Mükobakteri tuberkuloosi vastase kimäärse mitmeepitoopilise vaktsiini in silico disain, 2. osa

 2.15. Ülevaade mitme epitoopi vaktsiini disainist

Joonis fig 1 võttis kokku selle mitme epitoopiga vaktsiini disaini üldise kontseptsiooni. Lühidalt analüüsisime IEDB-st saadud M. tuberculosis valkude antigeensust ja valisime välja kaheksa antigeenset kandidaati mitme epitoopi vaktsiini konstrueerimiseks, võttes arvesse nende funktsionaalset klassifikatsiooni ja subtsellulaarset lokaliseerimist. Seejärel ennustasime nende kaheksa valgu antigeenseid epitoope ja valisime välja 15 CTL epitoopi, 16 HTL epitoopi ja 10 B-raku epitoopi, mis olid sobivate linkerite kaudu täiendavalt seotud HBHA adjuvandi ja PADRE-ga. Lisaks ennustasime kavandatud mitme epitoopi vaktsiini antigeensust, allergeensust, füüsikalis-keemilisi omadusi ja immunogeenset profiili. Vahepeal ennustasime ka vaktsiini sekundaarseid ja tertsiaarseid struktuure ning analüüsisime selle potentsiaalset koostoimet TLR4 immuunretseptoriga.

Mycobacterium tuberculosis on levinud patogeen, mis põhjustab tuberkuloosi. Mycobacterium tuberculosis'e valk on Mycobacterium tuberculosis'e üks peamisi komponente, mis on inimese immuunsüsteemi toimimiseks väga oluline.

Mycobacterium tuberculosis valk võib aktiveerida inimese immuunsüsteemi ja tugevdada organismi immuunsust. Kui keha on nakatunud Mycobacterium tuberculosis'ega, tekitab inimese immuunsüsteem rea immuunvastuseid, sealhulgas spetsiifiliste T- ja B-rakkude aktiveerimist ja proliferatsiooni. Need rakud võivad vabastada mitmesuguseid immuunfaktoreid, nagu interferoon, interleukiin jne, aga ka antikehi, mis aitavad organismil vastu seista sissetungivale Mycobacterium tuberculosis'ele.

Lisaks suudab Mycobacterium tuberculosis valk reguleerida ka immuunsüsteemi tasakaalu ja vältida organismi immuunvastuse liigsest aktiveerumisest tingitud immuunkahjustusi. Ka tuberkuloosivaktsiinide uurimis- ja arendustegevuses on viimastel aastatel keskendutud peamiselt Mycobacterium tuberculosis valgu rakendamisele, mis võib vaktsineerimise kaudu tugevdada inimese immuunsüsteemi immuunsust ning ennetada tõhusalt tuberkuloosi teket ja levikut.

Seetõttu on Mycobacterium tuberculosis’e valk inimese immuunsuse mõju seisukohalt väga oluline. Immuunsüsteemi aktiivselt tugevdades, korraliku treeningu ja mõistliku toitumisega saab paremini ennetada tuberkuloosi ja teisi nakkushaigusi ning hoida head tervist. Sellest vaatenurgast peame oma immuunsust parandama. Tistanche võib oluliselt parandada immuunsust, kuna lihas sisalduvad polüsahhariidid võivad reguleerida inimese immuunsüsteemi immuunvastust, parandada immuunrakkude stressivõimet ja tugevdada immuunrakkude immuunsust. Bakteritsiidne toime.

Klõpsake cistanche deserticola toidulisand

3. Tulemused

3.1. M. tuberculosis'e valkude otsimine mitme epitoopi vaktsiini konstrueerimiseks

Tuberkuloosivastase mitme epitoopi vaktsiini konstrueerimiseks analüüsisime esmalt M. tuberculosis H37Rv valkude antigeensust. IEDB andmebaasist saadi kokku 492 valideeritud immunoloogiliste omadustega valku, millest 402 valku (81,70 protsenti) arvati olevat antigeensed. Nende 492 valgu funktsionaalseks iseloomustamiseks rikastati 353 DAVIDi andmebaasi, 139 aga mitte. Lokaliseerimisanalüüs näitas, et 97 353 rikastatud valgust paiknesid rakuvälises sektsioonis, rakupinnast väljaspool. Ekstratsellulaarses sektsioonis paiknevad valgud hõlmavad välismembraani valke ja sekreteeritud valke.

97 valgu hulgast on 49 sekretsioonivalku. 49 sekreteeritud valgu edasine rikastamine näitas, et rakuvälisesse ruumi sekreteeriti viis valku ja patogeneesiks oli vaja viit valku (katseliselt kinnitas BioCyc) [48]. Veelgi enam, kui need kümme valku joondati H. sapiens'i koguvalkudega, olid kaks valku (Mpt83 ja Mpt70) väga sarnased H. sapiens'i valkudega. Seetõttu peeti ülejäänud kaheksat valku, mis ei sarnane H. sapiens'i valkudega (tabel 1), lõplikeks kandidaatideks mitme epitoobiga vaktsiini koostamisel.

