Polüfenoolsete antioksüdantide kvertsetiini ja naringeniini vahelised koostoimed määravad nende segude erilise redoksiga seotud keemilise ja bioloogilise käitumise 1. osa

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Viimase kahe aastakümne jooksul tehtud uuringud mittenakkuslike krooniliste haiguste molekulaarsel alusel, naguateroskleroos, hüpertensioon, diabeet ja eriti vähk, mis on suurt huvi tekitanud, on näidanud, et kõigil neil haigustel on ühine riskitegur, milleks on redoks-homöostaasi katkemine, mida sageli nimetatakse oksüdatiivseks stressiks12. See tekib reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) suurenenud endogeense taseme tõttu organismi antioksüdantse barjääri tõrke tõttu ja arvatakse, et see soodustab kõigi nende haiguste teket.3. Seega järgnes oletus, et eksogeensed tegurid, mis on võimelised neutraliseerima ROS-i, nt taimsed antioksüdandid, võivad takistada või aeglustada krooniliste haiguste teket ja toetada nende ravi. Selle hüpoteesi kontrollimine algatas üksikasjalikud uuringud toiduainetes sisalduvate antioksüdantide kohta, millel võib olla ennetav potentsiaal4. Tõepoolest, mitmed metaanalüüsis kokku võetud uuringud, milles võrreldi toidutarbimist ja toitumisega seotud kroonilisi haigusi, näitasid puu- ja juurviljade, täistera teraviljatoodete ning jookide, nagu vein, kohv ja tee, rikaste dieetide puhul riski vähenemist. seega tooted, mis on rikkad antioksüdantsete fütokemikaalide poolest. Pole üllatav, et eeldati, et need ained, mis kord nende looduslikest allikatest eraldati, puhastati ja seejärel toidulisandite kujul, mis sisaldavad dieediga saavutatavast suuremaid annuseid, võivad muutuda võimsateks kemopreventiivseteks aineteks. Seda oletust kinnitas suur hulk tõendeid, mis pärinesid uuringutest, milles kasutati erinevaid krooniliste haiguste, sealhulgas vähi eksperimentaalseid in vitro ja in vivo mudeleid.7.Pettumust valmistav on see, et hiljuti on inimestel tehtud uuringud näidanud, et antioksüdantsed toidulisandid ei avalda nii paljulubavat toimet. . Näiteks kahes metaanalüüsis inimeste kohordi ja juhtumikontrolli uuringutes E8-vitamiini või mikrotoitainete preparaatidega" jõuti järeldusele, et antioksüdantide madalal tasemel ei olnud mingit mõju, samas kui suured annused võivad suurendada nii vähi ja südame-veresoonkonna haiguste esinemissagedust kui ka suremust. Siiski, kui toidulisandid põhinesid tõelistel taimedel, näiteks kontsentreeritud polüfenoolirikaste toitude (granaatõun, roheline tee, spargelkapsas ja kurkum) spetsiifiline segu. Eesnäärmevähiga meestel täheldati olulist kaitsvat toimet1.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Täistoidu paljulubav mõju erinevalt isoleeritud ühenditest on kooskõlas toidu sünergia kontseptsiooniga, mis on defineeritud kui lisaaine või rohkem kui toidu erinevate koostisosade kombineerimise lisaaine mõju inimese tervisele. Meie varasem uuring kinnitas seda kontseptsiooni, võrreldes päristoidu bioaktiivsust nende isoleeritud peamise antioksüdandiga. See näitas, et marjade ekstraktide bioloogiline toime erineb oluliselt antotsüaniintsüanidiin-3-O-glükosiidi omast. Mõned teised aruanded osutasid ka erinevate bioaktiivsete ühendite ja toidumaatriksi komponentide vastastikmõjude olulisusele, mis osutusid koostööd tegevateks teguriteks, mis määravad toiduainete lõpliku bioaktiivsuse3-1. Meie hiljutised mehhaanilised uuringud, mis hõlmasid bioaktiivse kakao koostise järkjärgulist taastamist, toetasid ka toidu sünergia ideed, kuid näitasid, et keeruka koostisega proovide bioloogilised mõjud ei ole ainult üksikute komponentide toimingute kombinatsioon. Kõik need tähelepanekud viitasid sellele, et eraldatud antioksüdantide ja nende segude redoks-seotud bioaktiivsuse kaalumisel tuleb arvesse võtta komponentide vahelisi koostoimeid. Segu kasvav keerukusfütokemikaalidnäis Loo uusredoks-aktiivne aineselle asemel, et rikastada segu lisatud ühendile iseloomulike uute aktiivsustega, mis tuleneb toidu sünergia kontseptsioonist.

