Amüloid-beeta agregatsiooni ja Cistanche Tubulosa vesiekstrakti ladestumise pärssimine

1. Sissejuhatus

Dementsus on üks levinumaid kroonilise vananemisega seotud haigusi. 2015. aastal oli ülemaailmse Alzheimeri raporti hinnangul dementsuse all kannatanud umbes 46,8 miljonit inimest, 2030. aastal peaks see arv olema 74,7 miljonit ja 2050. aastal 131,5 miljonit. Ülemaailmne dementsuse elanikkond kasvab aasta-aastalt ja muutub tulevikus kontrolli alt välja . Ülemaailmsed tervishoiukulud dementsuse raviks olid 2010. aastal peaaegu 604 miljardit USA dollarit ja 2030. aastal eeldatavasti 1000 miljardit USA dollarit. Dementsusega patsientidel on suurem risk juhuslikku surma ja seetõttu vajavad nad rohkem arstiabi. See on raske koorem dementsusega patsientide perekondlikele hooldajatele. Dementsuse mõju hooldajatele, perekonnale ja ühiskonnale võib põhjustada suurt füüsilist, psühholoogilist, elu- ja majanduslikku stressi. On kaks peamist dementsuse vormi, Alzheimeri tõbi (AD) ja vaskulaarne dementsus. AD on kõige levinum dementsus ning see on pöördumatu ja progresseeruv neurodegeneratiivne haigus. AD oli 2015. aastal USA-s surmapõhjuste hulgas kuuendal kohal.

LOODUSLIK TUBULOOSA VÄLTIMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Hiljutised uuringud kinnitavad, et amüloidpeptiidi (A) (naastude) ja valgu tau (tangud) agregatsioonist põhjustatud neuronite toksilisus on tihedalt seotud AD patogeneesiga. A ja tau valgu kuhjumine ajus võib põhjustada neuronite kahjustusi ja mälukaotust. Lahustumatud A oligomeerid agregeeruvad rakuvälistes naastudes ja põhjustasid sünaptilist düsfunktsiooni, neuronite toksilisust ja rakusurma. Kahjuks ei ole seni saadaval tõhusat ravi A ja valgu tau puhastamiseks, A moodustumise või oligomerisatsiooni pärssimiseks ning pöördumatu neuronikahjustuse peatamiseks või ravimiseks. Praegused terapeutilised ained, nagu galantamiin ja donepesiil, mis on atsetüülkoliinesteraasi inhibiitorid, võivad neurotransmitterite taset tõstes ainult ajutiselt leevendada mälukaotust. 2012. aastal ei suutnud ükski kandidaatravim suurtes AD patsientide kliinilistes uuringutes A-efekti vähendada. Seetõttu on vaja kiiresti uurida Alzheimeri tõve levimust pärssivat uudset ravi. Metallioone peeti hiljuti peamiseks teguriks, mis on tihedalt seotud A agregatsiooniga. Potentsiaalseteks pliiühenditeks peetavad metallikelaatorid pakuvad AD-vastase lähenemisviisi jaoks täiesti uut strateegiat.

