Kuidas kasutada neere toniseerivat valemit, et kaitsta MES23.5 rakkude oksüdatiivseid kahjustusi?

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Yihui Xu,¹Wei Lin,²Shuifen Ye,³Huajin Wang,⁴Tingting Wang,⁵Youyan Su, ⁵Liangning Wu,⁶Yuanwang Wang,⁷Qian Xu,⁵Chuanshan Xu,⁸ja Jing Cai 5, *

Abstraktne

Oksüdatiivne kahjustusmängib olulist rolli neurodegeneratiivsete häirete, sealhulgas Parkinsoni tõve (PD) etioloogias. Meie uuringus iidne hiinlaneneere toniseerivValemit, mis koosneb Cistanche'ist, Epimedii'st ja Polygonatum cirrhifolium'ist, uuriti MES23.5 dopamiinergiliste neuronite kaitsmiseks vesinikperoksiidi (H2O2-) indutseeritud eest.oksüdatiivne kahjustus. H2O2 kahjustav mõjuMES23.5 rakudja KTF-i kaitsev toimeoksüdatiivnestressi hinnati MTT testi, transmissioonelektronmikroskoopia (TEM), immunotsütokeemia (ICC), ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) ja immunoblotanalüüsi abil. Tulemused näitasid, et rakkude elujõulisus vähenes dramaatiliselt pärast 12-tunnist kokkupuudet 150 μM H2O2-ga. TEM-i vaatlus näitas, et H2O2-töödeldudMES23.5 rakudtekitas raku organellide kahjustusi. Kui aga rakke inkubeeriti KTF-iga (3,125, 6,25 ja 12,5 ug/ml) 24 tundi pärast kokkupuudet H2O2-ga, täheldati H2O2-indutseeritud kahjustuste vastu olulist kaitsvat toimet.MES23.5 rakud. Kasutades ICC-d, leidsime, et KTF inhibeeris H2O2 poolt indutseeritud türosiinhüdroksülaasi (TH) redutseerimist, reguleeris üles HO-1, CAT ja GPx-1 mRNA ja valgu ekspressiooni ning vähendas kaspaas 3. Need tulemused näitasid, et KTF võib pakkuda neuronite kaitset H2O2-indutseeritud rakukahjustuste eest, parandadesoksüdatiivnestressi ja meie leiud pakuvad uut potentsiaalset strateegiat Parkinsoni tõve ennetamiseks ja raviks.

CISTANHE EELISED:Parkinsoni tõve ravi

1. Sissejuhatus

Neurodegeneratiivsed haigused on viimasel ajal muutunud oluliseks rahvatervise probleemiks. Parkinsoni tõbi (PD) on neurodegeneratiivne haigus, mida iseloomustab dopamiinergiliste neuronite järkjärguline kadumine mustaines. Kuigi PD põhjust tuleb veel selgitada, viitavad mitmed tõendid sellele kindlaltoksüdatiivne kahjustusja mitokondriaalne düsfunktsioon mängivad olulist rolli PD patoloogilistes mehhanismides [1–3]. Suurenenudoksüdatiivnestress tuleneb nendevahelisest tasakaalustamatusestoksüdatiivnetooted, nagu reaktiivsed hapniku liigid (ROS) ja antioksüdantide molekulid rakus [4]. Ajurakkude antioksüdatiivse võime suurendamine on muutunud tõhusaks strateegiaks närvirakkude kaitsmisel oksüdatiivse stressi kahjustuse eest.

PD on raskesti ravitav haigus, mis ohustab eakaid kogu maailmas. Praegustel terapeutilistel ravimitel on piiratud efektiivsus ja rasked kõrvaltoimed. Traditsioonilisi Hiina ürte ja segusid on rahvameditsiinis laialdaselt kasutatud neurodegeneratiivsete haiguste, sealhulgas PD, raviks pikka aega. Hiina meditsiini teooria kohaselt on puudujääkneerudon PD peamine patoloogiline mehhanism. Orobanchaceae sugukonda kuuluv Cistanche deserticola YC Ma on Hiina traditsioonilises meditsiinis tuntud rohttaim, millel on nn.neere toniseerivtõhusust ja seda kasutatakse raviksneeruddefitsiit, naiste viljatus, haiguslik leukorröa, neurasteenia ja seniilne kõhukinnisus [5]. On teatatud, et Cistanche koguglükosiidid avaldasid kaitsvat toimet substantia nigra dopamiinergilistele neuronitele hiirte mudelites ja PD rakkudes [6, 7]. Lisaks on dokumenteeritud, et Cistanche'i toimeainetel on neuroprotektiivne toime antioksüdantide võime suurendamise ja neuronite apoptoosi pärssimise kaudu [8–15]. Herba Epimedii on ka traditsioonilineneere toniseerivMärkimisväärse antioksüdatiivse toimega Hiina ravimtaim, mida kasutatakse laialdaselt osteoporoosi ja südame-veresoonkonna haiguste ravis ning seksuaal- ja neuroloogiliste funktsioonide parandamisel [16]. Polygonatum sibiricum'i kasutatakse sageli assistentina monarh-ravimi ja ministriravimi tõhususe parandamiseks traditsioonilises Hiina valemis. Hiljutine aruanne näitas, et Polygonatum sibiricum'i veeekstraktid on looduslikud antioksüdandid.

