Neeruhaigustega seotud apolipoproteiin L1 variandid näitavad katioonikanali aktiivsuse funktsiooni suurenemist

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Jonathan Bruno ja John C. Edwards

Apolipoproteiin L1 (ApoL1) variandid vastutavad teatavate progresseeruvate haiguste suurenenud riski eest.neerudhaigusedAafrika päritolu inimeste seas. ApoL1 on amfitroopne valk, mis võib sisestada fosfolipiidmembraanidesse ja anda anioon- või katioonselektiivse läbilaskvuse fosfolipiidmembraanidele sõltuvalt pH-st. Kas need tegevused erinevad variantide vahel või aitavad need kaasa haiguse patogeneesile, pole teada. ApoL1 isovormide erinevuste hindamiseks kasutasime fosfolipiidide vesiikulite pingepõhise ioonivoo ja stabiilse membraani seose analüüse. Võrreldes võrdlusvalguga on kahe neeruhaigusega seotud variandi katioonselektiivse ioonide permeaasi aktiivsus märkimisväärne (ligikaudu kaks korda) suurem. Seevastu me ei leia isovormide vahel erinevust aniooniselektiivses permeaasi aktiivsuses madala pH juures. Võrreldes võrdlusjärjestusega on kahel haigusega seotud variandil suurenenud stabiilne seos fosfolipiidvesiikulitega tingimustes, mis toetavad katioonpermeaasi aktiivsust, mis viitab sellele, et suurenenud aktiivsus võib olla tingitud tõhusamast membraani assotsiatsioonist ja sisestamisest. Anioonide permeaasi aktiivsuse optimaalsetes tingimustes ei ole isovormide vahel erinevusi membraani assotsiatsioonis. Need andmed toetavad mudelit, milles suurenenud katioonide läbilaskvus võib aidata kaasa progresseeruvatele neeruhaigustele, mis on seotud kõrge riskiga ApoL1 alleelidega.

Teadaolevalt on valgu ApoL1 kaks erinevat varianti vastutavad progresseeruva proteinuuria suurenenud riski eest.neerudhaigusAafrika päritolu inimestel, eriti fokaalse segmentaalse glomeruloskleroosi, hüpertensiivse nefroskleroosi ja HIV-ga seotud nefropaatia tõttu (1–3). ApoL1 funktsionaalsed rollid inimese rakkudes, haigusega seotud variantide mõju nendele funktsioonidele ja see, kuidas sellised muutused tegevusetus võib kiirendadaneeruhaiguson ebaselged (4, 5).

Ainus biokeemiline aktiivsus, mis ApoL1 valku teadaolevalt omab, on toimida ioonikanalina. On täheldatud, et ApoL1 N-terminaalsel domeenil on struktuurne sarnasus bakteriaalse kolitsiin A1-ga (6). Sarnaselt kolitsiinile A1 on ApoL1 amfitroopne valk, mis teatud tingimustel võib vesilahusest lipiidmembraani siseneda ja seejärel toimida ioonide permeaasina (6–9). Puhastatud rekombinantne metsiktüüpi ApoL1 on detergendilahuses stabiilne neutraalse pH (8, 9) juures. Madala pH korral võib ApoL1 siseneda fosfolipiidmembraanidesse ja suurendada membraanide aniooniselektiivset läbilaskvust (6, 7, 9). Kui cis-pH tõstetakse tagasi neutraalseks, siis anioonide selektiivne läbilaskvus pärsitakse ja katioonselektiivne kanal aktiveerub (8, 9). Need andmed toetavad mudelit, milles ApoL1, mis esitatakse happelisele sektsioonile kas eksotsüütiliste või endotsüütiliste radade kaudu, võib sisestada organelli piiravasse membraani, mis suurendab anioonide läbilaskvust. Valgu hilisem transportimine teistesse membraani sektsioonidesse, kus cis-pH oleks neutraalne (nagu plasmamembraan või mitokondriaalsed membraanid), pärsib anioonide läbilaskvust ja aktiveerib katioonpermeaasi. kas need ioonide läbilaskvuse aktiivsused mängivad rolli ApoL{22}}seotud patogeneesisneeru-haigusedon ebaselge.

Kasutasime vesiikulitel põhinevaid meetodeid, et analüüsida erinevusi ioonide permeaasi aktiivsuse ja membraani sidumise suhtes selle (metsiktüüpi) järjestuse (tähisega G0) ja kahe haigusega seotud variandi (tähisega G1 ja G2) vahel. Leiame, et võrreldes G0-ga näitavad nii G1 kui ka G2 isovormid katioonide permeaasi aktiivsuse eriaktiivsust neutraalse pH juures, muutmata aniooniselektiivset permeaasi aktiivsust madala pH juures. Lisaks näitavad haigusega seotud isovormid G1 ja G2 stabiilsemat membraaniühendust võrreldes G0-ga tingimustes, mis toetavad katioonipermeaasi aktiivsust, kuid mitte tingimustes, mis toetavad aniooni permeaasi aktiivsust. Me ei leia mingit mõju ei seondumisetapi ega katioonikanali aktiivsuse väljavooluetapi pH-tundlikkuse mustrile ning me ei leia mingit mõju aniooniselektiivse permeaasi aktiivsuse pH-tundlikkusele. Me järeldame, et ApoL1 haigusega seotud variandid suurendavad selektiivselt valgu katioonikanali aktiivsust, tõenäoliselt vähemalt osaliselt, suurendades membraani sisestamist. Teeme ettepaneku, et see täiustatud kanalitegevus aitaks kaasa progressiivseleneerudhaiguskõrge riskiga genotüüpe kandvatel inimestel.

Cistanche saab ravidaneeruhaigus

Tulemused

ApoL1 rekombinantsed isovormid, mille N-terminaalne signaaljärjestus eemaldati ja asendati 6His/T7 epitoobimärgisega, ekspresseeriti ja puhastati. Kõik kolm näitasid puhastamisel identseid kromatograafilisi omadusi ja neid ei olnud võimalik geelelektroforeesiga eristada. Joonis 1.

