Raua lisamine aeglustab vananemist ja pikendab rakkude eluiga mitokondriaalse funktsiooni võimendamise kaudu Ⅱ
Mar 23, 2023
3.2. Raualisandid suurendavad oksüdatiivse stressi vastupidavust
Rakkude vananemine on seotudsuurenenud oksüdatiivne stressmis kahjustab bioloogilisi süsteeme ja leevendab vanusega seotud haigusi [34]. Kuna raua lisamine aeglustab vananemist, uurisime selle mõjuoksüdatiivne stress. Kasutasime anoksüdatiivne stressindutseeriv ühend, vesinikperoksiid (H2O2), et testida rakkude oksüdatiivset vastupidavust. Rakke kasvatati esmalt raua juuresolekul statsionaarse faasi faasini (72 tundi) SD söötmes. Pärast seda pesti rakke ja inkubeeriti erinevate kontsentratsioonidega H2O2 YPD söötmes ja kasvas 24 tundi.Oksüdeerivstressiresistentsust analüüsiti, võrreldes H2O2--ga töödeldud rakkude kasvu töötlemata kontrolliga. Leidsime, et rauaga täiendatud rakud olid kontrolliga võrreldes resistentsed oksüdatiivse stressi suhtes (joonised2a ja S3). Kinnitamaks, et raua lisamine tagab resistentsuse oksüdatiivse stressi suhtes, lisati BPS-i rauale ja rakkude kasvule H2O2 analüüsiti. BPS-i lisamine vähendas rauaga täiendatud rakkude oksüdatiivset stressiresistentsust (joonis2b). Need tulemused on korrelatsioonis raualisandi rolliga vananemise edasilükkamisel ja rakkude eluea pikendamisel.
3.3. Raua lisamine võimendab mitokondriaalseid funktsioone
Mitokondrid on peamine rakuline raua kasutamise ja metabolismi keskus [35–38]. Mitokondriaalsete funktsioonide langus on seotud vananemisega [39–43]. Raud toimib mitme mitokondriaalse valgu, sealhulgas raua-väävli klastrite ja heemi sisaldavate valkude kofaktorina [44–46]. Need rauda sisaldavad valgud osalevad mitokondriaalse trikarboksüülhappe (TCA) tsüklis ja elektronide transpordiahelas (ETC) (joonis 3a). Uurisime, kas rakkude eluea pikenemine raua lisamisega nõuab mitokondriaalseid funktsioone. Selle testimiseks analüüsisime mitokondriaalse TCA tsükli geenide ekspressiooni. Leidsime, et raua lisamine indutseerib märkimisväärselt mitme TCA tsükli geeni ekspressiooni (joonised 3b ja S4a). TCA-tsükli metaboliidid - ketoglutaraat ja oksaloatsetaat võivad mitokondrites kataplerootiliste reaktsioonide kaudu toota glutamaati ja aspartaati (joonis 3a). Neid aminohappeid kasutatakse valkude, lipiidide ja nukleotiidide biosünteesis [47–49]. Huvitaval kombel vähenes rauaga täiendatud rakkudes glutamaadi (GDH1 ja GDH3) ja aspartaadi (AAT1 ja AAT2) biosünteetiliste geenide ekspressioon (joonis 3c). See ekspressiooniprofiil viitab sellele, et raua lisamine soodustab TCA tsükli vaheühendite tarbimise asemel säilimist. Kooskõlas selle ideega suurenes mitokondriaalse anaplerootilise raja geenide (PYC1, PYC2 ja GDH2) geeniekspressioon rauaga täiendatud rakkudes märkimisväärselt (joonis 3c). PYC1 ja PYC2 kodeerivad püruvaadi karboksülaasi, mis muudab püruvaadi oksaloatsetaadiks. GDH2 kodeerib glutamaatdehüdrogenaasi, mis sünteesib glutamaadist ketoglutaraadi. Need tulemused näitavad koos, et raua lisamine konfigureerib rakud metaboolsesse olekusse, mis soodustab anapleroosi ja hoiab ära katapleroosi, et suurendada TCA tsükli metaboliite.
