sotsiaalne võrgustik immuunsüsteemis. Blood 124, 710–719 (2014).

27. Dale, DC, Boxer, L. & Liles, WC Fagotsüüdid: neutrofiilid ja monotsüüdid. Blood 112, 935–945 (2008).

28. Ziegler-Heitbrock, L. et al. Monotsüütide ja dendriitrakkude nomenklatuur veres. Blood 116, e74–e80 (2010).

29. Rosales, C. Fcgamma retseptori heterogeensus leukotsüütide funktsionaalsetes vastustes. Ees. Immunol. 8, 280 (2017).

30. Golay, J. et al. Inimese neutrofiilid ekspresseerivad madalat FcgammaRIIIA taset, mis mängib rolli PMN-i aktiveerimisel. Blood 133, 1395–1405 (2019).

31. Steel, RW et al. Opsooniline fagotsütoosi test Plasmodium falciparumi sporozoitide jaoks. Clin. Vaktsiin Immunol. 24, e00445–00416 (2017).

32. Osier, FH et al. Plasmodium falciparum merozoiitide opsooniline fagotsütoos: inimese immuunsuse mehhanism ja malaariavastase kaitse korrelatsioon. BMC Med. 12, 108 (2014).

33. Kurtovic, L. et al. Inimese antikehad aktiveerivad Plasmodium falciparum sporozoitide vastast komplementi ja on seotud kaitsega malaaria eest lastel. BMC Med. 16, 61 (2018).

34. Tan, J. et al. Avalik antikehade liin, mis inhibeerib tugevalt malaariainfektsiooni kahekordse seondumise kaudu circumsporosoite valguga. Nat. Med. 24, 401–407 (2018).

35. Kerntke, C., Nimmerjahn, F. & Biburger, M. Numbrites on (teaduslik) tugevus: Fc gamma retseptorite arvude põhjalik kvantifitseerimine inimese ja hiire perifeerse vere leukotsüütidel. Ees. Immunol. 11, 118 (2020).

36. Fleit, HB & Kobasiuk, CD Inimese monotsüütide sarnane rakuliin THP-1 ekspresseerib Fc gamma RI ja Fc gamma RII. J. Leukoc. Biol. 49, 556–565 (1991).

37. Ulfman, LH, Leusen, JHW, Savelkoul, HFJ, Warner, JO & van Neerven, RJJ Veiste immunoglobuliinide mõju immuunfunktsioonile, allergiatele ja infektsioonidele. Ees. Nutr. 5, 52 (2018).

38. Lichtfuss, GF et al. HIV pärsib varajast signaaliülekande sündmusi, mille käivitab CD16 ristsidumine NK-rakkudel, mis on olulised antikehast sõltuva rakulise tsütotoksilisuse jaoks. J. Leukoc. Biol. 89, 149–158 (2011).

39. Veinid, BD et al. Dimeersed FcgammaR ektodomeenid kui gripivastase IgG Fc retseptori funktsiooni sondid. J. Immunol. 197, 1507–1516 (2016).

40. Li, X., Gibson, AW & Kimberly, RP Inimese FcR polümorfism ja haigus. Curr. Üles. Microbiol. Immunol. 382, 275–302 (2014).

41. Munde, EO et al. Seos Fcgamma retseptori IIA, IIIA ja IIIB geneetiliste polümorfismide ja vastuvõtlikkusega raskele malaaria aneemiale Lääne-Keenia lastel. BMC nakatada. Dis. 17, 289 (2017).

42. Chelimo, K. et al. Vanusega seotud erinevused looduslikult omandatud T-rakkude mälus Plasmodium falciparum merozoidi pinnavalgu 1 suhtes. PLoS ONE 6, e24852 (2011).

43. Kurtovic, L. et al. Multifunktsionaalseid antikehi indutseerib RTS, S malaaria vaktsiin ja seostatakse kaitsega I/IIa faasi uuringutes. J. Infect. Dis, jiaa144 (2020). 44. Abel, AM, Yang, C., Thakar, MS & Malarkannan, S. Looduslikud tapjarakud: arendamine, küpsemine ja kliiniline kasutamine. Ees. Immunol. 9, 1869 (2018).

45. Chaudhury, S. et al. RTS, S/AS01 malaariavaktsiini kandidaadi poolt indutseeritud antikehade bioloogilise funktsiooni määrab nende peen spetsiifilisus. Malar. J. 15, 301 (2016).

46. ​​Collins, KA, Snaith, R., Cottingham, MG, Gilbert, SC & Hill, AVS Malaariavastase kaitsva immuunsuse tugevdamine väga immunogeense viiruselaadse osakeste vaktsiiniga. Sci. Rep. 7, 46621 (2017).

