Lactobacillus Plantarum GKM3 soodustab pikaealisust, mälu säilimist ja vähendab aju oksüdatsiooni stressi SAMP8 hiirtel, 1. osa

Abstraktne: (1) Taust: vanusega seotud kognitiivne langus mõjutab tavaliselt eakate elu, kellel on sümptomid, mis on seotud mälu ja õppimise progresseeruva halvenemisega. On tehtud ettepanek, et probiootikumid võivad soolestiku-aju telje kaudu moduleerida vanusega seotud neuroloogilisi häireid. (2) Meetodid: probiootilise Lactobacillus plantarum GKM3 vananemisvastase toime uurimiseks viidi SAMP8 hiirte mudelis läbi nii ellujäämistestid kui ka kognitiivsed katsed. Kuuekuune SAMP8 (n{{10}} mõlemast soost) toideti probiootikumiga GKM3 annustes 5,1 × 109 ja 1,0 × 109 cfu / kg BW / päevas kuni nende loomuliku surmani. Seejärel uuriti eluiga. Kolmekuusele SAMP8 (mõlemast soost n=10) manustati GKM3 14 nädala jooksul. Seejärel registreeriti käitumistestid ja oksüdatsiooniparameetrid. (3) Tulemused: GKM3 rühmad näitasid märkimisväärselt suurenenud latentsust passiivse vältimise testis ja eduka vältimise aega aktiivse vältimise testis. Hiirte aju TBARS ja 8-OHdG näitasid ka olulist vähenemist GKM3-ga ravitud rühmades. Lisaks leiti GKM3 lisandiga SAMP8 hiirte ajus amüloidvalgu väiksem akumulatsioon. (4) Järeldused. Need tulemused näitasid, et L. plantarum GKM3 aeglustas vananemisprotsessi, leevendas vanusega seotud kognitiivseid häireid ja vähendas oksüdatiivset stressi.

Klõpsake valikul Cistanche Tubulosa Supplement

【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Märksõnad: vananemisele kalduv hiir 8 (SAMP8); probiootikumid; 8-hüdroksü-20 -desoksüguanosiin (8-OHdG); tiobarbituurhappega reageerivad ained (TBARS); amüloid- (A); vananemine

1. Sissejuhatus

Probleemiks on olnud see, et elanikkonna kognitiivsed häired on muutunud suuremaks pärast vanemate inimeste arvu kasvu viimasel kümnendil [1]. Maailma Terviseorganisatsiooni (WHO) raporti kohaselt ulatub kognitiivse langusega inimeste arv, mis 2015. aastal oli üle 46,8 miljoni, 2030. aastal üle 74,7 miljoni, mis on viieteistkümne aastaga peaaegu poole võrra suurenenud [2] . Arvatakse, et vananemine, mida peetakse tugevaks seoseks kognitiivsete häiretega, on üldiselt seotud oksüdatiivse stressiga, mis on seotud vabade radikaalide akumuleerumisega ja soodustab paljusid füsioloogilisi düsfunktsioone, eriti ajus, hapnikutundlikus organis, mis põhjustab degeneratiivseid. sümptomid, nagu mälukaotus ja õppimisvõime langus [3–5].