Joonis 3.Raua lisamine suurendab mitokondrite funktsioone. (a) Ülevaade mitokondriaalsestTCA (trikarboksüülhappe) tsükkel ja ETC (elektronide transpordiahel) koos peamiste kataplerootiliste jaanaplerootilised reaktsioonid on illustreeritud. (b) Prototroofset pärmitüve inkubeeriti 100-gaµM FeSO4 ja kasvatati SD söötmes 8 tundi 30 °C juures◦C. RNA ekstraheeriti kultuuridest jaNäidatud TCA tsükli geenide ekspressiooni analüüsiti kvantitatiivse RT-PCR abil. (c) Väljendkataplerootiliste geenide analüüsGDH1, GDH3, AAT1,jaAAT2) ja anaplerootilised geenid (PYC1, PYC2,jaGDH2) viidi läbi kvantitatiivse RT-PCR abil. (d) ETC geenide ekspressioonianalüüsi tegikvantitatiivne RT-PCR. Statistiline olulisus (*p < 0.05) was determined by Student's t- test.
TCA tsükli reaktsioonid tekitavad NADH ja FADH2 mida oksüdeerivad ETC kompleksid I ja II ning mis on vajalikud TCA tsükli funktsioneerimiseks (joonis3a). KuigiS. cerevisiaepuudub kompleks I, redutseerivad ekvivalendid kanduvad NADH dehüdrogenaaside kaudu hingamisahelasse. Suktsinaatdehüdrogenaas mängib keskset rolli ja osaleb nii TCA tsüklis kui ka ETC kompleksis II (joonis3a). Hämmastav on suktsinaatdehüdrogenaasi ekspressioon (SDH1jaSDH2) oli kõigi analüüsitud TCA tsükli geenide seas kõrgelt reguleeritud (joonis3b, d). Need tulemused näitavad, et TCA tsükli voog jätkab konkreetse vaheühendi kogumise asemel ETC suunas. Samuti oli kõigi teiste ETC komplekside geenide ekspressioon rauaga täiendatud rakkudes tugevalt ülesreguleeritud (joonis3d). ETC on seotud reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tekkega, mis reguleerivad hapniku ekspressiooniSOD2geen [50]. See kodeerib mangaan-superoksiidi dismutaasi (MnSOD), mis on mitokondriaalse superoksiidi peamine püüdja.SOD2geeniekspressioon oli rauaga täiendatud rakkudes ülesreguleeritud (täiendav joonis S4a), mis on kooskõlas ETC geenide ekspressiooniga. Lisaks analüüsisime mitokondriaalset membraanipotentsiaali (MMP), mida genereerivad ETC komplekside I, III ja IV prootonpumbad. Leidsime, et raua lisamine suurendas rakkude MMP-d (täiendav joonis S4b). Seejärel uurisime fluorestsentsmikroskoopia abil mitokondrite struktuuri. Leidsime, et raua lisamine takistab mitokondrite killustumist (täiendav joonis S4c). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et raua lisamine võimendab rakkude mitokondriaalseid funktsioone.
3.4. Raua lisamine suurendab raku eluea pikendamiseks vajalikku ATP taset
Mitokondriaalsed TCA tsükli reaktsioonid toodavad redutseerivad ekvivalendid NADH ja FADH2, mis kannavad elektronid ETC-sse ja tekitavad oksüdatiivse fosforüülimise (OXPHOS) kaudu adenosiintrifosfaati (ATP) (joonis3a). Kuna raua lisamine suurendas TCA tsükli ja ETC geenide ekspressiooni, testisime selle mõju ATP sünteesile. Kooskõlas mitokondriaalse TCA tsükli ekspressiooniprofiiliga oli ETC geeniekspressioon ja ATP tase rauaga täiendatud rakkudes kõrge (joonis4a). Seejärel küsisime, kas rauaga täiendatud rakkude eluea pikendamiseks on vaja ATP-d. Inhibeerisime ATP sünteesi ja mõõtsime pärmi CLS-i. Antimütsiin A (AMA) on ATP sünteesi inhibiitor, mis seondub kompleksiga III ja blokeerib elektronide ülekande mitokondriaalses ETC-s.51]. Esmalt uurisime ATP taset ja leidsime, et AMA-ravi pärsib ATP sünteesi (joonis4b). Lisaks testisime AMA mõju rauaga täiendatud rakkude elueale. Pärmirakke inkubeeriti raua ja AMA-ga SD-söötmes. Rakkude kasv jõudis küllastumiseni 24 tunni pärast (täiendav joonis S5). Seejärel mõõtsime ellujäämist ja leidsime, et AMA-ravi pärsib raualisandite poolt vahendatud eluea pikenemist (joonis4c). Need leiud näitavad koos, et raua lisamine suurendab ATP taset, mis on vajalik raku eluea pikendamiseks. Samuti täheldasime, et AMA-ga töödeldud rakkude eluiga oli madalam kui kontrollil (joonis4c), kinnitades veelgi, et võimetus ATP-d sünteesida kahjustas eluiga.