Nende iidsete hiinlaste eeliste põhjalneere toniseerivvalemi (KTF), mis koosneb Cistanche'ist, Epimedii'st ja Polygonatum cirrhifolium'ist, oletasime, et KTF võib kaitsta MES23.5 dopamiinergilisi neuroneid vesinikperoksiidi (H2O2-) indutseeritud eest.oksüdatiivne kahjustus. Siin viisime kontseptsiooni tõestuseks läbi rea katseid, et uurida KTF-i mõju rakusurmale ja antioksüdantsete ensüümide ekspressioonile töödeldud H2O2-.MES23.5 rakud.

Neere toniseeriv valem võib kaitsta MES23.5 rakkude oksüdatiivset kahjustust

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Kemikaalid ja reaktiivid

HO-1, CAT, kaspaas 3 ja -aktiini antikehad saadi ettevõttest Cell Signaling Technology Inc. (Boston, USA). GPx-1 antikeha pärines Abcamilt (Cambridge Science Park, Ühendkuningriik). Küüliku anti-türosiini hüdroksülaas pärines Bosterist (BA1454, Hiina). Mädarõika peroksüdaasi märgisega konjugeeritud kitse küülikuvastane IgG1 pärines ettevõttest Santa Cruz Biotechnology Inc. (California, USA). Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM) osteti ettevõttelt GIBCO BRL Co. Ltd. (Gaithersburg, MD, USA). Kõik muud reagendid, kui pole teisiti öeldud, pärinesid firmast Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). RevertAid™ First Strand cDNA sünteesikomplekt pärines ettevõttelt Fermentas Inc. (Burlington, USA). DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) pärines ettevõttest Fermentas Inc. (Burlington, USA). Bio DL100 pärines ettevõttest BioFlux (Tokyo, Jaapan). Polink-2 pluss Polymer HRP tuvastamissüsteem küüliku primaarsete antikehade (PV-9001) ja DAB (3,3'-diaminobensidiintetrahüdrokloriidi) (ZLI-9032) jaoks pärines ettevõttelt ZSGB-BIO (Peking, Hiina). ELISA komplektid CAT, GPx-1 ja GSH mõõtmiseks pärinesid ettevõttelt Hufeng Biotechnology Inc. (Shanghai, Hiina). Ginkgo biloba ekstraktid (GE) olid pärit Shanghai Sine Promod Pharmaceutical Co., Ltd.-st (Shanghai, Hiina).

2.2. Neeru toniseeriva valemi valmistamine ja standardimine

Selle komponendidneere toniseerivvalem, Cistanche deserticola, Epimedium brevicornum ja Polygonatum sibiricum, tarnisid Fujiani traditsioonilise hiina meditsiini ülikooli teine ​​sidushaigla ja need olid Hiina farmakopöa järgi hoolikalt autentitud (Hiina farmakopöa komisjon, 2005). KTF proovide valmistamiseks segati Cistanche deserticola, Epimedium brevicornum ja Polygonatum sibiricum massisuhtes 1 : 1 : 1,2 ja jahvatati pulbriks ning seejärel kasteti 10 korda (mass/maht) destilleeritud vette. h ja keedeti 2 h. Pärast lahuse filtreerimist filtraat koguti. Kogu jääk koguti ja keedeti 8 korda (mass/maht) destilleeritud veega 2 tundi. Lahus filtriti ja kaks filtraati ühendati, kontsentreeriti ja külmkuivatati. Lõpliku kuivatatud ekstrakti saagis oli 25% (mass/mass) lähtetoorainest ja seda hoiti kuni kasutamiseni temperatuuril -20 kraadi. KTF põhilahus (10 mg/ml) valmistati KTF lahustamisega fosfaatpuhverlahuses (PBS), millele järgnes ultrahelitöötlus, steriliseerimine 100 kraadi juures ja filtreerimine.

2.3. Rakukultuur ja H2O2 töötlemine

MES23.5 rakudkultiveeriti ja eksponeeriti H2O2-ga, nagu on kirjeldatud meie eelmises artiklis [10]. LühidaltMES23.5 rakudkasvatati DMEM/F12 (GIBCO BRL Co. Ltd., Gaithersburg, MD, USA) söötmes, mis sisaldas 5% (maht/maht) FBS-i (GIBCO BRL Co. Ltd., Gaithersburg, MD, USA), 1{{12} }0 U penitsilliini/streptomütsiini, 2 mM L-glutamiini (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) ja Sato's (50 × Sato: insuliin 25 mg; ülekantav 25 mg; püroviinamarihape, 243 mg; putrestsiin 20 mg; 1 mg/ml naatriumselenaati, 25 ul; 0,315 mg/ml progesterooni) 37 kraadi juures 5% CO2-ga. Üleöö kasvanudMES23.5 rakudinkubeeriti veel 150 µM H2O2-ga 12 tundi.

2.4. KTF ravi

MES23.5 rakudjagati juhuslikult kontrollrühma (värske sööde), H2O2 rühma (H2O2 sööde), Ginkgo biloba ekstrakti (GE) rühma (H2O2 ja GE kultiveerimissööde) ja KTF rühmadesse, sealhulgas madala annusega KTF-ravi, keskmine annus FTF-ravi ja KTF-ravi suur annus.MES23.5 rakudlogaritmilises faasis külvati 24 tunniks polü-L-lüsiiniga (PLL) kaetud kultuuriplaadile. Kontrollrühma rakke töödeldi värske söötmega ja kõigi teiste rühmade rakke töödeldi 12 tundi 150 μM H2O2 sisaldava söötmega. GE rühma rakke töödeldi söötmega, mis sisaldas 12,5 ug/ml GE-d, ning väikese annuse KTF rühma, keskmise annuse KTF rühma ja suure annuse KTF rühma rakke töödeldi KTF-iga kontsentratsioonides 3,125, 6,25, ja 12,5 ug/ml vastavalt 24 tunni jooksul.