47. Coppi, A., Pinzon-Ortiz, C., Hutter, C. & Sinnis, P. Plasmodium circumsporosoite valku töödeldakse proteolüütiliselt rakkude invasiooni ajal. J. Exp. Med. 201, 27–33 (2005).

48. Coppi, A. et al. Malaaria circumsporosoidi valgul on kaks funktsionaalset domeeni, millest igaühel on erinev roll sporosoitide liikumisel sääsest peremeesorganismi. J. Exp. Med. 208, 341–356 (2011).

49. John, CC et al. Antikehade kõrge taseme korrelatsioon mitme preerütrotsüütilise Plasmodium falciparum antigeeniga ja kaitse infektsioonide eest. Olen. J. Trop. Med Hyg. 73, 222–228 (2005).

50. Tran, TM et al. Mali laste ja täiskasvanute intensiivne pikisuunaline kohortuuring ei näita mingeid tõendeid omandatud immuunsuse kohta Plasmodium falciparum'i infektsiooni suhtes. Clin. Nakata. Dis. 57, 40–47 (2013).

51. Epstein, JE et al. Kaitse Plasmodium falciparum malaaria vastu PfSPZ vaktsiiniga. JCI Insight 2, e89154 (2017).

52. Sack, BK et al. Humoraalne kaitse sääsehammustuse kaudu ülekantava Plasmodium falciparum nakkuse vastu humaniseeritud hiirtel. NPJ Vaccines, 2, 27 (2017).

53. Stoute, JA et al. Plasmodium falciparum malaaria vastase rekombinantse circumsporosoite valgu vaktsiini esialgne hindamine. RTS, S malaariavaktsiini hindamisrühm. N. Ingl. J. Med. 336, 86–91 (1997).

54. Kester, KE jt. Rekombinantse circumsporosoite valgu vaktsiinirežiimide efektiivsus eksperimentaalse Plasmodium falciparum malaaria vastu. J. Infect. Dis. 183, 640–647 (2001).

55. Kester, KE jt. 2a faasi uuring malaariavaktsiini RTS, S/AS02 malaariavaktsiini 0, 1 ja 3 kuu ning 0, 7 ja 28-päevase immuniseerimiskava kohta Walter Reedis malaariasse varem põdenud täiskasvanutel Sõjaväe uurimisinstituut. Vaccine, 26, 2191–2202 (2008).

56. Kester, KE jt. Falciparum malaaria vaktsiinide RTS, S/AS01B ja RTS, S/AS02A randomiseeritud topeltpime faasi 2a uuring malaariast varem mittesaanud täiskasvanutel: ohutus, efektiivsus ja kaitse immunoloogilised tegurid. J. Infect. Dis. 200, 337–346 (2009).

57. Lux, A., Yu, X., Scanlan, CN & Nimmerjahn, F. Immuunkompleksi suuruse ja glükosüülimise mõju IgG seondumisele inimese FcgammaR-idega. J. Immunol. 190, 4315–4323 (2013).

58. Nesspor, TC, Raju, TS, Chin, CN, Vafa, O. & Brezski, RJ Avidity annab glükosüülitud immunoglobuliinile G1 FcgammaR-i sidumise ja immuunefektorfunktsiooni. J. Mol. Tunnustada. 25, 147–154 (2012).

59. Dent, AE jt. Merozoidi pinnavalgu-1 suhtes looduslikult omandatud immuunsuse ajaline stabiilsus Keenia täiskasvanutel. Malar. J. 8, 162 (2009).

60. John, CC et al. Antikehad erütrotsüütiliste Plasmodium falciparum antigeenide vastu ja kliinilise malaaria risk Keenia lastel. J. Infect. Dis. 197, 519–526 (2008).

61. Zavala, F. et al. Plasmodium falciparum malaaria vastase sünteetilise vaktsiini väljatöötamise põhjendus. Science 228, 1436–1440 (1985).

62. Arduin, E. et al. Väga vähendatud seondumine kõrge ja madala afiinsusega hiire Fc gamma retseptoritega L234A/L235A ja N297A Fc mutatsioonide poolt, mis on konstrueeritud hiire IgG2a-ks. Mol. Immunol. 63, 456–463 (2015).

63. Quinn, MT, DeLeo, FR & Bokoch, GM, Methods Mol Biol, Vol. 412 (toim. Quinn, MT) 13–18 (Springer Science plus Business Media, Springer New York Heidelberg Dordrecht London, 2007).

64. Maueroder, C. et al. CMA-le suunatud peptiid ei mõjuta otseselt neutrofiilide võimet moodustada NET-e. Ees. Immunol. 8, 16 (2017).