3.2. Kandidaatvalkude T-raku ja B-raku epitoopide ennustamine

Enne epitoobi ennustamist tuvastati ja kandidaatvalkudest kustutati signaalpeptiidid. NetMHCpan ennustas kokku 623 CTL epitoopi kaheksast kandidaatvalgust koos 135 tugeva sideainega (16 A1-st, 40 A2-st, 22 A3-st, 19 A24-st ja 38 B7-supertüübist MHC I klassist){12} }.1 server (joon. 2A, B). 135 tugevast sideainest olid 36 nii antigeensed kui ka immunogeensed. Lõpuks valisime 36 CTL-epitoobist 15 vastavalt järgmistele kriteeriumidele: kolm epitoopi supertüübi kohta ja vähemalt üks kandidaatvalgu kohta (Märkus: EsxA-l ei olnud tugevat sideainet, mis oleks nii antigeenne kui ka immunogeenne) (tabel 2).

Lisaks ennustasime nende HTL epitoope (MHC II klassi epitoobid). {{0}}enam epitoobid neljast alleelist (HLA_DRB, HLA_DP, HLA_DQ ja H-2-I) protsentuaalne järjestus Vähem kui 2 või sellega võrdne.{27}} peeti tugevateks sidujateks ja järjestati madalaimast kõrgeima punktisummani. HLA-DR alleelidel oli kõige rohkem MHC II sidujaid (2990), samas kui HLA-DP-l oli kõige vähem (601) (joonis 2C, D). Tuleb märkida, et granulomatoossete häirete, nagu tuberkuloos, pidalitõbi ja sarkoidoos, immuunvastuses domineerivad IFN-i tootvad T-abistaja-1 (Th1) rakud [97]. Lisaks näitasid varasemad aruanded, et Th1 tsütokiinide (IFN- ja IL2) ekspressioon vähenes tuberkuloosihaigetel [98]. Seetõttu ennustasime Th1-rakkude stimuleerimiseks nende valkude 15-mer IFN- -indutseerivaid peptiide. NetMHCIIpan 4.0 abil ennustati kokku 534 IFN-i indutseeriva toimega epitoopi, millest 315 epitoopi on antigeensed. Nendest 315 epitoobist 103 näitasid tugevat seondumisaktiivsust vähemalt ühe HLA alleeliga.

Samuti põhjustab polümorfism HLA alleelides alleelseid variatsioone, mille tulemuseks on laialdaselt erinevad peptiidide sidumise spetsiifilisus [55]. Selle tulemusena valisime kõigist kaheksast kandidaatvalgust ühe kõige tugevama sidumisaktiivsusega epitoobi (kõige ebasoodsama epitoobi). Lisaks järjestati ülejäänud 95 epitoopi sidumistugevuse alusel ja seejärel valiti välja veel kaheksa epitoopi, maksimaalselt kaks epitoopi kandidaatvalgu kohta. Lõpuks valisime 103 HTL-epitoobist 16 vastavalt järgmistele kriteeriumidele: vähemalt üks epitoop ja maksimaalselt kolm epitoopi kandidaatvalgu kohta, tugevaim seondumisaktiivsus kandidaatvalgu kohta ning kõige antigeensem ja IFN-i indutseeriv. Seejärel kasutasime neid selle mitme epitoopi vaktsiini valmistamiseks (tabel 2).

Lineaarse B-raku epitoobi ennustamiseks kasutati kahte serverit (BepiPred2.0 ja ABCpred) ning saadi 166 epitoopi. Prognoosisime iga valgu jaoks viie peamise epitoobi antigeensuse ja valisime seejärel kümme antigeenset epitoopi (16-mer, vähemalt üks igast kandidaatvalgust) (tabel 2).

3.3. Mitme epitoopi vaktsiini ehitus

Mitme epitoopi sisaldava vaktsiini konstrueerimiseks ühendati HBHA, PADRE, 16 HTL (15-mer), 15 CTL ja 10 lineaarset B-raku (16-mer) epitoopi sobivate linkerite kaudu ja ühendati His × 6 silt (joonis 3). Adjuvandid on vaktsiinide olulised komponendid, mis võivad võimendada kaasasündinud ja adaptiivseid immuunvastuseid [99]. Paljudel M. tuberculosis'est pärinevatel valkudel on adjuvantsed omadused ja neid on kasutatud vaktsiinide väljatöötamiseks [17,27,87,100–105]. Üks kõige laialdasemalt kasutatavaid on HBHA [100–105], mis on tugev immunostimulant, mis indutseerib dendriitrakkude (DC) küpsemist TLR4 töötlemise kaudu [105, 106]. On leitud, et HBHA-ga töödeldud DC-d aktiveerivad naiivseid T-rakke, polariseerivad CD4 pluss ja CD8 pluss T-rakke IFN-i sekreteerimiseks ja indutseerivad T-rakkude poolt vahendatud tsütotoksilisust [47].

Selles uuringus paigutasime HBHA valgu adjuvandina N-otsa, kuna see sobib vaktsiinikonstruktsiooni sünteesi algatamiseks looduslikult esinevast valgust HBHA-st. HBHA on varem paigutatud adjuvandina mõne multiepitoopi vaktsiini N-otsa [105, 107]. Lisaks adjuvantidele võib inimestele ohutu PADRE märkimisväärselt suurendada vaktsiini immunogeensust, kuna see seondub suure afiinsusega paljude hiire ja inimese MHC-II alleelidega, mille afiinsus on kõrge Th-rakkude poolt vahendatud vastuste esilekutsumiseks [47,62]. HBHA ja PADRE ühendati spiraalse PEAK linkeriga, mis tagab jäikuse, eraldades samal ajal kaks valgukomponenti, et suurendada tõhusust ja vähendada häireid. Lisaks stabiliseeris segmentides moodustunud Glu-Lys soolasild linkerit.