Tippfraktsioonid lahjendati kontsentratsioonini 100 ug/ml ja neile tehti vesiikulite väljavoolu testid kloriidi ja kaaliumi läbilaskvuse tagamiseks. Analüüs koosneb kahest eraldi etapist. Assotsiatsioonifaasis segatakse ApoL1 KCl-ga laetud fosfolipiidi vesiikulitega ja lastakse sisestada membraanidesse. Seejärel eemaldatakse ekstravehikulaarne KCl ja puhver isotoonilise sahharoosiga tasakaalustatud soolatustamise tsentrifuugimiskolonni kaudu, tekitades mõlema Kandi suured seest-välja gradiendid. Cl ioonid. Väljavoolu etapis lahjendatakse tsentrifuugimiskolonni eluaat isotoonilise puhverdatud sahharoosi lahusega, mis hoiab KCl gradienti soovitud pH juures. Ekstravehikulaarset Cl kontsentratsiooni jälgitakse kloriidselektiivse elektroodiga. Isegi kui K- või Cl-selektiivne läbilaskvus on olemas, ei saa kumbki ioon vesiikulitest väljuda, kuna vastasioon ei liigu. Pingepõhine ioonide väljavool käivitatakse vastaiooni ionofoori küllastava kontsentratsiooni lisamisega. K-selektiivse ionofoori valinomütsiini (Val) lisamine kutsub esile suure sisemise negatiivse membraanipotentsiaali, mis Cl-i läbilaskvuse korral juhib KCl-i väljavoolu, mille tuvastab kloriidselektiivne elektrood; seega pärast Val peegeldab Cl väljavoolu kiirus Cl läbilaskvust. Vastupidi, Cl-selektiivse ionofoori Chloride Ionophore 1 (CI1) lisamine kutsub esile sisemise positiivse membraanipotentsiaali, mis juhib KCl väljavoolu, kui on olemas K läbilaskvus. Seega, pärast CI1 lisamist, peegeldab Cl väljavoolu kiirus K läbilaskvust. Seega võib seda analüüsi kasutada kas Cl või K läbilaskvuse analüüsina, olenevalt sellest, millist ionofoori kasutatakse. Vesiikulite spetsiifiliseks läbilaskvuseks loetakse ionofoori lisamise järgset iooniväljavoolu esialgset kiirust. Pange tähele, Cl väljavool enne ionofoori lisamist näitab mõningast läbilaskvust mõlema Kand Cl. Isegi sel juhul näitab Cl-i väljavoolu kiirus pärast vastasiooni-ionofoori liia lisamist huvipakkuva iooni läbilaskvust – Cl pärast Val lisamist ja K pärast CI1 lisamist.

Cistanche saab ravidaneeruhaigus

Kloriidi permeaasi aktiivsus

Meie varasemad uuringud näitasid, et anioonide läbilaskvus on suurim, kui nii membraani assotsiatsioonietapp kui ka väljavooluetapp viiakse läbi pH väärtusel 5.0 ja neid tingimusi kasutati kolme isovormi Cl läbilaskvuse aktiivsuse võrdlemiseks, kasutades käivitamiseks Val. Cl läbilaskvusest sõltuv väljavool. Toorandmete näited on näidatud joonisel 2A, mis näitab Cl-selektiivse elektroodi väljundit millivoltides, mis on kujutatud aja suhtes. Salvestamine algab enne vesiikuleid ja valku sisaldava spinkolonni eluaadi lisamist, mV väärtus peegeldab 10 μM Cl kontsentratsiooni. Cl-vaba tsentrifuugimiskolonni eluaat lisatakse esimese noolega, lahjendades Cl, mis kajastub mV jälgimise ülespoole paindes. Val lisatakse teise noole juurde, käivitades Cl väljavoolu, kui Cl läbilaskvus on olemas, mida peegeldab inmV järkjärguline langus. Triton X-100 lisatakse kolmanda noole juurde, vabastades kogu ülejäänud intravesikulaarse kloriidi. Pärast mV-st kloriidi kontsentratsioonist teisendamist, kasutades elektroodi jaoks katsetingimustes genereeritud standardkõverat, määratakse Cl vabanemise fraktsionaalne esialgne kiirus pärast Val lisamist ja võetakse kloriidi läbilaskvusena. Võrreldes valgu puudumise kontrolliga (sinine jälgimine), näitab Cl vabanemise kõrge kiirus pärast Val lisamist, et ApoL1 annab olulise Cl-läbilaskvuse, mis näib olevat võrreldav kolme isovormi (punased, rohelised ja kollased jäljed) vahel. Väga madal väljavoolu kiirus enne Val-i näitab, et kaaliumi läbilaskvus on palju madalam kui Cl läbilaskvus. Cl permeaasi aktiivsust analüüsiti ApoL1 isovormide kontsentratsioonide vahemikus (joonis 2B). Nagu varem G0 puhul teatatud, leiame, et Clpermeaasi aktiivsus on kõigi kolme isovormi testis lineaarselt seotud valgu massiga. Permeaasi aktiivsus igal kontsentratsioonil ei erine kolme isovormi vahel. Kontsentratsioonikõver viidi läbi kaks korda, kasutades kahte erinevat valgupreparaatide komplekti, andes sama tulemuse.

Kolmest valgust koosneva kuue sõltumatu preparaadi Cl permeaasi aktiivsuse määrati pH väärtusel 5.0 nagu on kokkuvõtlikult näidatud joonisel 2C. Üheski preparaatide komplektis ei leidnud me olulist erinevust Cl permeaasi aktiivsuses isovormide vahel (p > 0.05 G0 võrdlemiseks G1 või G2-ga igas komplektis) . Kõigi kuue preparaadi (joonisel 2C märgistatud ALL) keskmised väljavoolukiirused olid võrdlusjärjestuse G0 puhul 1,21 ± 0,32 protsenti /s, 1,36 ± 0,41 protsenti /s G1 jaoks ja 1,18 ± 0,34 G2 jaoks (keskmine ± SD, n=6 mõlema jaoks; p=0,47 ja 0,94 G0 ja G1 võrdlemiseks ja G2, vastavalt). Et teha kindlaks, kas haigusega seotud mutatsioonid muudavad anioonide permeaasi pH-tundlikkust, analüüsiti iga isovormi Cl-i läbilaskvust pH väärtuste vahemiku kaudu, kasutades näidatud pH-d nii testi assotsiatsiooni- kui ka väljavooluetappide jaoks (joonis 2D). olulised erinevused isovormide vahel. See katse viidi läbi kaks korda, kasutades kahte erinevat valgupreparaatide komplekti, andes sama tulemuse. Seega ei erine Clpermeaasi aktiivsus kahe haigusega seotud variandi ja võrdlusjärjestuse vahel oluliselt.

Kaaliumi permeaasi aktiivsus

Meie varasemad uuringud näitasid, et katioonide läbilaskvus on suurim, kui membraani assotsiatsioonietapp viiakse läbi pH 6.0 ja väljavooluetapp viiakse läbi pH väärtusel 7,5, ning me kasutasime neid tingimusi, kui pole teisiti täpsustatud. Näited K permeaasi testi algandmetest on näidatud joonisel 3. Nagu Cl läbilaskvuse analüüside puhul, lisatakse esimese noole juures tsentrifuugimiskolonni eluaat, teise noole juures ionofoor (antud juhul Chloride Ionophore1, CI1) ja pesuainet lisatakse kolmanda noole juures. Algsed väljavoolukiirused pärast ionofoori lisamist, mis tähistavad K läbilaskvust, on näidatud hallide katkendjoontega. Sinine jälg pärineb valguvaba kontrollist, mis näitab ainult vesiikulite endogeenset tausta läbilaskvust. Punane joon näitab G0 (metsiktüüpi) variandi aktiivsust, mis näitab selgelt, et K-läbilaskvus on suurem kui valgu poolt antud kontrollvesiikulid, nagu varem teatatud (9). Kollane ja roheline jäljed näitavad vastavalt G1 ja G2 variantide aktiivsust. Esialgsed kalded pärast ionofoori lisamist on G1 ja G2 puhul selgelt suuremad kui G0 puhul, mis näitab, et haigusega seotud variandid toetavad suuremat K permeaasi aktiivsust kui G0.