2.5. Rakkude elujõulisus

Pärast 20 h KTF-i töötlemist inkubeeriti rakke MTT-ga (0,5 mg/ml) 4 tundi 37 kraadi juures, sööde eemaldati ettevaatlikult ja igasse süvendisse lisati 150 µl DMSO-d. Formasaani kristallid lahustati 10 minutit ja neeldumist mõõdeti 490 nm juures. Iga süvendi optiline tihedus (OD) mõõdeti spektrofotomeetriga (BIO-TEK ELX 800, BioTek Instruments Inc., Vermont, USA). Negatiivse kontrollina kasutati värsket rakukultuuri söödet.

Neere toniseeriv valem võib kaitsta MES23.5 rakkude oksüdatiivset kahjustust

2.6. Ultrastruktuurse morfoloogia vaatlus

Pärast 24-tunnist KTF-i töötlemist rakud koguti, suspendeeriti ja fikseeriti 3% glutaaraldehüüdiga 1,5% paraformaldehüüdi lahuses (pH 7,3) 4 kraadi juures 24 tundi. Seejärel loputati rakususpensioone kaks korda PBS-ga ja fikseeriti 1% osmiinhappe ja 1,5% kaaliumheksatsüanoferraadi (II) lahusega (pH 7,3) ning inkubeeriti 4 kraadi juures 2 tundi; seejärel dehüdreeriti rakususpensioone astmelises alkoholiseerias 5 minutit. Dehüdreeritud graanulid sisestati kolm korda propüleenoksiidiga 1 tunniks ja infiltreeriti vaigu/propüleenoksiidi seguga vahekorras 1:1 2 tundi ja seejärel vaiguga 12 tundi toatemperatuuril. Inklusioon tehti epoksüvaigu 618 ja araldiidiga ning polümerisatsioon viidi läbi 60 kraadi juures 48 tundi. Lõpuks värviti üliõhukesed lõigud (80 nm) uranüülatsetaadiga ja värviti 5 minutit pliitsitraadiga. Värvitud rakke uuriti ülekandeelektronmikroskoobiga H7650 (Hitachi, Jaapan).

2.7. Türosiinhüdroksülaasi (TH) immunotsütokeemiline analüüs

Pärast 24-tunnist KTF-i töötlemist pesti rakke kaks korda 2 minutit PBS-ga ja fikseeriti 4-protsendilise paraformaldehüüdiga 15 minutit. Fikseeritud rakke pesti 3 korda ja seejärel töödeldi 0,5% Triton X-100-ga 20 minutit. Seejärel pesti rakke 3 korda ja töödeldi 10 minutit 3% H2O2-ga. H2O2-töödeldud rakke pesti 3 korda ja seejärel blotiti kitse seerumiga 20 minutit. Pärast blotimist lisati igale proovile 4 kraadi juures üleöö küüliku anti-TH (1:400). Seejärel pesti proove 3 korda ja töödeldi Polymer Helperiga 20 minutit. Pärast polümeeriga töötlemist pesti rakke 3 korda ja töödeldi polü-HRP küülikuvastase IgG-ga 20 minutit. Rakke pesti 3 korda ja töödeldi DAB-ga 3 minutit. Lõpuks pesti proove jooksva veega ja töödeldi hematoksüliini vastuvärvimisega 1 minuti jooksul ning seejärel pesti jooksva veega ja suleti ülima kinnitusvahendiga.

2.8. Antioksüdatiivsete ensüümide mõõtmine ELISA abil

Pärast 24-tunnist KTF-ravi mõõdeti rakusisese CAT, GPx-1 ja GSH aktiivsuse taset ELISA komplektiga (Hufeng Biotechnology Inc., Shanghai, Hiina) vastavalt tootja juhistele. Lühidalt, 100 µl töödeldud rakkude lüsaadi homogenaadi supernatanti lisati ELISA süvenditesse ja inkubeeriti seejärel 37 kraadi juures 30 minutit. Pärast viis korda pesemist ja kuivatamist lisati igasse süvendisse 50 µl ensüümiga märgistatud antikeha töölahust (eeldatav kontrolltuub). Saadud lahust inkubeeriti 30 minutit 37 kraadi juures, pesti viis korda ja kuivatati. Igasse süvendisse lisati substraadi töölahus (150 μL) ja inkubeeriti 15 minutit 37 kraadi juures. Lõpuks lisati igasse süvendisse stopplahus (50 μL) ja neeldumisväärtus määrati 450 nm juures, kasutades automaatset ELISA-lugejat (XL800, BioTex, Incorporated, Houston, TX, USA).