Kuna vananemine on vältimatu ja selle suhtelised negatiivsed sümptomid on keerulised, otsivad inimesed vananemisvastaseid ravimeetodeid, mis ulatuvad dieediteraapiast kuni ravimiravini [6,7]. Näiteks ženšenni (Panax quinquefolius) juureekstrakt näitas kognitiivse funktsiooni paranemist ja korealased märkisid selle lemmikuna [8]. Veel üks näide Ginkgo biloba ekstrakti meeldis jaapanlastele selle funktsioonide tõttu kognitiivsete võimete parandamisel ja oksüdatsiooni vähendamisel [9]. Kuigi paljudes aruannetes on väidetud, et taimsed dieedid avaldavad antioksüdantset toimet ja aeglustavad vananemisprotsessi, on huvitavamad fookused soolestiku mikrobiota või isegi spetsiifiliste bakterite rühmal soolestikus, mis võivad neid toitaineid metaboliseerida ja pakkuda positiivset multimodulatsiooni. mõju peremehele, sealhulgas pikaealisus [10–14]. Soolestiku bakterid võivad toidust toota lühikese ahelaga rasvhappeid (SCFA-sid), nagu atsetaat, propionaat või butüraat [15]. Lastel, kes tarbisid taimset enteraalset toitumist, ilmnesid väljaheiteproovides kõrgemad SCFA-d kui tavalistel lastel [16]. Need SCFA-d võivad mängida olulist rolli inimese seedetrakti epiteelis [17]. Atsetaat võib läbida hematoentsefaalbarjääri, kutsudes esile hüpotalamuse-neuroni aktivatsiooni [18]. Lisaks on butüraadi kohta uuritud käärsoolepõletikku pärssivat toimet inimese soolestikus [19]. Seetõttu on oluline, milline mikrobiota või spetsiifilised bakterid inimese soolestikus on, eriti keha tervise ja pikaealisuse mõjutamise seisukohalt [20,21].

Soolestiku mikrobiota võib mõjutada ka soolestiku-aju telge ja aeglustada vananemisprotsessi, takistades seeläbi vanusega seotud haiguste, nagu amneesia, dementsus või isegi Alzheimeri tõbi, progresseerumist [22,23]. Näiteks neurotransmitterit gamma-aminovõihapet (GABA) võivad toota teatud bakteritüved, mille kohta on teatatud epiteeli tüvirakkude proliferatsioonist soolestikus ja depressiivse käitumise paranemisest hiirtel [24,25]. Praeguste toetavate andmete põhjal on probiootikumide lisamine ennetusmeetodiks olnud nende vanusega seotud neuroloogiliste häirete suundumus [26, 27].

Lactobacillus on kõige levinum probiootikum, millel on suur võimalus funktsionaalse toidu väljatöötamiseks, kuna see on inimtoidus olnud pikka aega [28]. Siiski on üksikutel bakteriliikidel tüvest tüveni unikaalne bioaktiivsus, mis nõuab eksperimentaalset kinnitust. Varasemates uuringutes eraldasime marineeritud lehtedest (Brassica juncea) probiootilise tüve Lactobacillus plantarum GKM3, mida Taiwani Hakka ühiskonnas tuntakse ka pikaealisuse köögiviljana, ning viisime läbi funktsionaalsed uuringud seedetrakti ja immuunsuse tugevdamiseks in vivo [29–31] . Seetõttu eeldasime, et L. plantarum GKM3 leevendab vananemisprotsessi ja vanusega seotud kognitiivseid häireid.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Õppeained

L. plantarum GKM3 eraldati Hiina sinepist (Brassica juncea) ja säilitati Taiwanis Bioresource Collection and Research Centeris (BCRC) kollektsiooni numbriga 910787. Esiteks kultiveeriti GKM3 katseklaasis MRS (BD Co., Franklin Lakes, NJ, USA) puljongiga temperatuuril 37 °C 18 tundi. {{10}}.01-protsendilise inokulatsiooniga suurendati GKM3 seemnekultuuri 50 l fermenteris pH 6.0 kontrolli all kell. 37 ◦C 18 tundi ettenähtud söötmega (5 protsenti glükoosi, 2 protsenti pärmiekstrakti, 0,05 protsenti MgSO4, 0,1 protsenti K2HPO4 ja 0,1 protsenti Tween 80). Seejärel koguti fermenteeritud bakterid tsentrifuugimisega kiirusel 3800 p/min 10 minutit, pesti kaks korda fosfaatpuhvriga ja pellet segati lüofiliseerimiseks 10% piimaga. Selles uuringus kohandati L. plantarum GKM3 külmkuivatatud pulbri annused suure annusena 5,1 × 109 cfu/kg BW/päevas ja madala annusena 1,0 × 109 cfu/kg BW/päevas hiiremudeli jaoks sondi abil. .