Kuna PADRE võib suurendada vaktsiini HTL epitoopide aktiivsust [54], paigutasime 16 HTL epitoopi PADRE järel. GPGPG linkerit kasutati HTL epitoopide ühendamiseks üksteisega ja PADRE-ga, kuna see hõlbustab immuunrakkude progresseerumist ja epitoobi esitlust [108, 109]. Veelgi enam, GPGPG indutseerib HTL-i immuunvastust, mis võib häirida ristmiku immunogeensust ja taastada üksikute epitoopide immunogeensuse pärast töötlemist [108].

15 CTL epitoobi puhul ühendati individuaalne epitoop AAY linkeriga, mis aitab epitoobil toota sobivaid kohti TAP transporteriga seondumiseks ja epitoobi esitluse tõhustamiseks [47]. Lisaks seoti kogu CTL epitoobi alaühik ülesvoolu HTL epitoopidega HEYGAEALERAG linkeri kaudu, millel on viis sobivat lõhustumiskohta (A7-L8, A5-E6, Y3-G4, R 10-A11 ja L8-E9), mis on olulised eukarüootsete proteasoomide ja lüsosomaalsete lagunemissüsteemide jaoks. Eukarüootides on proteasoomid ja lüsosoomid kõige olulisemad proteolüütilised masinad, mis kasutavad vastavalt ubikvitiini-proteasoomi süsteemi (UPS) ja autofagia rada [110].

HEYGAEALERAG linkerit kasutati ka CTL epitoobi subühiku sidumiseks 10 allavoolu lineaarse B-raku epitoobiga, mis olid omavahel seotud KK linkeritega. Varasemate uuringute kohaselt takistab KK linker antikehade indutseerimist aminohappejärjestusse, mis tuleneb kahe peptiidi kombinatsioonist, hõlbustades seeläbi iga peptiidi spetsiifilist eksponeerimist antikehale [111]. Lõpuks kinnitati viimase lineaarse B-raku epitoobi C-otsa His×6 märgis vaktsiini järgnevaks puhastamiseks ja iseloomustamiseks (joonis 3).

Lõplik kimäärne valk koosneb 933 aminohappejäägist, alustades HBHA adjuvandist, millele järgneb 41 epitoobi ja lõpetades His×6 märgisega (joonis 3). Kuna see kimäärne valk koosneb kaheksa valgu mitme epitoopi antigeenist, nimetasime selle MTBV8, mitme epitoopi TB vaktsiiniks, mis on tuletatud 8 kandidaatvalgust.

3.4. MTBV8 antigeensuse, allergeensuse ja füüsikaliskeemiliste parameetrite analüüs

Varasemad uuringud on näidanud, et inimese vaktsiinide jaoks on vajalik antigeensus, et kutsuda esile humoraalne immuunvastus, mis viib nakkusetekitajate epitoopide vastu suunatud mälurakkude tekkeni [112]. Seetõttu ennustasime mitme epitoobiga vaktsiini MTBV8 antigeensust, kasutades VaxiJen 2.0 serverit ja saime antigeensuse 0,97, mis on oluliselt kõrgem kui läviväärtus ({{7} }.4) [45,46], et bakteriaalset valku peetakse antigeenseks. Eelkõige oli MTBV8 antigeensem kui kõik komponendi valgud (joonis 4), mis viitab sellele, et see võib tõhusalt stimuleerida peremeesorganismi immuunvastuseid.

Lisaks on teatatud, et paljud mikroobsed makromolekulid võivad inimestel esile kutsuda ülitundlikkusreaktsioone [113]. MTBV8 ja selle kaheksa valgu ülitundlikkuse probleemi analüüsimiseks ennustasime AllerTOP 2.0 serveri abil nende allergeensust. Kaheksast komponendivalgust kaks (LprA ja EspC) arvati olevat allergeenid (tabel 1). Tuleb märkida, et kuigi kavandatud mitme epitoopi vaktsiin (MTBV8) sisaldas kümmet epitoopi, mis saadi nendest kahest valgust, ennustati, et see ei ole allergiline, mis näitab, et see vaktsiin on ohutu.

MTBV8 edasiseks iseloomustamiseks analüüsisime selle füüsikalis-keemilisi omadusi ExPASy ProtParam serveri kaudu. Rekombinantse valgu molekulmass on 94,84 kDa ja isoelektriline punkt 8,91. Veelgi enam, valku peeti stabiilseks arvutatud ebastabiilsuse indeksiga (II) 26,44 (ebastabiilseks loeti valke, mille ebastabiilsuse indeks oli > 40) [64]. Hinnanguline poolväärtusaeg in vitro on imetajate retikulotsüütides 30 h, pikem kui in vivo 20 h pärmis ja in vivo 10 h E. coli's. Lisaks oli MTBV8 alifaatne indeks 71, 91 ja hüdrofiilsuse üldine keskmine väärtus (GRAVY) oli –0, 32, mis näitab, et rekombinantne valk oli hüdrofiilne. Lõpuks oli MTBV8 proportsionaalne lahustuvuse väärtus (0,54) suurem kui populatsiooniandmestiku keskmine (0,45), mis näitab, et vaktsiinikandidaat oli lahustuvam kui pooled E. coli valkudest [114]. Ülaltoodud tulemused näitasid, et MTBV8-l on head füüsikalised ja keemilised omadused ning see sobib kasutamiseks vaktsiinina.