Cistanche tubulosa kuivatatud vars(Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong, korjatakse laialdaselt Hiinas Xhinjangi kõrbes. See on oluline traditsiooniline hiina meditsiin, mis kuulub Hiina farmakopöas indekseeritud toonilise hiina meditsiini hulka ja mida on tuhandeid aastaid kasutatud füüsilise nõrkuse, neerupuudulikkuse, viljatuse, unustamise, impotentsuse ja seniilse kõhukinnisuse raviks.C. tubulosa vesiekstrakt (CTE)kapslid on Hiinas heaks kiidetud vaskulaarse dementsuse botaanilise ravimina. Vastavalt kliinilisele uuringule, milles osales 18 patsienti, kellel oli diagnoositud kerge kuni mõõdukas AD, andsid CTE kapslid patsientidele stabiilsema mäluseisundi võrreldes atsetüülkoliinesteraasi inhibiitoritega. Meie eelmises uuringus vähendas CTE amüloidpeptiidi (A) ladestumist ja parandas mälukaotust Alzheimeri tõvega sarnastel rottidel. Fenüületanoidglükosiide, ehhinakosiidi (1), akteosiidi (2) ja isoakteosiidi (3) peetakse CTE peamisteks komponentideks. Ühendil 1 on neuroprotektiivne toime 1-metüül-4-fenüül-1,2,3,6-tetrahüdropüridiini (MPTP), 1-metüül{{13} }}fenüülpüridiiniumioon (MPP+) ja 6-hüdroksüdopamiin (6-OHDA). Meie eelmine aruanne näitas, et 1 pärssis in vitro uuringus A oligomerisatsiooni ja toksilisust ning inhibeeris A ladestumist, parandas mälu halvenemist ja kognitiivset düsfunktsiooni A-indutseeritud rottidel. Ühendid 2 ja 3 suurendasid A lagunemist ja vähendasid A oligomerisatsiooni in vitro. Ühend 3 vähendas A ladestumist A-indutseeritud rottidel. Nende uuringute põhjal on C. tubulosa juba tõestanud, et tal on potentsiaali ravida AD-d. CTE on tihedalt seotud A-vastase agregatsiooni ja ladestumisega. CTE mehhanismi paremaks mõistmiseks peab meil olema mugav ja tõhus meetod aktiivse komponendi, samuti ajukoe proovide sisalduse tuvastamiseks. Enamik uuringuid oli mõeldud kvantitatiivseks määramiseksehhinakosiid, akteosiid ja isoakteosiid maitsetaimedesvõi toiduained kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) abil, kuid ainult kaks uuringut olid mõeldud seerumis või kudedes määramiseks. Siiski puuduvad aruanded 1–3 samaaegse analüüsi kohta ajukoes pärast CTE suukaudset manustamist. Lisaks on viimaste uuringute põhjal endiselt ebaselge, kas CTE aktiivsed komponendid või nende metaboliidid läbisid edukalt hematoentsefaalbarjääri ja toimisid aju neuronitele. Seetõttu pakub see uuring täiustatud ja tundlikku meetodit veenvate tõenditega, mis illustreerivad selgelt CTE aluseks olevat mehhanismi A agregatsiooni ja ladestumise vastu.

2. Tulemused

2.1. Kolme peamise ühendi eraldamine ja tuvastamine (1–3)

C. tubulosa kuivatatud varred ekstraheeriti toatemperatuuril 75% EtOH-ga. Kondenseeritud 75% EtOH ekstrakti töödeldi vaigu ja C18 kolonnkromatograafiaga, et saada kolm peamist ühendit, ehhinakosiid (1),akteosiid (2) ja isoakteosiid(3). Nende struktuure selgitati NMR (tuumamagnetresonantsi) spektroskoopia ja ESI-MS (elektropihustusionisatsiooni mass) analüüsi ning kirjanduse andmetega võrdlemise (joonis 1, lisamaterjalide joonised S3–S11) abil.

2.2. CTE fenüületanoidglükosiidide (1–3) sisalduse analüüs

Analüüsimeetod valideeriti fenüületanoidglükosiidide analüüsi jaoks. Ühendid 1–3 (50 mg) kaaluti täpselt ja segati 50% metanooliga (40 ml). Segusid töödeldi ultraheliga 5 minutit. Kolme fenüületanoidglükosiidi (1–3) standardlahust segati standardlahusena (100 ug/ml). Standardset põhilahust kasutati viie erineva kontsentratsiooniga (5, 10, 25, 50 ja 100 ug/ml) näidatud lahuste valmistamiseks, lahjendades seeriakoguste 50% metanooliga. Fenüületanoidglükosiidide (1–3) kõverad määrati ultra-performance-vedelikkromatograafia (UPLC) abil vahemikus 5–100 ug/ml ja olid vastavalt lineaarsed (1, r2= 0.9999; 2, r{{25}). }.9999; 3, r2= 0.9998). Päevasisene ja päevadevaheline täpsus [% RSD (suhteline standardhälve) oli 0,1–1,8%] ja täpsus (95,6–104,2%) olid UPLC jaoks vastuvõetavad 1–3 puhul. UPLC kvantifitseeris CTE sisalduse 1, 2 ja 3 väärtuseks vastavalt 254, 38 ja 41 mg/g (joonis S2).

