Cistanche Herbal on kroonilise ettearvamatu stressi korral antidepressantne toime

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li et al

ABSTRAKTNE

Hiljuti kinnitati, et Cistanche tubulosa, üks Cistanches Herba liik, omab antidepressantide efektiivsust kroonilise ettearvamatu stressi (CUS) rottidel, taastades soolestiku mikrobiota homöostaasi. Käesolevas artiklis püüame uurida C. tubulosa metaboolset profiili normaalsetel ja CUS-indutseeritud depressiivsetel mudelrottidel in vitro ja in vivo. Kasutades UPLC-Q-TOF-MS-i, uuritakse in vitro seedetrakti metabolismi.Cistanche tubulosa ekstrakt(CTE) hinnati nii normaalsetel kui ka CUS-rottidel. Samal ajal toimub CTE metabolism in vivo(Cistanche tubulosa ekstrakt)normaalsetel ja depressioonis rottidel uuriti ka roti uriini ja väljaheitega. Normaalsete ja CUS-rottide in vitro ja in vivometabolismist iseloomustati kokku 20 ja 26 metaboliiti. CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)metaboliseeriti aglükoonideks ja fenüületanoidglükosiidide (PhG) ja iridoidglükosiidide lagunemissaadusteks kas normaalse või depressiooniga roti soolestiku mikrobiota in vitro. Aglükoonide II faasi metaboliidid ning PhG-de ja iridoidglükosiidide lagunemissaadused olid peamised metaboliidid roti uriinis ja väljaheites. Lisaks oli metaboolne võime genereerida sekundaarseid glükosiide ja aglükoone depressiivses roti soolestiku mikrobiotas palju nõrgem kui normaalses roti soolestiku mikrobiotas, mis oli tingitud CUS-depressiivsete rottide soole mikrobiota poolt toodetud korrastamata glükosiidhüdrolaasidest. Selle uuringu tulemused panid aluse CTE antidepressantide omaduste metaboolse protsessi ja terapeutilise mehhanismi mõistmisele.

Märksõnad: Cistanche tubulosa, Depressioon, ainevahetus, in vitro, in vivo, soolestiku mikrobiota

1. Sissejuhatus

Cistanches Herba on ametlikult registreeritud kui kuivatatud mahlakad Cistanche deserticola (YC Ma) ja C. tubulosa (Schrenk) varred, mida kasutatakse neerupuudulikkuse, impotentsuse, naiste viljatuse, morbidleukorröa, rikkaliku metrorraagia ja seniilse kõhukinnisuse raviks [1]. Kaasaegsed farmakoloogilised uuringud on näidanud, et Cistanches Herbal on mitmesugused bioloogilised toimed, nagu neurodegeneratsioonivastane, immunoregulatsioon ja põletikuvastane toime [2,3]. Meie varasemad uuringud on seda kinnitanudCistanche tubulosa ekstrakt(CTE), mis koosnesid 48,6 protsendist fenüületanoidglükosiididest (PhG), 6,9 protsendist iridoidglükosiididest ja 2{5}},0 protsendist sahhariidide koguarvust, võivad märkimisväärselt leevendada kroonilise ettearvamatu stressi (CUS) põhjustatud depressiivsete rottide depressiivseid sümptomeid. soolestiku mikrobiota homöostaasi taastamine [4]. Hiljutised uuringud näitavad, et muutused soolestiku mikrobiota koostises olid seotud depressiooni tekke ja progresseerumisega [5,6]. Mikroobiperekondade suhteline arvukus oli CUS-depressiivsetel mudelrottidel normaalsete kontrollidega võrreldes märkimisväärselt häiritud [7]. Depressiooniga patsientidel muutus oluliselt ka soolestiku mikrobiota mitmekesisus ja rikkus [8]. Lisaks peeti Cistanches Herba [2,3] peamisteks koostisosadeks mitmesuguseid ühendeid, sealhulgas fenüületanoidglükosiide (PhG) ja iridoidglükosiide, mis metaboliseerusid kergesti sekundaarseteks glükosiidideks ja aglükoonideks, sealhulgas hüdroksütürosooliks (HT), 3,4-dihüdroksüfenetüüliks. glükosiid, deglükosüülitud geniposidhape jne inimese soolestiku mikrobiota poolt. Need metaboliidid imenduvad soolestiku kaudu kergemini ja avaldavad prototüübi komponendile vastavat bioloogilist aktiivsust[9–11]. Seega usume, et depressiooni esinemise ja arengu ajal mõjutab soolestiku mikrofloora struktuuri häire lisaks peremeesorganismi füsioloogilisele seisundile paratamatult ka suukaudsete traditsiooniliste hiina ravimite (TCM) metabolismi seedetraktis. Enamik olemasolevatest Cistanches Herba metaboolsetest andmetest pärinevad tervete loomade metaboolsetest uuringutest[12–15]. Seetõttu oleks CTE metaboolse profiili uurimine kliiniliselt olulisem(Cistanche tubulosa ekstrakt)patoloogilises seisundis selle bioaktiivsete komponentide selgitamisel ja selle antidepressiivse efektiivsuse toimemehhanismi mõistmisel.

