Parakvaadi madalad kontsentratsioonid kutsuvad esile ekstratsellulaarse signaaliga reguleeritud kinaasi 1/2, valgu kinaasi B ja C-Jun N-terminaalse kinaasi 1/2 raja: C-Jun N-terminaalse kinaasi roll parakvaadi poolt põhjustatud rakusurmas

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Mireia Niso-Santano, Jose´ M. Mora´n, Lourdes Garcı´a-Rubio, Ana Go´mez-Martı´n, Rosa A. Gonza´lez-Polo, Germa´n Soler,§ ja Jose´ M. Fuentes

Abstraktne:

Paraquat on herbitsiid, mis võib põhjustada parkinsonismi, kuna selle neurotoksilisus ja tugev struktuurne sarnasus 1-metüül-4-fenüülpüridiiniumiga (MPP pluss) on tuntud neurotoksiin, mis põhjustab sarnast kliinilist sündroomi. juurdeParkinsoni tõbi(PD). Praegu on aga parakvaadi poolt mis tahes rakusüsteemis aktiveeritud signaaliradade kohta väga vähe teada. Selles uuringus oleme uurinud parakvaadi mõju rakuvälistele signaaliga reguleeritud kinaasidele 1 ja 2 (ERK1/2), c-Jun N-terminaalsele kinaasile (JNK) ja proteiinkinaasi B (PKB) aktivatsioonile E18 rakkudes. Madalad parakvaadi kontsentratsioonid stimuleerisid ERK1/2, JNK1/2 ja PKB fosforüülimise väga varajast suurenemist. Fosfatidüülinositool 3-kinaasi (PI-3K) inhibiitorid wortmanniini ja LY 294002 (2-(4-morfolinüül)-8-fenüül-4H{{ 19}}bensopüraan-4-üks) pärssis varajast parakvaadi põhjustatud PKB fosforüülimise suurenemist. Lisaks olid varajane parakvaadi poolt vahendatud ERK1/2 aktivatsiooni suurenemine tundlikud mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi kinaasi 1 (MEK1) inhibiitori PD 98059 (2#-amino-3#-metoksüflavoon) suhtes, samas kui JNK1/2 vastused olid blokeeritud JNK1/2 inhibiitori SP 600125 poolt (antra[1-9-cd]pürasool-6(2H)-oon). Eeltöötlemine wortmanniini, LY 294002 või PD 98059-ga ei mõjutanud parakvaadi rakkude surma E18 rakkudes. Seevastu SP 600125 vähendas märkimisväärselt parakvaadi poolt indutseeritud rakusurma E18 rakkudes. Kokkuvõtteks oleme näidanud, et parakvaadi madalad kontsentratsioonid stimuleerivad ERK1 / 2, JNK1 / 2 ja PKB fosforüülimise tugevat väga varajast suurenemist E18 rakkudes. Lisaks näitavad esitatud andmed, et JNK1 / 2 raja inhibeerimine kaitseb E18 rakke parakvaadi poolt indutseeritud rakusurma eest ja toetab tõsiasja, et JNK1 / 2 varajase aktiveerimise pärssimine võib olla potentsiaalne strateegia PD-ravis. Märksõnad: parakvaat; madalad kontsentratsioonid; JNK; rakusurm; Parkinson.