Selles uuringus tutvustati vananemisega kiirendatud kalduvushiired P8 (SAMP8) vananeva loomamudelina. Kõikidele SAMP8 hiirtele rakendati ja neid hoiti 12-tunnise pimeduse/valguse tsüklis temperatuuril 25 ± 2 °C, suhtelise õhuniiskuse juures 65 ± 5 protsenti koos toidu ja veega ad libitum. Järgmised katseprotseduurid kiitis heaks Providence'i ülikooli (Taichung City, Taiwan) toidu- ja toitumisosakonna loomakorralduskomitee IACUC numbriga 20170629-A02.

2.2. Ellujäämise test

Elulemustestis rühmitati kuuekuused SAMP8 hiired 20 emase ja 20 isasega järgmiselt: kontrollrühm, GKM3 suure annuse rühm ja GKM3 väikese annuse rühm. Probiootilist L. plantarum GKM3 manustati ravitud hiirtele iga päev kuni nende loomuliku surmani. Iga rühma elusad / surnud SAMP8 hiired registreeriti ja arvutati keskmine eluiga.

2.3. Katse kavandamine vanusega seotud kognitiivsete häirete jaoks

Kognitiivse kahjustuse katse jaoks majutati kolme kuu vanuseid SAMP8 hiiri. Nii isased kui ka emased SAMP8 hiired rühmitati järgmiselt (n=10 igas soost): kontrollrühm, GKM3 suure annuse rühm ja GKM3 väikese annuse rühm. Ravirühmade hiirtele manustati suukaudselt L. plantarum GKM3 14 nädala jooksul. Liikumistegevus viidi läbi katse 11. nädalal. Passiivse vältimise test ja aktiivse vältimise test viidi läbi vastavalt 13. ja 14. nädalal ning seejärel ohverdati hiired biokeemiliseks analüüsiks ja histoloogiliseks uuringuks.

2.4. Liikumistegevus

Iga hiir asetati süstikupuuri (25 cm × 25 cm × 25 cm, Coulbourn Instruments Model E61-21, Lehigh, PA, USA) keskele ja nende liikumine salvestati aktiivsusmonitori videotee analüsaatoriga. 10 min. Hiire keskmist liikumise aega analüüsiti iga 5 minuti järel (s / 5 min). See rongkäik viidi läbi hämaras valguses ja vaikses tingimustes.

2.5. Passiivse vältimise test

Süstikupuur (35 cm × 17 cm × 20 cm, Coulbourn Instruments Model E10-15, Lehigh, PA) jaotati pimedasse ja heledasse ruumi. Kahe ruumi vahel oli giljotiinuks (7,5 cm × 6,5 cm, Coulbourn Instruments Model E10-15GD, Lehigh, PA, USA). Passiivse vältimise testi treeningtestis pandi hiir minutiks kohanemiseks valgusruumi ja seejärel avati giljotiini uks. Hiir saaks pimedasse ruumi sisenedes 0,5 µA elektrilöögi 0,5 sekundi jooksul. Šokk toimus pidevalt kolm korda iga viie sekundi järel. Hiir asendati sama toiminguga 24 tundi, 48 tundi ja 72 tundi pärast mälutesti treeningut, välja arvatud see, et šokki ei antud. Mõõdeti hiirte keskmine aeg heledas ruumis viibimise ajal. Ülemine katkestusaeg oli 180 s.

2.6. Aktiivse vältimise test

Aktiivse vältimise testi treeningtestis saaks hiir valgusel ja helil põhineva konditsioneeritud stiimuli (CS) 10 s ja seejärel 5 sekundit 0,3 mA elektrilöögi (tingimusteta stiimul, UCS), kui hiir jäi samasse tuppa, samas kui hiir teise tuppa kolis, šoki vastuvõttu ei olnud. Iga hiir oli treeninud 5 CS ja UCS tsüklit. Hiirt testiti sama toiminguga (CS/UCS-süsteem) 15–20-minutiste vaheaegadega neli korda päevas ja pidevalt nelja päeva jooksul. Keskmist vältimisaega mõõdeti õppimismälu mõjuna.