Erinevalt Cl-i läbilaskvuse testist ja nagu varem teatatud G0 isovormi (9) kohta, esineb K permeaasi testitingimustes vesiikulites, mis sisaldavad ühtki kolmest isovormist, mõningane väljavool enne ionofoori teket, mida tähistab allapoole kalle. salvestustest pärast proovi lisamist ja enne ionofoori lisamist. Kuigi kõrge väljavoolu kiirus pärast ionofoori lisamist näitab olulise K läbilaskvuse olemasolu, näitab väljavool enne ionofoori ka mõningast Cl läbilaskvust, võimaldades mõlemal ioonil vesiikulitest välja lekkida ionofoori puudumisel. Tõenäoliselt põhjustab see nii elektroodi väljundi nüri suurenemist vahetult pärast tsentrifuugimiskolonni eluaadi lisamist kui ka järgnevat langust enne CI1, mida on näha kõigi ApoL1 sisaldavate salvestiste puhul. Eeldades, et see leke algab siis, kui proov liigub läbi tsentrifuugimiskolonni, arvestab see ka Cl lõpliku kontsentratsiooni erinevusi pärast detergendi lisamist, kuna igasugune KCl kadu tsentrifuugimiskolonnis tähendaks vähem testile lisatavat KCl kogust. Ionofoori kiiruse kvantitatiivne tõlgendamine ei ole lihtne, kui see peab olema mõlema Kand Cl läbilaskvuse funktsioon. Nagu varem (9), omistame selle aktiivsuse jääkCl permeaasi aktiivsusele, mida näeme pH 7,5 juures nagu joonisel 2D (vt ka Bruno et al. (9), joonis 4D).

Kaaliumipermeaasi testid viidi läbi valgu kontsentratsioonide vahemikus (joonis 4A). Aktiivsus oli lineaarselt seotud valgu massiga testis iga isovormi puhul, kuid kaks haigusega seotud isovormi näitasid oluliselt suuremat väljavoolu aktiivsust võrreldes G0-ga. See kontsentratsioonikõver reprodutseeriti kolme eraldi valgupreparaatide komplektiga, mis andis väga sarnased tulemused.

Kolmest isovormist koosneva kuue sõltumatu preparaadi K väljavoolu aktiivsust analüüsiti, kasutades igas testis 2 ug valku. Igas kuues komplektis oli G1 ja G2 isovormide aktiivsus oluliselt suurem kui G0 (joonis 4B). Kõigi kuue andmekogumi keskmine andis väljavoolukiiruseks 0,349 ± 0.063 protsenti /s G{{10}} jaoks, {{15} },709 ± 0,176 protsenti /s G1 puhul ja 0,673 ± 0,142 protsenti /s G2 puhul (keskmine ± SD, n=6 iga jaoks; p < 0,00001="" g0="" võrdlemisel="" kas="" g1="" või="" g2-ga).="" g1="" ja="" g2="" k-permeaasi="" spetsiifilised="" aktiivsused="" on="" vastavalt="" 203-="" ja="" 193-="" korda="" suuremad="" kui="" g0="" selle="" testi="">

K permeaasi aktiivsuse sõltuvust membraani assotsiatsioonietapi ja ioonide väljavoolu etapi pH-st analüüsiti eraldi. Kuigi me kinnitasime, et G1 ja G2 koguväljavoolu aktiivsus on "standardsetes" tingimustes (seondumine pH 6 juures, väljavool pH 7,5 juures) suurem kui G0 oma, ei leidnud me kõvera kujus olulist erinevust. aktiivsus võrreldes välise (cis) pH-ga kas membraani ühendamise etapis (joonis 4C) või ioonide väljavoolu etapis (joonis 4D). Samuti ei leidnud me erinevusi isovormide vahel aktiivsuse sõltuvuses kõrgest intravesikulaarsest (trans) pH-st ega vajadusest kahevalentse katiooni olemasolu järele (joonis 4E), ja lisaks pange tähele, et kaltsium või magneesium on võrdselt tõhusad täielikuks vajaliku kahevalentse katiooni pakkumisel. tegevust. Kõik need katsed viidi läbi kaks korda, kasutades erinevaid puhastatud valgu komplekte, mis andsid identsed tulemused.

Stabiilne membraaniühendus

Oleme varem näidanud, et puhastatud rekombinantne ApoL1 seondub spontaanselt fosfolipiidide membraanidega, näidates sarnast sõltuvust pH-st ja fosfolipiidide koostisest nagu ioonide permeaasi aktiivsus (9). Kasutades sarnaseid meetodeid, võrdlesime ApoL1 võrdlusversiooni lipiidide vesiikulite sidumisomadusi neeruhaigusega seotud variantidega tingimustes, mis toetasid optimaalset Cl või K permeaasi aktiivsust (joonis 5). Clpermeaasi tingimustes inkubeeriti valku enne kaotroopset ekstraheerimist lipiidvesiikulite pH väärtusega 5.{6}}, et eemaldada valgud, mis ei olnud vesiikulitega stabiilselt seotud. Membraaniga seotud valk eraldati flotatsiooniga läbi sahharoosipadja ja hinnati kvantitatiivse Western blot analüüsiga. Tulemused on näidatud joonisel 5A. G{{10}} ja G1 või G2 isovormide vahel vesiikulitega seotud valgu koguses olulist erinevust ei esinenud. Iga reaktsiooni 500 ng valgust oli vesiikulitega seotud kogus 223 ± 33 ng G0, 239 ± 38 ng G1 ja 191 ± 28 ng G2 puhul (keskmine ± SD n=8 iga rühma jaoks, p=0,35 ja 0,076 vastavalt G0 võrdlemiseks G1 ja G2-ga). Ligikaudu 40–50 protsenti testis olevast valgust on nendes tingimustes seotud membraanidega. Seda katset tehti kaks korda, andes väga sarnased tulemused.