Parkinsoni tõve vastane ravimtaim:cistanche

SISSEJUHATUS

Parkinsoni tõbi (PD)on neurodegeneratiivne haigus, mida iseloomustab dopamiinergiliste neuronite surm subconstantia nigras koos intratsütoplasmaatiliste inklusioonidega, mida tuntakse Lewy kehadena (Olanow ja Tatton, 1999). Ainult 5–10 protsendil PD patsientidest on selle haiguse perekondlik vorm autosomaalse domineeriva pärilikkusega (Gasser, 2001). Geneetilised tegurid on noortel patsientidel olulised, kuid tõenäoliselt ei mängi nad enam levinud juhuslikus PD-s olulist rolli. Seevastu epidemioloogilised uuringud näitavad mitmeid keskkonnategureid, mis suurendavad riski haigestuda PD.Parkinsoni tõbi). Nende hulka kuulusid pestitsiidid, herbitsiidid, tööstuskemikaalid, põllumajandus ja maakeskkonnas elamine (Cory-Slechta et al., 2005; Gasser, 2001; Landrigan et al., 2005; Tanner ja BenShlomo, 1999). Kõige veenvam argument PD keskkonnateguri toetuseks on seotud MPTP (1-metüül-4-fenüül-1,2,3,6-) bioloogiliste mõjude avastamisega. tetrarhia-dropüridiin). See kesknärvisüsteemi toksiin tekitab sündroomi, mis on nii kliiniliselt kui ka anatoomiliselt sarnane PD-ga (Kopin ja Markey, 1988; Langston et al., 1983). Selles mõttes on laialdaselt kasutatavat herbitsiidi parakvaati (1,1#-dimetüül-4,4#-bypiridiinium) pakutud oletatavaks riskiteguriks, mis põhineb nii selle struktuursel homoloogial MPTP aktiivse metaboliidi MPP-ga ( Tanner ja Langston, 1990) ning teadete kohta parkinsonismi kohta, mis on korrelatsioonis ainega kokkupuutega (Hertzman et al., 1990; Hubble jt, 1993; Jimenez-Jimenezet al., 1992; Liou jt, 1997; Wang et al. al., 1992). Kuigi MPPþ rakusurmaga seotud signalisatsiooniteed on hästi teada (Halvorsen et al., 2002; Gomez-Santos jt, 2002; Gonzalez-Polo jt, 2003), on aktiveeritud signaaliradade kohta väga vähe teada. parakvaadi poolt (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) Igatahes puuduvad uuringud varajaste sündmuste kohta, mis on täheldatud pärast kokkupuudet madala kontsentratsiooniga parakvaadiga.

Mitmed stiimulid, sealhulgas MPPþ ja parakvat, võivad aktiveerida hulga rakusiseseid signaaliülekandekaskaade, mis on tihedalt seotud nii rakusurma kui ka rakkude ellujäämise radadega. Näiteks MPPþ (Gomez-Santos et al., 2002; Halvorsen et al., 2002) aktiveerib mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) perekonna ja proteiinkinaasi B (PKB) liikmeid. TheMAPK perekonna liikmed aktiveeritakse MPPþ või parakvaatiga, sealhulgas rakuvälised signaaliga reguleeritud kinaasid 1 ja 2 (ERK1/2), c-Jun N-terminaalsed kinaasid (JNK1 ja JNK2) ja p38 MAPK-d. Üldiselt aktsepteeritakse, et ERK1/2 ja PKB aktiveerimine soodustab rakkude ellujäämist, aktiveerides apoptootilisi signaaliülekande radu, samas kui JNK1/2 ja p38 MAPK aktiveerimine on seotud neuronaalse rakusurmaga (Harper ja LoGrasso, 2001; Shin et al., 2001; Xia et al., 1995) . Fosfatidüülinositool-3-kinaasi (PI-3K)/PKB raja aktiveerimine on seotud neuronite ellujäämisega (Shin et al., 2001). Eelkõige võib JNK1/2 raja aktiveerimine mängida kriitilist rolli MPP ja parakvaadi toksilisuses (Cassarino et al., 2000; Halvorsen et al., 2002; Peng et al., 2004) ja sellest tulenevalt ka rakuprotsessides, mis on mõjutatud PD(Parkinsoni tõbi).

Herb cistanche: Parkinsoni tõve vastane

MATERJALID JA MEETODID

Rakuliin ja kultuur.

Selles uuringus kasutati spontaanselt immortaliseeritud roti aju neuroblaste, E18 rakke. Rakuliin E18 on saadud spontaanse immortaliseerimise teel 18-päevaste loote rottide ajukoorte kultuuridest ja selle andis lahkelt dr A. Mun˜oz (Instituto de InvestigacionesBiome´dicas, CSIC, Madrid, Hispaania) . E18 rakud esindavad primitiivseid neuroblaste, mis ekspresseerivad NF 68 ja primitiivset neuronaalset markerit nestiini, kuid neil puudub astrotsüütide marker, gliiafibrillaarne happeline valk. Pärast osalise diferentseerumise esilekutsumist dibutürüül-cAMP-ga ekspresseerivad rakud täiendavaid neuronaalseid markereid, nagu NF 145, NF 220 ja neuronispetsiifilist enolaasi (Mun˜oz, isiklik suhtlus). Rakke kasvatati Hanksi F{10}}-s (Hyclone, Brevieres, Prantsusmaa) ja neile lisati 10 protsenti FCS-i (Hyclone), streptomütsiini (100 mg/ml) ja penitsilliini (100 U/ml). Rakud külvati 5 3 10 5 °C juures 75-cm2 koekultuuri kolbi (TPP, Trasadingen, Šveits) ja inkubeeriti 37 °C juures 5% CO2/95% õhu atmosfääris. Kultuure passeeriti kord nädalas trüpsiiniga, kasutades trüpsiin-EDTA lahust (Hyclone).