65. Feng, G. et al. Inimese immuniseerimine polümorfse malaariavaktsiini kandidaadiga indutseeris antikehi konserveerunud epitoopide vastu, mis soodustavad funktsionaalseid antikehi mitme parasiiditüve vastu. J. Infect. Dis. 218, 35–43 (2018).

66. Boyle, MJ et al. Inimese antikehad fikseerivad komplemendi, et pärssida Plasmodium falciparum'i invasiooni erütrotsüütidesse ja neid seostatakse kaitsega malaaria vastu. Immunity, 42, 580–590 (2015).

Tänuavaldused

Täname uuringus osalejaid ja Kenya Meditsiiniuuringute Instituudi töötajaid Chulaimbo kohordi ja Kanyawegi kohortide proovide eest. P. falciparum sporosoidid ja mAb 2H8 saadi lahkelt PATH malaariavaktsiini algatusest (MVI). MAb 3D11 ja hübridoomi andis lahkelt Miguel Prudêncio Instituto de Medicina Molecularist. P. falciparum CSP-d ekspresseerivad P. berghei parasiidid pakkusid Chris Janse, Shahid Khan ja Hans Kroeze Leideni ülikooli meditsiinikeskusest. Antigeeni kovalentset sidumist fluorestseeruvate helmestega toetasid suuresti Paul Ramsland RMIT-st, Paul Sanders Burneti Instituudist ja Geoffrey Pietersz Bakeri Südame- ja Diabeedi Instituudist.

Täname ka Michelle Wongi Burneti Instituudist meie flebotoomi eest ja Emily Locke'i kasuliku tagasiside ja nõuannete eest. Seda uuringut toetas ka AMREP Flow tsütomeetria põhiseade. Seda tööd toetas Austraalia riiklik tervise- ja meditsiiniuuringute nõukogu (NHMRC) (JG Beesoni programmi stipendium ja vanemteaduri stipendium; projektitoetused JGB-le, GI McFaddenile ja PM Hogarthile; karjääriarenduse stipendium MJB-le), PATH-MVI (toetus JGB-le), CASS Foundation (grant GF-ile), Austraalia Teadusnõukogu laureaadi stipendium GI McFaddenile ja NIH rahvusvahelistele malaariauuringute tippkeskustele (U19AI129326). Burneti instituuti toetab NHMRC sõltumatute uurimisinstituutide infrastruktuuri toetusskeem ja Victoria osariigi valitsuse operatiivinfrastruktuuri tugi. JGB, GF, MJB, JAC, SC ja LK on NHMRC Austraalia malaaria likvideerimise teadusuuringute tippkeskuse liikmed.

Autorite kaastööd

JGB, GF ja BDW juhtisid uuringu kavandamist PMH, GIM, LK, JAC ja teiste autorite panusega; GF, BDW, LK, PB, DML, SC, VM ja AC viisid läbi katseid ja tõlgendasid tulemusi; GF, PB ja JAC viisid läbi andmete analüüsi JGB, LK ja MJB sisendiga; JGB, BDW, PMH, JWK, AED, KC, GIM, AC, VM, DRD ja RJC pakkusid või genereerisid võtmereaktiive, andmeid ja/või ressursse; GF, JGB, LK, JAC ja DRD panustasid paberi ettevalmistamisse kõigi teiste kaasautorite panusega.

Konkureerivad huvid

Autorid ei deklareeri konkureerivaid huve.

Vastastikuse eksperdihinnangu teave

Nature Communications tänab Katie Ewerit, Photini Sinnist ja teist, anonüümset arvustajat, panuse eest selle töö vastastikusesse eksperdihinnangusse. Vastastikuse eksperdi aruanded on saadaval.

Väljaandja märkus

Springer Nature jääb avaldatud kaartide ja institutsionaalsete seoste suhtes erapooletuks.

Avatud juurdepääs

See artikkel on litsentsitud Creative Commons Attribution 4.0 Rahvusvaheline litsents, mis lubab kasutamist, jagamist, kohandamist, levitamist ja reprodutseerimist mis tahes andmekandjal või vormingus, tingimusel et annate originaalautori(te)le asjakohase tunnustuse. ) ja allikas, lisage link Creative Commonsi litsentsile ja märkige, kas muudatusi on tehtud. Selles artiklis olevad pildid või muu kolmanda osapoole materjal sisaldub artikli Creative Commonsi litsentsis, kui materjali krediidilimiidil ei ole märgitud teisiti. Kui materjal ei sisaldu artikli Creative Commonsi litsentsis ja teie kavandatud kasutamine ei ole seadusega lubatud või ületab lubatud kasutust, peate hankima loa otse autoriõiguste omanikult. Selle litsentsi koopia vaatamiseks külastage aadressi http://creativecommons.org/licences/by/4.{3}}/.

 For more information:1950477648nn@gmail.com