3.5. Raualisandid takistavad AMPK Knockout Mutandi kiirendatud vananemist
AMPK on raku energia homöostaasi peamine regulaator [20,21]. AMPK väga konserveerunud inimese analoog pärmisS. cerevisiaeon Snf1 valk [52]. AMPK aktiveerib mitokondriaalseid funktsioone, et toota ATP-d piiratud energiaga tingimustes. Hiljutised aruanded on näidanud, et mitokondrite funktsioonide langus vanusega tuleneb osaliselt AMPK aktiivsuse vähenemisest erinevates vanuses organismides.53,54]. Seega mõjutab AMPK aktiivsuse puudumine mitokondriaalseid funktsioone ja kahjustab paljusid raku funktsioone, sealhulgas ainevahetust, vastupidavust stressile ja rakkude ellujäämist, mis on vananemise ja eluea kõige kriitilisemad tegurid. Kooskõlas varasemate uuringutega, meleidis, etsnf1knockout mutatsioon kahjustas ATP taset, resistentsust oksüdatiivse stressi suhtes ja eluiga (joonis5a–c).
Joonis 5.Raua lisamine päästab AMPK knockout mutandi kiirendatud vananemise. Thepärmi prototroofne metsiktüüpi ja AMPK knockout mutant (snf1∆) tüved kasvatati statsionaarseksfaasis SD-söötmes 72 tundi temperatuuril 30◦C. (a) ATP analüüs metsikut tüüpi jasnf1∆ tüved. (b) Oksüdeerivstressianalüüs metsiktüüpi jasnf1∆ tüved erinevate H-ga2O2 kontsentratsioonid. (c) Kronoloogilineeluea (CLS) analüüs metsiktüüpi jasnf1∆ tüved. (d) ATP analüüs metsikut tüüpi jasnf1∆ tüvedinkubeeriti erinevate FeSO kontsentratsioonidega4. (e) Metsiktüüpi jasnf1∆ tüved, mida inkubeeriti erinevate FeSO kontsentratsioonidega4. (f) CLS analüüs metsiktüüpi jasnf1∆ tüved, mida inkubeeriti erinevate FeSO kontsentratsioonidega4. Statistiline olulisus (*p < 0.05) was determinedStudenti pooltt- test.
Alatessnf1mutant on mitokondriaalsetes funktsioonides puudulik, testisime, kas raua lisamine võib päästa kiirendatud vananemisfenotüüpe. Seetõttu täiendasime raudasnf1mutant ja analüüsis ATP taset, oksüdatiivset stressi ja eluiga. Leidsime, et raua lisamine suurendas ATP taset, vastupidavust oksüdatiivsele stressile ja eluiga (joonis5d–f). Kokkuvõttes kinnitasid need leiud, et raua lisamine aeglustab vananemist ja pikendab rakkude eluiga, suurendades mitokondrite funktsioone.
4. Arutelu
Toitained määravad rakkude funktsionaalse seisundi ja oluliste toitainete puudus kahjustab inimeste tervist [55,56]. Lisaks on toitained raku ainevahetuse peamised regulaatorid, mis kontrollivad mitmeid bioloogilisi protsesse, sealhulgasvananemine, mis on mitme peamise riskitegurkroonilised haigused. Langus sissemetaboolne aktiivsuson üks tunnuseidvananemine [10]. Hiljutised uuringud erinevate organismide, sealhulgas imetajatega, on näidanud, et vananemise edasilükkamine ja tervisliku seisundi suurendamine on võimalik vananemisvastaste sekkumiste, sealhulgas rapamütsiini ja metformiini ravimite manustamisega.11,16]. Need ravimid on suunatud toitainete tundmise kompleksidele TORC1 ja AMPK, mis on rakkude olulised metaboolsed regulaatorid.11,16].