LOODUSLIK TUBULOOS REKLAAM PATSIENTIDE RAVIKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3. UPLC/MS/MS valideerimine

Fenüületanoidglükosiidid (1–3) segati ja lisati roti ajukoe homogenaadiga ning analüüsiti ultrajõudlusega vedelikkromatograafia-tandemmassispektromeetriga (UPLC/MS/MS) koos tahke faasi ekstraheerimisega. Avastamise alumine piir (LLOQ) 1–3 oli 0,2 ng/ml. Fenüületanoidglükosiidide saagis suurenes ajukoe homogenaadiga (10 ng/ml) vastavalt 91,39% 1, 89,54% 2 ja 96,81% 3 puhul (joonis 2).

2.4. AD-sarnaste roti ajukudede analüüs

Pärast 14-päevast CTE suukaudset manustamist (200 mg/kg/päevas) koguti AD-sarnased roti ajukoed ja jagati kaheks osaks, hipokampuseks ja juttkehaks, ning mõlemad homogeniseeriti. Kuna iga roti hipokampuse ja juttkeha homogenaadid olid liiga vähesed, et neid tahke faasi ekstraheerimisse laadida ja et vältida liigseid katsevigu, segati nelja üksiku roti hipokampuse ja juttkeha homogenaadid UPLC/MS/MS analüüsitud prooviks, kasutades tahket ainet. faasi ekstraheerimise meetod (joonis 3A, B). Fenüületanoidglükosiide (1–3) täheldati hipokampuses (joonis 3A) ja juttkehas (joonis 3B). Tühjades ajukoes ei olnud olulist piiki (joonis 3C). Hipokampuses oli ehhinakosiidi sisaldus 11,97 ± 0,34 ng/ml, akteosiidi sisaldus 1,25 ± 0,16 ng/mL ja isoakteosiidi sisaldus 1,38 ± 0,08 ng /mL. Juttkehas oli ehhinakosiidi sisaldus 22,60 ± 1,69 ng/mL, akteosiidi sisaldus 2,03 ± 0,61 ng/mL ja isoakteosiidi sisaldus 4,90 ± 0,64 ng/mL. Nagu on näidatud joonisel 4, läbib CTE hematoentsefaalbarjääri vastavalt olulistele tuvastatavatele kogustele 1–3 hipokampuses ja juttkehas. UPLC analüüsi põhjal on 1 sisaldus CTE-s palju suurem kui 2 ja 3 (joonis S2). Seetõttu on mõistlik jälgida, et 1 on ajukoes kõrgeim pärast suukaudset CTE manustamist.

2.5. Fenüületanoidglükosiidide (1–3) metalli kelaatimise aktiivsus

Kirjanduses on vabade ühendite ja nende metallikomplekside määramine teostatud HPLC abil. Selles uuringus analüüsiti kelaatimise aktiivsust UPLC abil. Iga fenüületanoidglükosiidi (1–3) 50 µg/mL lahus lisati 10 µg/ml vase (Cu), kaltsiumi (Ca), magneesiumi (Mg), tsingi (Zn), raua (Fe) lahusesse. ) või roti seerumit. Iga ühendit iga metallilahuse või seerumiga analüüsiti UPLC-ga. Fenüületanoidglükosiididel (1–3) ilmnes raua ja seerumiga metalli kelaatimise aktiivsus (joonis 5, lisamaterjalid, joonis S1).

2.6. Ehhinakosiidi (1) analüüs roti seerumis in vivo

Et mõista ehhinakosiidi jaotumist roti seerumis, koguti seerum algsest ajast kuni 720 minutini pärast ehhinakosiidi (1) suukaudset manustamist (100 mg/kg) ja analüüsiti UPLC-ga. Joonisel 6 on kujutatud ehhinakosiidi kontsentratsiooni ja aja profiile roti seerumis.