Käesolevas uuringus on meie eesmärk iseloomustada CTE metaboolseid profiile(Cistanche tubulosa ekstrakt)nii tervetel kui ka CUS-indutseeritud depressiivsetel mudelrottidel üliefektiivse vedelikkromatograafia kvadrupoolilise lennuaja massispektromeetria (UPLC-Q-TOF-MS) abil. CTE metaboolse protsessi simuleerimiseks on kasutatud normaalsete ja depressiivsete patoloogiliste rottide maomahla, soolevedelikku ja mikrobiot(Cistanche tubulosa ekstrakt)seedetraktis in vitro, iseseisvalt ja järjestikku. In vivo metaboliidid selgitatakse välja ka pärast CTE suukaudset manustamist(Cistanche tubulosa ekstrakt)normaalsetel ja CUS-rottidel. See uuring annab uue ülevaate CTE metabolismist ja aktiivsetest metaboliitidest(Cistanche tubulosa ekstrakt)depressiooni jaoks.

2. Materjal ja meetodid

2.1. Materjal

C. tubulosa kuivatatud varred koguti Hetiani maakonnast (Xinjiang, Hiina). Voucheri näidised kinnitas prof Xiaobo Li ja deponeeriti Shanghai Jiao Tongi ülikooli farmaatsiakooli herbaariumis (Shanghai, Hiina). Ekstraheerimismeetodit kasutati nii, nagu on kirjeldatud meie eelmises väljaandes [4]. TheCistanche tubulosa ekstrakt(CTE) proove hoiti 4 kraadi juures ja lahustati enne kasutamist uuesti steriilses vees. CTE steriilsed vesilahused(Cistanche tubulosa ekstrakt)Seejärel filtriti proov läbi 0,22 μm membraani ja filtraadid koguti steriilsetesse katsutitesse.

Ehhinakosiidi andis dr. Pengfei Tu Pekingi ülikooli labor (Peking, Hiina). Akteosiid, isoakteosiid, 2'-atsetüüllakteosiid ja tsistanosiid A osteti ettevõttelt Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Chengdu, Hiina). Hüdroksütürosool, kohvhape, 3,4-dihüdroksübenseenpropioonhape, 3-hüdroksüfenüülpropioonhape ja 3-fenüülpropioonhape osteti ettevõttelt Aladdin IndustrialInc. (Shanghai, Hiina). Iga komponendi puhtus määrati HPLC-UV abil > 95%. HPLC puhtusastmega atsetonitriil osteti firmalt Merck (Darmstadt, Saksamaa). Deioniseeritud vesi valmistati destilleeritud veest, kasutades Milli-Q veepuhastussüsteemi (Millipore, Bedford, MA, USA). Kõik muud kasutatud reaktiivid ja kemikaalid olid analüütilise puhtusega.

2.2. Loomkatsed

Isased Sprague-Dawley rotid (200 ± 20 g) hangiti ettevõttest Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Peking, Hiina) ja majutati Shanghai JiaoTongi ülikooli laboriloomade keskuses (Shanghai, Hiina). Loomi hoiti rühmas kontrollitud toatemperatuuril (25 ± 2 kraadi, suhteline õhuniiskus 55 ± 10 protsenti) 12:12-tunnise valguse-pimeduse tsükliga. Rottidel võimaldati ühe nädala jooksul vaba juurdepääs tavalistele laborirottide toidule ja veele. Loomade rajatised ja protokollid kiitis heaks Shanghai Jiao Tongi ülikooli (Shanghai, Hiina) loomade eetikakomitee.

Pärast ühenädalast aklimatiseerumist jagati kaksteist naiivset rotti juhuslikult kahte rühma (n=6), kontrollrühma ja kroonilise ettearvamatu stressi (CUS) rühma. CUS-rotid töötati välja nagu meie eelmises aruandes [4], mis allutati mitmesugustele stressiteguritele: valge müra (100 dB) 1 tund, üleöö madala intensiivsusega stroboskoopiline valgustus (120 välku/min), veepuudus 24 tundi, tühi. veepudelid 1 h (peale veepuudust), toidupuudus 24 h, füüsiline vaoshoitus (1-2 h), sundujumine (5 min), määrdunud puur 24 h (200 ml vett 100 g saepuru allapanu), saba pigistus ( 1 min), šokk 30 minutit, 45-kraadine puuri kalle 24 tundi ja üleöö valgustus (12 tundi). Stressifaktoreid rakendati pidevalt ja juhuslikult 4 nädala jooksul, üksikasjalikku korraldust on kirjeldatud tabelis S1. Pärast 4-nädalast stressi viidi läbi sahharoosieelistuse test, avatud väli test ja uudsuse allasurutud söötmise test, nagu eelnevalt kirjeldatud [4]. CUS-i ja käitumiskatse ülevaade on näidatud joonisel S1. Pärast käitumisteste võeti igalt rotilt vähemalt 4 fekaaligraanulit ja pandi steriilsesse koonilisse torusse CTE in vitro analüüsimiseks.(Cistanche tubulosa ekstrakt)ainevahetus.