Seonduvuse hindamiseks Kpermease aktiivsuse jaoks optimaalsetes tingimustes inkubeeriti valku vesiikulitega pH 6 juures.0, seejärel viidi pH väärtuseni 7,5 enne kaotroopset ekstraheerimist, et eemaldada mittestabiilselt sisestatud valk. Membraaniga seotud valk eraldati membraani vesiikulite flotatsiooniga läbi askroospadja ja hinnati kvantitatiivse Western blot analüüsiga. Tulemused on näidatud joonisel 5B. Haigusega seotud variandid seonduvad oluliselt tõhusamalt kui G0. Igasse reaktsiooni lisatud 500 ng valgust oli vesiikulitega seotud kogus 43,5 ± 14,5 ng (n=8) G{{30}} puhul ,73.0 ± 17,7 ng (n=7) G1 puhul ja 69,3 ± 10,3 ng (n=8) G2 puhul (keskmine ± SD; p=0,00076 ja 0,0018 G0 võrdlemiseks vastavalt G1 ja G2-ga). Umbes 9 protsenti reaktsioonis olevast G0-valgust oli stabiilselt seotud vesiikulitega, võrreldes umbes 14 protsendiga G1 ja G2 nendes tingimustes. See katse viidi läbi kaks korda, kasutades sõltumatuid preparaate, mis andsid sarnased tulemused.

Arutelu

Siin tutvustame ApoL1 ja selle ioonide läbilaskvuse aktiivsuse uuringute tulemusineerud-haigus-seotud variandid, mis andsid mitmeid olulisi tulemusi. Esiteks leiame, et ApoL1 haigusega seotud variandid on oluliselt suurendanud Kpermeaasi aktiivsust, mis on meie analüüsides ligikaudu kaks korda suurem kui G0 isovormil. Teiseks, erinevalt Kpermeaasist, ei ole isovormide vahel olulisi erinevusi Cl permeaasi aktiivsuse spetsiifilisuses pH väärtusel 5.0. Kolmandaks, isovormide vahel ei ole erinevusi K- või Cl-permeaasi aktiivsuse pH-tundlikkuses ega kõrge trans-pH nõudmises ja kahevalentse katiooni vajaduses Kpermeaasi aktiivsuse jaoks. Neljandaks, optimaalsetes tingimustes, mis toetavad K permeaasi, näitavad haigusega seotud variandid võrreldes G0-ga tugevamat stabiilset membraaniühendust, kuid Cl permeaasi aktiivsuse optimaalsetes tingimustes membraani assotsiatsioonis erinevusi ei esine.

Meie leiud, mis näitavad suurenenud K permeaasi, millel puudub mõju Cl permeaasile, on väga tugevad. Kasutades iga permeaasi aktiivsuse jaoks optimaalseid tingimusi, leidsime kuue sõltumatu preparaadikomplekti vahel sisuliselt identsed tulemused, kusjuures haigusega seotud variantide Kpermease aktiivsus oli oluliselt suurem kui G0. Iga komplekt valmistati ette ja analüüsiti samal ajal, kasutades tavalisi reaktiive. BCA testiga määratud valgukontsentratsioonide kehtivust kinnitas Coomassie värvimise võrreldav intensiivsus SDS-PAGE-l. Need andmed hõlmavad kõiki edukaid üheaegse puhastamise katseid – me ei loonud kunagi edukalt kõigi kolme variandi seadistust, mille puhul neid suhtelisi tegevusi ei täheldatud.

Samamoodi oli erinevuste puudumine anioonipermeaasi spetsiifilises aktiivsuses pH 5 juures ühtlane kõigi preparaatide komplektide puhul. Seega on meie esmane järeldus, et ApoL1 haigusega seotud variandid suurendavad selektiivset funktsiooni K permeaasi aktiivsuses, ilma et see mõjutaks Cl permeaasi aktiivsust, nagu on testitud iga selle tegevuse jaoks optimaalsetes tingimustes. Olulised erinevused ApoL1 variantide katioonikanali aktiivsuses, mis korreleeruvad võimega haigust juhtida, mõjutavad võimalikke patogeenseid mehhanisme. Suurenenud ioonide läbilaskvuse selektiivne olemus näitab, et haigusega seotud variantide suurenenud katioonide läbilaskvuse aktiivsus võib kaasa aidata haiguse tekkele, kuid anioonide permeaasi aktiivsus madala pH juures, mis ei erine isovormide hulgas, ei oma tõenäoliselt olulist rolli.

Variantide mõju uuringud aktiivsuste pH-tundlikkusele ja valgu stabiilse membraani sidumise ulatusele näitasid mehhanismi, mille abil saab K permeaasi aktiivsust suurendada. Esiteks, peale K permeaasi suurenenud aktiivsuse kinnitamise optimaalsetes tingimustes, ei leidnud me erinevusi kõverate kujudes, mis näitavad pH mõju K permeaasi aktiivsuse membraaniassotsiatsiooni ja väljavoolu etappidele või pH mõjule üldisele Cl permeaasi aktiivsusele. Lisaks ei olnud kõigi isovormide puhul erinevusi vesiikulite sisemuse kõrgendatud pH nõuetes ega kahevalentse katiooni olemasolu nõuetes K permeaasi aktiivsuse reaktsioonis. Seega ei leidnud me tõendeid kanali enda olemuslike omaduste erinevuse kohta. Seevastu näitasid variandid märkimisväärselt suurenenud stabiilset seost fosfolipiidi vesiikulitega tingimustes, mis toetavad Kpermease aktiivsust, kusjuures selle efekti ulatus on ligikaudu samas vahemikus kui muutuse passiivsus. Kokkuvõttes näitavad andmed, et suurenenud K permeaasi aktiivsuse aluseks on lihtsalt tõhusam membraani sisestamine aktiivsust toetavates tingimustes, ilma et oleks vaja sisestatud valgu omadustes olulisi muutusi.

ApoL1 struktuuris (6) on tuvastatud kolm domeeni. Arvatakse, et ioonikanali aktiivsus peitub kolitsiini homoloogses "poore moodustavas" domeenis, mis hõivab umbes 60 protsenti valgu N-otsast. Haigusega seotud järjestuse variatsioonid ei ole poore moodustavas domeenis, vaid asuvad sellest eemal keerdunud spiraali domeenis, mis sisaldab umbes 16 protsenti C-otsas olevast valgust. Selle domeeni kustutamine ei mõjuta trüpanolüütilist aktiivsust, kuid on Apol isovormide seas väga konserveerunud nii liikide sees kui ka liikide vahel (10). On oletatud, et see piirkond toimib kontrollitud domeenina (10) ja meie andmed näitavad, et selle domeeni haigusi põhjustavatel mutantidel on tõepoolest suurenenud membraani sidumine tingimustes, mis toetavad katioonikanali aktiivsust ja suurendavad katioonikanali aktiivsust. Üks tõlgendus on see, et C-terminaalne domeen pärsib katioonide permeaasi aktiivsuse jaoks vajalikku membraani assotsiatsiooni / sisestamist ja selle domeeni mutatsioon lõdvestab seda supressiooni.

