Karnovski fiksatiiv hoiab ära artefaktide ilmnemise vakuolatsioonina, mis tuleneb kudede töötlemisest antisenss-oligonukleotiidiga töödeldud neerudes Ⅰ

Abstraktne: Antisenss-oligonukleotiid(ASO) ravimeetodid on tuvastatud kui uus ravimeetodravitavad haigused. sisseASO-dega ravitud neerud, vaakumid, lisaks basofiilsetele graanulitele, on sageli täheldatud proksimaalsetes tuubulites. Mõnedes aruannetes on kirjeldatud, et need vakuoolid on tõenäoliselt sekundaarne nähtus, mis tulenebASOde kaevandaminekudede töötlemise ajal. Selles uuringus võrdlesime neerude morfoloogiat pärast fikseerimist Karnovsky fikseeriva või 4% paraformaldehüüdfosfaatpuhvriga (PFA) 10% neutraalse puhverdatud formaldehüüdi lahuse (NBF) omaga. Uuriti emaseid Sprague-Dawley rotte, keda töödeldi intravenoosselt neli korda 50 mg/kg lukustatud nukleiinhappega, mis sisaldas antisenss-oligonukleotiide (LNA-ASO-sid) 1 või 2 nädala jooksul. Mikroskoopiliselt täheldati NBF-ga fikseeritud neerudes proksimaalsetes tuubulites vakuoole ja basofiilseid graanuleid. Basofiilsed graanulid näitavad ASO-de kuhjumist. Veelgi enam, mõned vakuoolid sisaldasid ka nõrku basofiilseid graanuleid, mis viitab sellele, et vakuoolid olid olulised ASO-de akumuleerumisel. Kuigi proksimaalsetes tuubulites täheldati mõõdukat vakuolatsiooni, oli suurem osa vakuoleerunud epiteelitest immunohistokeemilisel värvimisel neerukahjustuse molekuli -1 suhtes negatiivsed. Karnovski fikseeritud proovides proksimaalsetes tuubulites vakuoole ei täheldatud, kuigi täheldati basofiilseid graanuleid. PFA-ga fikseeritud proovides täheldati proksimaalsetes tuubulites vakuoole ja basofiilseid graanuleid, mis on sarnased NBF-i fikseeritud proovide omadega. Üldiselt näitasid meie leiud tavapärase NBF-i fikseerimise kasutamisel koetöötluse käigus tekkinud artefaktide tõttu vakuolatsiooni ülehindamise võimalust. Karnovski fiksaatorit peetakse kasulikuks alternatiiviks kunstlike vakuoolide eristamisel tõelisest nefrotoksilisusest. (DOI: 10.1293/tox.{11}}; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Märksõnad:antisenss-oligonukleotiid, artefakt,Karnovski fiksaator, vakuolatsioon, basofiilne graanul, neer

Cistanche toidulisand neerufunktsiooni toetav toidulisand PhGs75% Ech 30% Act 12%

Hiljuti hakati kasutama antisenss-oligonukleotiidi (ASO) teraapiaid kui uusi meetodeid raskete haiguste raviks1, 2. ASO-d on lühikesed, sünteetilised, üheahelalised oligodesoksünukleotiidid, mis seonduvad ribonukleiinhappega ja pärsivad geeniekspressiooni3.

Toksikoloogiliselt liigitatakse ASO-indutseeritud toksilisus hübridisatsioonist sõltuvaks toksilisuseks, mis on seotud ASO järjestusega, ja hübridisatsioonist sõltumatuks toksilisuseks, mis on seotud keemilise modifikatsiooniga. Hübridisatsioonist sõltumatut toksilisust kutsuvad esile kolm peamist mehhanismi: 1) ASO akumuleerumine, 2) põletikueelsed toimed ja 3) aptameersed seondumisefektid4. ASO-de kogunemist täheldatakse peamiselt maksas ja neerudes ning liigne akumuleerumine põhjustab nende organite talitlushäireid5. Põletikueelset toimet indutseerib kaasasündinud immuunsüsteemi stimuleerimine näriliste ja ahvide Toll-sarnaste retseptoritega seondumise kaudu või alternatiivse komplemendi raja aktiveerimine H faktori pärssimise kaudu ASO-de poolt ahvidel6. Aptameerne seondumisefekt kutsub esile trombotsüütide aktivatsiooni ja agregatsiooni/trombotsütopeenia, et seonduda trombotsüütide-spetsiifilise retseptoriga7. Veelgi enam, aptameerset seondumist intratsellulaarsete valkudega hepatotsüütides peetakse üheks hepatotoksilisuse põhjuseks 8–10. Nende toksilisuse tuvastamiseks on teadlased välja töötanud mitu mittekliinilist analüüsi; nende hulgas on histopatoloogiline uuring üks tundlikumaid teste ASO akumulatsiooni tuvastamiseks.

Histopatoloogiliselt täheldatakse ASO-de akumuleerumist tavaliselt basofiilsete graanulitena maksa Kupfferi rakkude tsütoplasmas või neerude proksimaalsetes tuubulites. Basofiilsete graanulite silmapaistev kuhjumine on korrelatsioonis degeneratiivsete muutuste esinemissageduse või raskusastmega, mida tavaliselt täheldatakse neerude proksimaalse tubulaarse epiteeli vakuolatsiooni või degeneratsiooni/nekroosina4. Basofiilseid graanuleid üksi ei peeta toksikoloogiliselt olulisteks11; seetõttu on ASO-ga seotud toksilisuse hindamiseks oluline basofiilsete graanulite akumuleerumise eristamine degeneratiivsetest muutustest.