2.9. Western blot analüüs

Pärast 24-tunnist KTF-i töötlemist pesti rakke jääkülma PBS-ga ja valgud ekstraheeriti lüüsipuhvris, mis sisaldas 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 protsenti Nonidet P{{ 9}}, 1 mM fenüülmetüülsulfonüülfluoriid ja 10 ug/ml aprotiniini. Valgu kontsentratsioon määrati BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific Pierce, Rockford, Illinois, USA) abil. Valk eraldati SDS-PAGE elektroforeesiga ja viidi üle PVDF-i (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Blokeerimine viidi läbi 5% rasvavaba kuivatatud piimaga; membraani inkubeeriti küüliku rotivastase HO-1, CAT, kaspaas 3, -aktiini antikehaga (1:1000, rakusignaal) ja küüliku rotivastase GPx-1 antikehaga (1:1000). , Abcam) üleöö temperatuuril 4 kraadi . Töödeldud membraani pesti ja seejärel eksponeeriti kitse küülikuvastase IgG1-ga, mis oli konjugeeritud mädarõika peroksidaasi märgisega (1:5000, Santa Cruz, USA) 2 tundi toatemperatuuril. Pärast veel viit pesu visualiseeriti ristreaktiivsus elektrokemiluminestsentsi (ECL) Western blot tuvastusreaktiivide abil ja analüüsiti skaneeriva densitomeetria abil Image Systemis (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

2.10. RT-PCR analüüs

HO-1, CAT, GPx-1 ja -aktiini PCR-praimerid osteti ettevõttelt Sangon Biotech Co. Ltd. (Shanghai, Hiina). Pärast 24-tunnist KTF-i töötlemist eraldati rakkude kogu RNA, kasutades Trizol reagenti vastavalt tootja juhistele. Pöördtranskriptsioon (RT) viidi läbi, kasutades AMV pöördtranskriptsioonisüsteemi (Fermentas, Burlington, USA). cDNA fragment ja -aktiini amplifitseeriti Green PCR master MIX Kit (Fermentas, Burlington, USA) abil. DNA amplifitseeriti kohe ühe tsükliga 94 kraadi juures 5 minutit ja 30 tsükliga 94 kraadi juures 30 sekundit ja 58 kraadi juures 30 sekundit ja 72 kraadi juures 30 sekundit -aktiini puhul ning viimane pikendamisetapp tehti 72 kraadi juures. 10 min. Etiidiumbromiidiga värvitud geelid skaneeriti ja kvalifitseeriti Tanon Image Software abil. Iga riba intensiivsus normaliseeriti aktiini intensiivsuse suhtes.

2.11. Statistiline analüüs

Statistiline analüüs tehti SPSS 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) abil. Kõik andmed esitati kui keskmine ± SD (standardhälve) ja erinevuse statistiline olulisus määrati ühesuunalise ANOVA ja LSD (lineaarne standardhälve) abil. Erinevust peeti oluliseks, kui P <>

Neere toniseeriv valem võib kaitsta MES23.5 rakkude oksüdatiivset kahjustust

3. Tulemused

3.1. H2O2 kahjustav mõju MES23.5 rakkudele ja KTF-i kaitsev toime oksüdatiivse stressi vastu

Nagu on näidatud joonisel fig 1(a), inhibeeris H2O2 annusest ja ajast sõltuvat MES23.5 dopamiinergiliste neuronaalsete rakkude elujõulisust. Pärast 12-tunnist kokkupuudet 50 μM H2O2-ga täheldati rakkude elujõulisuse olulist kaotust ja rakkude elujõulisuse kadu suurenes järk-järgult koos H2O2 annuse suurenemisega 150 μM-ni. Kuid H2O2 annuse edasine suurendamine 200-lt 500 μM-le ei põhjustanud oluliselt suuremat rakkude elujõulisuse kadu. PikendadesMES23.5 rakudkokkupuude H2O2-ga 12 tunnist 24 tunnini ja 48 tunnini suurendas rakkude elujõulisuse kadu madalamate H2O2 kontsentratsioonide korral. MES23.5 rakkude elujõulisuse olulist vähenemist täheldati pärast 24-tunnist kokkupuudet 25 μM H2O2-ga ja 48-tunnist kokkupuudet 12,5 μM H2O2-ga. Kõigi testitud H2O2 kontsentratsioonide puhul täheldati rakkude elujõulisuse kadumise ajast sõltuvat viisi.

Joonis 1 H2O2 kahjustuste mõjuMES23.5 rakudja KTF-i kaitsev toimeoksüdatiivnestressi hinnati MTT testi abil. (a) H2O2 töötlemise erinevate kontsentratsioonide mõju rakukahjustustele. MES23.5 rakke töödeldi 12,5, 25, 50, 100, 150, 200, 300, 400 ja 500 μMol/l H2O2-ga 12, 24 ja 48 tundi. (b) KTF-ravi erinevate kontsentratsioonide kaitsev toime H2O2-indutseeritud rakukahjustusele. KTF-i töötlemine suurendas pärast H2O2 lisamist MES23.5 rakkude elujõulisust.MES23.5 rakudinkubeeriti GE-ga (12,5 ug/ml) või KTF-iga (3,125, 6,25, 12,5 ug/ml) 24 tundi pärast H202 lisamist. Rakkude elujõulisust mõõdeti MTT-ga. Andmed on väljendatud keskmisena ± SD (standardhälve) kolmes sõltumatus katses. #P < 0.05="" võrreldes="" kontrollrühmaga.="" ∗p="">< 0,05="" võrreldes="">

EksponeerimineMES23.5 rakudKTF-ile üksi ei avaldanud olulist tsütotoksilist toimet isegi siis, kui KTF-i kontsentratsioon oli kuni 100 ug/ml. MES23.5 rakud, mida kultiveeriti koos 150 μM H2O2-ga 12 tundi, põhjustasid rakkude elujõulisuse kaotuse 46,76 protsenti. H2O2 tsütotoksiline toime MES23.5 rakkudele nõrgenes 24 tunni jooksul KTF-ga töötlemisel oluliselt (joonis 1 (b)). Töödeldud H2O2 elujõulisuse suurendamineMES23.5 rakudtaastati 95.86 protsenti ± 7,18 protsenti , 96,49 protsenti ± 15,07 protsenti ja 99,04 protsenti ± 10,57 protsenti KTF-iga töötlemisel vastavalt kontsentratsioonidel 3,125, 6,25 ja 12,5 ug/ml.