Rakuravi.

Konfluentsed rakud (~ 80 protsenti) 75-cm2 koekultuuri kolbides trüpsiiniti ja külvati koekultuuri tassidesse kontsentratsiooniga 5 3104 rakku/cm2. 24 tundi hiljem sööde aspireeriti ja asendati ainult värske söötmega või söötmega, mis sisaldas näidatud parakvaadi kontsentratsioone. Edasistes katsetes kasutati kinaasi inhibiitorite (LY 294002, wortmannin, SP 600125 ja PD) erinevaid kontsentratsioone.(Parkinsoni tõbi)98059, kõik Tocris, Bristol, Ühendkuningriik) lisati 30 minutit enne parakvaadiga kokkupuudet. Kuna kinaasi inhibiitorid lahustati dimetüülsulfoksiidis, tehti kontrollid kõrgeima kasutatud kontsentratsiooniga (0,2 mahuprotsenti). Dimetüülsulfoksiidi lisamine ei mõjutanud kontrollplaatide elujõulisuse väärtusi.

Rakkude elujõulisuse test.

Rakkude elujõulisus määrati kolorimeetrilise MTT testiga (Mosmann, 1983). Elujõulistes rakkudes võib mitokondriaalne ensüüm suktsinaatdehüdrogenaas metaboliseerida MTT formazaanvärviks, mis neelab valgust lainepikkusel 57{6}} nm. Nende katsete jaoks kasutati 24-kaevude testplaate. Iga töötlemise lõpus lisati igale plaadile 100 ui MTT-d, mis oli valmistatud PBS-is kontsentratsiooniga 5 mg/ml. Pärast 3-tunnist inkubeerimist sööde dekanteeriti ja formazaani sade lahustati happelise isopropanooliga (0, 04–0, 1 N HCl absoluutses isopropanoolis). Teisendatud värvaine neeldumist mõõdeti lainepikkusel 570 nm, tausta lahutamisega 630–690 nm juures. Töötlemata kultuuride neeldumine määrati 100 protsendile.

MTT testiga saadud tulemuste kinnitamiseks hinnati rakusurma ka tsütosoolse ensüümi laktaatdehüdrogenaasi (LDH) vabanemise mõõtmisega söötmesse, kasutades kolorimeetrilist LDH analüüsi komplekti (Roche, Indianapolis, IN) vastavalt tootja juhistele. . LDH leke määratleti kui LDH aktiivsuse suhe kultiveerimissöötmes kogu aktiivsusesse süvendi kohta (3100). Mõlemat meetodit kasutades saadi võrreldavad andmed.

Rakuekstraktide valmistamine ja Western blot analüüs.

Pärast eksperimentaalset töötlemist loputati rakke (kultuuritud 60- mm tassidel) kaks korda külma PBS-ga ja eemaldati praagiga ning seejärel tsentrifuugiti 900 3 g juures 5 minutit temperatuuril 4 °C. Rakud lüüsiti puhvris. mis sisaldab 50 mM HEPES-i, pH 7,5, 300 mM NaCl, 1 protsenti Triton X-100, 2 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 25 mM NaF, 1 mMNa3VO4 ja proteaasi inhibiitori kokteili (Sigma, St Louis, MO). Rakke tsentrifuugiti 13,000 3 g juures 5 minutit temperatuuril 4 °C. Supernatante säilitati temperatuuril 80 °C kuni Western blot analüüsini. Valgu kontsentratsiooni mõõdeti vastavalt Bradfordile (1976), kasutades standardina BSA-d.

