Lamivudiin parandab SAMP8 hiirte kognitiivset langust: in vivo farmakoloogilise hindamise ja võrgustiku farmakoloogia integreerimine

Abstraktne

Pöördtranskriptaasi inhibiitorid nagu lamivudiin (3TC) mängivad olulist rolliVananemisvastane, kuid nende mõjuvananemisest tingitud neurodegeneratiivsed haigusedei ole selged, eriti funktsioonide kohtanärvisüsteem nagu tunnetus. Selles uuringus manustati 3TC-d vananemisele kiirenenud hiirtele kalduvatele 8 (SAMP8) hiirtele mao perfusiooni teel (100 mg/kg) 4 nädala jooksul. Meie tulemused näitasid, et 3TC parandas oluliseltSAMP8 hiirte vananemise staatus, eriti Morrise veelabürindi testiga hinnatud kognitiivsete võimete langus. Molekulaarsete mehhanismide edasiseks uurimiseksvananemisseisundi parandamineHiirte ajukudede (st hipokampuse ja ajukoore) uurimiseks kasutati SAMP8 hiirte 3TC abil qPCR-i ja kudede värvimismeetodeid, samas kui 3TC potentsiaalsete sihtmärkide uurimiseks kasutati võrgufarmakoloogia analüüsi. Tulemused näitasid, et geenide mRNA tasemed olid seotud pikkade vahelduvate elementide -1, 1. tüüpi interferooni vastuse, vananemisega seotud sekretsiooni fenotüübi jaAlzheimeri tõbiSAMP8 hiirte hipokampuses ja ajukoores suurenesidvananemine, kuid 3TC muutis selle suundumuse osaliselt ümber. Histoloogiliste uuringute tulemused näitasid, et 3TC vähendas hipokampuse neuronite surma, samas kui võrgufarmakoloogilise analüüsi tulemused näitasid, et 3TC võib avaldada mõju mitmel viisil, sealhulgas östrogeeni signaaliülekande ja PI3K/Akt ja neuroaktiivse ligandi-retseptori interaktsiooni signaaliradade kaudu. mida oleme kontrollinud in vitro katsetega. Need leiud annavad tõendeid 3TC terapeutilise potentsiaali kohta neurodegeneratiivsete haiguste ravis.

MÄRKSÕNADvananemine, kognitiivne võime, lamivudiin, long vahele jäänud element-1, neurodegeneratiivsed haigused

Hiina maitsetaimed Cistanche Effect OnPöördtranskriptaasi inhibiitorid Vananemisvastased ained

1|SISSEJUHATUS

Tänaseks on vananemis- ja neurodegeneratiivsed haigused, ntAlzheimeri tõbi (AD) või Parkinsoni tõbivananemisega seotud, on globaalsete demograafiliste muutuste tõttu üha suurenevad.1,2 kognitiivne langus kujutab tõsist takistust pika ja terve elu saavutamisel. Aastakümneid on tehtud märkimisväärseid jõupingutusi, et otsida ravimeid, mida saaks kasutada vananemisega kaasneva kognitiivse degeneratsiooni raviks.3 Viimastel aastatel on pikalt vahele jäänud element -1 (L1) pälvinud üha suuremat tähelepanu kui võimalik uudne. vananemise uurimise sihtmärk.4 L1 kuulub kõige arvukamasse mittepikkade terminaalsete korduvate retrotransposoonide perekonda, millel on ~500,{10}} koopiat ja mis hõlmab ~17 protsenti inimese genoomist. L1 geen sisaldab operonit, millel on kaks avatud lugemisraami (ORF1 ja ORF2), mis mõlemad on vajalikud retrotranspositsiooniks.5–7 ORF1 kodeerib pöördtranskriptaasi aktiivsusega valku (ORF1p), mida saab inhibeerida nukleosiidi analoogidega, nagu näiteks lamivudiin (2'-3'-deoksü-3'-tiotsütidiin, 3TC).8