Cistanche saab ravidaneerudhaigus

Membraani sidumise tähelepanekutel on täiendavad tagajärjed ja need valgustavad anioonide ja katioonide läbilaskvuse aktiivsuse vahelise seose mõningaid aspekte. Leiame, et optimaalsete anioonide permeaasi aktiivsuse tingimustes (pH 5.0) seondub membraanidega oluliselt rohkem valku kui katioonide permeaasi aktiivsust toetavate optimaalsete sidumistingimuste korral (pH 6.0), ja see kehtib kõigi kohta. isovormid (joonis 5). Pange tähele anioonide permeaasi aktiivsuse (joonis 2D) ja katioonipermeaasi aktiivsuse membraani sidumise etapi (joonis 4C) pH-tundlikkuse erinevust (joonis 4C): anioonide permeaas suureneb dramaatiliselt alla pH 6, samas kui membraani sisestatud valgu võime katiooni toetada läbilaskvuse aktiivsus langeb märkimisväärselt. Meie varem avaldatud andmed näitasid, et G0 stabiilne membraani assotsiatsioon tõuseb oluliselt, kui pH langeb samasse pH vahemikku ja see on vahemik, kus sisemine valgu fluorestsents on kõige dramaatilisemalt alla surutud (9), mis näitab olulist üleminekut valgu struktuuris. . Kokkuvõttes näitavad andmed, et membraani sisestamine pH 6 juures.{12}} erineb põhimõtteliselt membraani sisestamisest pH 5 juures.0. pH väärtusel 6.{16}} seostub väiksem osa valkudest membraanidega, millega kaasneb vaid väike muutus sisemises fluorestsentsis ja piiratud anioonide läbilaskvus, kuid võime minna üle katiooniläbilaskvasse vormi, kui cis-sektsioon tiitritakse pH-ni 7 .5. Lisaks on selle seondumise efektiivsus suurem haigusega seotud variantide puhul, mis on paralleelne suurenenud katioonpermeaasi aktiivsusega pärast pH muutust. Seevastu pH väärtusel 5.{21}} seostub membraanidega palju suurem osa valku; selle seondumisega kaasneb suur muutus sisemises fluorestsentsis ja palju suurema anioonipermeaasi aktiivsus. Ei membraani sidumine ega anioonipermeaasi aktiivsus ei erine isovormide vahel. Selle sisestatud valgu võime minna üle katioonide permeaasi kinnitusele on oluliselt vähenenud. Hüpoteesime, et varem teatatud sisemise fluorestsentsi muutus, kui pH langeb 6-lt 5-le, peegeldab struktuurset transformatsiooni vormi, mis ei ole võimeline üle minema katioonide permeaasi konformatsioonile, ja erinevused isovormide vahel ei mõjuta selle konformatsiooni ioonide läbilaskvusomadusi.

Täiendav uudne tähelepanek on see, et kaltsiumi- ja magneesiumiioonid on võrdselt tõhusad ApoL1 katioonikanali aktiivsuse toetamisel. See viitab tugevalt sellele, et kahevalentse katiooni roll ei seisne valgu kõrge afiinsusega seondumises, vaid tõenäoliselt vähem spetsiifilises laengusillas, mis võimaldab negatiivselt laetud valkudel suhelda fosfolipiidmembraanide negatiivselt laetud pinnaga.

Avaldatud on ka teisi uuringuid, mis hindavad ApoL1 isovormide ioonikanali aktiivsuse erinevusi. Thompson ja Finkelstein (8) kasutasid puhastatud rekombinantse ApoL1 kanali aktiivsuse hindamiseks elektrofüsioloogilisi meetodeid tasapinnaliste lipiidide kahekihiliste tehnikatega, teatades, et isovormide kanali omadustes ei esinenud erinevusi. Oluline on märkida, et tasapinnalised lipiidide kahekihilised meetodid ja vesiikulipõhised väljavoolutestid, kuigi mõlemad on kanalitestid, annavad erinevat tüüpi teavet ja neid võib pidada täiendavateks eksperimentaalseteks süsteemideks. Lipiidide kahekihilised meetodid on võrreldamatu lähenemisviis puhastatud valgu ühe kanaliga omaduste määratlemiseks, kuid need on vähem võimsad vahendid spetsiifilise aktiivsuse kvantifitseerimiseks, samas kui vesiikulite väljavoolu testid võivad anda kvantitatiivseid andmeid populatsiooni aktiivsuse kohta, kuid vähe teavet ühe kanali omaduste kohta. Seega ei ole Thomp soni ja Finkelsteini tähelepanekud meie omadega vastuolus, mis samuti ei näita ilmseid erinevusi kanali olemuslikes omadustes, vaid ainult umbes kahekordset erinevust spetsiifilises aktiivsuses, mille erinevus on üsna raske. tuvastada lipiidide kahekihilistes süsteemides.

Puhastatud valku ja lipiide kasutavatel uuringutel on omadus paljastada omadusi, mis on selgelt tingitud valgust endast ja mida ei muuda ükski teine ​​komponent, ekspressioonikineetika ega membraanikaubandus, mis kompromiteerib keerukamaid süsteeme. Siiski on nad paratamatult vaikivad nende tegevuste lõplikust mõjust elusrakkudele. On teatatud uuringutest, milles kasutati rakupõhiseid ekspressioonisüsteeme ApoL1 ioonkanalite aktiivsuse kõrvaldamiseks (vaadatud Friedman ja Pollak, 2019 (3)). Olabisi jt (11) ekspresseerisid HEK-rakkudes ApoL1 isovorme ja hindasid rakusisese kaaliumi püsikontsentratsiooni. Nad leidsid madalamat intratsellulaarset kaaliumisisaldust G1 ja G2 ekspresseerivates rakkudes võrreldes G0 ekspresseerivate rakkudega. Kuigi see tähelepanek võib olla kooskõlas plasmamembraani K suurenenud läbilaskvusega, võib madalam rakusisene K olla ka variandi suurema tsütotoksilise toime mittespetsiifiline tagajärg mis tahes mehhanismi kaudu, mis põhjustab vähem aktiivset NaK ATPaasi aktiivsust ja/või plasmamembraani terviklikkuse lagunemist. O'Toole jt. (12) kalibreeris hoolikalt ekspressioonitasemed HEK-rakkudes ja hindas plasmamembraani katioonikanali aktiivsust, leides isovormide vahel erinevusi. Shah et al. (13) teatas ApoL1 sihtimisest mitokondritele, kus haigusega seotud variandid kutsusid esile mitokondriaalse läbilaskvuse üleminekupooride avanemise, mis on kooskõlas hiljutiste tõenditega trüpanosoomi tsütotoksilisuse kohta. Kas see efekt nõuab ApoL1 ioonkanali aktiivsust, on ebaselge. Kõigi nende uuringute puhul ei saa rakupõhiste ekspressioonisüsteemide keerukuse tõttu olla kindel, kas täheldatud erinevused on tingitud valgu olemuslikest omadustest või teistest rakkudes esinevatest interakteeruvatest komponentidest.