TEM näitas, et kontrollrühma normaalsetel rakkudel oli ovaalne kuju terve rakumembraaniga, millel on palju lainetusi ja mikrovilli sarnaseid struktuure. Rakutuum oli keskelt elliptiline ühe tuumaga ning sellel oli normaalne eukromatiin ja hajutatud heterokromatiin. Mitokondrid olid vardataolised või elliptilised, hajutatud ja normaalsete mitokondriliste kristallidega. Kare endoplasmaatiline retikulum oli hästi arenenud ja sellel ei olnud ilmset degranulatsiooni (joonis 2 (a)). H2O2-ga töödeldud rakud olid aga tüüpilisedoksüdatiivne kahjustusväiksemate, ebaregulaarsete tuumade ja paisunud mitokondritega. Karedas endoplasmaatilises retikulumis leiti ilmne degranulatsioon (joonis 2 (b)). KTF-iga töödeldud rakkudes paranes H2O2-indutseerimineoksüdatiivne kahjustus, mitokondrid olid vardataolised või elliptilised, hajutatud ja rohkemate kristlastega mitokondriaalsed. Karedal endoplasmaatilisel retikulumil ei olnud ilmset degranulatsiooni (joonised 2(d), 2(e) ja 2(f)).

Joonis 2 KTF mõju raku ultrastruktuurile H2O2-indutseeritud veesMES23.5 rakud. TEM-i all täheldati rakkude ultrastruktuuri. Tsütoplasma normaalne morfoloogia, rakuorganellid kontrollrühmas ((a), ×15, 000), iseloomulik ultrastruktuurne morfoloogiaoksüdatiivne kahjustusH2O2--ga töödeldud rühmas ((b), × 15, 000), töötlemine KTF-rühmaga (vastavalt 3,125, 6,25 ja 12,5 ug/ml) ((d), (e), (f), × 15, 000) või hõlmikpuu ekstrakt (12,5 ug/ml) ((c), × 15, 000).

3.2. TH ekspressiooni suurenemine MES23.5 rakkudes pärast KTF-ravi

TH on kriitiline katalüüsiv ensüüm aminohappe L-türosiini muundamisel L-3,4-dihüdroksüfenüülalaniiniks (L-DOPA), mis on neurotransmitterite dopamiini eelkäija. TH normaalne ekspressioon on aktiivsete neuronite märk. Seetõttu võrdlesime TH ekspressiooni inkubeeritud H2O{5}}MES23.5 rakudkoos KTF-i immunohistokeemiaga töötlemisega või ilma. Tulemus näitas, et H2O2 vähendas TH ekspressiooni MES23.5 rakkudes ja pärast KTF-ravi võib TH ekspressiooni oluliselt parandada (joonis 3). See näitab, et KTF-ravi suutis taastada H2O2--ga töödeldud MES23.5 rakkude funktsiooni.

Joonis 3 KTF parandas H2O2-indutseeritud TH vähenemistMES23.5 rakud. Rakud fikseeriti 4-protsendilise paraformaldehüüdiga ja TH ekspressioon tuvastati immunotsütokeemia abil. (a) Tan esindab TH positiivset avaldist (×400). (b) Negatiivne kontroll. (c) Tulemused on väljendatud keskmise halli kraadina. Andmed on kolme sõltumatu katse keskmine ± SD. #P < 0,05="" võrreldes="" kontrollrühmaga.="" ∗p="">< 0,05="" võrreldes="">

3.3. KTF-i allasurutud H2O2-indutseeritud kaspaas 3 aktiveerimine MES23.5 rakkudes

MES23.5 rakukahjustuse mehhanismi edasiseks uurimiseks hindasime proapoptoosifaktori kaspaas 3 ekspressiooni immunoblotimisega. Tulemused näitasid, et ravi H2O2-ga vähendas märkimisväärselt prokaspaas 3 ekspressiooni ja suurendas kaspaas 3 ekspressiooni. Seevastu taastas KTF-ravi prokaspaas 3 ja kaspaas 3 tasakaalu, suurendades prokaspaas 3 ekspressiooni ja vähendades kaspaas 3 ekspressiooni (joonis 4). ). Need leiud näitavad, et KTF-ravi inhibeeris tõhusalt kaspaas 3 aktivatsiooni.