2.3. CTE seedetrakti metabolism(Cistanche tubulosa ekstrakt)normaalsete ja CUS-rottide poolt in vitro

2.3.1. CTE metabolism(Cistanche tubulosa ekstrakt)simuleeritud mao- ja soolemahlas

Viiskümmend milligrammi CTE-d(Cistanche tubulosa ekstrakt)lisati vastavalt 10 ml simuleeritud maomahlale ja soolemahlale. Siis CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)inkubeeriti 37 kraadi juures 4 h maomahlas ja 6 h soolemahlas. Kultiveeritud segu (1 ml) kustutati 3 ml veega küllastunud n-butanooliga kohe 0 ja 4 tunni pärast maomahlas ning 0 ja 6 tunni pärast soolemahlas. Kasutatud proovi töötlemismeetod oli selline, nagu eelnevalt kirjeldatud [9].

2.3.2. CTE metabolism(Cistanche tubulosa ekstrakt)normaalse ja CUS roti soolestiku mikrobiota poolt

Värsked normaalsed ja CUS-rottide väljaheiteproovid segati esmalt ja homogeniseeriti 25-kordse GAM-puljongi mahuga. Setted eemaldati filtreerimisega läbi kolme marlitüki. Seejärel inkubeeriti suspensiooni 37 kraadi juures anaeroobses inkubaatoris, milles õhk asendati gaasiseguga (H2 5 protsenti, CO2 10 protsenti, N2 85 protsenti). 50 milligrammi CTE lisati eraldi 5 ml normaalsele ja CUS roti väljaheite suspensioonile ning suspensiooni inkubeeriti 37 kraadi juures 48 tundi. Kultiveeritud segu eemaldati ja ekstraheeriti veega küllastunud butanooliga 0, 12, 24 ja 48 tunni pärast. Proovide töötlemise meetodit kirjeldati varem [9].

2.3.3. CTE järjestikune metabolism(Cistanche tubulosa ekstrakt)maomahla, soolemahla, normaalse ja CUS-rottide soolestiku mikrobiota poolt

Esiteks 100 mg CTE-d(Cistanche tubulosa ekstrakt)lisati 1{{10}} ml simuleeritud maomahlale ja inkubeeriti 37 kraadi juures 4 tundi. Kogu reaktsioon peatati 3-kordse mahuga veega küllastunud n-butanooliga ja tsentrifuugiti 15 minutit kiirusel 3000 p/min, millele järgnes supernatandi aurustamine lämmastikuvoolu all. gaas 37 kraadi juures. Teiseks lahustati jääk uuesti 0,4 ml steriilses vees, lisati 8 ml simuleeritud soolemahlale ja inkubeeriti 37 kraadi juures 6 tundi. Samal viisil valmistati proov maomahlaga. Lõpuks lahustati jääk uuesti 0, 3 ml steriilses vees, lisati vastavalt 6 ml normaalsele ja CUS roti väljaheite suspensioonile ja inkubeeriti 37 kraadi juures 48 tundi anaeroobses inkubaatoris. Üks milliliiter reaktsioonist kustutati 3 ml veega küllastunud n-butanooliga kohe 0 ja 4 tunni pärast maomahlas, 0 ja 6 tunni pärast soolemahlas ning 0, 12, 24 ja 48 tunni pärast roti soolestiku mikrobiotas. . Proovi töödeldi identselt CTE-ga(Cistanche tubulosa ekstrakt)simuleeritud maomahlas.

2.4. CTE metabolism(Cistanche tubulosa ekstrakt)normaalsete ja CUS-rottide poolt in vivo

Iga rott kahes rühmas paigutati seejärel individuaalsesse metaboolsesse puuri. Pärast üleöö paastumist, mis võimaldas ainult vaba juurdepääsu veele, manustati kõikidele rottidele suu kaudu agastraalsondi kaudu 2 ml vett. Tühjad uriini- ja väljaheiteproovid koguti kõigilt rottidelt ajavahemikus 0 h kuni 12 h. Lisaks CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)(400 mg/kg) manustati sondiga. Uriini- ja väljaheiteproovid koguti 0 kuni 24 tundi. Kõik uriini- ja väljaheiteproovid säilitati kohe -80 kraadi juures.

Normaalsete ja CUS-rottide uriini- ja väljaheiteproove töödeldi eelnevalt kirjeldatud viisil [12]. Kõiki saadud proove analüüsiti UPLC-Q-TOF-MS abil.

2.5. Analüütiline meetod

UPLC viidi läbi Waters ACQUITY UPLC süsteemiga (WatersCorp., Milford, MA, USA) kolonniga ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm × 2,1 mm sisemõõt, 1,7 μm, Waters Corp. , USA) gradientelueerimise teel, kasutades {{10}},1 protsenti sipelghappe atsetonitriili (A) ja 0,1 protsenti sipelghapet vees (B) voolukiirusel 0,4 ml/min . Gradiendi profiil oli: 0–5 min (A: 5–20 protsenti), 5–7,5 min (A: 20–30 protsenti), 7,5–10 min (A: 30–70 protsenti), 10–11 min (A : 70–100 protsenti) ja hoiti 1,5 minutit. Gradient taaskasutati 5 protsendini 0,5 minutiga ja seda hoiti järgmise jooksu jaoks 2,5 minutit. Süstimismaht oli 3 μL. Kolonnahju temperatuur oli seatud 35 kraadini.