Patogeensed funktsioonivõimenduse mutatsioonid näitavad tavaliselt domineerivat pärilikkusmustrit, samas kuineeruhaiguse fenotüüpApoL1 variantidega seotud on retsessiivne. Üks mehhanism, mille abil funktsiooni suurenemise mutatsioon võib olla retsessiivne, on see, kui valk toimib homomultimeerina ja WT võib avaldada aktiveeritud variandile domineerivat negatiivset mõju. Kas ApoL1 toimib kanalina monomeeri või multimeerina, pole praegu teada.

Meie andmed viitavad sellele, et suurenenud katioonide läbilaskvus, valgu ekspressiooni tase võib kaasa aidata tsütotoksilisusele podotsüütides või teistes rakkudes. Siiski võib tunduda tõenäoline, et pelgalt kahekordne aktiivsuse suurenemine võib näiliselt healoomulise molekuli muuta üheks tõukehaiguseks. Sellegipoolest kipuvad ApoL1 variantidega seotud haigused aeglaselt progresseeruma ja pikema aja jooksul (kuudest aastateni) esinevatel väikestel erinevustel võib olla suur kumulatiivne mõju. Muud potentsiaalsed ApoL1 toimemehhanismid, mis vastutavadneerudvigastuson välja pakutud ja neid toetavad tõendid (3–5, 11–16), sealhulgas mõju apoptoosile, autofagiale, mitokondriaalsele funktsioonile, rakusisese membraaniga kaubitsemisele ja rakuväliste signaalimolekulide vahendavale toimele. Siin kirjeldatud ApoL1 kanali aktiivsuse erinevuste suhteline tähtsus võrreldes teiste potentsiaalsete toimemehhanismidega haiguse juhtimisel tuleb veel kindlaks teha.

Cistanche saab ravidaneerudhaigus

Eksperimentaalsed protseduurid

Väljenduskonstruktsioonid

N-terminaalset 6His ja T7 epitoopmärgisega ApoL1 (G0 versioon) kodeerivat pET-ApoWT-d on varem kirjeldatud (9). Kodeeritud valk on identne Genbanki juurdepääsunumbriga #BC143038 (haplotüüp 150K, 228I, 255K) aminohappest 28 kuni 398, kõrvaldades signaaljärjestuse aminohapetes 1-27 ja lisades N-terminaalse {{ 17}}PET28a plasmiidi poolt kodeeritud His ja T7 epitoop. G1 ja G2 variante kodeerivad plasmiidid genereeriti pET-ApoWT-st, asendades AleI restriktsioonifragmendi XhoI-ga fragmentidega, mis sisaldasid variantjärjestusi, mis sünteesiti Integrated DNA Technologies, Coralville, IA abil, ja saadud plasmiidide identsus kinnitati otsese sekveneerimisega. Kõik kolm konstrukti olid identsed, välja arvatud S342G ja I384M aminohappe asendused G1 isovormis ja seejärel N388-Y389 deletsioon G2 isovormis. Rekombinantsed ApoL1 isovormid ekspresseeriti bakterites ja puhastati nagu kirjeldatud (8), välja arvatud see, et S200 kolonni puhver sisaldas 0,03 protsenti n dodetsüül- -D-maltosiidi (DDM) (Millipore-Sigma). Kõigi isovorme võrdlevate katsekomplektide jaoks valmistati materjalid ette samaaegselt identsetes tingimustes, kasutades samu reagente. Valgu kontsentratsioon määrati BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) abil, kasutades veisevere albumiini standardit. Koguvalgu jaoks, nagu joonisel 1, värviti geelid Instant Blue värviga (Expedeon Inc). S200 puhvris olev valk külmutati kiirkülmutati vedelas lämmastikus ja säilitati temperatuuril –80 C. Alikvoodid sulatati jääl ja lahjendati S200 puhvris enne teste.

Ionofoorid

Valinomütsiin (Millipore Sigma) lahustati 50 mM absoluutse etanooli juures ja lahjendati 1 mM absoluutses etanoolis vahetult enne kasutamist. Chloride Ionophore 1 (MilliporeSigma) lahustati 100 mM 1-heksanoolis ja lahjendati 0,2 mM absoluutses etanoolis vahetult enne kasutamist.

Membraani vesiikulid

Asolektiin (sojaoa II tüüpi fosfatidüülkoliin, Sigma) ekstraheeriti atsetooniga, nagu kirjeldatud (30), kuivatati, seejärel lahustati kloroformis ja säilitati temperatuuril –20 °C. Fosfolipiidide alikvoot kloroformis kuivatati lämmastikuvoolus ja suspendeeriti. 20 mg/ml 200 mM KCl-s, 5 mM HEPES-s pH 8,0 viie külmutamis-sulatamise tsükliga ja intensiivselt segades. Seda suspensiooni hoiti –20 kraadi juures. Ligikaudu 200 nm läbimõõduga KCl-ga laetud unilamellaarsete vesiikulite genereerimiseks lasti lipiidisuspensioon 15 korda läbi 200 nm poorse polükarbonaadi membraanfiltri, kasutades ekstruuderikambrit (Avanti Polar Lipids) ja tootja poolt antud protokolli (17, 18). Ekstrudeeritud vesiikulid hoiti jääl ja kasutati 24 tunni jooksul.

Aktiivsuse analüüsid

Ioonide permeaasi aktiivsuse testid, milles kasutati kloriidi selektiivse elektroodi abil tuvastatud membraanipotentsiaaliga juhitud KCl väljavoolu, viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud (9). Lisatakse 20 mikroliitrit ApoL1 S200 puhvris (15{{20}} mM NaCl, 10 mM Tris pH 8,3, 0,3 protsenti DDM). kuni 380 ul reaktsioonisegu, mis sisaldas 82 mM KCl, 127 mM sahharoosi, 42,1 mM puhvrit näidatud pH juures (MES pH 5–6,5, HEPES pH 7,0–8,0 jaoks), 2,63 mMCa (glükonaati)2 ja 1,84 mg/ml ekstraheeritud isolektiini vesiikulid. Segu inkubeeritakse toatemperatuuril 4 minutit, enne kui see lastakse läbi 3 ml Bio-Gel P-6DG (Bio-Rad) spinkolonni, mis on tasakaalustatud 330 mM sahharoosiga. Eluaat lisatakse viivitamatult 2 ml 330 mM sahharoosile, 10-5 M KCl-le, 2,5 mM Ca(glükonaat)2-le ja 10 mM puhvrile (MES pH 5–6,5 jaoks; HEPES pH 7–8 korral). pideva jälgimisega kloriidi selektiivse elektroodiga ja registreeriti vastavalt kirjeldusele. 20 sekundi pärast käivitati pingepõhine väljavool ionofoori lisamisega (2,5 ul kas 1 mM valinomütsiini või 0,2 mMChloride Ionophore 1 etanoolis) ja lasti toimida 30 sekundit millele järgnes Triton X-100 lisamine 0,1 protsendini, et vabastada allesjäänud intravesikulaarne kloriid. Toorandmed mV-des teisendati Cl kontsentratsiooniks, kasutades elektroodi jaoks testi tingimustes genereeritud standardkõverat. Kloriidi vabanemise esialgne fraktsionaalne kiirus tuletati 3 sekundist ionofoori lisamise maksimaalse kohese reaktsiooni ajal.