Joonis 4 KTF mõju kaspaas 3 valgu ekspressioonile H2O2-indutseeritud veesMES23.5 rakud. ( a ) Kaspaas 3 valgu ekspressioon määrati Western blot abil ja kvantifitseeriti punktis b. Andmed on väljendatud keskmisena ± SD kolmes sõltumatus katses. #P < 0.05="" võrreldes="" kontrollrühmaga.="" ∗p="">< 0,05="" võrreldes="" h2o2="" -ravitud="">

3.4. Antioksüdatiivsete ensüümide suurenenud ekspressioon MES23.5 rakkudes KTF-ravi abil

ELISA test näitas, et rakusisene CAT, GPx-1 ja GSH olid MES23.5 rakkudes pärast 150 µM H2O2-ga töötlemist alareguleeritud. Pange tähele, et pärast KTF-i ravi taastati rakusisene CAT, GPx-1 ja GSH ekspressioon. RT-PCR analüüs näitas, et H2O2-ravi vähendas CAT ja GPx{10}} mRNA ekspressiooni; KTF-ravi aga taastas CAT ja GPx-1 mRNA ekspressioonidMES23.5 rakud. Spetsiifiliste antikehadega tehtud immunoblot kinnitas samuti, et CAT ja GPx-1 valgu ekspressioonMES23.5 rakudolid H2O2-ravi poolt reguleeritud ja KTF-ravi suutis taastada CAT ja GPx-1 valgu ekspressiooni. Veelgi enam, mRNA ekspressioonoksüdatiivnestressile reageeriv valk HO-1 inhibeeriti ka pärast H2O2-ravi ja seejärel taastati pärast KTF-ravi. Immunoblotanalüüs tõestas ka, et H2O2 reguleeris märkimisväärselt HO-1 valgu ekspressiooni, kuid KTF-ravi suutis taastada HO-1 valgu ekspressiooni. Nagu oodatud, on meie uurimises kasutatud kõrgeimal KTF-i kontsentratsioonil parim mõju CAT, GPx-1, GSH ja HO-1 ekspressiooni taastamisele (joonised (joonised 55 ja 6).6). Kokkuvõttes näitavad saadud tulemused, et KTF-ravi reguleeris oluliselt antioksüdantseid substraate H2O2-töödeldud MES23.3 rakkudes.

Joonis 5 KTF mõju rakusisese CAT, GPx-1 ja GSH tasemele H2O2-indutseeritud veesMES23.5 rakud. Intratsellulaarse CAT, GPx{{0}} ja GSH aktiivsuse taset mõõdeti ELISA komplektiga. Andmed on väljendatud keskmisena ± SD kolmes sõltumatus katses. #P < 0.05="" võrreldes="" kontrollrühmaga.="" ∗p="">< 0,05="" võrreldes="">

Joonis 6 KTF suurendas antioksüdantsete ensüümide valgu ja mRNA ekspressiooni H2O2--indutseeritudMES23.5 rakud. (a) HO{0}}, CAT ja GPx-1 valgu ekspressioonid määrati Western blot abil ja kvantifitseeriti punktis c. (b) HO-1, CAT ja GPx-1 mRNA ekspressioonid määrati RT-PCR abil ja kvantifitseeriti punktis d. Andmed on väljendatud keskmisena ± SD kolmes sõltumatus katses. #P < 0.05="" võrreldes="" kontrollrühmaga.="" ∗p="">< 0,05="" võrreldes="">

4. Arutelu

Redokssüsteemi olulise komponendina mängib ROS olulist rolli raku funktsiooni reguleerimisel. ROS-i mõõdukad tasemed võivad toimida signaalidena, mis soodustavad rakkude proliferatsiooni ja ellujäämist. Füsioloogilistes tingimustes säilitab tasakaal ROS-i tekke ja kõrvaldamise vahel redoks-tundliku signaalisüsteemi õige funktsiooni. Redoks-homöostaasi võib häirida ROS-i tootmise suurenemine või ROS-i eemaldamise võime vähenemine, mis toob kaasa üldise suurenemiseoksüdatiivnestress [17, 18], põhjustades seejärel intratsellulaarse struktuuri pöördumatuid kahjustusi ja kutsudes esile rakusurma.

Suur O2 tarbimine ajus põhjustab ROS-i kuhjumist; seega on neuronid rünnaku suhtes eriti haavatavadoksüdatiivnestress. Surmajärgsed uuringud on näidanud lipiidide peroksüdatsiooni jaoksüdatiivne kahjustusPD patsientide ajurakkudele [19]. Kasvavad uuringud kinnitavad sedaoksüdatiivne kahjustusmängib kriitilist rolli neuronite degeneratiivsete haiguste, nagu AD, PD, HD ja ALS, patogeneesis [18, 20]. Käesolevas uuringus täheldati MES23.5 dopamiinergilistes neuronaalsetes rakkudes rakkude elujõulisuse olulist vähenemist pärast kokkupuudet 50 μM H2O2-ga 12 tundi, 25 μM H2O2-ga 24 tundi või 12,5 μM H2O2-ga 48 tundi. Nagu näitas morfoloogiline vaatlus, ilmnesid 12 tundi 150 μM H2O2-ga eksponeeritud rakkudel tüüpiline oksüdatiivne kahjustus, sealhulgas tsütoplasmas mitmed membraansed vakuoolid, endoplasmaatilise retikulumi ja mitokondrite katkemine ning eukromatiini kondenseerumine raku tuumas.

Hiina meditsiini teooria kohaselt on puudujääkneerudon PD peamine patoloogiline mehhanism. Turgutavneerudon oluline strateegia PD ravis. Käesolevas uuringus leidsime, et traditsioonilineneere toniseerivvalem KTF, mis koosneb Cistanche'ist, Epimedii'st ja Polygonatum sibiricum'ist, suurendas oluliselt rakkude elujõulisust ja töödeldud H2O2-TH ekspressiooniMES23.5 rakud.