Aktiivne L1 võib sünteesida cDNA-d väljaspool kromatiini ja seejärel sisestada see uuesti ORF1p katalüüsitud genoomi, muutes lõpuks teiste geenide ekspressiooni ja põhjustades genoomse ebastabiilsusega seotud haigusi.9,10 Peremeesorganism inhibeerib üldiselt L1 transponeeritavat aktiivsust seeria kaudu. regulatsioone, nagu epigeneetiline modifikatsioon ja peremeesorganismi piirava faktori regulatsioon.11,12 L1 transpositsioon toimub tavaliselt ainult idu- või vähirakkudes, samas kui hiljutised uuringud on näidanud, et L1 on väga aktiivne ka kesknärvisüsteemis või vananevates rakkudes, kuigi L1 aluseks olevad närvimehhanismid on ebaselged.13 Uuringud on näidanud, et L1 jälgimismehhanismiga seotud tegurid (nt TREX1, RB1 ja FOXA1) on rakkude vananemises düsfunktsionaalsed, mille tulemuseks on L1 aktiveerumine. TREX1 on 3' eksonukleaasi aas, mis lagundab võõraid sissetungivaid DNA-sid ja selle kadu on seostatud tsütoplasmaatilise L1 cDNA akumuleerumisega.14 On näidatud, et RB1 seondub korduvate elementidega, sealhulgas L1 elementidega, ja soodustab nende heterokromatiniseerumist.15 Ja FOXA1 on ülesreguleeritud vananevates rakkudes13 ja seotud L1 5' UTR keskse piirkonnaga. Aktiveeritud L1 aktiveerib veelgi I tüüpi interferooni (IFN-I) reaktsiooni, mis kutsub esile põletiku pöördtranskriptsioonilise cDNA kaudu ja säilitab vananemisega seotud sekretsiooni fenotüübi (SASP). Seetõttu peetakse L1-d vananemisest põhjustatud aseptilise põletiku oluliseks teguriks oluliseks sihtmärgiks vananemisega seotud haiguste ravis. Eakatel hiirtel, keda raviti 3TC-ga, paraneb põletikuliste tegurite kuhjumine, inhibeerides L1 rakuvälist transkriptsiooni lihas- ja muudes kudedes.16 Praeguseks on pöördtranskriptaasi inhibiitorite mõju närvisüsteemi funktsioonidele uuritud vähe. Hiljuti on surnud AD-ga patsientide ajudest leitud tuhandeid genoomse cDNA (gencDNA) variante, mis tulenevad iseloomulike RNA splaissinguvariantide uuesti sisestamisest genoomi.17 Seda nähtust peetakse AD oluliseks põhjuseks. GencDNA-de teket põhjustavad tegurid hõlmavad transkriptsiooni, DNA hävitamist, pöördtranskriptaasi ja vananemist.

Uuringud on näidanud, et endogeense pöördtranskriptaasi aktiivsusega hiina hamstri munasarja (CHO) rakuliinides nukleosiidsete pöördtranskriptaasi inhibiitorite kasutamine blokeerib gencDNA moodustumise protsessi.19 Lisaks on üle 65-aastased AIDS-i patsiendid, kes on võtnud pöördtranskriptaasi inhibiitoreid. pikka aega harva arenenud AD.20 Seetõttu oletame, et 3TC võib pöördtranskriptaasi inhibiitorina olla potentsiaalne ravim vananemisest põhjustatud kognitiivsete häirete ja neurodegeneratiivsete haiguste raviks. Näidati, et vananemiskiirenenud kalduvustega 8 (SAMP8) hiirtel on inimese vananemise ja vanusega seotud haiguste uurimise mudelina palju tunnuseid, mis teadaolevalt esinevad neurodegeneratiivsete haiguste varases staadiumis, nagu suurenenud oksüdatiivne stress, neuropõletik ja kognitiivsed häired. Seetõttu valiti selles uuringus SAMP8 hiired ideaalseks loommudeliks vananemisest põhjustatud neurodegeneratiivsete haiguste korral. Keskendusime 3TC kognitiivsetele mõjudele enneaegselt vananevatele hiirtele ja vananemisega seotud molekulaarsetele radadele, pakkudes tõendeid pöördtranskriptaasi inhibiitorite rolli kohta vananemisest tingitud neurodegeneratiivsete haiguste ravis. Lisaks rakendasime võrgufarmakoloogia meetodit 3TC sihtmärkide ennustamiseks, võrkude ehitamiseks ja 3TC-ga seotud bioloogiliste funktsioonide ja radade analüüsimiseks.

2|EKSPERIMENTAALNE OSA 2.1 |

Loomad Tianjini Traditsioonilise Hiina Meditsiini Ülikooli poolt pakutavaid 44-nädalaseid isaseid SAMP8 ja normaalse vananemisega kiirendatud hiire-R1 (SAMR1) hiiri kasutati pärast 1-nädalast aklimatiseerumisperioodi. Loomkatsete protokolli kiitis heaks Shandongi provintsihaigla loomaeetika komitee ja see viidi läbi riiklike tervishoiuinstituutide (NIH) laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendi alusel. Hiiri hoiti autoklaavitud puurides ning neile anti steriilset toitu ja vett. Hiirte kehakaal registreeriti iga päev. Selles uuringus tehtud katsete vooskeem on toodud joonisel 1A. Pärast katsete lõppu hiired surmati dietüüleetri sissehingamise teel.