3.5. MTBV8 immunogeenne profiil

MTBV8 immunogeensusprofiili hindamiseks analüüsisime immuunvastuseid in silico C-IMMSIM-i immuunserveri kaudu. Nagu on näidatud joonisel 5A, suurenesid IgM ja IgG1 tiitrid oluliselt pärast sekundaarset immuunstimulatsiooni MTBV8 poolt. Veelgi enam, aktiivsete B-rakkude tase tõusis ja püsis kõrgel tasemel pärast iga immuniseerimist (joonis 5B). Isegi plasma B-rakkude puhul jäid B-isotüübid IgM ja IgG1 pärast immuniseerimist kõrgeks (täiendav joonis 1A, B). Mis puudutab mõju T-rakkudele, siis Th-mälurakkude (y2) (täiendav joonis 1C) ja aktiivsete Th-rakkude (joonis 5C) tase tõusis kiiresti pärast esmast immuniseerimist ja pärast sekundaarset immuniseerimist suurenes see oluliselt. Reguleerivaid T-rakke (peamiselt aktiivseid rakke) stimuleeriti esmasel immuniseerimisel ja seejärel vähenesid need kiiresti (täiendav joonis 1D). Huvitav on see, et aktiivsete tsütotoksiliste T (Tc) rakkude tase tõusis kiiresti pärast esmast immuniseerimist, püsis kõrgel teisel immuniseerimisel ja langes seejärel pidevalt, samas kui puhkeolekus Tc rakkudel ilmnes vastupidine suundumus aktiivsete Tc rakkude suhtes (joonis 5D). Seevastu anergiliste (y2) Tc-rakkude (joonis 5D) ja mälu-Tc-rakkude (täiendav joonis 1E) tasemed jäid immuniseerimisel muutumatuks. Lisaks tuleb märkida, et T-rakkude poolt sekreteeritavate immuunfaktorite IFN- ja IL-2 tase, mis on kriitilise tähtsusega M. tuberculosis'e vastase immuunvastuse jaoks [115], suurenes oluliselt ka pärast MTBV8 immuniseerimist (joonis fig. 5E).

Lisaks ennustasime MTBV8 vaktsineerimise mõju kaasasündinud immuunrakkude populatsioonidele (joonis 5F ja täiendav joonis 1FH). -2 rakkude esinemine DC-des ja makrofaagides suurenes esimesel immuniseerimisel kiiresti, samas kui pärast teist immuniseerimist täheldati vaid väikest suurenemist (joonis 5F ja täiendav joonis 1G). Lisaks põhjustas esimene immuniseerimine makrofaagides aktiivsete ja puhkeolekus olevate makrofaagide samaaegse suurenemise või vähenemise. Mõni nädal pärast teist immuniseerimist vähenesid aktiivsed makrofaagid kiiresti, samal ajal kui puhkeolekus olevad makrofaagid suurenesid kiiresti. (täiendav joonis 1G). Nimelt näitasid looduslikud tapjarakud ja aktiivsed epiteelirakkude populatsioonid immuniseerimisel üsna püsivat mustrit. (Täiendav joonis 1F, H). Kokkuvõttes näitasid need ennustused, et MTBV8 võib tugevalt stimuleerida nii kaasasündinud kui ka adaptiivseid immuunvastuseid, muutes selle potentsiaalselt tõhusaks vaktsiinikandidaadiks.

3.6. MTBV8 prognoositavad sekundaarsed ja tertsiaarsed struktuurid

MTBV8 paremaks iseloomustamiseks ennustasime selle sekundaarseid ja tertsiaarseid struktuure, millele järgnes selle tertsiaarse struktuuri täpsustamine. MTBV8 sekundaarne struktuur koosnes 42,12 protsendist spiraalidest, 11,79 protsendist ahelatest ja 46,09 protsendist mähistest (täiendav joonis 2). DISOPRED3 ennustuste kohaselt oli 27,11 protsenti aminohappejääkidest korrastamata.

MTBV8 tertsiaarset struktuuri ennustas I-TASSER server ja saadi 5 heade C-skooridega mudelit. C-skoor on vahemikus −5.0 kuni 2.0 ja on võrdeline ennustuse usaldusväärsusega. Nende mudelite jaoks tehti ProSA-veebianalüüs ja mudel 4 valiti järgmiste omaduste tõttu; C-skoor=−3,8, Z-skoor=−4,4. Selle tertsiaarse struktuuri Ramachandrani graafiku analüüs näitas, et vähem kui 70,0 protsenti jääkidest oli eelistatud piirkondades, seega on vaja tertsiaarset struktuuri täiendavalt täpsustada.