Massispektromeetria viidi läbi, kasutades Waters Vion IMS massispektromeetrit (Waters Corp., Milford, MA, USA). Ioniseerimine viidi läbi negatiivse elektropihustus (ESI−) režiimis. MS parameetrid olid järgmised: kapillaarpinge, −2.0 kV; koonuse pinge, 20 V; lähtetemperatuur, 120 kraadi ; desolvatsioonitemperatuur, 500 kraadi ; koonuse ja desolvatatsiooni gaasivoolud vastavalt 50 ja 1000 l/h. Massi täpseks mõõtmiseks kasutati [M-H]-iooni (m/z 554,2615) tekitamiseks luku massina leutsiini-enkefaliini. MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) katse kahe skaneerimisfunktsiooniga viidi läbi järgmiselt: funktsioon 1 (madal energia): m/z 50–1000, 0,25 s skaneerimisaeg, 0,02 s skaneerimise vaheline viivitus, 6 eV kokkupõrkeenergia; funktsioon 2 (suur energia): m/z50–1000, skaneerimisaeg 0,25 s, skaneerimisevaheline viivitus 0,02 s, kokkupõrke energiaramp 20–45 eV.

2.6. Andmetöötlus

Andmeid töödeldi UNIFI 1.8.1 tarkvara abil (Waters Corp., Milford, MA, USA) metaboliitide tuvastamiseks MSE kaudu kogutud täpsete täisskaneerimise algandmete raames. Ühendid identifitseeriti täpse massi, fragmentide põhjal suure energiaga massispektromeetrias. Intensiivsuse läveks määrati 100,0. Sihtmärgi tuvastamine, fragmentide sobitamise tolerants ja muud parameetrid määrati automaatselt.

3. Tulemused

3.1. Käitumismuutused CUS-i põhjustatud depressiooni rotil

CUS-i indutseeritud depressiivsete sümptomitega rotte hinnati käitumistestidega, sealhulgas sahharoosieelistuse test, avatud väli test ja uudsuse allasurutud söötmise test. Studenti t-test näitas, et sahharoosieelistus sahharoosieelistuste testis (p < 0,001),="" kogu="" läbitud="" vahemaa="" avamaa="" testis="" (p="">< 0,001)="" ja="" söömise="" latentsus="" uudse="" toitumise="" testis="" (p="">< 0,01)="" olid="" olulised.="" erinev="" võrreldes="" kontrollrühmaga="" pärast="" 4-nädalast="" cus-ravi="" (joonis="" 1).="" need="" leiud="" näitasid,="" et="" kroonilise="" ettearvamatu="" stressi="" mudel="" on="" edukalt="" välja="">

3.2. CTE keemiliste koostisosade iseloomustus(Cistanche tubulosa ekstrakt)

CTE prototüübi koostisosade põhjalik analüüs(Cistanche tubulosa ekstrakt)viidi läbi UPLC-Q-TOF-MS abil. Kokku 27 komponenti CTE-st(Cistanche tubulosa ekstrakt)tuvastati ja esialgselt iseloomustati, sealhulgas 20 PhG-d, 5 iridoidi ja iridoidglükosiidi ning 2 oligosahhariidi. Üksikasjalik teave, sealhulgas retentsiooniaeg, täpne MS ja MS/MS fragmentioonid, on loetletud tugiteabes (tabel S2), et anda ülevaade nende keemiliste koostisosade struktuurist. CTE UPLC-Q-TOF-MS kogu ioonkromatogramm (TIC) on näidatud joonisel S2.

3.3. CTE seedetrakti metabolism(Cistanche tubulosa ekstrakt)normaalsete ja CUS-rottide poolt in vitro

Selles uuringus CTE potentsiaalsed metaboliidid(Cistanche tubulosa ekstrakt)normaalsete ja CUSrats in vitro tuvastati TIC-dest ja identifitseeriti elementkompositsioonide ja MS/MS fragmentide massispektri kombinatsiooniga pärast nende võrdlemist kontrollproovidega. Kõik CTE metaboliidid(Cistanche tubulosa ekstrakt)simuleeritud mao- ja soolemahlades on tabelis 1 loetletud normaalne ja CUS roti soolestiku mikrobioota.