Võrdsed kogused valke (10 LG seisundi kohta) lahutati 12-protsendilise SDS-geelelektroforeesiga ja kanti PVDF-i membraanidele vastavalt tavapärastele osaliselt modifitseeritud meetoditele (Fuentes et al., 2000). Lühidalt, valgud kanti (250 mA 60 minutit) PVDF membraanidele, kasutades Mini Trans-Blot Cell aparaati (Bio-Rad, Hercules, CA). Immuuntuvastuse protseduur hõlmab membraani ülekandmist ja blokeerimist (60 minutit toatemperatuuril) TTBS-ga (10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl ja 0,2 protsenti Tween-20), mis sisaldab 10 protsenti rasvavaba kuivatatud piima. Seejärel inkubeeriti membraane 60 minutit toatemperatuuril küüliku polüklonaalsete primaarsete antikehadega (kõik firmast Cell Signalling, Beverly, MA, lahjendatud 1:1000) TTBS-s þ 10% rasvata kuivatatud piimas või 5% BSA-s. Pärast pesemist (kaks 5-minutilist perioodi TTBS-ga) inkubeeriti membraane (60 minutit toatemperatuuril) peroksidaasiga konjugeeritud küülikuvastaste sekundaarsete antikehadega (1:5000 TTBS-s 10% rasvavaba kuivatatud piimaga). Pärast pesemist (kaks 5-minutilist perioodi ja üks 10-minutiline periood) visualiseeriti seondunud antikehade tuvastamine kemoluminestsentsi abil, kasutades ECL-plus reaktiivi (Amersham Biosciences, Orsay, Prantsusmaa) ja analüüsiti Quantity abil. Üks tarkvara (Bio-Rad). Aktiinisisaldust analüüsiti kontrollina, kasutades küüliku polüklonaalset antikeha (Sigma), mis oli lahjendatud 1:2500 TTBS-s koos 10% rasvavaba kuivatatud piimaga).

Statistiline analüüs.

Iga katset korrati vähemalt kolm korda, kusjuures üksikute katsete tulemuste vahel oli rahuldav korrelatsioon. Näidatud andmed on tüüpilise katse andmed; iga rühm oli keskmiselt kolm kuni neli kultuurirooga. Kõik andmed on väljendatud keskmisena ± SEM. Tulemusi analüüsiti ANOVA abil. Oluliseks peeti p-väärtusi, mis olid väiksemad kui 0,05.

Parkinsoni tõve vastu võitlemine:Cistanche ekstrakt

TULEMUSED

Parakvaadi tsütotoksiline toime E18 rakkudele

Nagu varem teatatud (Cappelletti et al., 1998; Chun et al., 2001; Gonzalez-Polo et al., 2004), on mitmed rakuliinid tundlikud parakvaadi toksiliste omaduste suhtes. Kokkupuude parakvaadiga põhjustas annusest sõltuva rakkude elujõulisuse vähenemise. (Joonis 1.) Selles uuringus kaotasid E18 rakud, mida töödeldi 25 lM parakvaadiga 24 tundi, 50 protsenti rakkude elujõulisusest. Rakkude elujõulisust hinnati, mõõtes muundumist MTT-ks formazaanvärviks, mis neelab valgust lainepikkusel 570 nm. Seda analüüsi kasutatakse laialdaselt rakusurma jälgimiseks mitmetes rakuliinides, sealhulgas E18 rakkudes (Donaire et al., 2005; Garcia-Roman et al., 2001) ja erinevate solvangute, sealhulgas parakvaadi (Chun et al., 2001; Gonzalez). -Polo et al., 2004).

Parakvaadi poolt indutseeritud ERK1/2 aktiveerimine E18 rakkudes

ERK1/2 aktivatsiooni suurenemist parakvaadiga töödeldud E18 rakkudes jälgiti Western blot analüüsiga, kasutades fosfospetsiifilist ERK1/2 (Thr202/Tyr204) antikeha. E18neuroblastide rakkude eksponeerimine 25 lM parakvaadiga põhjustas ERK1/2 (44/42 kDa) fosforüülimise (Thr202/Tyr204) seisundi märgatava tõusu (joonis 2A). Fosforüülimise maksimaalne suurenemine toimus 5 minuti pärast, pärast mida fosforüülimise tase langeb aeglaselt peaaegu baastasemeni. Lisaks ei sõltunud parakvaadi poolt indutseeritud ERK1/2 fosforüülimise suurenemine kontsentratsioonist (joonis 2B). Eeltöötlus theMEK1 inhibiitoriga PD(Parkinsoni tõbi)98059 (50 lM; Dudley et al., 1995) inhibeeris täielikult parakvaadi poolt indutseeritud ERK1/2 fosforüülimise suurenemise (joonis 3).