I-TASSERi saadud tertsiaarset struktuuri täpsustas ModRefineri server, millele järgnes GalaxyRefine'i server viie mudeli genereerimiseks. Viiest täiustatud mudelist oli mudelil 2 parim struktuur, võttes arvesse järgmisi parameetreid: globaalne kaugustesti kõrge täpsus (0.89), RMSD (0.58), MolProbity (2.31), kokkupõrge skoor (14,8), kehv rotameeri skoor ({{10}},80) ja Ramachandrani graafiku skoor (86,5 protsenti) (joonis 6A). Selle struktuuri Ramachandrani graafiku analüüs PROCHECKi abil näitas, et 753 mitteglütsiini-, mitteproliini- ja mitteterminaalsest jäägist asus 78,9 protsenti neist kõige soodsamas piirkonnas [A, B, L], 17,3 protsenti neist oli kõige soodsamas piirkonnas [A, B, L]. lisaks lubatud piirkond [a, b, l, p] ja 1,5 protsenti üldiselt lubatud piirkonnas [∼a, ~b, ~l, ~p], kusjuures ainult 2,4 protsenti keelatud piirkonnas (joonis 6B). Rafineeritud struktuuri Ramachandrani graafiku analüüsimisel Molprobity abil leidsime, et 86,5 protsenti aminohappejääkidest paiknes soodsas piirkonnas, mis oli sama, mis saadi GalaxyRefine'i serveriga (joonis 6C). . Lisaks oli 98,0 protsenti jääkidest lubatud piirkonnas, samas kui 19 jääki olid kõrvalekalded (phi, psi) (joonis 6C). Kuigi täiustatud mudelil on eelistatud piirkonnas rohkem jääke kui I-TASSERi loodud mudelil, vajab see täiendavat kinnitamist.

Mudeli valideerimine on mudeli koostamise protsessi põhietapp, kuna see võimaldab tuvastada potentsiaalseid vigu prognoositud 3D-mudelites [116]. MTBV8 täiustatud mudeli kinnitamiseks viidi läbi ProSA-web ja ERRAT analüüsid. ProSA-veebianalüüs näitas MTBV8 Z-skooriks –5,76 (joonis 6D), mis jäi veidi väljapoole sarnase suurusega valkude eksperimentaalselt määratud skooride vahemikku. ERRAT analüüs näitas aga rafineeritud MTBV8 üldist kvaliteeditegurit 70,94. Kuna ERRAT-i skoor, mis on suurem kui 50, tähistab hea kvaliteediga mudelit [117], näitas skoor 70,94, et meil on modelleeritud struktuuri suhtes suur usaldus järgneva analüüsi jaoks.

3.7. MTBV8 molekulaarne dokkimine immuunrakkude retseptoritega

Vaktsiinide tugev afiinsus immuunrakkude retseptorite suhtes tekitab stabiilse immuunvastuse [118]. Et saada ülevaade MTBV8 ja immuunrakkude retseptorite võimalikest koostoimetest, viisime läbi molekulaarse dokkimise MTBV8 ja immuunretseptori TLR4 vahel (joonis 7A ja B). Varasemad uuringud on näidanud, et TLR4 ligandid võivad aktiveerida DC-sid, mis omakorda aktiveerivad naiivseid T-rakke, polariseerivad tõhusalt T-rakke (CD4 pluss ja CD8 pluss rakud), et sekreteerida IFN-i ja kutsuda esile T-rakkude poolt vahendatud tsütotoksilisust [106]. Need protsessid tooksid kaasa efektormälurakkude kogumi suurenemise [119]. Kuna TLR4 interaktsioon antigeensete peptiididega põhjustab vastuseid TB infektsiooni vastu, keskendusime MTBV8 ja TLR4 vastastikmõjudele (joonis 7A). Firedocki molekulaarse dokkimise tulemused näitasid, et kõige eelistatumal rafineeritud mudelil oli globaalne energia –40,28, atraktiivne van der Waalsi energia (aVdW) –19.{20}}, tõukeenergia (punane) 2,19, aatomi kontaktenergia 4,70 ja vesiniksideme (HB) panus –1,03 (joonis 7B). Lisaks ennustas Prodigy sidumisenergiaks TLR4 ja MTBV8 vahel –8,6 kcal/mol. Ülaltoodud tulemused näitasid, et MTBV8-l on tugev afiinsus TLR4 suhtes, mis võimaldab tal tekitada stabiilse immuunvastuse.

3.8. Molekulaardünaamika simulatsioon

Aatomite liikumise analüüsimiseks vaktsiinis kasutati molekulaarset dünaamilist simulatsiooni [120]. Peaahela deformeeritavus näitab, mil määral võib molekul deformeeruda iga koostisosa jäägi juures. Suure deformatsiooniga piirkonnad näitasid keti "hinge" asendit (joonis 7C) ja eksperimentaalne B-tegur saadi vastavast esialgsest esialgsest eelarveprojektist andmepangast, samal ajal kui arvutus tehti NMA liikuvuse korrutamisel 8pi^2-ga (joonis 7D). ). Igale normaalrežiimile määratud omaväärtus on liikumise jäikuse mõõt, mis on otseselt seotud kogu konstruktsiooni deformatsioonienergiaga. Omaväärtus on otseselt võrdeline deformatsiooni kergusega (joonis 7E). Iga normaalrežiimi dispersioon on pöördvõrdeline omaväärtusega. Üksikud variatsioonid on värvitud pruuniga, kumulatiivsed aga rohelised) (joonis 7F). Kovariatsioonimaatriksis on jääkide paaride vahel seos ning kuvati korreleeritud (punane), korrelatsioonita (valge) ja korrelatsioonivastaseid (sinine) liikumisi (joonis 7G). Elastsusvõrk tähistas vedrudega ühendatud aatomipaare ja iga punkt tähistas vedrut vastavate aatomipaaride vahel. Täppide värvus tähistas nende jäikust; tumedamad hallid täpid illustreerivad jäigemaid vedrusid ja vastupidi (joonis 7H). Molekulaarse dünaamika simulatsioonid iMODS-serveri abil näitasid, et MTBV8 ja TLR4 vaheline dokkimiskompleks oli stabiilne.