2.7. Oksüdatiivse stressi analüüs

8-hüdroksü-20 -desoksüguanosiini (8-OHdG) tuvastamiseks aju mitokondriaalsest DNA-st ekstraheeriti vere ja koe genoomse DNA ekstraheerimise miniprepsüsteemiga (Viogene Biotek) 30 mg ajukudet. Corp., Taipei, Taiwan) ja ülitundlikku 8-OHdG Check ELISA komplekti (Nikken SEIL Co. Ltd., Shizuoka, Jaapan) kasutati neeldumisega 450 nm juures. Tiobarbituurhappega reageerivate ainete (TBARS) analüüsi jaoks jahvatati 25 mg ajukudet 250 µL RIPA puhvriga ja tsentrifuugiti 16,000 × g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C. Kokku koguti 100 µl supernatanti ja lisati 100 µL SDS lahust ja 4 ml värvireaktiivi, seejärel keedeti tund aega enne jahutamist. Töödeldud proove tsentrifuugiti kiirusel 16,000 × g 10 minutit ja asetati 30 minutiks toatemperatuurile. TBARS-i sisaldus (mM/g valku) igast 150 µl proovist mõõdeti standardkõveraga 535 nm neeldumisel.

2.8. Aju amüloidvalgu mõõtmine

Ajukoe sektsioonist pärit amüloid- (A ) valk värviti immunohistokeemia meetodil. A akumulatsiooni protsenti analüüsiti pildisüsteemiga (Leica, Q500, Wetzlar, Saksamaa) mikroskoobiga 40 × väljal. Arvutamine põhines A-kuhjumispiirkonna protsendil kogu ajus: (-amüloidi ladestumise piirkond / kogu aju piirkond) × 100 protsenti.

2.9. Histoloogia

Ajud lõigati välja ja fikseeriti 10-protsendilise formaliiniga. Hipokampuse kude töödeldi dehüdratsiooni, puhastamise, infiltratsiooni ja lõikumiseks sisestamise protsessiga. Seejärel uuriti hipokampuse piirkonna kude hematoksüliini ja eosiini (H&E) värvimisega.

2.10. Statistika

Selles uuringus kasutati statistilist väljaheidet SPSS 19.{1}}. Kõik andmed on väljendatud keskmisena ± SEM ja hinnatud ühesuunalise ANOVA abil erinevate rühmade keskmiste võrdlemiseks. Oluliseks erinevuseks peeti Duncani mitme vahemiku testide põhjal, kui p-väärtus oli väiksem kui 0,05. Elulemustestis kasutati analüüsiks Kaplan-Meieri testi ja rühmadevaheliste erinevuste kontrollimiseks viidi läbi log-rank test.

3. Tulemused

3.1. L. plantarum GKM3 mõju SAMP8 ellujäämistestile

Ellujäämiskatses jälgiti SAMP8 hiirte eluiga kuni nende loomuliku surmani ja kõigi individuaalsete kirjete täitmiseks kulus 21 kuud. Ravimata isaste SAMP8 hiirte keskmine eluiga oli 11,90 ± {{10}},18 kuud ja emastel 11,20 ± 0.21 kuud. Probiootilise GKM3 toitmise rühmades pikenes meeste keskmine eluiga 12-ni.{31}}5 ± 0,15 kuud ja 13,50 ± 0,14 kuud GKM3 väikeste ja suurte annuste korral. Probiootilise GKM3 annusest sõltuvat mõju naiste eluea pikenemisele võis täheldada ka 12,15 ± 0,21 kuuga väikese annuse rühmas ja 14,30 ± 0,17 kuuga suure annusega ravi korral (andmeid pole näidatud).