Rakkude apoptoos on programmeeritud rakusurma viis erinevatel stiimulitel, mis aktiveerivad kas väliseid või sisemisi radu. Tsüsteinüülaspartaadi spetsiifilised proteaasid (kaspaasid) on paljurakulistes organismides väga konserveerunud ja toimivad apoptoosi kesksete regulaatoritena. Kaspaaside aktiveerimine on kõigi apoptoosisündmuste põhitelg. Nende kaspaaside hulgas on kaspaas 3 tuvastatud raku apoptoosi võtmevahendajana ja indikaatorina. Nagu teisedki kaspaasid, eksisteerib kaspaas 3 tavaliselt inaktiivse proensüümina (prokaspaas 3). Pärast proteolüütilist töötlemist toodab see kaks subühikut, mis võivad dimeriseerida, moodustades aktiivse kaspaasi 3, kutsudes seejärel esile paljud biokeemilised ja biofüüsikalised muutused, et kutsuda esile raku apoptoos [21]. Meie käesolev uuring näitas, et ravi H2O2-ga reguleeris oluliselt kaspaas 3, kuid KTF-ravi muutis selle suundumuse vastupidiseks.MES23.5 rakud, mis näitab, et KTF vähendas H2O2-töödeldud MES23.5 rakkude apoptoosi.

Antioksüdatiivsed ensüümid, nagu superoksiiddismutaas (SOD), CAT, GPx-1, GSH ja HO-1, on rakkude olulised kaitsemehhanismid.oksüdatiivnestress. Antioksüdatiivse ensüümina võib SOD muuta superoksiidi radikaalid vesinikperoksiidiks, mis seejärel muudeti CAT ja GPx abil H2O-ks [22]. GSH on ka oluline antioksüdant. Redutseeritud glutatiooni (GSH) katalüütiline muundamine GPx-ga oksüdeeritud glutatiooniks (GSSG) on abiks H2O2 muutmisel O2-ks. On teatatud, et antioksüdandi aktiivsus vähenes PD mudeli hiirtel [23–25]. Seetõttu võivad ravimid, mis reguleerivad ensümaatiliste antioksüdantide ekspressiooni, olla potentsiaalseteks kandidaatideks PD raviks. Meie andmed näitasid, et H2O2-ravi pärssis CAT, GPx, GSH ja HO-1MES23.5 rakud, samas kui KTF-ravi erinevatel kontsentratsioonidel taastas tõhusalt CAT, GPx, GSH ja HO ekspressiooni-1.

Kokkuvõtteks näitavad meie tulemused, et traditsiooniline Hiina ravimtaimneere toniseerivCistanche'st, Epimedii'st ja Polygonatum sibiricum'ist koosneval koostisel on tugev antioksüdatiivne võime ja märkimisväärne neuroprotektiivne toime. See uuring annab vihje selle arendamiseksneere toniseerivpreparaat kui potentsiaalne raviaine Parkinsoni tõve ennetamiseks ja raviks.

Neere toniseeriv valem võib kaitsta MES23.5 rakkude oksüdatiivset kahjustust

Tänuavaldused

Seda tööd toetasid Hiina Rahvavabariigi riikliku tervise- ja pereplaneerimise komisjoni teadusfond (WKJ-FJ-38), Chen Keji integreeriva meditsiini arendusfond (CKJ2014012) ja põhidistsipliinifond ( X2014010-värin). Autorid avaldavad siirast tänu preili Xin Panile abistava abi eest.

Konkureerivad huvid

Autorid kinnitavad, et uuring viidi läbi selliste äriliste või finantssuhete puudumisel, mida võiks tõlgendada potentsiaalse huvide konfliktina.

Autorite kaastööd

Yihui Xu ja Wei Lin jagavad artiklis sama panust. Chuanshan Xu on vastav autor.

Viited

1. Fahn S., Cohen G. Parkinsoni tõve oksüdeeriva stressi hüpotees: seda toetavad tõendid. Annals of Neurology. 1992;32(6):804–812. doi: 10.1002/ana.410320616. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

2. Jenner P., Olanow CWOksüdeerivstress ja Parkinsoni tõve patogenees. Neuroloogia. 1996;47 (lisand 3): S161–S170. doi: 10.1212/wnl.47.6_suppl_3.161s. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

3. Akaneya Y., Takahashi M., Hatanaka H. Vabade radikaalide kaasamine MPP-sse pluss neurotoksilisus roti dopamiinergiliste neuronite vastu kultuuris. Neuroteaduste kirjad. 1995;193(1):53–56. doi: 10.1016/0304-3940(95)11668-M. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

4. Emerit J., Ideas M., Bricaire F. Neurodegeneratiivsed haigused jaoksüdatiivnestress. Biomeditsiin ja farmakoteraapia. 2004;58(1):39–46. doi: 10.1016/j.biopha.2003.11.004. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

5. Hiina farmakopöa komisjon. Hiina Rahvavabariigi farmakopöa. Vol. 1. Peking, Hiina: People's Medical Publishing House; 2010. [Google Scholar]

6. Cai J., Tian Y., Lin R., Chen X., Liu Z., Xie J.neere toniseerivHiina taimne preparaat substantia nigra neuronitel Parkinsoni tõve hiiremudelis. Neuraalse regeneratsiooni uurimine. 2012;7(6):413–420. [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Google Scholar]