3. Arutelu

Dementsus, eriti AD, on pöördumatu vananemine ja krooniline haigus, mis toob kaasa Gordiuse küsimuste sõlme. See ületamatu haigus toob kaasa tõsiseid majandusprobleeme koos tohutu ja kasvava finantskoormusega. Kogu maailmas on AD-teadlased uurimiseks palju vaeva näinuduued AD-vastased ravimidkuid 2012. aastal ebaõnnestusid mitmed suured kliinilised uuringud, mis olid suunatud A-le. Välja arvatud otseselt A sihtmärgiks olev, peetakse metalliioonide homöostaasi ajus peamiseks põhjuseks, mis on seotud A agregatsiooni ja ladestumisega, mis põhjustab AD moodustumist. Seetõttu mängivad metalliioonid AD patogeneesis olulist rolli ja metalli kelaatimise hüpotees on muutunud oluliseks uurimissuunaks.

Meie varasemate uuringute kohaseltCTE näitas potentsiaalset dementsusevastast toimet. Isegi inimeste kliinilistes uuringutes ei näidanud Alzheimeri tõve hindamise skaala kognitiivse alamskaala (ADAS-cog) skoor pärast 1-aastast ravi CTE kapslitega mõõduka AT-ga patsientidel, võrreldes ravieelsega. CTE hoidis AD-patsientide ADAS-cog skoori stabiilsena, kuid teised retseptiravimid seda ei teinud. Ainus valik retseptiravimeid, millel on litsentsAD ravion atsetüülkoliinesteraasi inhibiitorid (AChEI-d), nagu donepesiil ja galantamiin, mis parandavad lühiajaliselt AD sümptomeid, kuid halvenemine toimub pärast 1-aastast ravi. Kliiniliste uuringute põhjal on CTE-l võimalus olla potentsiaalne ravimeetod AD-vastaste ainete väljatöötamisel. Meie varasemate aruannete põhjal kaitsevad ehhinakosiid (1), akteosiid (2) ja isoakteosiid (3) neuroneid A kahjustuste eest, vähendavad A oligomerisatsiooni in vitro ja parandavad oluliselt A in vivo põhjustatud kognitiivset düsfunktsiooni. In vitro uuring näitas, et 1–3 aktiivsed annused olid kuni 5{{10}} µg/ml. Siiski leiti varasemates uuringutes, et suukaudne 1 ja 2 biosaadavus oli rottidel väga madal (0,83% 1 ja 0,12% 2 puhul). Ühendit 1 ei olnud pärast ehhiaatsia tableti suukaudset manustamist võimalik isegi inimese seerumis tuvastada. Praegused uuringud näitavad, et 1–3-l oli halb membraani läbilaskvus ja imendumine soolerakkudes ning suurem osa 1-st metaboliseerus seedetrakti kanalites. Ühendi 2 sisaldus roti seerumis oli pärast 15-minutilist intravenoosset süstimist akteosiidi annusega 10 mg/kg vaid umbes 4,5 ug/ml. Kuid see uuring näitab, et pärast CTE suukaudset manustamist tuvastatakse roti ajukudede hipokampuses ja striatumis 1–3 (joonised 3 ja 4). Lisaks näitas joonis 6, et ühendi 1 sisaldus roti seerumis suurenes pärast ühendi 1 suukaudset manustamist (100 mg/kg) umbes 5 korda 15 minutilt 720 minutini. Arvasime, et CTE fenüületanoidglükosiidid läbivad hematoentsefaalbarjääri ja CTE ja metalli vahel tekivad kelaativad toimed. Kelaatimine on pöörduv keemiline reaktsioon. Raud on seerumi ja aju oluline element [10,40]. Joonisel 5 on näidatud, et kolmel fenüületanoidglükosiidil on raua ja seerumiga metalli kelaatimise aktiivsus. Raud ja seerum muudavad kolme fenüületanoidglükosiidi piigi retentsiooniaja pindala. Raua kelaatimine võib olla otsustav põhjus, mis viib fenüületanoidglükosiidide väga madala biosaadavuse väära tuvastamiseni. Seetõttu tuleks kolme CTE fenüületanoidglükosiidi vereseerumi ja ajuanalüüsis arvesse võtta metalli kelaatimise aktiivsust, et taastada tegelik biosaadavus ja farmakokineetika. Lisaks näitasid tulemused, et kolm fenüületanoidglükosiidi (1–3) läbivad hematoentsefaalbarjääri ja jõuavad keha vereringe kaudu ajukudedesse. Selles uuringus töötati välja kõige kiirem ja tundlikum meetod 1–3 analüüsiks, kasutades UPLC/MS/MS-i, ning andis võimsaid tõendeid selle kohta, et fenüületanoidglükosiidid (1–3) on CTE peamised bioaktiivsed koostisosad.