Raud on oluline toitaine, mis osaleb rakkudes mitmetes olulistes metaboolsetes reaktsioonides [23–26]. Rauapuudus kahjustab metaboolset aktiivsust, mille tulemuseks on rakufunktsioonide häired, mis põhjustab paljusid haigusi, sealhulgas aneemiat, kognitiivseid häireid jalihasjõud [26,57–59]. Rauapuudus on laialt levinud eakate inimeste seasSuurem või võrdne65 aastat [60–62].
Kuna raud reguleerib ainevahetusprotsesse, siis uurisime selle rolli vananemisel. Kasutasime pärmi mudelorganismina, et uurida raua rolli kronoloogilises vananemises. Uurisime raualisandi mõju pärmi CLS-ile. Leidsime, et mõlemad FeSO4 ja FeCl3 suurendas raku eluiga. Kasutades erinevaid sulfaadi, kloriidi ja raua kelaativaid sooli, kinnitasime, et raud pikendab raku eluiga. Vananemine on seotud oksüdatiivse stressi järkjärgulise kuhjumisega, mis kahjustab raku funktsioone ja vähendab rakkude ellujäämist.34]. Kuna leidsime, et raua lisamine aeglustab vananemist, katsetasime, kas see võib pakkuda vastupidavust oksüdatiivsele stressile. Oksüdatiivse stressi fenotüübi uurimiseks töödeldi rakke oksüdatiivse indutseerijaga H2O2 ja mõõtis rakkude ellujäämist. Leidsime, et raua lisamine suurendas oksüdatiivse stressi vastupanuvõimet võrreldes kontrolliga. Need leiud on korrelatsioonis raualisandite rolliga eluea pikendamisel.
Lisaks selgitasime välja raualisandite vananemisvastase mehhanismi. Mitokondrid on raua kasutamise ja metabolismi peamised rakutarbijad.35–38]. Esmalt analüüsisime mitokondriaalse TCA tsükli geenide ekspressiooni. Leidsime, et raua lisamine reguleeris peaaegu kõigi TCA tsükli geenide ekspressiooni. Oluline on see, et raua lisamine vähendas mitokondriaalse anapleroosi ekspressiooni ja reguleeris üles kataplerootilisi metaboolseid geene. Need tulemused näitavad, et raua lisamine suurendab TCA tsükli vaheühendite sünteesi ja takistab nende rakkude kasutamist. Need leiud toetasid raualisandite vananemisvastast toimet, kuna TCA tsükli vaheühendite regulaarne eksport mõjutab mitokondriaalset terviklikkust [47]. Lisaks on mitokondriaalse süsinikuvaru täiendamine hädavajalik, et säilitada raku vananemise ajal ellujäämiseks vajalikud mitokondriaalsed funktsioonid.
TCA tsükli vaheaine On näidatud, et ketoglutaraat pikendab erinevate organismide eluiga [63]. Siiski leidsime, et raua lisamine suurendas ekspressiooni -ketoglutaraatdehüdrogenaas (KGD1jaKGD2), mis teisendab - ketoglutaraat suktsinüül-CoA moodustamiseks. Lisaks täheldasime, et suktsinaatdehüdrogenaasi geenide ekspressioon (SDH1jaSDH2) oli teiste TCA tsükli testitud geenide hulgas kõrgelt reguleeritud. Oluline on see, et suktsinaatdehüdrogenaas osaleb nii TCA tsüklis kui ka ETC kompleksis II. Need tulemused näitasid, et konkreetse TCA tsükli vaheühendi kogumise asemel võib raualisandite vananemisvastane toime hõlmata ETC rada.