Kõik aktiivsuse võrdlused viidi läbi, kasutades kolme isovormi samaaegsete preparaatide materjali, mis oli enne analüüsi lahjendatud 100 ug/ml valguni S200 puhvris. Kõik testid, mida kasutati variantide vahetuks võrdlemiseks, viidi läbi samal päeval, kasutades samu värskelt valmistatud reaktiive.

Membraani assotsiatsiooni test

Membraaniassotsiatsiooni testid viidi läbi eraldi Cl permeaasi aktiivsuse ja K permeaasi aktiivsuse jaoks optimaalsetes tingimustes. Clpermeaasi aktiivsust toetavate seisundite korral 5 ul 100 ug/ml valku 1{{30}} mM Tris pH8,2-s, 150 mM NaCl-s , 0,03 protsenti DDM-i lisati 95 ul reaktsioonisegule (3,4 mg/ml isolektiini vesiikulid (laetud 200 mM KCl-ga, 5 mM HEPES, pH 8), 20 mM MES pH 5,0, 2,5 mM Ca(glükonaat) 2, 100 mM KCl, 100 mM sahharoosi) ja inkubeeriti toatemperatuuril 1 minut. Valkude ja lipiidide suhe testis on 1:680 mass/mass. Proov lahjendati ilma pH-nihketa, lisades 200 ul 60 mM MES pH 5,0, 2,5 mMCa(glükonaati)2, 100 mM KCl, 100 mM sahharoosi ja inkubeeriti 20 sekundit. Lisati sada mikroliitrit 8 M uureat, segati ja inkubeeriti seejärel toatemperatuuril 15 minutit. Sahharoosi kontsentratsioon viidi 40 protsendini, lisades 1,6 ml 50-protsendilist sahharoosi. 2 ml proovi kanti alla 1 ml 30% sahharoosi 8 mM MES-s pH 5,0, mis omakorda oli alla 1,7 ml sahharoosivaba 8 mM MES pH 5,0. Järsu gradiente tsentrifuugiti 200,{56}}g juures Beckman Coulter TLA-110rootoris 90 minutit temperatuuril 4 °C. Vesiikulid koguti 0 kuni 30% sahharoosi liidesest. Proovide võrdsed fraktsioonid lahjendati 4 korda ja tsentrifuugiti 100,{64}}g juures 1 tund. Membraanigraanulid kuivatati, eraldati SDS-PAGE abil, blotiti polüvinülideenfluoriidmembraanile ja sondeeriti Western blotting'iga T7 epitoobi vastaste antikehadega (MilliporeSigmaproduct nr 69522-3) kemoluminestsentsi tuvastamisega, kasutades digitaalset kuvamissüsteemi. Puhastatud valgu seerialahjendused lisati geelile, et luua iga valgu jaoks isotüübi- ja blot-spetsiifiline standardkõver.

K-permeaasi aktiivsust toetavate tingimuste korral lisati 5 ul 100ug/ml valku 10 mM Tris-s pH 8,2, 150 mM NaCl, 0,03 protsenti DDM-is 95 ul reaktsioonisegu (3,4 ug/ml isolektiini vesiikulid (laetud 200 mM KCl-ga, 5 mM HEPES-iga, pH 8), 20 mM MES-iga, pH 6,0, 2,5 mM Ca(glükonaat)2, 100 mM KCl, 100 mM sahharoosi) ja inkubeeriti toatemperatuuril 1 min. Proov lahjendati pH nihkega 7,5-ni, lisades 200 ul 60 mM HEPES pH 8,0, 2,5 mM Ca(glükonaati) 2100 mM KCl, 100 mM sahharoosi ja inkubeeriti 20 sekundit. Lisati sada mikroliitrit 500 mM Na2CO3 ja inkubeeriti toatemperatuuril 15 minutit. Sahharoosi kontsentratsioon viidi 40 protsendini, lisades 1,6 ml 50 protsenti sahharoosi. 2 ml proovi kanti alla 1 ml 30% sahharoosi lahusesse 8 mM Tris pH 8,3, mis omakorda oli alla 1,7 ml sahharoosivaba 8 mM Tris pH 8,3. Sahharoosipadjad tsentrifuugiti ja proov koguti ja töödeldi ülaltoodud viisil.

Statistika

Andmekogumite keskmiste paaride vaheliste erinevuste olulisus määrati dispersioonanalüüsi (ANOVA) (19) abil. Statistilised parameetrid määrati Excelisse manustatud funktsiooni abil. P väärtused arvutati saidi socscistatistics.com abil. Kõik andmepunktid on esitatud kui keskmine ± standardhälve (SD), mis on määratud Exceli funktsiooniga STDEV.S iga üksiku koopiarühma jaoks.

Andmete kättesaadavus Kõiki seda artiklit toetavaid andmeid jagatakse taotluse korral dr John C. Edwardsile, john.edwards@health.slu.edu.

Cistanche saab ravidaneerudhaigus

Tänuavaldused— Täname Saint Louisi ülikooli nefroloogia osakonda ja sisehaiguste osakonda selle töö tegemiseks vajaliku toetuse eest.

Autorite kaastööd— JCE kavandas ja juhendas uuringut, tagas rahastamise, viis läbi väljavoolutestid, tõlgendas andmeid ja kirjutas töö; JB puhastas valgud, viis läbi membraaniassotsiatsiooni testid, tõlgendas andmeid, valmistas ette joonised ja redigeeris paberit.

Rahastamine ja lisainfo-Tööd rahastati Saint Louis'i ülikooli institutsionaalsetest ressurssidest ja riiklike tervishoiuinstituutide toetus R01 DK120651 JCE-le Selle artikli sisu eest vastutavad ainult autorid ja see ei esinda tingimata riiklike terviseinstituutide ametlikke seisukohti.

Huvide konflikt—Autorid kinnitavad, et neil ei ole selle artikli sisuga huvide konflikti.