3.9. MTBV8 in silico optimeerimine ja kloonimine

Valkude süntees on selle tegevuse eeltingimus [121]. Kooskõlas sellega on vaktsiini transkriptsiooni ja translatsiooni efektiivsuse suurendamine vajalik selle üleekspressiooniks E. coli rakkudes isepaljuneva plasmiidi pET28a( plus ) kaudu [103]. Selle optimeerimine saavutati koodoni kohanemisindeksi (CAI) väärtusega 0,99 ja GC sisaldusega (54,81 protsenti) vahemikus 30–70 protsenti, mida üldiselt peetakse peremeesorganismis valgu ekspressiooniks soodsaks. mtbv8 DNA fragmendi saab kloonida pET-28a(pluss) vektorisse NcoI ja XhoI restriktsioonisaitide vahel, kasutades SnapGene'i, et genereerida pET-28a(pluss)-mtbv8 rekombinantne plasmiid (täiendav joonis 1). .3).

4. Arutelu

4.1. Tuberkuloosi vastaste mitme epitoopi vaktsiinide ilmumine

Vaktsineerimine on kõige usaldusväärsem viis tuberkuloosiga võitlemiseks. Paljude aastate jooksul on teadlased tuvastanud arvukalt paljutõotavaid vaktsiinikandidaate, mis võiksid asendada ainsa heakskiidetud tuberkuloosivaktsiini BCG [8100,122–125]. Viimasel ajal on üha enam tähelepanu pööratud rekombinantsetele tuberkuloosivaktsiinidele. Mitmed rekombinantsed vaktsiinid on näidanud efektiivsust prekliinilistes ja kliinilistes uuringutes, sealhulgas ID93/GLA-SE, mis koosneb neljast vaktsiinikandidaadist Rv2608 (PE/PPE perekond), Rv1813 (väljendub stressi/hüpoksia all), ESXV ja ESXW, mis on paljulubavad. hiirte prekliiniline uuring [122]. Kliinilistes uuringutes oli GamTBvac, mis saadi Ag85a ja ESAT{10}}CFP10 liitmisel, I faasi uuringutes [125], samas kui M72, mis koosnes kahest kandidaadist [Mtb39A (PPE18) ja Mtb32A], andis faasis märkimisväärse tõhususe. II katsed [123].

Nende rekombinantsete vaktsiinide edukad katsed näitavad, et epitoobipõhistel vaktsiinidel on suurem tõhusus, mis lihtsalt ühendab erinevate kandidaatvalkude immunoloogilised omadused sünteetiliseks valguks [124]. Nimelt on mitmed tuberkuloosi subühiku vaktsiinid tuletatud paljudest vaktsiinikandidaatidest ja need on loommudeliuuringutes osutunud potentsiaalselt atraktiivseteks kandidaatideks [100]. Näiteks MP3RT, kuuest immunogeensest HTL peptiidist koosnev multiepitooppeptiidne tuberkuloosivaktsiini kandidaat, indutseeris humaniseeritud hiirte kopsudes ja põrnas oluliselt kõrgemaid IFN- ja CD3 pluss IFN-pluss T-lümfotsüütide tasemeid ning madalamaid kolooniaid moodustavaid ühikuid (CFU-d). metsikut tüüpi hiired [8]. Edaspidi on nende vaktsiinide suurema tõhususe uuringud viinud potentsiaalsete valgukandidaatide rikastamiseni.

Lisaks on MTBV8 kavandamisel arvesse võetud ka M. tuberculosis'e poolt sekreteeritud valke (tabel 1), kuna need on olulised tuberkuloosi patogeneesi ja virulentsuse jaoks [126]. Lisaks võivad mõned M. tuberculosis'e rakkude väliskihtide sekreteeritud valgud toimida kasulike antigeenidena. Näiteks EsxA ja EsxB on puhastatud M. tuberculosis'e kapslist [127] ja EsxA peetus kapslis on seotud tsütotoksilisusega [128]. Lisaks on EsxA vajalik bakteriraku seina terviklikkuse tagamiseks [129]. Üldiselt on sekreteeritud valkudel piisavalt avatud pinnad, nii et need on peremeesorganismi immuunvastuste sihtmärgid [130, 131].

4.2. Kaasasündinud immuunsüsteemi potentsiaalne stimuleerimine MTBV8 poolt

Epitoobi skriinimine kandidaatvalkudes hõlmab kaasasündinud immuunsüsteemi aktiveerimist, millele järgneb antigeeni äratundmine lümfotsüütide poolt, sest mõlemad tegurid on vajalikud adaptiivse immuunsüsteemi järgnevaks aktiveerimiseks [50]. Kaasasündinud vastuse jaoks on oluline stabiilse kompleksi moodustumine MTBV8 (mida aitab adjuvandina TLR4 stimulaator HBHA) ja DC-de TLR4 (joonis 5F) vahel, kuna TLR4 ligandid võivad aktiveerida DC-sid ja aktiveeritud DC-d võivad omakorda aktiveerida. naiivsed T-rakud, polariseerivad tõhusalt CD4 pluss ja CD8 pluss T-rakke, et sekreteerida IFN-d, ning kutsuvad esile T-rakkude poolt vahendatud tsütotoksilisuse [106] ja seejärel suurendavad efektormälurakkude kogumit [119].