Parakvaadi poolt indutseeritud PKB aktiveerimine E18 rakkudes

PKB aktivatsioon E18 rakkudes tuvastati Western blot analüüsiga, kasutades fosfospetsiifilist (Ser473) antikeha. E18 rakkude stimuleerimine 25 lM parakvaadiga põhjustas PKB fosforüülimise märgatava tõusu (joonis 4A). See suurenemine toimub 20 minuti pärast, mis on võrreldav ERK1 / 2 fosforüülimisega pärast seda, kui fosforüülimise tase langes aeglaselt peaaegu baastasemeni (joonis 4A). Lisaks sõltus parakvaadi poolt vahendatud PKB fosforüülimise suurenemine kontsentratsioonist, maksimaalne parakvaadi kontsentratsioon oli 25 lM (joonis 4A). Kuna PI-3K on PKB aktiveerimiseks vajalik, uuriti PI-3K rolli parakvaadi poolt indutseeritud PKB aktivatsioonis E18 rakkudes, kasutades PI-3K inhibiitoreid wortmannin ja LY 294002.

Parakvaadi poolt vahendatud PKB fosforüülimise suurenemine blokeeriti täielikult pärast E18 rakkude eeltöötlust (30 min) 100 nM wortmanniini ja 30 lM LY 294002-ga (joonis 5). Need tähelepanekud näitavad, et PI-3K-sõltuv rada vahendab parakvaadi poolt indutseeritud PKB fosforüülimise suurenemist E18 rakkudes.

JNK1/2 parakvaadi poolt indutseeritud aktiveerimine E18 rakkudes

Varasemad uuringud on näidanud, et parakvaat aktiveerib JNK1/2 neuronites (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) ja mitteneuronaalsetes rakkudes (Bennett et al., 2001; Cheng et al., 2003). Siiski on kasutatud kontsentratsioonid suuresti kõrgemad kui selles töös kasutatud kontsentratsioonid. Lisaks on JNK1/2 aktiveerimise visualiseerimiseks valitud ajad ka pikemad. JNK1/2 aktivatsioon E18 rakkudes tuvastati Western blot analüüsiga, kasutades fosfospetsiifilist JNK (Thr183/Tyr185) antikeha. E18 rakkude stimuleerimine 25 lM parakvaadiga põhjustas JNK (46/54 kDa) fosforüülimise märgatava ja varajase suurenemise (joonis 6A). Need tõusud olid maksimaalsed 5 minuti pärast, pärast mida vähenes fosforüülimise tase baastaseme suunas (joonis 6A). Kuid parakvatvahendatud JNK1/2 fosforüülimise suurenemine ei sõltunud kontsentratsioonist (joonis 6B). Parakvaadi poolt vahendatud JNK1/2 fosforüülimise suurenemine oli tundlik JNK1/2 inhibiitori SP 600125 suhtes (10 lM; joonis 7; Bennett et al., 2001). Lõpuks ei stimuleerinud parakvaat (25 lM) sama aja jooksul tehtud katsetes p38 MAPK fosforüülimise mõõdetavat suurenemist E18 rakkudes (andmeid pole näidatud). Need katsed viidi läbi, kasutades fosfospetsiifilist p38 MAPK (Thr180/Tyr182) antikeha.