2.2|3TC valmistamine ja ravi

Ravimid valmistati värskelt iga katse päeval. MCE-st (Shanghai, Hiina) ostetud 3TC lahustati DMSO-s lõppkontsentratsioonini 2 mmol/l. Seejärel lahjendati põhilahus joogiveega töökontsentratsioonini, mille DMSO lõppkontsentratsioon oli alla 0,1 protsenti. Moodustati kolm hiirte rühma: kontrollrühm, mida töödeldi vehiikulilahusega (joogivesi), katserühm, mida töödeldi 3TC-ga, ja SAMR1 rühm, kes sai vehiiklit, kasutati teise vananemise kontrollrühmana. Katserühm sai suukaudselt 3TC-d annuses 100 mg/kg päevas. Kõiki hiiri toideti intragastrilise manustamisega 4 nädalat (joonis 1B).

JOONIS 1 Eksperimentaalne ülesehitus ja 3TC mõju suhtelise kaalukaotuse parandamisele vananemise ja vananemise hindamisskooride tõttu. (A) Farmakoloogiliste katsete vooskeem, et uurida 3TC mõju SAMP8 hiirte kognitiivsele võimele. (B) Loomkatsete ajakava skemaatiline esitlus. (C) Kontseptuaalne töövoog ravimi sihtmärgi interaktsioonide ennustamiseks, kasutades Pharmmapperit, mis näitab vasakult paremale 3TC molekulaarstruktuuri, 3TC 3D struktuuriskeemi ja farmakofoori mudelit, mis on prognoositud 3TC seondumisel östrogeeni retseptoriga kõrgeima normaliseeritud väärtusega sobivad hinded. (D) Kehakaalu kasvumuster igas hiirte rühmas. (E) Muutused hindamisskoorides enne ja pärast 3TC ravi. SAMR1 pluss Vehicle: 44-nädalased SAMR1 hiired, keda raviti kandjaga 4 nädalat. SAMP8 pluss Vehicle: 44-nädalased SAMP8 hiired, keda raviti vehiikuliga 4 nädalat. SAMP8 pluss 3TC: 44-nädalased SAMP8 hiired, keda raviti 3TC-ga 4 nädalat. Studenti t-test: *p < 0.05, **p < 0,01 ja ***p < 0,001. ns: puudub statistiline olulisus. Mustad tärnid tähistavad võrdlust SAMR1 pluss sõidukirühmaga. Punased tärnid tähistavad võrdlust SAMP8 pluss sõidukirühmaga. Sinine joon tähistab SAMP8 pluss 3TC rühma vanuses 44 ja 48 nädalat.

2,3|Hindamissüsteem

Hiirte vananemisastet hinnati eelnevalt kirjeldatud hindamissüsteemi abil.22 Iga hindekategooria sisaldab viit taset vahemikus 0 kuni 4, kusjuures hinde kõrgeim skoor näitab looma kõrgeimat vananemisastet. . Iga kategooria hindeid hindasid eraldi neli kogenud katsetajat, kes olid ravitingimuste suhtes pimedad (täiendav tabel S1).

.2.4|Morrise veelabürindi test

Morrise veelabürindi uuringud viidi läbi Morrise protokolli järgi, sealhulgas orientatsiooninavigatsioonikatse ja sondikatsed.23 Vesilabürint oli ringikujuline bassein (120 cm läbimõõduga, mis oli varustatud 10 cm läbimõõduga platvormiga) ja täidetud veega temperatuuril 25 °C. ± 1 kraad. Hiiri treeniti leidma platvormi veepinna all ühe minuti jooksul. Kui hiir 60 sekundi jooksul platvormi üles ei leidnud, juhatati ta platvormile ja lasti sinna jääda 20 sekundiks. Kõiki hiirt treeniti viis korda päevas, eraldades igaüks neist 15 minutit. Igas katses oli lähtepositsioon erinev, pseudojuhuslikus järjekorras. Testi kuuendal päeval eemaldati platvorm ja loom sisenes veelabürinti punktist, mis oli vastas labürindi kvadrandile, kus platvorm enne treeningu ajal asus, ja tal lasti labürinti 60 sekundit uurida. Ujumisrada ja aeg, mille hiired labürinti otsides kulutasid, salvestati videokaameraga ja analüüsiti EthoVision XT (Noldus Software) abil. Iga rühm koosnes vähemalt kaheksast loomast.