3.3.1. CTE metabolism(Cistanche tubulosa ekstrakt)simuleeritud mao- ja soolemahlas

Seitse CTE metaboliiti(Cistanche tubulosa ekstrakt)simuleeritud maomahlas identifitseeriti esialgselt täpse massi ja MSE fragmendi teabe põhjal: M1 (m/z315,1074, C14H20O8, 1,66 min), M4 (m/z 459,1501, C20H28O12, 2,36 min), M5 (m/z 45,0,1 H 145,10. 2,60 min), M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min), M12 (m/z 785,2481, C35H46O20, 4,77 min), M16 (m/z 827,2580, C37H48O21, M3,/6,8 ja 1,8 min). .1968, C29H36O15, 5,81 min). Deglükosüülimist, dehüdroksüülimist, dehüdrogeenimist ja isomerisatsiooni peeti CTE peamisteks metaboolseteks radadeks maomahlas. Leiti, et M4 ja M5 molekulmass on 2 Da ja 16 Da võrra madalam kui nende prototüübikomponendil dekofeoüüllakteosiidil ja seega tuvastati need vastavalt selle dehüdrogeenitud ja dehüdroksüülitud toodetena. M12 tuvastati ehhinakosiidi isomeerina, mis toodab samu ioone kui ehhinakosiidi m/z 623,2178, 477,1601, 315,1055, 161,0237.

Samad metaboliidid tuvastati pärast CTE-d(Cistanche tubulosa ekstrakt)inkubeerimine soolemahlas. Tähelepanuväärne on, et PhG-des C-6′ asendis olev kofeoüülrühm metaboliseeriti kergesti soolemahla seedeensüümide poolt, et toota selle dekofeüülmetaboliite ja kofeiinhapet.

3.3.2. CTE metabolism(Cistanche tubulosa ekstrakt)normaalse ja CUS roti soolestiku mikrobiota poolt

Kokku on CTE-st biotransformeerunud 20 metaboliiti(Cistanche tubulosa ekstrakt)normaalses rotisoole mikrobioota tuvastati ja tuvastati (joonis 2). Nende tulemuste põhjal täheldati, et PhG-d lagunesid aglükoonhüdroksütürosooliks (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 min) ja kohvhappeks (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min) metaboliseerusid edasi M3-ks (m/z 163,0390, C9H8O3, 2,02 min), M6-ks (m/z181,0501, C9H10O4, 2,76 min), M10-ks (m/z 195,0655, C10H12O4, C10H12O4, C10H12O4, 4,15) ja 4,15. , C9H10O3, 4,36 min) läbi dehüdroksüülimise, redutseerimise ja metüülimise. Lisaks on tsentraalsed metaboolsed rajad, mis toodavad CTE-st PhG prototüüpühendite otseseid metaboliite normaalses roti soolestiku mikrobiotas, redutseerimine, metoksüleerimine, deglükosüülimine, kofeoüülrühm, dehüdrogeenimine ja isomerisatsioon.

Pärast inkubeerimist CUS-indutseeritud depressioonis roti soolestiku mikrobiota, CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)muudeti 20 metaboliidiks samade metaboolsete radade kaudu nagu normaalsetel rottidel.

3.3.3. CTE järjestikune metabolism maomahla, soolemahla, normaalse ja CUS roti soole mikrobiota poolt

Pärast järjestikust inkubeerimist maomahlas, soolemahlas, normaalses ja CUS roti soolestiku mikrobiotas, CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)metaboliseeriti 14 metaboliidiks (sealhulgas 8 maomahlaga, 7 soolemahlaga, 11 normaalse ja 10 CUS-i roti soolestiku mikrobiotaga). Nende hulgas olid M2(HT) ja M11 (3-hüdroksüfenüülpropioonhape, 3-HPP) PhG-de lõplikud metaboliidid pärast CTE järjestikust inkubeerimist.(Cistanche tubulosa ekstrakt)maomahlas, soolemahlas ja soolestiku mikrobiotas. Normaalsete ja CUS-rottide metaboliitide osas ei esinenud olulist erinevust.

M8, M9, M14, M17, M19 ja M20 tuvastati CTE sõltumatus metabolismis ainult normaalse ja CUS-i roti soolestiku mikrobiota poolt. Need metaboliidid olid peamiselt metaboolsed vahesaadused, mis olid CTE järjestikuse metabolismi uurimisel täielikult metaboliseerunud lõplikeks metaboliitideks ja seetõttu on neid raske tuvastada.

3.3.4. Erinevused CTE metaboolse kiiruse vahel normaalse ja CUS-i rotisoole mikrobiota järgi

Et selgitada erinevusi CTE ainevahetuse kiiruse vahel(Cistanche tubulosa ekstrakt)Normaalse ja CUS roti soolestiku mikrobiota järgi määrati 27 prototüübi ühendi ja 20 metaboliidi suhteline sisaldus pärast inkubeerimist maomahla, soolemahla, normaalse ja CUS roti soolestiku mikrobiotaga eraldi ja järjestikku (tabelid S3 ja S4). Tulemused näitasid, et kuigi CTE vahel olulisi erinevusi ei olnud(Cistanche tubulosa ekstrakt)normaalsete ja depressiivsete rottide metaboliitidega, täheldati olulist erinevust nende ainevahetuse kiirustes. Näiteks C2 ja C5 identifitseeriti 8-epilogaanhappe või selle isomeerina. Need metaboliseerusid normaalsetes proovides täielikult 12-tunnise inkubatsiooni jooksul. Patoloogiliselt depressiooniga rottide soolestiku mikrobiotas metaboliseerusid nad aga pärast 48-tunnist inkubeerimist põhjalikult. Oli ilmne, et normaalsete rottide ainevahetuse kiirus oli kiirem kui CUS-rotil. Sarnased tulemused avastati C18-st (isoakteosiid). Lisaks on tähelepanuväärne, et M12 (ehhinakosiidi isomerisatsioon) ja M16 (tubulosiidi A isomerisatsioon) piigi pindala normaalsetes proovides oli palju suurem kui CUS-i proovides, mis näitab, et CTE isomerisatsioonireaktsioon(Cistanche tubulosa ekstrakt)oli tavalisem roti soolestiku mikrobiota korral rohkem kui roti soolestiku depressiooni korral.