Oodatava eluea kokkuvõtteks hinnati ellujäämise määra. 50 protsendilise ellujäämismääraga oli GKM3 väike annus meeste rühmas 12,67 kuud ja GKM3 suur annus meeste rühmas 13,33 kuud, samas kui meeste kontrollrühmas oli ainult 12,50 kuud (joonis 1A). Sarnaselt emaste SAMP8 hiirte vaatlusega oli 12.00 kuud ja 15,50 kuud 50-protsendilise ellujäämismääraga rühmades, kellele toideti probiootilist GKM3 annustes 1,0 × 109 CFU/kg kehamassi kohta päevas ja 5,1 × 109 vastavalt CFU/kg BW/päevas; naiste kontrollrühmas täheldati aga 10,50 kuud 50-protsendilise elulemuse määraga (joonis 1B). Selle katse aluseks olid emased SAMP8 hiired lühema elueaga kui isastel; huvitav, et L. plantarum GKM3 mõju elueale avaldas emasloomadele suuremat mõju. Arvatakse, et L. plantarum GKM3 võib pikendada mõlemast soost SAMP8 hiirte eluiga, eriti emasloomadel.

3.2. Kehakaal, toidutarbimine ja vee tarbimine SAMP8 hiirtel

Vanusega seotud kognitiivsete häirete katses ei olnud enne ohverdamist erinevate ravirühmade kõigi SAMP8 hiirte energiatarbimises ja kaalumuutuses olulisi erinevusi (tabel 1). See tähendab, et probiootiline GKM3 ei mõjutanud neid metaboolseid parameetreid vananenud hiire mudelis.

3.3. L. plantarum GKM3 mõju mälu säilitamisele ja õppimise parandamisele

Liikumisaktiivsuse test näitas, et kõigi SAMP8 hiirte vahel ei olnud esimese 5-minuti jooksul olulisi erinevusi, sõltumata soost (tabel 2). Kuigi teises 5-minutises intervallis esines langus, ei toimunud võrreldes esimese 5-minutilise intervalliga olulist muutust ravitud ja ravimata rühmade vahel.

Passiivsed vältimise testid viidi läbi SAMP8 hiirte isaste ja emaste rühmadega (joonis 2). Proovitesti ajal ei ilmnenud kõigi rühmade vahel olulisi erinevusi (p > 0.05). Probiootilise GKM3-ga toidetud SAMP8 isaste hiirte latentsusaeg oli esimesel päeval kontrollrühmaga võrreldes oluliselt suurenenud (p < 0.05) (joonis 2A). Emaste SAMP8 hiirte valgusruumis viibimise aeg pikenes ka GKM3-ravi esimesel päeval, p-väärtus oli madala annuse rühmas alla 0,05 ja kõrge annuse rühmas p-väärtus alla 0,01. -annuse rühm võrreldes kontrollrühmaga. Pärast passiivse vältimise testi teist päeva aga olulisi erinevusi ei olnud. Pikem latentsus, mis viidi läbi GKM3 toitmisrühmas nii isastel kui ka emastel SAMP8 hiirtel, näitas, et probiootiline GKM3 võib kaasa aidata vanusega seotud mälu säilitamisele ja õppimise parandamisele.

Aktiivse vältimisprotseduuri käigus pidid hiired võtma mis tahes meetmeid, et vältida kahjulikku stiimulit. Aktiivse vältimise testi katsepäeval näitasid nii GKM3-ga söödetud isas- kui ka emased SAMP8 hiirtel vältimise edukuse tendentsi (joonis 3), kuid statistilist erinevust ei saavutatud (p > 0). 9}}5) võrreldes kontrollrühmaga. Aktiivse vältimise testi esimesel ja teisel päeval saadud tulemus näitas aga, et GKM3-ga söödetud isaste rühmades oli edukas aeg märkimisväärselt pikenenud, võrreldes ravimata isaste SAMP8 hiirtega (joonis 3A) (p < 0,05). Sarnast tulemust täheldati ka naisrühmades (joonis 3B). Huvitaval kombel ei ilmnenud statistilisi erinevusi (p=0,157) neljanda päeva tulemustes kontroll- ja probiootiliste rühmade vahel. See tähendab, et kontrollhiired vajasid neljapäevast koolitust, et probiootikumidega toidetud hiirtele järele jõuda. Eeldatakse, et probiootilise GKM3 lisamine dieedile võib aidata peremeesorganismi tunnetust, mis mõjutab mõlema soo sobivat käitumist.

【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】