Kuna TCA tsükkel on funktsionaalselt seotud ETC-ga, analüüsisime ETC geenide ekspressiooni. Leidsime, et raua lisamine reguleeris tugevalt ETC geenide ekspressiooni. TCA tsükli tooted NADH ja FADH2 oksüdeeritakse ETC komplekside poolt ja tekitavad OXPHOS-i kaudu ATP-d. Leidsime, et raua lisamine suurendab raku ATP taset, mis on korrelatsioonis TCA tsükli ja ETC geenide ülesreguleerimisega. Järgmisena selgitasime välja, kas raku eluea pikendamiseks on vajalik ATP taseme tõus raualisandiga. Leidsime, et ATP sünteesi pärssimine kaotas eluea pikendamise raua lisamisega. Seega näitavad need leiud, et raua lisamine suurendab ATP taset, mis on vajalik raku eluea pikendamiseks. Meie tulemused on kooskõlas eelmiste aruannetega, mis näitavad ATP rolli raku eluea jooksul [51,64,65]. Lisaks kasutasime raua lisamist mitokondriaalsete funktsioonide parandamiseks ja päästsime AMPK mutandi lühikese eluea ja oksüdatiivse stressi suhtes tundliku fenotüübi. Kokkuvõttes näitasid need tulemused, et raua lisamine võimendab mitokondriaalseid funktsioone, mis aeglustavad vananemist ja pikendavad rakkude eluiga.
Hiljutised uuringud on näidanud, et raua lisamine taastab lüsosoomikahjustusega mutantide mitokondriaalse defekti ja hoiab ära mitokondrite vähenemise vananemise ajal.66,67]. Seega toetavad meie tulemused varasemaid järeldusi, et raua lisamine parandab mitokondriaalseid funktsioone. Huvitaval kombel näitas üks varasematest uuringutest, et raua lisamine päästis lüsosoomikahjustusega mutantide kiirenenud replikatiivse vananemise; siiskiaruanne ei sisaldanud mõju metsikut tüüpi rakkudele [67]. Sellegipoolest on meie tulemused korrelatsioonis varasemate leidudega ja vaatamata erinevatele vananemismudelitele (kronoloogiline vananemine), leidsime, et raua lisamine aeglustab vananemist ja pikendab rakkude eluiga. Seega näitavad meie tulemused ja varasemad aruanded selgelt, et raua lisamine võib olla potentsiaalne vahend vananemise sihtimiseks ja tervise pikendamiseks.
Täiendavad materjalid:Joonis S1: Raualisandiga pärmirakkude kasvu ja kronoloogiline eluea analüüs; Joonis S2: Erinevate rauda, sulfaati ja kloriidi sisaldavate sooladega täiendatud pärmirakkude kasvuanalüüs; Joonis S3: rauaga täiendatud pärmirakkude oksüdatiivse stressiresistentsuse analüüs. Joonis S4: rauaga täiendatud pärmirakkude mitokondriaalse geeni ekspressioon, membraanipotentsiaal ja struktuurianalüüs; Joonis S5: Raua ja antimütsiin A-ga täiendatud pärmirakkude kasvuanalüüs; Tabel S1: Selles uuringus RT-PCR jaoks kasutatud praimerite loend.
Autori kaastööd:JLJ: metoodika, formaalne analüüs, uurimine ja läbivaatamine; TCYN: metoodika, formaalne analüüs, uurimine ja läbivaatamine; FN: valideerimine, formaalne analüüs ja ülevaatus; FE: läbivaatamine, toimetamine ja järelevalve; MA: kontseptualiseerimine, andmete kureerimine, metoodika, kirjutamine, läbivaatamine, toimetamine ja järelevalve. Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.
Rahastamine:Seda tööd toetasid Bioinformaatika Instituut (BII), A*STAR Career Development Fund (C210112008) ja Global Healthy Longevity Catalyst Awards stipendium (MOH-000758-00).
Tänuavaldused:Täname Maurer-Stroh Sebastianit, Lee Hwee Kuani, Loo Lit Hsini, Chiam Keng Hwee ja Prakash Arumugami selle uurimistöö toetamise eest.
Huvide konfliktid:Autorid ei deklareeri konkureerivaid finants- ja mitterahalisi huve.