Lühendid— Kasutatud lühendid on: ApoL1, apolipoproteinL1; CI1, kloriidionofoor 1; DDM, n-dodetsüül- -D-maltosiid; PVDF, polüvinülideenfluoriid; SD, standardhälve; Val, valinomütsiin.

Saatja: 'Neer-haigusApolipoproteiin L1 -seotud variandid näitavad katioonikanali aktiivsuse funktsiooni suurenemistJonathan Bruno ja John C. Edwards

---J. Biol. Chem. (2021) 296 100238

Viited

1. Genovese, G., Friedman, DJ, Ross, MD, Lecordier, L., Uzureau, P., Freedman, BI, Bowden, DW, Langefeld, CD, Oleksyk, TK, Uscinski Knob, AL, Bernhardy, AJ, Hicks, PJ, Nelson, GW, Vanhollebeke, B., Winkler, CA jt. (2010) Trüpanolüütiliste ApoL1 variantide assotsiatsioonneerudhaigusafroameeriklastel. Teadus 329, 841–845
2. Parsa, A., Kao, WH, Xie, D., Astor, BC, Li, M., Hsu, CY, Feldman, HI, Parekh, RS, Kusek, JW, Greene, TH, Fink, JC, Anderson , AH, Choi, MJ, Wright, JT, Jr., Lash, JP jt. (2013) APOL1 riskivariandid, rass ja kroonilise haiguse progresseerumineneerudhaigus. N. Ingl. J. Med. 369, 2183–2196
3. Friedman, DJ ja Pollak, MR (2020) APOL1 janeerudhaigus: Geneetikast bioloogiani. Annu. Rev. Physiol. 82, 323–342
4. Bruggeman, LA, O'Toole, JF ja Sedor, JR (2017) APOL1 rakusisese funktsiooni tuvastamine. J. Am. Soc. Nephrol. 28, 1008–1011
5. Kopp, JB, Roshanravan, H. ja Okamoto, K. (2018) Apolipoprotein L1 nephropathies: 2017 in review. Curr. Arvamus. Nephrol. Hüpertensioon. 27, 153–158
6. Perez-Morga, D., Vanhollebeke, B., Patriaux-Hanocq, F., Nolan, DP, Lins, L., Homble, F., Vanhamme, L., Tebabi, P., Pays, A., Poelvoorde, P., Jacquet, A., Brasseur, R. ja Pays, E. (2005) Apolipoproteiin LI soodustab trüpanosoomi lüüsi, moodustades poorid lüsosoomimembraanides. Teadus 309, 469–472
7. Harrington, JM, Howell, S. ja Hajduk, SL (2009) Membraanide permeabiliseerimine trüpanosoomi lüütilise faktoriga, inimese tsütolüütilise suure tihedusega lipoproteiiniga. J. Biol. Chem. 284, 13505–13512
8. Thomson, R. ja Finkelstein, A. (2015) Inimese trüpanolüütiline faktor APOL1 moodustab tasapinnalistes lipiidide kaksikkihtides pH-ga reguleeritud katioonselektiivseid kanaleid: olulisus trüpanosoomi lüüsi jaoks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112, 2894–2899
9. Bruno, J., Pozzi, N., Oliva, J. ja Edwards, JC (2017) Apolipoproteiin L1 annab fosfolipiidvesiikulitele pH-switchable ioonide läbilaskvuse. J. Biol. Chem. 292, 18344–18353
10. Vanhollebeke, B. ja Pays, E. (2006) Apolipoproteiinide funktsioon L. Cell Mol. Life Sci. 63, 1937–1944
11. Olabisi, OA, Zhang, JY, Verplank, L., Zahler, N., DiBartolo, S., 3., Heneghan, JF, Schlondorff, JS, Suh, JH, Yan, P., Alper, SL, Friedman, DJ ja Pollak, MR (2016) APOL1neerudhaigusriskivariandid põhjustavad tsütotoksilisust, kahandades raku kaaliumisisaldust ja indutseerides
stressiga aktiveeritud proteiinkinaasid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113, 830–837
12. O'Toole, JF, Schilling, W., Kunze, D., Madhavan, SM, Konieczkowski, M., Gu, Y., Luo, L., Wu, Z., Bruggeman, LA ja Sedor, JR (2018) ApoL1 üleekspressioon põhjustab variandist sõltumatut tsütotoksilisust. J. Am. Soc. Nephrol. 29, 869–879
13. Shah, SS, Lannon, H., Dias, L., Zhang, JY, Alper, SL, Pollak, MR ja Friedman, DJ (2019) APOL1neerudriskivariandid kutsuvad esile rakusurma mitokondriaalse translokatsiooni ja mitokondriaalse läbilaskvuse üleminekupoori avamise kaudu. J. Am. Soc. Nephrol. 30, 2355–2368
14. Hayek, SS, Koh, KH, Grams, ME, Wei, C., Ko, YA, Li, J., Samelko, B., Lee, H., Dande, RR, Lee, HW, Hahm, E. , Peev, V., Tracy, M., Tardi, NJ, Gupta, V., et al. (2017) SuPAR-i, APOL1 riskivariantide ja alfavbeta3 integriini kolmepoolne kompleks podotsüütidel vahendab kroonilistneerud haigus. Nat. Med. 23, 945–953
15. Ma, L., Chou, JW, Snipes, JA, Bharadwaj, MS, Craddock, AL, Cheng, D., Weckerle, A., Petrovic, S., Hicks, PJ, Hemal, AK, Hawkins, GA, Miller, LD, Molina, AJ, Langefeld, CD, Murea, M. jt. (2017) APOL1 neeruriskiga variandid kutsuvad esile mitokondriaalse düsfunktsiooni. J. Am. Soc. Nephrol. 28, 1093–1105
16. Wan, G., Zhaorigetu, S., Liu, Z., Kaini, R., Jiang, Z. ja Hu, CA (2008) Apolipoprotein L1, romaan Bcl-2 homoloogiadomeen {{4 }}ainult lipiide siduv valk, kutsub esile autofagilise rakusurma. J. Biol. Chem. 283, 21540–21549
17. Hope, MJ, Bally, MB, Webb, G. ja Cullis, PR (1985) Suurte unilamellaarsete vesiikulite tootmine kiire ekstrusiooniprotseduuri abil: suurusjaotuse, lõksu mahu ja membraanipotentsiaali säilitamise võime iseloomustus. Biochim. Biophys. Acta 812, 55–65
18. Olson, F., Hunt, CA, Szoka, FC, Vail, WJ ja Papahadjopoulos, D. (1979) Määratletud suurusjaotusega liposoomide valmistamine ekstrusiooni teel läbi polükarbonaatmembraanide. Biochim. Biophys. Acta 557, 9–23
19. Armitage, P. (1971) Statistical Methods in Medical Research, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Ühendkuningriik