2,5|RNA ekstraheerimine ja kvantitatiivne PCR

Kogu RNA ekstraheeriti hiirte hipokampuse ja kortikaalsetest kudedest pärast töötlemist, kasutades TRIzol Reagenti (Invitrogen) vastavalt tootja protokollile. Iga RNA proov (1 ug) pöördtranskribeeriti cDNA saamiseks cDNA pöördtranskriptsioonikomplekti (Takara) abil ja seejärel amplifitseeriti PCR-ga, kasutades TaKaRa Taq komplekti (Takara). Praimerite komplekte on kirjeldatud täiendavas tabelis S2.

2,6|Kudede ettevalmistamine

Loomad anesteseeriti dietüüleetriga ja nende ajud koguti pärast transkardiaalset perfusiooni fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) ja 4-protsendilise paraformaldehüüdi lahusega. Ajukude eemaldati ja fikseeriti paraformaldehüüdis üle 2 päeva. Fikseeritud ajud sisestati parafiini ja hipokampuse kude lõigati paksusega 5 μm.

2,7|Hematoksüliini ja eosiini (H & E) värvimine

Aju morfoloogiat analüüsiti hematoksüliini ja eosiini (H & E) värvimismeetodite abil. Hipokampuse kudede parafiinilõigud deparafeeriti ja dehüdreeriti mitme kontsentratsiooniga alkoholi gradiendiga. HE värvimine viidi läbi H & E värvimiskomplekti (Solarbio) abil vastavalt tootja juhistele. Pärast etanooli ja ksüleeni sukeldamist paigaldati sektsioonid vaiguga ja vaadeldi valgusmikroskoobi all (Olympus).

2,8|Nissl värvimine

Nissli värvimise (Biyuntian) meetodit kasutati neuronaalsete kahjustuste tuvastamiseks hipokampuse kudede lõikudes. Sektsioone inkubeeriti Nissl peitsiga 30 minutit ja pesti 95% etanooliga. Värvitud rakud loendati ja pildistati valgusmikroskoobiga (Olympus). Rakud loendati kolmel juhuslikult valitud mittekattuval väljal hipokampuse koe igal slaidil, kusjuures ellujäämisindeks määratleti kui ellujäänud neuronite arv / neuronite koguarv.

2,9|TUNEL värvimine

Hipokampuse kudede sektsioone inkubeeriti proteinaasi K lahusega 15 minutit, millele järgnes inkubeerimine TUNELi reaktsiooniseguga (Beyotime). Pärast kolmekordset pesemist PBS-iga paigaldati sektsioonid tuumavärvi DAPI sisaldava paigalduslahusega ja jälgiti kas tavapärase fluorestsentsmikroskoobi või konfokaalse laserfluorestsentsmikroskoobi abil.

2.10|3TC sihtandmebaasi loomine

3TC sihtandmebaas koostati kahe andmebaasi põhjal. Esiteks tuvastati 3TC potentsiaalsed sihtmärgid, kasutades Pharmmapperi andmebaasil põhinevat pöördfarmakodünaamilist geenikaarti (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/results/20081 6062539.html). Chembiodraw teisendas kõik keemilised komponendid .mol2-vormingusse ja laaditi üles Pharmmapperi andmebaasi (joonis 1C). 3TC potentsiaalsete sihtmärkidena tuvastati molekulid, mille normaliseeritud sobivusskoor on suurem kui 4.{7}}. Teiseks kasutati sihtmärkide või ühendite bioloogilise aktiivsuse päringute tegemiseks andmebaasi ChEMBL (https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_re port_card/CHEMBL141/). 3TC potentsiaalseteks sihtmärkideks tuvastati Homo sapiensist pärinevad valgud.

2.11|Sihtvalgu interaktsiooni analüüs ja võrgu ehitamine

The target proteins screened were integrated for the protein-protein interaction (PPI) analysis using String 9.1 (http://string-db.org/) with the protein network interaction diagrams generated. Protein interactions with a confidence score >Pärast duplikaatide kõrvaldamist valiti kavandatud seadistuses 0.4.

3TC molekulaarsete mehhanismide põhjalikuks uurimiseks konstrueeriti PPI võrgud, kasutades tarkvara Cytoscape versiooni 3.6.0.(http://www.cytoscape.org/). Sõlmede astme analüüs viidi läbi rakendusega Centiscape 2.2 (http://apps.cytoscape.org/apps/centiscape), et sõeluda võrkudes jaoturi geene, mille läheduse tsentraalsuse, vahelise tsentraalsuse ja kraadi kesksuse väärtuseks oli määratud {{6 }}.2, 450 ja 50 vastavalt.