Vakuoolid, mida sageli täheldatakse ASO-ga ravitud makaakide neerude proksimaalsetes tuubulites, sisaldavad basofiilset materjali ja nende üldine jaotus rakkudes on samasugune kui basofiilsed graanulid11, 12. Mõned aruanded on näidanud, et fikseerimisprotsess võib mõjutada ASO akumuleerumise ilmnemine fagolüsosomaalses sektsioonis5, 11. Lisaks Henry et al. ja Engelhardt kirjeldasid, et vakuoolid proksimaalsetes tuubulites on tõenäoliselt sekundaarne nähtus, mis tuleneb ASO-de ekstraheerimisest töötlemise ajal, kuna vakuoolid puuduvad paraformaldehüüdi/glutaraldehüüdi perfusiooniga fikseeritud neerudes5, 11. Vakuoolid proksimaalsetes tuubulites ahvidel ravitud makaagidel spekuleeriti, et mipomerseenid ilmnevad fikseerimisprotsessi ajal13.

Seega, kuigi ASO-ravist tingitud vakuolatsioon võib mõnel juhul olla artefakt, ei ole see hüpotees selgelt tõestatud ja ükski aruanne ei ole tuvastanud toksikoloogiliseks hindamiseks sobivat fikseerimismeetodit. Sellest lähtuvalt võrdlesime selles uuringus neerude morfoloogiat pärast fikseerimist Karnovsky fikseeriva või 4% paraformaldehüüdfosfaatpuhvriga (PFA) 10% neutraalse puhverdatud formaldehüüdi lahuse (NBF) omaga. Lisaks demonstreerisime Karnovsky fiksaatori kasulikkust alternatiivse fiksaatorina, et vältida artefaktidest tulenevat vakuolatsiooni.

Neljanädalased emased Sprague-Dawley rotid osteti ettevõttelt Charles River Laboratories Japan Inc. (Kanagawa, Jaapan) ja aklimatiseeriti laboritingimustega. Loomi peeti kontrollitud tingimustes (12-tunnine valguse/pimeduse tsükkel, temperatuur 23 ± 2 kraadi, suhteline õhuniiskus 50 ± 25%) ja neile võimaldati vaba juurdepääs standardsele kaubanduslikule dieedile (autoklaavitud CR-LPF; Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo, Jaapan) ja kraanivesi. Kakskümmend looma jaotati järgmisse nelja rühma (igaüks viis looma): 1-nädalane soolalahusega töödeldud rühm (kontroll- 1W), 2-nädalane soolalahusega töödeldud rühm (kontroll {14}}W), 1-nädala lukustatud nukleiinhapet, mis sisaldab antisenss-oligonukleotiidi (LNA-ASO) töödeldud rühm (ASO-1W) ja 2-nädalane LNA ASO-ga töödeldud rühm (ASO-2W). Loomad olid 50 mg/kg LNA-ASO manustamise alustamise ajal 5 nädala vanused. LNA-ASO-d manustati intravenoosselt kokku neli korda vastavalt järgmisele skeemile: 1., 4., 8. ja 11. päeval ASO-2W rühmas; ja 1., 2., 3. ja 4. päevad ASO-1W rühmas. Kontroll-1W ja ASO-1W rühmade loomad surmati 7. päeval. Kontroll-2W ja ASO-2W rühmade loomad surmati päeval. 14. Igal lõplikul lahkamisel võeti isofluraaniga sügava anesteesia all kõhuõõnesveenist kliinilise patoloogia tuvastamiseks vereproovid. Pärast vereproovide võtmist surmati kõik rotid veretustamise teel, lõigates koheselt kõhuaordi. Makroskoopiliselt uuriti keha välispinda, rinna- ja kõhuõõnesid ning siseelundeid ning vasakpoolsed neerud eemaldati ja töödeldi mikroskoopiliseks uurimiseks. Kõik protseduurid viidi läbi vastavalt Mitsubishi Tanabe Pharma Corporationi katseloomade söötmise ja ladustamise ning loomkatsete reeglitele.

Seerumiproovid saadi vereproovide tsentrifuugimisel 4 kraadi juures. Seerumi biokeemiline analüüs viidi läbi TBA-2000FR-seadmega (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, Jaapan), et hinnata vere uurea lämmastiku (BUN) ja kreatiniini (CRE) taset.

Neerud fikseeriti kolme fikseerimislahusega järgmiselt: Pärast neeru jagamist risti kolmeks segmendiks fikseeriti keskmine osa, sealhulgas neeruvaagna, 10% NBF-s 5 päevaks; kraniaalne osa fikseeriti Karnovski fiksaatoris (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tokyo, Jaapan); ja kaudaalne osa fikseeriti 4% PFA-s 17 tundi 4 kraadi juures ja asetati seejärel 24 tunniks 10% NBF-i. Iga fikseeritud proov dehüdreeriti ja sisestati parafiini. Hematoksüliini ja eosiini (H&E) värvimiseks valmistati koelõigud. Immunohistokeemiline värvimine viidi läbi, kasutades antikehi, mis on suunatud neerukahjustuse molekulile -1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA; lahjendus 1:300) ja lüsosoomiga seotud membraanivalku 2 (LAMP{{). 13}} Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA lahjendus 1:1000) pärast antigeeni otsimist (tsitraatpuhver, pH 6,0, kuumutatakse 10 minutit või kuumutatakse rõhu all 20 minutit); Sekundaarse antikehana kasutati Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Jaapan).

Wecistanche'i tugiteenus:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Lisateabe saamiseks ostke:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-pood