See kompleks aitas tõenäoliselt kaasa mälurakkude (y2) populatsiooni suurenemisele B-lümfotsüütides (täiendav joonis 1A) ja Th-lümfotsüütides (täiendav joonis fig 1C) võrreldes mittemälurakkudega. Immuunsüsteemi stimuleerimine MTBV8-ga on võrreldav TB [33, 37, 39] ja teiste haiguste [27, 62, 107, 124 132] vastaste multiepitoopvaktsiinidega saavutatavaga. See vihjas mitme epitoopi vaktsiinimehhanismi järjepidevusele.

4.3. Adaptiivse immuunsüsteemi potentsiaalne stimuleerimine MTBV8 poolt

B- ja T-lümfotsüüdid on peamised efektorrakud, mis koordineerivad adaptiivseid immuunvastuseid humoraalse või raku poolt vahendatud immuunsuse kaudu, tundes ära sissetungivate patogeenide osi, mida nimetatakse antigeenideks [50]. Humoraalse adaptiivse immuunvastuse esilekutsumiseks lisasime B-lümfotsüütide poolt ekspresseeritud ja sekreteeritud antikehade tuvastamiseks ja hävitamiseks kõrge skooriga B-raku epitoope (tabel 2) [50,133]. Aktiivsete B-lümfotsüütide (joonis 5B), peamiselt IgM- ja IgG{9}}sekreteerivate B-rakkude (täiendav joonis 1A) stimuleerimine vaktsiiniga võib põhjustada IgM ja IgG1 liigset sekretsiooni (joonis 5A).

Vaktsiini kõrge antigeensus (joonis 4) võib omada olulist mõju antikehade vastuste suurendamisele (joonis 5A). Tõepoolest, rakuvahendatud immuunvastused sõltuvad suuresti T-rakkude võimest antigeene ära tunda [134]. Selle saavutamiseks valisime välja tugevad antigeensed ja tugevad MHC-d siduvad CTL ja HTL epitoobid (tabel 2), mis suurendasid peptiidi: MHC kompleksi (pMHC) stabiilsust, mis on MHC peptiidi immunogeensust kontrolliv võtmetegur [135] ja mängib rolli CD8 pluss ja CD4 pluss T-rakkude praimimine DC-de poolt, mis viib T-lümfotsüütide vastuseni (joonis 5C, täiendav joonis 1C) [136].

Sobivate linkerite ja sünteetiliste oligopeptiidide (PADRE ja HEYGAEALERAG) lisamine ning iga komponendi täpne positsioneerimine võib hõlbustada epitoobi kulgemist ja esitlemist (joonis 3). Inimeste alleelide varieeruvuse tõttu valisime CTL-epitoobid suuremate inimrasside MHC-I alleelide äratundmise põhjal. Täiendav tabel 1 (tabel 2) ja valiti HTL-epitoobid pärast IFN-i indutseerivate omaduste ja antigeensuse skriinimist.

4.4. MTBV8 arenguväljavaated

See in silico vaktsiini disain on kandidaatvaktsiinide sünteesi ja efektiivsuse seisukohalt sõeluuringufaasides oluline näitaja. Sünteesi puhul näitasid meie ennustused, et seda saab sünteesida E. coli süsteemis, kuid kui E. coli-põhistel süsteemidel on raskusi, võib kaaluda ka muid süsteeme, nagu putuka- ja imetajarakud. Märglabori valideerimine on järgmine etapp vaktsiinikandidaatide kinnitamisel pärast in silico uuringuid. Seda meetodit on tegelikult tõhusalt kasutatud mõnede vaktsiinikandidaatide puhul, mis samuti kavandati algul in silico ja osutusid hiljem katsefaasis tõhusaks [137].

5. Järeldus

WHO säästva arengu eesmärgi põhitugi tuberkuloosi täielikuks likvideerimiseks on juurdepääs tugevale vaktsiinile, et vältida M. tuberculosis'e nakatumist. Varasemad uuringud on näidanud, et kimäärsed mitme epitoobiga vaktsiinid võivad immuuntõhususe suurendamiseks ära kasutada teatud valkude immuun-/antigeenseid omadusi. Selles uuringus kasutasime kimäärse vaktsiini (MTBV8) väljatöötamiseks in silico lähenemisviisi, integreerides 41 ebasoodsat epitoopi, mis pärinevad kaheksast M. tuberculosis H37Rv poolt sekreteeritud antigeensest valgust. Eeldati, et MTBV8 on stabiilne, lahustuv, ohutu, väga antigeenne ja immunogeenne.

Immunoinformaatika analüüs näitas, et MTBV8-l oli hea afiinsus peamise immuunraku retseptori TLR4 suhtes. Oluline on see, et MTBV8 vaktsineerimisega stimuleerimine võib märkimisväärselt tõsta B-rakkude, T-rakkude ja kaasasündinud immuunrakkude populatsioonide taset ning stimuleerida immunoglobuliinide (IgG1, IgM jne) ja immuunfaktorite (IFN-, IL{6) tootmist. }}, jne). Kokkuvõttes on mitme epitoobiga vaktsiin MTBV8 oluline näitaja tuberkuloosivastaste vaktsiinide kavandamise etapis ja võib saada potentsiaalseks nurgakiviks tuberkuloosivastase strateegia elluviimisel.