LOODUSLIK TUBULOOS ALŽEIMERI HAIGUSE VÄLTIMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Taimne materjal

C. tubulosa varred koguti 2016. aasta mais Hiinast Hangzhoust. Taim tuvastati Dr. Lin HC kviitungi näidiste (nr 20016CT) järgi, mis on hoiule antud Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Hiina.

4.2. Isoleerimine ja puhastamine

Kuivatatud C. tubulosa vars jahvatati pulbriks ja ekstraheeriti viis korda 75% EtOH-ga. Pärast lahusti aurustamist alandatud rõhul töödeldi toorekstraktiga makropoorse vaigu AB-8 kolonnkromatograafiaga H2O/EtOH gradientlahustisüsteemidega alates 20% EtOH kuni 100% EtOH. Õhekihikromatograafia kohaselt koguti edasiseks eraldamiseks neli fraktsiooni (Fr.1-Fr.4). Fr. 2 viidi läbi preparatiivse kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) COSMOSIL® 5C18-AR-II kolonnis (250 mm × 20 mm id, 5 µm), kasutades liikuva faasi süsteemina 18% atsetonitriili. Voolukiirus oli 15 ml/min. Selektiivselt koguti kolm peamist huvipakkuvat tippu. Sihtühendeid sisaldavad fraktsioonid kondenseeriti täiendavalt kuivaks ja saadi vastavalt 1, 2 ja 3.

4.3. Eksperimentaalne analüüs

1H ja 13C NMR spektrid saadi Bruker Avance DRX 500 MHz spektromeetritega (Billerica, MA, USA), kasutades sisestandardina tetrametüülsilaani (TMS). Ettevalmistav HPLC viidi läbi pöördfaasikolonni (Cosmosil C18-AR-II kolonn, 250 mm × 20 mm id; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Jaapan) Shimadzu LC-6AD seeriaga. aparaat Prominence HPLC UV-Vis detektoritega (Kyoto, Jaapan).