3.4. CTE metabolism normaalsete ja CUS-rottide poolt in vivo

Võrreldes CTE-ga töödeldud rühma bioloogilisi proove tühjade bioloogiliste proovidega, saadi kokku 26 CTE metaboliiti (ühendid 1–26).(Cistanche tubulosa ekstrakt)tuvastati ebanormaalsed ja CUS-rotid (tabel 2). Tavalised ja CUS-rottide uriiniproovide tüüpilised UPLC-kromatogrammid on toodud joonisel 3.

3.4.1. CTE metaboliitide iseloomustus normaalses ja CUS-raturiinis

Kokku 18 CTE in vivo metaboliiti(Cistanche tubulosa ekstrakt)normaalsetes rottide uriiniproovides tuvastati esialgselt. PhG-de, sealhulgas HT ja CA, lagunemise metaboliidid ning nende edasised sulfatsiooni (ühendid 1, 2, 3, 5, 8 ja 16), metüülimise (6, 21, 22 ja 24) ja metoksülatsiooni (13 ja 14) metaboliidid olid peamised metaboliidid roti normaalses uriinis. Iridoidglükosiidid metaboliseerusid kergesti aglükoonideks (23, 25 ja 26) deglükosüülimise teel. Tähelepanuväärne on, et normaalses roti uriiniproovis prototüübi komponenti ei tuvastatud.

Depressiivsete rottide uriiniproovis 22 CTE metaboliiti(Cistanche tubulosa ekstrakt)tuvastati ja iseloomustati. Patoloogilises roti uriinis tuvastati üks prototüüpühend, 8-epilogaanhape. Teised metaboliidid vastasid normaalses roti uriinis leidudele, sealhulgas sulfaaditud metaboliidid (1, 2, 3, 8, 10 ja 16), metüülitud metaboliidid (6, 11, 19 ja 22), metoksüülitud metaboliidid (13 ja 14). HT ja CA ning iridoidglükosiidide teaglükoonid (25 ja 26).

3.4.2. CTE metaboliitide iseloomustus(Cistanche tubulosa ekstrakt)tavalistes ja CUS-rottide väljaheidetes

Selles uuringus oli ainult üks CTE metaboliit (ühend 20, 3-HPP).(Cistanche tubulosa ekstrakt)tuvastati normaalsetes roti väljaheidetes. Enamik PhG-sid lagundati esmalt CA-ks ja seejärel metaboliseeriti edasi selle peamiseks mikroobse metaboliidiks 3-HPP. CUS-roti väljaheiteproovis iseloomustati 3 metaboliiti, sealhulgas sulfaaditud 3-HPP (ühend 16) ja sulfaaditud HT (ühendid 2 ja 3).

3.4.3. Erinevused CTE in vivo metaboliitide vahel normaalsetes ja CUSrottides

Pärast CTE suukaudset manustamist(Cistanche tubulosa ekstrakt), näitasid in vivo metaboliidid tervetel ja depressiivsetel mudelrottidel ilmseid erinevusi. Nii tervete kui ka CUS-rottide proovides tuvastati 21 metaboliiti (ühendid 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 ja 19–26). Ühend 23 (deglükosüülitud geniposidhape) tuvastati ainult tervete rottide proovides, samas kui ühendid 4 (HT), 7 (8-epilogaanhape), 15 (3, 4-dihüdroksübenseenpropioonhape) ja 18 ({{ 19}}HPP glükuroniidi konjugatsioon) tuvastati ainult CUS mudelrottide proovides. Kokkuvõttes tuvastati prototüübi koostisosad ainult CUS-rottidel, samas kui normaalsetel rottidel avastati rohkem II faasi metaboliite.