7. Li WW, Yang R., Cai DF Cistanche'i koguglükosiidide kaitsev toime Parkinsoni tõve mudelhiirte mustaines dopamiinergilisele neuronile. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2008;28(3):248–251. [PubMed] [Google Scholar]

8. Wei W., Jing C. Parkinsoni tõve TCM mustri ja valemi analüüs. Traditsioonilise Hiina meditsiini ajakiri. 2013;54(20):1778–1782. [Google Scholar]

9. Tian Y., Cai J., Chen X. Protection ofneere toniseerivHiina ravimtaim Parkinsoni tõvega hiirte nigra striatal neuronitel. Hiina gerontoloogia ajakiri. 2011;31(3):440–443. [Google Scholar]

10. Lin SG, Ye SF, Huang JM jt. Kuidas Hiina ravimid, mis toniseerivadneerudinhibeerida dopamiinergiliste neuronite apoptoosi? Neuraalse regeneratsiooni uurimine. 2013;8(30):2820–2826. doi: 10.3969/j.issn.{7}}.2013.30.004. [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

11. Wang H., Li W.-W., Cai D.-F., Yang R. Cistanche ekstraktide kaitsev toime MPP pluss-indutseeritud Parkinsoni tõve rakumudeli vigastustele. Hiina integreeriva meditsiini ajakiri. 2007;5(4):407–411. doi: 10.3736/jcim20070409. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

12. Geng X., Tian X., Tu P., Pu X. Ehhinakosiidi neuroprotektiivne toime Parkinsoni tõve hiire MPTP mudelis. European Journal of Pharmacology. 2007;564(1–3):66–74. doi: 10.1016/j.ejphar.2007.01.084. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

13. Tian X.-F., Pu X.-P. Cistanches salsa fenüületanoidglükosiidid inhibeerivad neuronites 1-metüül-4-fenüülpüridiiniumiooni poolt indutseeritud apoptoosi. Ajakiri Etnofarmakoloogia. 2005;97(1):59–63. doi: 10.1016/j.jep.2004.10.014. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

14. Geng X., Song L., Pu X., Tu P. Cistanches salsa fenüületanoidglükosiidide neuroprotektiivne toime 1-metüül-4-fenüül-1,2,3,{{ 6}}tetrahüdropüridiini (MPTP) poolt indutseeritud dopamiinergiline toksilisus C57 hiirtel. Bioloogia- ja farmaatsiabülletään. 2004;27(6):797–801. doi: 10,1248/bpb.27,797. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

15. Wong HS, Ko KM Herba Cistanches stimuleerib rakkude glutatiooni redokstsüklit H9c2 kardiomüotsüütide mitokondriaalsel hingamisel tekkivate reaktiivsete hapnikuliikide poolt. Farmaatsiabioloogia. 2013;51(1):64–73. doi: 10.3109/13880209.2012.710242. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

16. Wing Sze SC, Tong Y., Ng TB, Yin Cheng CL, Cheung HP Herba Epimedii: anti-oksüdatiivneomadused ja selle meditsiinilised tagajärjed. Molekulid. 2010;15(11):7861–7870. doi: 10,3390/molekulid15117861. [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

17. Trachootham D., Lu W., Ogasawara MA, Valle NR-D., Huang P. Rakkude ellujäämise redoksregulatsioon. Antioksüdandid ja redokssignaal. 2008;10(8):1343–1374. doi: 10.1089/ars.2007.1957. [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

18. Moore DJ, West AB, Dawson VL, Dawson TM Parkinsoni tõve molekulaarne patofüsioloogia. Neuroteaduse aastaülevaade. 2005;28:57–87. doi: 10.1146/annurev.neuro.28.061604.135718. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

19. Sian J., Dexter DT, Lees AJ jt. Glutatiooni taseme muutused Parkinsoni tõve ja teiste basaalganglioneid mõjutavate neurodegeneratiivsete häirete korral. Annals of Neurology. 1994;36(3):348–355. doi: 10.1002/ana.410360305. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

20. Halliwell B., Gutteridge JMC Vabade radikaalide roll inimeste haigustes: ülevaade. Ensümoloogia meetodid. 1990;186:1–85. [PubMed] [Google Scholar]

21. Venderova K., Park DS Programmeeritud rakusurm Parkinsoni tõve korral. Cold Spring Harbori väljavaated meditsiinis. 2012;2(8) doi: 10.1101/cshperspect.a009365.a009365 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

22. Fridovitš I. Reaktiivsete hapnikuliikide põhiaspektid ehk mis on hapnikuga? New Yorgi Teaduste Akadeemia Annals. 1999;893:13–18. doi: 10.1111/j.{7}}.1999.tb07814.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

23. Xiong Q., Kadota S., Tani T., Namba T. Cistanche deserticola fenüületanoidide antioksüdatiivne toime. Bioloogia- ja farmaatsiabülletään. 1996;19(12):1580–1585. doi: 10,1248/bpb.19,1580. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

24. Koppula S., Kumar H., More SV, Lim H.-W., Hong S.-M., Choi D.-K. Hiljutised uuendused Parkinsoni tõve eksperimentaalsetes mudelites taimsete toodete redoksregulatsiooni ja vabade radikaalide eemaldamise mõju kohta. Molekulid. 2012;17(10):11391–11420. doi: 10,3390/molekulid 171011391. [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

25. Fang Z., Wang Y. Isatiini mõju antioksüdaasi aktiivsusele PD mudelhiirtel. Hiina apteek. 2008;19(22):1696–1697. [Google Scholar]