ehhinakosiid (1): valge pulber; ESI-MS m/z: 785 [M-H]-; 'H NMR (CD3OD, 5{44}} MHz): 8 1.{68}}7 (1H, d, J=6,2 Hz, Rha-H{11}}), 2,79 ( 2H, t, J=5,2 Hz, H-7), 3,56 (1 H, m, Ha-8), 3,79 (1 H, m, H{25}}), 3,91 (1 H, m, Hb-8), 4,29 (1 H, d, J=7,7, Glc-H-1), 4,38 (1 H, d, J {{4{ {80}}},9 Hz, H-10), 5.{{100}}0 (1H, t, J=9.6 Hz, H-40), 5,17 (1 H, d, J=1,5 Hz, Rha-H-1), 6,27 (1 H, d, J=15,9) Hz, H{61}}), 6,58 (1 H, dd, J=8,1, 2,0 Hz, H-6), 6,67 (1 H, d, J=8,1 Hz, H{75}}), 6,70 (1 H, d, J=2,0 Hz, H-2), 6,77 (1 H, d, J=8,2 Hz, H-500), 6,94 (1 H, dd, J=8,3, 2,0 Hz, H-600), 7,05 (1 H, d, J=2,0 Hz, H{101}}), 8 7,59 (1H, d, J=15,9 Hz, H{107}}); 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): 8 18,5 (Rha-C{115}}), 36,6 (C-7), 62,6 (Glc-C-6), 69,4 (C{{ 125}}), 70,5 (C-40), 70,6 (Rha-C-5), 71,5 (Glc-C-4), 72,0 (Rha-C{140}}) 72,3 (C{143}}), 72,4 (Rha-C{147}}), 73,8 (Rha-C{151}}), 74,7 (C{154}}), 75,1 (Glc-C) -2), 76,1 (C-20), 77,8 (Glc-C-5), 77,9 (Glc-C-3), 81,7 (C-30) , 103,1 (Rha-C-1), 104,2 (C-10), 104,7 (Glc-C-1), 114,7 (C-200), 115,3 (C{-1). 189}}), 116,3 (C-500), 116,5 (C-2), 117,1 (C-5), 121,3 (C-6), 123,3 (C{{ 204}}), 127,6 (C-100), 131,5 (C-1), 144,7 (C-3), 146,1 (C-4), 146,9 (C{{) 219}}), 148,2 (C-700), 149,8 (C-300), 168,5 (C-900) (joonis S3–S5).

Akteosiid (2): valge pulber; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): 8 0,94 (3H, d, J =5,9 Hz, H-6000 ), 2,68 (2H, m, H{15}}), 4,33 (1H, d, J=7,8 Hz, H{21}}), 4,70 (1H, t) , J=9.{{160}} Hz, H-400 ), 5.{{209}}1 (1H, s, H{{ 31}}), 6,18 (1 H, d, J=15,9 Hz, H-80), 6,48 (1 H, dd, J=7,9, 1,4 Hz, H{{ 45}}), 6,62 (1 H, d, J=7,1 Hz, H-5), 6,73 (1 H, d, J=2,0 Hz, H{57} }), 6,75 (1 H, d, J=7,9 Hz, H-50), 6,97 (1 H, d, J=8,1 Hz, H{69}}) 7,01 (IH, s, H{73}}), 7,44 (1H, d, J=15,8 Hz, H{79}}); 13C NMR: (DMSO-d6, 125 MHz): 8 18,2 (C{86}}), 35,1 (C{89}}), 60,8 (C{92}}), 68,8 (C{95}). }), 69,2 (C{98}}), 70,3 (C{101}}), 70,3 (C{104}}), 70,4 (C{107}}), 70,6 (C{110}). }), 71,7 (C-500), 74,5 (C-200), 79,2 (C-300), 101,3 (C-1000), 102,3 (C{125}). }), 113,6 (C-80), 114,7 (C-20), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50), 116,3 (C{140}). }), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60), 125,6 (C-10), 129,2 (C-1), 143,6 (C{155}). }), 145,0 (C-3), 145,0 (C-30), 145,6 (C-70), 148,5 (C-40), 165,7 (C{170}). } ) (joonised S6–S8). Isoakteosiid (3): valge pulber; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 'H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): 8 1,07 (3H, d, J {182}},1 Hz, H{184}}), 2,65 (2H, m, H{188}}), 4,35 (1 H, d, J=10,0 Hz, H{194}}), 5,10 (1 H, s, H{198}}), 6,27 (1 H, d, J{202}} 0,9 Hz, H-80), 6,45 (1 H, dd, J=8,0, 1,8 Hz, H{212}}), 6,58 (1 H, d, J{216}} 0,8 Hz, H{218}}), 6,73 (1H, d, J=1,6 Hz, H{224}}), 6,74 (1H, d, J=8,1) Hz, H{230}}), 6,94 (1 H, d, J=8,2 Hz, H-60), 7,04 (1 H, s, H{240}}), 7,46 ( 1 H, d, J=15,8 Hz, H{246}}); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): 8 17,9 (C{253}}), 35,2 (C{256}}), 63,5 (C{259}}), 68,2 (C{262}} ), 70,4 (C{265}}), 70,6 (C{268}}), 71,7 (C-8), 72,1 (C{274}}), 73,7 (C{277}} ), 74,1 (C-500), 74,5 (C-200), 80,9 (C-300), 100,7 (C{289}}), 102,7 (C{292}} ), 113,9 (C-20), 114,9 (C-80), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50), 116,3 (C-2 ), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60), 125,5 (C-10), 129,2 (C-1), 143,5 (C-4 ), 145,0 (C-3), 145,3 (C-30), 145,6 (C-70), 148,5 (C-40), 165,6 (C-90 ) (joonised S9–S11).