Cistanche võib parandada immuunsust

Praeguses uurimistöös lihtsustasime eksperimentaalset süsteemi, piirates seda ainult kahe põhistruktuuriga, et süveneda nende interaktsioonide üksikasjadesse keemilise struktuuri, redoksreaktiivsuse ja redoks-reaktsiooniga seotud bioaktiivsuse kontekstis, et võimaldada paremat arusaamist ja antioksüdantide kemopreventiivse potentsiaali ennustamine.'Selleks otstarbeks kasutatud fütokemikaalid olid tavalised antioksüdandid, mis esinesid erinevates ürtides, köögiviljades ja puuviljades, eriti tsitrusviljades, nimelt: flavonoolid, mida esindavad kvertsetiin (O) ja selle ramno-külgrutiin ( R) ja flavanoonid naringeniini (N-) ja selle pooltneohesperidosiidnaringiin (N pluss ), samuti nende ühendite kaks segu (QN-, RN plus ). Uuringu keemiline koostis hõlmas määramisi, mis andsid mõningase ülevaate oksüdatiivsete protsesside termodünaamikast ja kineetikast, nt DPPH-test, potentsiomeetriline tiitrimine ja diferentsiaalimpulss-voltameetria (DPV). Bioloogilistes testides uuriti uuritud proovide mõju rakkude kasvule (MTT test), raku antioksüdantsele aktiivsusele (CAA test), genotoksilisusele (komeedi test), globaalsele DNA metüülimise tasemele (komeedi testi epigeneetiline versioon) ja 84 redoks-ekspressioonile. -seotud geenid (reaalajas PCR massiivipõhised tehnoloogiad). Bioloogilised katsed viidi läbi, kasutades toitumisuuringuteks soovitatud käärsoole adenokartsinoomi HT29 rakuliini sooleepiteeli mudelina, mis võib kokku puutuda suhteliselt kõrgete allaneelatud antioksüdantide kontsentratsioonidega.

Tulemused

Meie varasemad uuringud, milles võrreldi kakaopulbri ja selle peamiste koostisosade redoks-seotud omadusi, osutasid segu polüfenoolsete komponentide interaktsioonide tähtsusele üldisele antioksüdantsele aktiivsusele. Praeguses uurimistöös lihtsustasime eksperimentaalset süsteemi, et uurida selliseid interaktsioone üksikasjalikumalt flavonoidide paari puhul, mis on tavalised toidukomponendid. Valiti kaks flavonoidi, nii aglükoonide kui ka glükosiidide kujul. Flavonoole esindasid kvertsetiin (Q) ja selleramnosiid-rutiin(R) jaflavanoonidnaringeniini (N-) ja selle neohesperidosiidi naringiini (N pluss) poolt. Need polüfenoolid erinevad redoks-aktiivsete hüdroksüülrühmade arvu ja asukoha poolest, samuti võime poolest moodustada molekulisiseseid H-sidemeid, st kolme struktuuritunnust, mis võivad segada antioksüdantsete ühendite omaduste vähendamist. Nagu on näidatud joonisel fig 1, moodustusid vahepealsed semikinooniradikaalid tsükli B katehhoolifragmendi oksüdatsiooni esimeses etapis