Viited
1. Bloom, DE; Canning, D.; Lubet, A. Ülemaailmne rahvastiku vananemine: faktid, väljakutsed, lahendused ja perspektiivid.Väljakutse. Solut. Perspektiiv. Daedalus2015, 144, 80–92.
2. ÜRO majandus- ja sotsiaalministeerium, rahvastikuosakond.Maailma rahvastiku väljavaated 2019; Tähtsündmused (ST/ESA/SERA/423); ÜRO: New York, NY, USA, 2019.
3. Robine, J.Vananev elanikkond: me elame kauem, kuid kas oleme tervemad?ÜRO majandus- ja sotsiaalministeerium, rahvastikuosakond: New York, NY, USA, 2021; ÜRO DESA/POP/2021/TP/NO.
4. Niccoli, T.; Partridge, L. Vananemine kui haiguste riskifaktor.Curr. Biol.2012, 22, R741–R752. [CrossRef] [PubMed]
5. Hou, Y.; Dan, X.; Babbar, M.; Wei, Y.; Hasselbalch, SG; Croteau, DL; Bohr, VA Vananemine kui neurodegeneratiivse haiguse riskitegur.Nat. Rev Neurol.2019, 15, 565–581. [CrossRef] [PubMed]
6. Harman, D. Vananemisprotsess: peamine haiguste ja surma riskitegur.Proc. Natl. Acad. Sci. USA1991, 88, 5360–5363. [CrossRef] [PubMed]
7. Partridge, L.; Deelen, J.; Slagboom, PE Seisame silmitsi vananemise ülemaailmsete väljakutsetega.Loodus2018, 561, 45–56. [CrossRef] [PubMed] 8. Fontana, L.; Kennedy,
BK; Longo, VD; Seals, D.; Melov, S. Meditsiinilised uuringud: ravige vananemist.Loodus2014, 511, 405–407. [CrossRef] [PubMed]
9. Fontana, L.; Partridge, L.; Longo, VD Tervisliku eluea pikendamine - pärmilt inimestele.Teadus2010, 328, 321–326. [CrossRef] [PubMed]
10. López-Otín, C; Blasco, MA; Partridge, L.; Serrano, M.; Kroemer, G. Vananemise tunnused.Kamber2013, 153, 1194–1217. [CrossRef]
11. Partridge, L.; Fuentealba, M.; Kennedy, BK Püüdlus aeglustada vananemist ravimite avastamise kaudu.Nat. Rev. Drug Discov.2020, 19, 513–532. [CrossRef]
12. Zimmermann, A.; Hofer, S.; Pendl, T.; Kainz, K.; Tehtud.; Carmona-Gutierrez, D. Pärm kui vahend vananemisvastaste ühendite tuvastamiseks.FEMS Yeast Res.2018, 18, foy020. [CrossRef]
13. Kaeberlein, M.; Burtner, CR; Kennedy, BK Hiljutised arengud pärmi vananemises.PLoS Genet.2007, 3, e84. [CrossRef]
14. Longo, VD; Shadel, GS; Kaeberlein, M.; Kennedy, B. Replikatiivne ja kronoloogiline vananemine aastalSaccharomyces cerevisiae. Lahtri metab.2012, 16, 18–31. [CrossRef] 15. Longo, VD; Fabrizio, P. Saccharomyces cerevisiae kronoloogiline vananemine.Aging Res. Pärm2011, 57, 101–121. [CrossRef]
16. Kulkarni, AS; Gubbi, S.; Barzilai, N. Metformiini eelised vananemise tunnuste leevendamisel.Lahtri metab.2020, 32, 15–30. [CrossRef]
17. Alfatah, M.; Wong, JH; Krishnan, VG; Lee, YC; Patt, QF; Goh, CJH; Kong, KW; Lee, WT; Lewis, J.; Hoon, S.; et al. TORC1 reguleerib Saccharomyces cerevisiae transkriptsioonilist vastust glükoosile ja arengutsüklit Tap{2}}Sit4-Rrd1/2 raja kaudu.BMC Biol.2021, 19, 1–22. [CrossRef]
18. Saxton, RA; Sabatini, DM mTOR signaalimine kasvus, ainevahetuses ja haigustes.Kamber2017, 168, 960–976. [CrossRef]