4.4. C. Tubulosa vesiekstrakti (CTE) valmistamine

C. tubulosa tüve pulbrit ekstraheeriti kaks korda püstjahutiga keetmisel veega 1,5 tundi ja ekstraktilahus filtriti. Filtreeritud vesiekstrakti (CTE) hoiti enne kasutamist temperatuuril 4 °C.

4.5. Loomamudel ja katseplaan

Selles uuringus kasutatud AD-sarnane roti mudel ja eksperimentaalne ajakava vastasid meie eelmises uuringus [19]. Pärast A 1–42 (300 pmol/päevas) infundeerimist ajuvatsakesse vähemalt kaks nädalat või kauem, anti AD-sarnastele rottidele järgmisel päeval suukaudselt CTE (200 mg/ml). Pärast 14-päevast manustamist surmati rotid ajukudede kogumiseks. Ülemääraste katsevigade vältimiseks ühendati neljalt üksikult rotilt võetud proovid üheks prooviks. Iga rühma kohta oli kolm proovi.

4.6. Kemikaalid ja reaktiivid

Metanool (HPLC klass) osteti firmalt Merck (Darmstadt, Saksamaa). Sipelghape (98% analüüsiks, ACS) osteti ettevõttest Panreac (Barcelona, ​​Hispaania). Atsetonitriil (HPLC klass) osteti firmalt JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA). Puhas vesi valmistati ELGA süsteemiga (Woodridge, UK). Hesperidiin osteti firmalt Chromadex ja seda kasutati sisestandardina (IS) UPLC analüüsi jaoks.

4.7. UPLC/MS/MS aparaat

UPLC/MS/MS analüüsiks kasutati Waters Acquity TQD üliefektiivset vedelikkromatograafiat (UPLC)/MS/MS süsteemi (Milford, MA, USA). Kromatograafilised katsed viidi läbi Acquity UPLC BEH C18 kolonnis (2,1 × 100 mm, 1,7 µm, Waters) gradientelueerimisel voolukiirusel 0,4 ml/min. Liikuv faas koosnes sipelghappest-veest (1:1000, maht/maht) (A) ja sipelghappe-atsetonitriilist (1:1000, maht/maht) (B). Ajaprogramm oli järgmine: 0–5 min, A–B (92:8, v/v) vahetati vastu A–B (62:38, v/v); 5–7 min, AB (62:38, v/v); 7-7,1 min, AB (62:38, v/v) muudeti A–B (92:8, v/v); 7,1–9 min, (92: 8, v/v). Negatiivse elektropihustusionisatsiooni (ESI) iooniallikaga UPLC/MS/MS süsteemi süstimismaht oli 5 µl. 1–3 koguioonkromatogrammid (TIC) viidi läbi mitme reaktsiooni jälgimise (MRM) režiimis. Massiparameetrid optimeeriti, et saada kõige selgemad ja kõrge intensiivsusega signaalid. Parimaks parameetrite valikuks olid 3000 V kapillaarpinge, 20 V koonuspinge, 125 ◦C lähtetemperatuur, 400 ◦C desolvatseerimistemperatuur, 50 l/h koonuse gaasivool, 900 l/h desolvatseerimisgaasi vool ja 38 eV kokkupõrge. energiat. Andmeid töödeldi MassLynx 4.1 (Milford, MA, USA) tarkvaraga.