2.12|3TC signaaliradade rikastamine ja sõelumine

Geeniontoloogia (GO) rikastamise analüüs bioloogiliste protsesside, rakuliste komponentide ja potentsiaalsete sihtmärkide molekulaarsete funktsioonidega viidi läbi bioloogiliste funktsioonide annotatsiooni jaoks, mis põhines DAVID-i bioinformaatika andmebaasil (//david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp). KEGG metaboolsed rajad märgiti Kyoto geenide ja genoomide entsüklopeedia (KEGG) andmebaaside põhjal, kasutades veebipõhist KEGG automaatset märkuste serverit (http://www.genome.jp/kegg/)

2,13|3TC sidumine prognoositud sihtmärkidega

Ühendi 3TC SDF-i struktuurifailid saadi Pubchemi veebisaidilt (//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). SDF-fail teisendati OpenBabel2.3.2 tarkvaraga PDB-failiks ning retseptorvalgud ADRB2 (PDBID:3KJ6), AKT1 (PDBID:4EKL) ja EGFR (PDBID:6S9C) saadi Protein Data Banki andmebaasist (www.wwpdb). .org). Vee ja ligandide eemaldamiseks retseptorvalkudest kasutati tarkvara PYMOL2.3.4. Dokkimisuuring viidi läbi, kasutades AutoDock Vina (1.1.2), mis on Scrippsi välja töötatud avatud lähtekoodiga molekulaarse dokkimise tarkvara. Tööriistade tarkvara kasutati nelja retseptorvalgu muutmiseks ja Grid Box käsku Grid programmi all kasutati Grid Option tööriista avamiseks iga retseptorvalgu analüüsimiseks. Võre vahekauguseks määrati 1 ja sidumiskoha keskpunktiks määrati tasku keskpunkt.

2,14|Rakukultuur ja ravi

Hiire hipokampuse neuronaalsed rakuliinid HT22 osteti ettevõttelt Shanghai Cell Biotechnology Company. HT22 rakke kultiveeriti DMEM-is, millele oli lisatud 10 protsenti veiseloote seerumit (FBS). Rakud külvati 6-süvendiplaatidele 1 päev enne eksperimentaalset töötlemist. Rakkude vananemine indutseeriti formaldehüüdiga (FA), mis osteti firmalt Sigma-Aldrich, nagu eelnevalt kirjeldatud.24 HT22 rakud jagati kolme rühma, sealhulgas FA rühm, mida töödeldi 30 µmol/L FA-ga 24 tundi, FA/3TC rühm, mida töödeldi nii 30 umol/L FA-ga kui ka 50 umol/l 3TC-ga, ja kontrollrühm kultiveeriti ilma FA või 3TCta.

2,15|Immunofluorestsents ja mikroskoopia

Sööde eemaldati ja rakud fikseeriti 2-protsendilise paraformaldehüüdi lahusega 1 tund toatemperatuuril. Immunofluorestsentskatse viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud.25 Selles uuringus kasutatud antikehad hõlmasid LINE-1 ORF1p-vastast antikeha (1:1000; Sigma-Aldrich) koos Alexa Fluor 594 sekundaarse antikehaga (1:1000; Invitrogen) . Tuumade märgistamiseks inkubeeriti rakke DAPI-ga (lahjendus 1:500; Thermo Fisher Scientific) 1 minut. Pärast fluorestsentsi summutava kinnitusaine lisamist vaadeldi rakke konfokaalse mikroskoobi (Nikon) abil. 2,16|Western blot analüüs

EGFR, p-AKT1 (Aktiivne Akt1: fosforüülitud S473 juures) ja ADRB2 ekspressioone mõõdeti Western blot analüüsiga. Pärast erinevaid töötlusi koguti rakkudest kogu valk. Western blot viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud.26 Selles uuringus kasutatud antikehad hõlmasid anti-EGFR antikeha (1:500; Sigma-Aldrich), anti-pAKT1 antikeha (1:1000; Sigma-Aldrich) ja anti-ADRB2 antikeha (1:200; Sigma-Aldrich) koos küülikuvastase sekundaarse antikehaga (1:1000; Invitrogen). Pärast pesemist töötati blotid välja ECL Western blot tuvastamise süsteemiga (Amersham, Aylesbury, UK).

2,17|Andmete analüüs ja statistika

Iga katset korrati vähemalt kolm korda ja seda peeti kehtivaks, kui katsed näitasid sarnaseid tulemusi. Tulemused esitati kui keskmine ± standardhälve (SD). Oluline erinevus määrati kummagi Studenti t-testiga, mille p < 0.05.

Küsi lisa:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: pluss 86 15292862950