Q või R saab stabiliseerida kahel viisil8,19. Esimene viis on nii tuumstruktuuri konjugeerimine B- ja C-tsükliga kui ka teise H-sideme moodustamine naabruses asuva OH-rühma või asendajatega C-tsüklis, eriti R-s. Hüdroksüülrühmade olemasolu suhkruasendajas asendis 3 ringi C võib seda stabiliseerimisefekti veelgi tugevdada tänu suurematele võimalustele H-sidemete moodustumiseks (otse või veemolekuli kaudu). Seevastu vahepealset fenoksüülradikaali N pluss või N-s ei stabiliseeru konjugeeritud kaksiksidemed, mis hõlmavad ka tsüklit. C- ega H-side naaberasendajatega. Veelgi enam, N plussis on suhkruosa seotud tsükliga A ja on seega liiga kaugel H-sideme moodustamiseks tsüklis B oleva radikaaliga. Võib eeldada, et need struktuuriomadused mõjutavad uuritud flavonoidide redoksaktiivsust.

Antioksüdantne aktiivsus keemiliste testide abil.

Uuritud polüfenoolide ja nende segude redutseerivate omaduste määramine viidi läbi kahe keemilise analüüsiga temperatuuril 37 °C, et sobitada redoksprotsesside rakulisi tingimusi. Esimene meetod oli tavaliselt kasutatav partii spektrofotomeetriline DPPH test; üksikute flavonoidide ja nende segude tulemused on toodud joonisel 2A. Need on väljendatud stöhhiomeetriliste väärtustena n, kus arv 10 viitab reaktsiooni kestusele – 10 min. Ajaparameetri lisamisega mõõtmistesse lisati antioksüdantide aktiivsuse hindamisse kineetiline aspekt, nagu on varem kirjeldatud13. Nendes määramistes ilmnesid mõlemal aglükoonil tugevamad redutseerivad omadused kui vastavatel glükosiididel, nagu oli ka varem näidatud selle testiga2021, samas kui flavonoolid olid rohkem. aktiivsemad kui flavanoonid. O oli DPPH-radikaali eemaldamisel kõige tõhusam ühend ja sellele järgnes R. Vaatamata tühisele reaktsioonivõimele DPPH suhtes, suurendasid mõlemad flavanoonid, sealhulgas N, millel iseenesest 10-minutilise reaktsiooniperioodi jooksul redoksomadusi ei ilmnenud, märkimisväärselt kogu antioksüdantset aktiivsust. segud, nii aglükoonide ON- kui ka glükosiidide puhul RN plus .

Teine meetod hõlmas potentsiomeetrilist tiitrimist (PT), mis võimaldab mõõta standardset redutseerimispotentsiaali (E) ja seega hinnati puhaste ühendite termodünaamilist võimet saada elektrone. Kinnitatud, et Q ja R on tugevad redutseerivad ühendid (joonis 2B) määratud väärtused. Kuid PT-s võttis R doonorelektrone vastu meelsamini kui Q. E määramine N- ja N pluss jaoks ei olnud võimalik väga aeglase elektronide ülekande tõttu oksüdatsiooniprotsessi ajal (N pluss aeglasem). PT mõõdab potentsiaali erinevust võrdluselektroodi ja mõõteelektroodi vahel pärast iga tiitri osa lisamist. Püsipotentsiaal tähendab, et reaktsiooni (Q) jagatis tiitri ja analüüdi vahel on stabiilne (Q= konstantne). Kui laengu ülekande kiirus reaktsiooni ajal on madal (madalad voolud voltammeetrias), kulub Q stabiliseerimiseks PT-s kaua aega. Järelikult on väga aeglaste reaktsioonide korral raske saada potentsiomeetrilist tiitrimiskõverat ja seega on leitud väärtus E vähem usaldusväärne.