4.8. Proovi ettevalmistamine

Roti ajukoes kasutati homogeniseerimiseks 50% metanooli (1 g kudet 5 ml metanooli kohta). Homogenaati tsentrifuugiti kiirusel 10, 000 p/min temperatuuril 4 °C 10 minutit. Supernatant (50 µL) koos 10 µL IS-ga (100 µg/mL) lisati 1 ml-le puhast vett. Segu laaditi ettevaatlikult Oasis HLB (hydrophilic-lipophilic balanced) padrunisse (Waters, Milford, MA, USA), mis oli juba elueeritud 1 ml metanooliga ja seejärel tasakaalustatud 1 ml veega vaakumi tingimustes. Pärast seda, kui kasseti pesemiseks kasutati 1 ml 10% metanooli, kasutati analüüsitud proovi saamiseks elueerimiseks 1 ml metanooli, mis viidi teise 1,5 ml Eppendorfi tuubi koos 10 µL 1% askorbiinhappe lahusega ja kuivatati aurustamisega. Lõpuks lahustati analüüsitud proovi jääk analüüsiks 200 µl 50% metanoolis.

4.9. Kalibreerimisstandardi kõvera ettevalmistamine

Ühendeid 1–3 kasutati kalibreerimisstandardite valmistamiseks, mis lisati vastavalt ajukoe homogenaadile ja hesperidiinile sisestandardina, et saada lõplikud kalibreerimisstandardi kontsentratsioonid, mis olid 1.0, 5.0, 1{{7 }}.0, 50,0 ja 100,0 ng/mL.

4.10. Kinnitamine

Kalibreerimise standardkõver saadi lineaarsustesti abil, kasutades viit erinevat kontsentratsiooni 1–3, vahemikes 1.0, 5.0, 10.0 , 50.0 ja 100,0 ng/mL ning seda peeti lineaarseks, määramiskoefitsiendiga üle 0,99 (R-ruut). Avastamise alumine piir (LLOQ), mis on määratletud kui ± 20% uuritava proovi kontsentratsioonist, tekitas pigem signaali piigi kui müra. Analüüsimeetodi usaldusväärsust ja täpsust hinnati, kasutades taastumistesti 10 ng/ml juures 1–3.

4.11. Metalli kelaatimise aktiivsuse analüüs

UPLC-d kasutati metalli kelaativa efekti analüüsimiseks, kasutades CTE fenüületanoidglükosiidide 1–3 50 µg/ml lahust, mis sisaldas 10 µg/ml vase, kaltsiumi, magneesiumi, tsingi, raua või roti seerumi metallilahust. Iga ühendit iga metallilahuse või seerumiga analüüsiti UPLC-ga. Metalli kelaatimise efekt muudaks vedelikkromatograafias retentsiooniaega 1–3 võrra. Metalli kelaativa efekti protsent arvutati järgmiselt ja andmed olid keskmised ± SD (n=3).

5. Kokkuvõtted

See uuring näitas, et 1–3 on CTE aktiivsed komponendid AD-vastase toime jaoks. Raua kelaatimisest on saanud uus kontseptsioon AD raviks mõeldud uue põlvkonna ravimite väljatöötamisel.CTE on potentsiaalne botaaniline AD-vastane Hiina meditsiinsihiks raua kelaatimise poolt indutseeritud A agregatsiooni ja ladestumist. Lisaks tõestasime, et 1–3 jõuavad ajju läbi vere-vere-aju barjääri (BBB). CTE aktiivsed komponendid ja nende aluseks oleva mehhanismi kinnitus aitavad tulevikus oluliselt kaasa tooteuuringute kvaliteedikontrollile ja biosaadavusele. Samal ajal on esitatud täiustatud ja tõhus analüüsimeetod kasulik 1–3 määramisel taimedes, toiduainetes, veres ja ajukoes keemiliste sõrmejälgede ja farmakokineetika uuringute jaoks.

LOODUSLIK TUBULOOS ALŽEIMERI HAIGUSE RAVIKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%