Rakkude elujõulisuse mõõtmine pärast E18 rakkude töötlemist parakvaadi ja kinaasi inhibiitoritega

Olles näidanud, et parakvaat tekitab E18 rakkudes kõigil juhtudel varajase aktivatsiooni ERK1/2, PKB ja JNK1/2, määrasime seejärel nende kinaasiradade kiire aktiveerimise rolli parakvaadi madalate kontsentratsioonide indutseeritud rakusurmas, kasutades farmakoloogilisi spetsiifilisi omadusi. inhibiitorid. Nagu on näidatud joonisel 1, põhjustas E18 rakkude kokkupuude 25 lM parakvaadiga rakkude elujõulisuse olulise vähenemise (umbes 50 protsenti). ERK1/2, PKB ja JNK1/2 rolli uurimiseks parakvaadi poolt indutseeritud rakusurmas eelinkubeeriti E18 rakke 30 minutit järgmiste kinaasi inhibiitoritega: PD(Parkinsoni tõbi)98059 (50 lM; MEK1/2 inhibiitor), LY 294002 (30 lM; PI-3K inhibiitor), wortmanniin (100 nM; PI-3K inhibiitor) ja SP 600125 (10 lM; JNK1/2 inhibiitor). Nagu on näidatud joonisel 8 (ja see on kokku võetud tabelis 1), ei avaldanud wortmanniinil, LY 294002 ja PD 98059 olulist mõju 25 lM parakvaadi indutseeritud rakkude elujõulisuse vähenemisele.

ARUTELU

Hiljuti on mitmed uuringud suurendanud huvi selle vastu, et keskkonna neurotoksiinid, nagu pestitsiidid, võivad olla seotud mittegeneetilise PD tekkega.(Parkinsoni tõbi)(Cory Slechta jt, 2005; Landrigan et al., 2005; Norris jt, 2004; Ritz ja Yu, 2000; Sherer jt, 2001). PQ on üks võimalikest herbitsiididest, mis on seotud PD-ga, kuna MPPþ-ga on sarnane keemiline struktuur ning tugev korrelatsioon haiguse esinemissageduse ja kasutatud PQ koguse vahel (Lanska, 1997; Liou et al., 1997; Ritz ja Yu, 2000). Siiski ei ole kindlaks tehtud parakvaadi madala tasemega kokkupuutel tekkiva neuronaalse toksilisuse mehhanismi. Igal juhul ei huvita varasemaid töid varajane protsess, mis ilmnes pärast parakvaadi ekspositsiooni. Käesoleva uuringu peamine järeldus on see, et oleme näidanud, et E18neuroblasti rakud, mis puutuvad kokku paraquatrapiidselt madala kontsentratsiooniga, suurendasid üldiselt antiapoptootiliste signaaliradade PI-3K/PKB ja MEK ERK aktiveeritud fosforüülimist ning ka üldiselt proapoptootilise JNK1/ 2 MAPK. Seevastu parakvaat ei stimuleerinud ajast või kontsentratsioonist sõltuvat p38 MAPK fosforüülimise mõõdetavat suurenemist. Nagu eespool märgitud, kasutasime parakvaadi madalat kontsentratsiooni. Selle üle, kas parakvaat võib ajju sattuda või mitte, kuna see on laetud molekul, on arutatud. Kuid hiljutised leiud (Shimizu et al., 2001) näitasid, et parakvaat võib ajju pääsemiseks kasutada neutraalset aminohappepumpa. Selles töös esitatud leiud näitavad, et rakus on vaja ainult madalat parakvaadi kontsentratsiooni, et kiiresti stimuleerida mitmeid rakusurma protsessides osalevaid signaaliradu, sealhulgas NK-d. Need varajased aktiveerimised, mis on tingitud parakvaadi madalast kontsentratsioonist, on esmakordselt välja pakutud käesolevas töös.