Antioksüdantne aktiivsus diferentsiaalimpulss-voltameetria abil,

Kasutatud keemilised testid viitasid sellele, et polüfenoolide antioksüdantse toime selgitamisel tuleb arvesse võtta kineetilisi aspekte, kus vaheradikaalide stabiilsus võib mängida rolli. Nagu on näidatud joonisel 1, on flavanooli oksüdatsiooni esimeses etapis moodustunud semikinooni radikaalid palju paremini stabiliseerunud kui flavanooni oksüdatsioonil tekkivad fenoksüülradikaalid. Seda seost on illustreeritud joonisel 1 ja see võib mõjutada redoksprotsesside kiirust. Seetõttu analüüsiti edasi uuritud puhaste antioksüdantide ja nende segude redutseerimis-oksüdatsiooniomadusi diferentsiaalpulss voltamperomeetria (DPV) abil. Kuna see meetod võimaldab jälgida nii oksüdatsioonireaktsioonide termodünaamilisi kui ka kineetilisi aspekte, ühendatakse mõlemad lõpuks parameetris, mida nimetatakse antioksüdantseks võimsuseks (AOP)15.

DPV mõõtmistega tehtud tähelepanekud (joonis 2B-F) olid vastuolus DPPH testiga (joonis 2A) saadud tähelepanekutega. Üllataval kombel näitas DPV, et Q, mida kirjanduses kirjeldatakse suurepärase redutseerijana, osutus ainult termodünaamilisi aspekte arvesse võttes (anoodne tipppotentsiaal, E.) kõige nõrgemaks antioksüdandiks (joonis 2B, C). Termodünaamiliselt oli R veidi tugevam antioksüdant. Huvitav on see, et N- ja N pluss loetakse kirjanduses nõrkadeks antioksüdantideks, mis näitasid termodünaamiliselt kõrgeimaid E väärtusi, mis tähendab, et need olid väga tugevad redutseerivad ained. Mõlema flavonoidiklassi puhul suurendas glükosiidiosa aglükoonide antioksüdantset aktiivsust. Kuid kineetikaga seotud parameetrid (joonis 2E, F), st anoodvool (I,.) ja laengutihedus (Q), näitasid, et N pluss oksüdatsioon on aeglasem protsess võrreldes Q ja R oksüdatsiooniga. , oli anoodvool (I) N- puhul madalam kui Q ja R puhul, kuid selle ühendi laengu ülekanne saavutas kõrgeima väärtuse.

Segude puhul tuvastati voltamperomeetrilistel kõveratel kaks anoodset piiki (1. ja 2.), nagu võis eeldada kahekomponendilise segu puhul. Anoodi tipppotentsiaalide (E.) määratud väärtused näitasid, et esimene täheldatud tipp peegeldab flavonoolide oksüdatsiooni, samas kui 2" d - flavanoonide oksüdatsiooni (täiendavad materjalid - joonis S1). Enamikul juhtudel on teise komponendi olemasolu segu mõjutas redoksprotsessi termodünaamikat ja/või kineetikat võrreldes puhaste ühendite oksüdatsiooniga.Näiteks QN- puhul oli E. väärtus 1. oksüdatsioonipiigi puhul võrdne Q anoodse tipupotentsiaaliga 2" anoodne tipp, mis vastab N-oksüdatsioonile ja selle ülemineku potentsiaalile, oli kõrgem kui puhta N (joonis 2C) anoodne potentsiaal. Selle reaktsiooni kineetika puhul täheldati vastupidist olukorda. QN 1s anoodipiik I ja Q olid lähedased puhaste komponentide oksüdatsiooni kineetilistele parameetritele (joonis 2E, F), samas kui ON-oksüdatsiooni 2n etapis vahetatud laeng oli palju madalam kui N-oksüdatsioonil. (joonis 2F). Need kombineeritud termodünaamilised ja kineetilised efektid tõid kaasa selle segu AOP (joonis 2D) suurenemise, mis on kooskõlas DPPH testi tulemustega.

Tsütotoksilisuse hindamine.