Autoriõiguse panuse avaldus

Binda T. Andongma: Kontseptualiseerimine, metoodika, tarkvara, kirjutamine – algne mustand. Yazheng Huang: andmete kureerimine, tarkvara. Fang Chen: Tarkvara, visualiseerimine. Qing Tang: andmete kureerimine, formaalne analüüs. Min Yang: Tarkvara, visualiseerimine. Shan-Ho Chou: kirjutamine – ülevaatamine ja toimetamine. Xinfeng Li: kontseptualiseerimine, metoodika, tarkvara, rahastamise hankimine. Jin He: järelevalve, kirjutamine – läbivaatamine ja toimetamine, rahastamise hankimine.

Konkureerivate huvide deklaratsioon

Autorid kinnitavad, et neil ei ole teadaolevaid konkureerivaid finantshuve ega isiklikke suhteid, mis oleksid võinud mõjutada käesolevas artiklis käsitletud tööd.

Tänuavaldused

Seda tööd toetasid Hiina riiklik loodusteaduste fond (32200026, 31900057), riikliku põllumajanduse mikrobioloogia võtmelabori (AMLKF202108) ja Hiina järeldoktorantuuri sihtasutus (2019M662654).

Lisa A. Täiendav teave

Selle artikliga seotud täiendavad andmed leiate veebiversioonist aadressil doi:10.1016/j.csbj.2023.01.019.

Viited

[1] Boineau R, Domanski M, Troutman C, Anderson J, Johnson G, Mcnulty SE, Clappchanning N, Davidson-ray LD, Fraulo ES, Fishbein DP jt. Amiodaroon või siirdatav kardioverter-defibrillaator kongestiivse südamepuudulikkuse korral. New Engl J Med 2005;352(3):225–37.

[2] Khoshnood S, Heidary M, Haeili M, Drancourt M, Darban-sarokhalil D, Nasiri MJ, Lohrasbi V. Uued vaktsiinikandidaadid Mycobacterium tuberculosis'e vastu. Int J Biol Macromol 2018; 120 (Pt A): 180–8.

[3] Kyu HH, Maddison ER, Henry NJ, Ledesma JR, Wiens KE, Reiner R jt. Globaalne, piirkondlik ja riiklik tuberkuloosikoormus, 1990-2016: 2016. aasta ülemaailmse haiguste, vigastuste ja riskitegurite koormuse tulemused. Lancet Infect Dis 2018;18(12):1329–49.

[4] Maailma Terviseorganisatsioon (2022). Ülemaailmne tuberkuloosiaruanne. 〈https://www. WHO. int/publications/i/item/9789240061729〉.

[5] Mirzayev F, Viney K, Linh NN, Gonzalez-Angulo L, Gegia M, Jaramillo E, Zignol M, Kasaeva T. Maailma Terviseorganisatsiooni soovitused ravimiresistentse tuberkuloosi raviks, 2020. aasta värskendus. Eur Respir J 2021;57(6):2003300.

[6] Ahmad Khan F, Fox G, Menzies D. Ravimiresistentne tuberkuloos. New York: Handbook of Antimicrobial Resistance Springer; 2017. lk. 263–86.

[7] Mitchison D, Davies G. Tuberkuloosi kemoteraapia: minevik, olevik ja tulevik. Int J Tube Lung Dis 2012;16(6):724–32.

[8] Gong W, Liang Y, Mi J, Jia Z, Xue Y, Wang J, Wang L, Zhou Y, Sun S, Wu X. Peptiididel põhinev vaktsiin MP3RT indutseeris kaitsva immuunsuse Mycobacterium tuberculosis nakkuse vastu humaniseeritud hiiremudelis . Front Immunol 2021;12:1–19.

[9] Lange C, Aaby P, Behr MA, Donald PR, Kaufmann SHE, Netea MG, Mandalakas AM. 100 aastat Mycobacterium bovis batsilli Calmette-Guérin. Lancet Infect Dis 2022;22(1):e2–12.

[10] Glaziou P, Floyd K, Raviglione MC. Tuberkuloosi globaalne epidemioloogia. Semin Respir Crit Care Med 2018;39(3):271–85.

[11] Ernst JD. M. tuberculosis'e immuunvastuse mehhanismid kui väljakutsed tuberkuloosi vaktsiini kavandamisel. Cell Host Microbe 2018;24(1):34–42.

[12] Li X, Chen F, Liu X, Xiao J, Andongma BT, Tang Q, Cao X, Chou SH, Galperin MY, He J. Clp proteaas ja antisenss-RNA reguleerivad ühiselt globaalset regulaatorit CarD, et vahendada mükobakterite nälgimise vastust. eElu 2022;11:1–22.

[13] Liu CH, Liu H, Ge B. Kaasasündinud immuunsus tuberkuloosi korral: peremeesorganismi kaitse vs patogeeni vältimine. Cell Mol Immunol 2017;14(12):963–75.

[14] Elvang T, Christensen JP, Billeskov R, Hoang TTKT, Holst P, Thomsen AR, Andersen P, Dietrich J. CD4 ja CD8 T-rakkude vastused M. tuberculosis Ag85B-TB10.4-le, mida soodustab adjuveeritud subühik, adenovektor või heteroloogne esmane võimendusvaktsineerimine. PLoS ONE 2009;4(4):e5139.

[15] Rossjohn J, Gras S, Miles JJ, Turner SJ, Godfrey DI, McCluskey J. Antigeeni esitlevate molekulide T-raku antigeeni retseptori tuvastamine. Annu Rev Immunol 2015;33:169–200.

For more information:1950477648nn@gmail.com