Parakvaadi poolt indutseeritud PKB või ERK1/2 fosforüülimise tasemete muutuste uurimisele on vähe tähelepanu pööratud (Cheng et al., 2003; Peng et al., 2004). Igal juhul on varasemates aruannetes (Peng et al., 2004) kasutatud suhteliselt kõrgeid parakvaadi kontsentratsioone (400 lM), mõõtes ERK fosforüülimise astet pärast 12–18-tunnist kokkupuudet. Sel ajal ei täheldanud nad p-ERK taseme muutusi. Oma töös tuvastasime ERK1/2 varajase (5–10 min) ja olulise aktiveerimise (joonis 2A). See aktiveerimine langeb aeglaselt põhitasemeni. Meie tingimustes on fosforüülitud ERK1 / 2 tasemed (pärast 12–18 tundi) samad, mis kontrollis, mis näitab, et see rada ei ole nendel aegadel aktiivne (andmeid pole näidatud), nagu on kirjeldanud Peng et al. (2004). See aktiveerimine ei sõltu kontsentratsioonist, mis näitab, et ERK tugev stimulatsioon saavutatakse ja säilitatakse väga madalate parakvaadi kontsentratsioonidega. Pärast parakvaadiga kokkupuudet ei ole endiselt kirjeldatud fosforüülitud PKB taseme muutusi. Joonisel 4 on näidatud, et tulemused sõltuvad ajast ja kontsentratsioonist, mis näitab maksimaalset mõju pärast 20-minutilist eksponeerimist 25 lM parakvaadiga. See tähendab, et PKB fosforüülimise varajane parakvaadi poolt vahendatud suurenemine on võrreldav ERK1 / 2 puhul täheldatuga. Need andmed näitavad nii PKB kui ka ERK ellujäämisradade fosforüülimise aktiveerimise varajast suurenemist. Puuduvad andmed PKB või ERK varajase aktiveerimise kohta parakvaadi põhjustatud rakusurma korral. Varasemad uuringud (Halvorsen et al., 2002) kirjeldavad aga MPP-ga kokkupuutunud neuroblastoomi SH-SY5Y rakkude mõlema raja sarnast varajast suurenemist. Sel juhul ei vähene fosforüülimise tase baastaseme suunas. Need andmed on eriti huvitavad varem seotud sarnase struktuuri tõttu parakvaadi ja MPPþ vahel, mis näitab mõlema molekuli mõjuga seotud rakulise masina erinevat algust.

Rohkem tähelepanu on pööratud JNK1 / 2 raja rollile parakvaadi poolt indutseeritud rakusurma soodustavate signaalide vahendamisel. Selles uuringus näitasime, et parakvaadi madalad kontsentratsioonid (25 lM) põhjustasid fosforüülitud JNK1/2 olulise suurenemise (joonis 6). Nagu PKBor ERK1/2 puhul, on see aktiveerimine ajast sõltuv väga varajase algusega (5 min) ja aeglase naasmisega põhitasemele. Varasemad tööd (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) näitavad JNK1/2 raja hilist (12–18 tundi) aktiveerumist, mis on igal juhul põhjustatud parakvaadi suhteliselt kõrgest kontsentratsioonist (alates 400 lM). [Peng et al., 2004] kuni 800 lM [Chunet al., 2001]). Meie tingimustes on JNK1 / 2 fosforüülimise aste näidatud aegadel võrreldav kontrolliga. Üldiselt näitavad need tulemused esimest korda, et rakkude kokkupuude väga madala parakvaadi kontsentratsiooniga põhjustab PKB, ERK1/2 ja JNK1/2 radade varajase aktiveerimise.

Olles kindlaks teinud, et parakvaat käivitab E18 rakkudes varajase PKB, ERK1 / 2 ja JNK1 / 2 aktivatsiooni, uurisime seejärel nende proteiinkinaasi radade rolli parakvaadi poolt indutseeritud rakusurmas, kasutades mitmeid farmakoloogilisi inhibiitoreid. Rakkude elujõulisust jälgiti, mõõtes transformatsiooni MTT-ks formazaanvärviks, mis neelab valgust lainepikkusel 570 nm. MTT testi on kasutatud neuronaalsete vigastuste täpseks mõõtmiseks pärast mitmesuguseid solvanguid, sealhulgas MPPþ või parakvaat (Gonzalez Polo et al., 2003, 2004; Schmuck jt, 2002; Sheng et al., 2002; Storch jt, 2004 ) ja see on enimkasutatav meetod rakusurma määramiseks. Nagu on näidatud joonisel 8, vähendas eeltöötlus selektiivse JNK1/2 inhibiitoriga SP 600125 märkimisväärselt parakvaadi põhjustatud rakusurma. See SP 600125 kontsentratsioon blokeeris täielikult parakvaadi poolt indutseeritud JNK1/2 aktivatsiooni (joonis 7). Need andmed viitavad sellele, et JNK1 / 2 raja varajase aktiveerimise pärssimine kaitseb rakke parakvaadi poolt indutseeritud rakusurma eest. Need andmed on kooskõlas varasemate uuringutega (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004), mis on näidanud, et JNK1 / 2 on seotud parakvaadi poolt põhjustatud neuronaalse rakusurmaga. Nendes uuringutes kasutatakse aga 15–30 korda suuremat parakvaadi kontsentratsiooni kui selles uuringus kasutatud. Samuti demonstreerime, et parakvaadi madalad kontsentratsioonid võivad põhjustada mitte ainult selle raja aktiveerimise, vaid ka varajase aktiveerimise. SP600125 puhul täheldatud kaitse näitab ka, et JNK1/2 rada on seotud parakvaadi poolt indutseeritud rakusurmaga. Lisaks on JNK1 / 2 inhibeerimine kavandatud potentsiaalse strateegiana PD ravimisel(Parkinsoni tõbi)mitmes mudelis nii in vivo kui ka in vitro (Wang et al., 2004).