Uuritud flavonoid-aglükoonide (Q, N-), glükosiidide (R, N pluss) ja nende segude (QN-, RN pluss) mõju soolestiku rakkude kasvule hinnati MTT testiga. Inimese käärsoole adenokartsinoomi HT29 rakuliin valiti seedetrakti epiteeli mudeliks, st kude, mis on otseses kontaktis toidu koostisosadega, nagu polüfenoolid. Rakke töödeldi üksikute flavonoidide ja nende segudega füsioloogilistes kontsentratsioonides, mis võivad esineda veres (0.01-1 uM)22-2 või seedekulglas saavutatavas kontsentratsioonis (10-100). uM) pärast toidu allaneelamist25-27. 6-, 24- ja 72-tunnise ravi annuse-vastuse kõverad on esitatud joonisel 3.

Üksikud ühendid ei mõjutanud oluliselt rakkude kasvu ühelgi uuritud kontsentratsioonil, ei lühikese ega pikema ravi korral. Erandiks oli kõrgeim N kontsentratsioon, mis 72 tunni pärast pärssis rakkude kasvu kuni 75 protsendini võrreldes kontrolliga. Seevastu uuritud segud (QN-, RN pluss) stimuleerisid kontsentratsioonist sõltuval viisil märkimisväärselt rakkude kasvu kõigi testitud kokkupuuteaegade jooksul. Seda toimet täheldati madalatel kontsentratsioonidel (0.01-1 uM), mis on vereringes kättesaadavad, ja see oli veelgi tugevam kõrgemate kontsentratsioonide (10-100 uM) korral, millele seedekulgla epiteelirakud jõudsid. võib kokku puutuda. Ainult kõrgeima QN-kontsentratsiooni korral pärast 72-tunnist töötlemist stimulatsioon lakkas, tõenäoliselt N- sellistes tingimustes täheldatud inhibeeriva toime tõttu. Raku antioksüdantne aktiivsus. Puhastatud flavonoidide ja nende segude efektiivsust HT29 rakkude endogeense antioksüdantse barjääri toetamisel kontrolliti CAA testi abil. See meetod põhineb redoksaktiivseid ühendeid sisaldava proovi võimel inhibeerida või soodustada imendunud sondi oksüdatsiooni. rakkude poolt fluorestseeruvasse vormi. Sondi oksüdatsiooni nõrgenemine, mida täheldatakse fluorestsentsi kustutamisena, on antioksüdantide redutseerimisvõime mõõt rakkudes (positiivsed CAA väärtused), samas kui sondi oksüdatsiooni suurenemine näitab nende prooksüdatiivset aktiivsust (negatiivsed CAA väärtused)28. . Aglükoonide ja glükosiidide määramine viidi läbi kontsentratsioonides, mis peegeldasid nii füsioloogilist (endogeenset) kui ka toidust pärinevat (eksogeenset) soolestiku kokkupuudet. Inkubeerimine uuritud flavonoididega viidi läbi aglükoonide ja glükosiidide jaoks standardse soovitatava perioodi jooksul 1 h 18. Pikaajalisi ravimeetodeid (3 ja 6 tundi), mille eesmärk oli jälgida redoksreaktsiooni kineetikat rakendatud rakumudelis, kasutati ainult aglükoonide puhul, kuna neil on suurem mõju raku antioksüdantsele aktiivsusele.

Uuritud flavanoonid ja flavonoolid erinesid oma mõju poolest HT29 rakkude redoksseisundile. Üksikute aglükoonide puhul täheldati määratletud kontsentratsioonist sõltuvaid reaktsioone pärast 1-tunnist kokkupuudet. Kuid flavonool-Q antioksüdantne aktiivsus suurenes koos kontsentratsiooniga, samas kui flavanooni-N-i puhul täheldati prooksüdatiivse toime järkjärgulist suurenemist (joonis 4A). Üksikute glükosiidide annusesõltuvus oli vähem ilmne; ainult R oma kõrgeimas kontsentratsioonis suurendas veenvalt raku antioksüdantset aktiivsust (joonis 4A). Huvitav on see, et mõlemal segul oli suurenenud antioksüdantne aktiivsus, mida ilmselt ei mõjutanud üksikute ühendite prooksüdatiivne toime.