4. Arutelu

Selles uuringus kasutati CTE gastrointestinaalse metaboolse profiili uurimiseks sõltumatult ja järjestikku kolme in vitro inkubatsioonimudelit, sealhulgas maomahla, soolemahla, normaalset ja CUS-i roti soolestiku mikrobioota.(Cistanche tubulosa ekstrakt)in vitro. Leiti, et PhGsand iridoidglükosiidid CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)CUS-indutseeritud depressiivse roti soolestiku mikrobiota metaboliseeriti kergesti nende sekundaarseteks glükosiidideks ja aglükoonideks. Pärast seda CTE metabolismi in vivo(Cistanche tubulosa ekstrakt)kontrolliti ka normaalsetel ja CUS-rottidel. Kavandatavad metaboolsed teed CTE jaoks(Cistanche tubulosa ekstrakt)tervetel ja CUS-indutseeritud depressiivsetel rottidel on näidatud joonisel 4. PhG-d, nagu ehhinakosiid ja akteosiid, metaboliseerusid HT-ks ja CA-ks ning CA metaboliseeriti edasi oma peamiseks mikroobseks metaboliidiks 3-HPP. Seejärel metaboliseeriti HT, CA ja 3-HPP nende sulfaaditud, metüleeritud ja metoksüleeritud metaboliitideks. Iridoidglükosiidid, sealhulgas geniposidhape, kankanosiid A ja kankanosiid N, metaboliseerusid nende aglükoonideks deglükosüülimise teel. Need näitasid veel, et PhG-d ja iridoidglükosiidid CTE-s(Cistanche tubulosa ekstrakt)metaboliseerusid CUS-rottidel kergesti sekundaarseteks glükosiidideks ja aglükoonideks. Nendel metaboliitidel on tavaliselt parem imendumine soolestikus ja biosaadavus, et seejärel imenduda verre, et avaldada bioloogilist aktiivsust [16–18]. Väärib märkimist, et isomerisatsioon oli seedetraktis levinud PhG-de puhul, asjakohased metaboliidid tuvastati pärast nende prototüüpühendite UPLC retentsiooniajaga võrdlemist optimeeritud ideaalse UPLC gradiendi profiili põhjal.

Kofeiinhape oli CTE peamine lagunemissaadus(Cistanche tubulosa ekstrakt)depressiivse patoloogilise roti soolestiku mikrobiota poolt. Varasemates väljaannetes on teatatud, et kofeiinhape avaldab hiirte sunnitud ujumistestis antidepressiivseid toimeid. Nii ajust pärineva neurotroofse faktori (BDNF) mRNA tase eesmises ajukoores kui ka TrkB mRNA tase amügdalas langes pärast sunnitud ujumistesti oluliselt ning kohvhape pärssis eelmist vähenemist märkimisväärselt [19]. Hüdroksütürosool oli PhG-de aglükoon, mis kaitseb neurogeneesi ja kognitiivset funktsiooni, vältides stressist põhjustatud närvivalgu BDNF allareguleerimist [20]. Seega on vaja pöörata rohkem tähelepanu mõnedele bioaktiivsetele metaboliitidele (st HT ja CA), mis on pärast suukaudset manustamist muudetud soole mikrobiota poolt.

Lisaks annavad praegused leiud tõendeid selle kohta, et depressiivse soolestiku mikrobiota puhul oli metaboolne võime sekundaarseid glükosiide ja aglükoone genereerida märkimisväärselt nõrgem kui ebanormaalse roti soolestiku mikrobiota. Põhjuseks on tõenäoliselt depressiooni põhjustatud soolestiku mikrobiota struktuursed muutused, mis põhjustavad soolestiku mikrobiota poolt toodetavate metaboolsete ensüümide aktiivsuse vähenemist [21]. Huvitaval kombel näitas eelmine uuring, et sugukond Bacteroidetes kodeeris kõige enam glükosiidhüdrolaasi ja polüsahhariidlüaasi geene glükosiidide hüdrolüüsiks ja komplekssete süsivesikute lõhustamiseks koos eliminatsioonimehhanismiga [22]. Täpsemalt, Bacteroides spp. sealhulgas B. caccae, B. dorei, B. finegoldii, B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis ja B. ksülanisolvenid näitasid domineerivat GH-sid ja PL-sid kodeerivate geenide koguarvu. Parabacteroides distasonisel on samuti samad omadused [22]. Meie varasemad uuringud kinnitasid, et 28-päevane krooniline ettearvamatu stressistimulatsioon vähendas sugukondade Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas ja Weissella suhtelist arvukust, samas kui rottidel suurenes Ruminococcus ja Deinococcus [4]. On tähelepanuväärne, et Bacteroides ja Parabacteroides olid kaks kõige arvukamat mikroobset taksonit, mille suhteline arvukus normaalsetel rottidel oli ligikaudu 20 protsenti. Pärast CUS-ravi langes Bacteroides'i ja Parabacteroides'i suhteline arvukus depressiivsetel mudelrottidel järsult ligikaudu 5 protsendini. Seetõttu põhjustab see paratamatult GH ja PL ensüümide koguarvu vähenemist CUS-rottidel ning häirib veelgi CUS-i depressiivse soolestiku mikrobiota deglükosüülitud reaktsiooni pärast CTE suukaudset manustamist.(Cistanche tubulosa ekstrakt)mudelrottidel.