cistanche neuroprotektiivne toime

Varasemad uuringud on näidanud, et nii PKB kui ka ERK rada on seotud neuronite ellujäämisega (Guyton et al., 1996; Shin et al., 2001). Selles uuringus oleme näidanud, et parakvaadi madalad kontsentratsioonid toodavad ja stimuleerivad varakult nii PKB kui ka ERK radu. Need tähelepanekud viitavad sellele, et parakvaadi indutseeritud PKB ja ERK aktiveerimine võib olla seotud rakkude kaitsmisega parakvaadi põhjustatud rakusurma eest. Selle võimaluse uurimiseks kasutasime struktuurselt mitteseotud PI-3K inhibiitoreid wortmanniini ja LY 294002 ning ERK1/2 inhibiitorit PD(Parkinsoni tõbi)98059. Huvitaval kombel ei muutnud nii PKB kui ka ERK inhibeerimine rakkude elujõulisust parakvaadi juuresolekul, mis viitab sellele, et meie tingimustes ei ole suurenenud PKB ja ERK aktivatsioon E18 rakkudes parakvaadi poolt põhjustatud rakusurma ellujäämiseks hädavajalik.

On hästi teada, et parakvaadi neurotoksilisuse mehhanism on muude tegurite hulgas vahendatud oksüdatiivse stressi kaudu (Gonzalez-Polo et al., 2004; Mollace et al., 2003). Selles mõttes on hiljuti kirjeldatud väga kiiret tsütosoolset oksüdatiivset stressi varajastes apoptootilistes sündmustes, mis on seotud parakvaadi poolt indutseeritud rakusurmaga (Gonzalez-Polo et al., 2004). Kuna oksüdatiivne stress aktiveerib MAPK perekonna liikmeid (nagu ERK1/2 ja JNK1/2) ja PKB (Kamata ja Hirata, 1999), võib selle ERK1/2, JNK1/2 ja PKB varajase aktivatsiooni seostada kiire oksüdatiivse toimega. stressist põhjustatud pärast parakvaadi eksponeerimist.

Kokkuvõttes näitavad meie tulemused esimest korda, et parakvaadi madalad kontsentratsioonid stimuleerivad PKB, ERK1 / 2 ja JNK1 / 2 fosforüülimise väga varajast ja tugevat suurenemist E18 rakkudes. Lisaks oleme näidanud, et JNK1 / 2 raja varajase aktiveerimise pärssimine kaitseb E18 rakke parakvaadi poolt indutseeritud rakusurma eest. See tulemus viitab mõnede varajaste sündmuste olemasolule (nagu kiire JNK1 / 2 aktiveerimine), mis mängivad olulist rolli parakvaadi madalate kontsentratsioonide põhjustatud rakusurmas. See tulemus avab ka uue ja põneva suuna parakvaadi toksilisuse ja selle võimaliku mõju uurimisel PD arengus.(Parkinsoni tõbi).

MÄRGE: Cistancheon traditsiooniline Hiina ravimtaim, millel on mõju neuronitele ja ajurakkudele. cistanche on tuntud ka kui kõrbe ženšenn, see on potentsiaalne ravi neurohaiguste, näiteksParkinsoni tõbipõhineb kaasaegsel farmakoloogilisel uuringul