Joonisel 4B on kujutatud CAA väärtuste muutuste kineetika, mis on määratud pärast HT29 rakkude 1, 3 ja 6 tundi töötlemist aglükoonidega. Madalaima kontsentratsiooni (1 μM) korral, mis vastab füsioloogilisele kokkupuutele, ei täheldatud ajasõltuvust ei üksikute aglükoonide ega nende segude puhul. Suurema kontsentratsiooni mõju CAA väärtustele oli aga selgelt ajast sõltuv. Pikaajaline kokkupuude vähendas nii N- prooksüdatiivset toimet kui ka Q ja QN- antioksüdantset aktiivsust.

Uuritud aglükoonidel oli erinev nutrigenoomne aktiivsus, mida lisaks modifitseeris rakkudele rakendatud kontsentratsioon.

Flavanoon N- l μM juures vähendas oluliselt CCL5, CYGB, GTF2I, MT3 ekspressiooni (p<0.05) as="" well="" as="" showing="" some="" tendency="" to="" down-regulate="" alox12="" and="" ucp2="" transcription=""><><0.09). the="" increased="" expression="" caused="" by="" n-was="" observed="" for="" the="" ncf2="" gene="" only=""><0.05). these="" genes,="" though="" in="" one="" or="" another="" way,="" related="" to="" cellular="" redox="" status,="" do="" not="" fall="" into="" any="" specific="" common="" pathway="" nor="" are="" involved="" in="" any="" coordinated="" process.="" the="" protein="" encoded="" by="" ccl5="" belongs="" to="" a="" group="" of="" inflammation-relevant="" genes,="" while="" the="" cytoglobin="" gene(cygb)functions="" as="" a="" tumor="" suppressor="" gene2930.="" gtf2i="" protein="" acts="" as="" a="" general="" transcription="" factor="" and="" is="" involved="" in="" the="" coordination="" of="" cell="" growth="" and="" division31.="" so,="" the="" other="" gene="" down-regulated="" by="" the="" n-at="" l="" um="" gene—mt3—may="" cooperate="" with="" it,="" because="" although="" it="" plays="" a="" role="" in="" zinc="" and="" copper="" homeostasis,="" it="" is="" also="" known="" as="" growth="" inhibition="" factor2.="" the="" enzyme="" encoded="" by="" alox12="" acts="" on="" different="" polyunsaturated="" fatty="" acid="" substrates="" to="" generate="" bioactive="" lipid="" mediators3.="" the="" protein="" coded="" by="" ucp2="" has="" been="" described="" as="" a="" mitochondrial="" scavenger="" of="" ros.="" the="" only="" up-regulated="" gene="" by="" n-at="" 1="" um="" was="" ncf2="" which="" encodes="" a="" cytosolic="" protein="" required="" for="" the="" activation="" of="" the="" nadph="" oxidase="" system="" responsible="" for="" superoxide="">

See flavanoon, mida rakendati HT29 rakkudele kontsentratsioonis 10 uM, mõjutas 5 geeni ekspressiooni, mida samuti vähendas selle väiksem annus, nimelt: CCL5, CYGB.MT3 (p<0.05)as well="" as="" gtf2i="" and=""><><0.09).additionally,in contrast="" to="" lower="" dose,="" n-at="" 10="" um="" showed="" tendency="" to="" decrease="" expression="" of=""><><0.09). the="" latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" with="" superoxide="" dismutase="" activity,i.e.,="" the="" antioxidant="" enzyme="" catalyzing="">

superoksiidi radikaalide dismutatsioon vesinikperoksiidiks ja hapnikuks6. N-i põhjustatud ekspressiooni kerget tõusu 10uM juures täheldati ainult VIMP geeni puhul (0,05<><0.09)that is="" involved="" in="" the="" degradation="" process="" of="" misfolded="" endoplasmic="" reticulum(er)luminal="">

See artikkel on välja võetud saidilt www.nature.com/scientificreports