5. Järeldus

Käesolevas uuringus loodi UPLC-Q-TOF-MS tehnika ja seda rakendati metaboliitide skriinimiseks ja tuvastamiseks.Cistanche tubulosa ekstraktnormaalsetel ja CUS-depressiivsetel rottidel in vitro ja in vivo. Tulemused näitasid, et CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)nii terve kui ka depressioonis soolestiku mikrobiota metaboliseeriti aglükoonideks ja PhG-de ja iridoidglükosiidide lagunemissaadusteks. Pärast CTE suukaudset manustamist(Cistanche tubulosa ekstrakt), II faasi aglükoonide metaboliite ning PhG-de ja iridoidglükosiidide lagunemissaadusi leiti peamiselt rottide uriinis. Metaboolne võime genereerida sekundaarseid glükosiide ja aglükoone depressiivses rottisoole mikrobiotas oli palju nõrgem kui normaalse roti soolestiku mikrobiootas, mis oli tingitud CUS-depressiivsete rottide soolestiku mikrobiota poolt toodetud korrastamata glükosiidhüdrolaasidest. See uuring annab uue perspektiivi hilisematele uuringutele. CTE arendamine(Cistanche tubulosa ekstrakt)potentsiaalse antidepressandina.

Tänuavaldused

Seda tööd toetasid Hiina riikliku võtmeuuringute ja arendustegevuse programmi (2017YFC1702400) toetused.

Lisa A. Täiendavad andmed

Selle artikli täiendavaid andmeid leiate veebist aadressil HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

Päritolu: ' In vitro ja in vivo metabolismCistanche tubulosa ekstraktnormaalsetel ja kroonilistel ettearvamatutel stressist põhjustatud depressiivsetel rottidelYang Li et al

---Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728

Viited

[1] Chinese Pharmacopoeia Commission, The Pharmacopeia of the People's Republic of China, 2015 väljaanne, China Medical Science Press, Peking, Hiina, 2015, lk. 135 I osa.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Cistanche liikide keemiliste koostisosade analüüs, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: ülevaade selle keemiast, farmakoloogiast ja farmakokineetikast, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, antidepressantide sarnased toimedCistanche tubulosa ekstraktkroonilise ettearvamatu stressiga rottidel soolestiku mikrobiota homöostaasi taastamise kaudu, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Soolestiku-aju telg: kuidas mikrobioom mõjutab ärevust ja depressiooni, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Hiljutised arengud soolestiku mikrobiota rolli mõistmisel aju tervises ja haigustes, Ann. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Variations in soolestiku mikrobiota ja väljaheite metaboolne fenotüüp, mis on seotud depressiooniga 16S rRNA geenijärjestuse ja LC/ MS-põhine metaboloomika, J. Pharm. Biomed. Anal. 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Bluesi ülekandmine: depressiooniga seotud soolestiku mikrobiota indutseerib neuro-käitumuslikud muutused rottidel, J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Cistanches Herba veeekstrakti metabolism inimese seedetraktis in vitro: metaboolse profiili selgitamine, mis põhineb ulatuslikul metaboliitide tuvastamisel maomahlas, soolestikus mahl, inimese soolebakterid ja soolestiku mikrosoomid, J. Agric. Food Chem. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Inimese soolebakterite poolt toodetud ehhinakosiidide metaboliitide identifitseerimine ultra-performance-vedelikkromatograafia/kvadrupoolse lennuaja massispektromeetria abil, J. Põllumajandus. Food Chem. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Cistanches Herba kolme tüüpilise fenüületanoidglükosiidide metaboliidi sõelumine ja tuvastamine inimese soolebakterite poolt, kasutades UPLC/Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomed. Anal. 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Cistanche deserticola ja C. tubulosa vesiekstrakti metaboliitide kiire sõelumine ja erinevuste tuvastamine rottidel UPLC-ga. Q-TOF-MS kombineeritud mustrituvastuse analüüs, J. Pharm. Biomed. Anal. 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Cistanche tubulosa ehhinakosiidi ja akteosiidi metaboliitide süstemaatiline iseloomustamine roti plasmas, sapis, uriinis ja väljaheites UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, lähenemine järjestikuste metaboliitide tuvastamisele tüüpiline fenüületanoidglükosiid ehhinakosiid, mis põhineb vedelikkromatograafia ioonilõksajal
lennu massispektromeetria analüüs, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolism of echinacoside, a good antioxidant, in rotts: isolation and identifitseerimine selle sapiteede metaboliitide kohta, Narkootikumide Metab. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Taimsete ravimite ja soolestiku mikrobiota vastastikuse mõju molekulaarsete mehhanismide mõistmine, Med. Res. Rev. 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Ginsenosiidide imendumine ja dispositsioon pärast suukaudset manustamist Panaxi notoginšenni ekstrakti manustamine rottidele, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Interactions of soolestiku mikrobiota funktsionaalsete toidukomponentide ja toitainetega, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Kohvhape nõrgendab kortikaalse BDNF-i mRNA ekspressiooni vähenemist, mis on põhjustatud sunnitud kokkupuutest ujumisstress hiirtel, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Ema hüdroksütürosooli manustamine parandab neurogeneesi ja kognitiivset funktsiooni sünnieelse stressi korral järglased, J. Nutr. Biochem. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Soolestiku mikrobiota mõju ravimite metabolismile ja toksilisusele, Expert Opin. Narkootikumide Metab. Toksikool. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Süsivesikute suhtes aktiivsete ensüümide arvukus ja mitmekesisus inimese soolestiku mikrobiotas, Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497–504.