Tuberkuloosi mükobakteri vastase kimäärse mitmeepitoopilise vaktsiini in silico disain, 1. osa

Abstraktne

Tuberkuloos (TB) on ülemaailmne terviseoht, mis tapab igal aastal ligikaudu 1,5 miljonit inimest. Tuberkuloosi peamise põhjustaja Mycobacterium tuberculosis'e likvideerimine on ulatuslike ravimiresistentsete tüvede esilekerkimise tõttu üha keerulisem. Vaktsineerimist peetakse tõhusaks viisiks peremeesorganismi patogeenide eest kaitsmiseks, kuid ainsal kliiniliselt heaks kiidetud tuberkuloosivaktsiinil Bacillus Calmette-Guérinil (BCG) on täiskasvanutel piiratud kaitse. On leitud, et mitme epitoobiga vaktsiinid suurendavad immuunsust haiguste vastu, kombineerides selektiivselt mitme kandidaatvalgu epitoope.

Tuberkuloos on bakteri Mycobacterium tuberculosis põhjustatud nakkushaigus, mis mõjutab peamiselt kopse, kuid võib kahjustada ka teisi organeid. Immuunsus mängib tuberkuloosi tekkes ja ravis olulist rolli.

Ebapiisava immuunsuse korral võib Mycobacterium tuberculosis kergesti tungida inimkehasse ja areneda tuberkuloosiks. Näiteks suurendab teatud haiguste või meditsiiniliste ravimeetodite tõttu kahjustatud immuunsüsteem tuberkuloosi nakatumise riski. Lisaks võivad sellised tegurid nagu alatoitumus, halb elukvaliteet ja liigne stress nõrgendada immuunsust, mis võib viia tuberkuloosi tekkeni.

Seetõttu on hea tervise hoidmine ja immuunsuse tugevdamine tuberkuloosi ennetamiseks väga oluline. Immuunsust saab tugevdada tervisliku toitumise, regulaarse elustiili, õige liikumise ja piisava une abil, mis võib tõhusalt vähendada riski haigestuda erinevatesse haigustesse, sealhulgas tuberkuloosi.

Immuunsus on oluline ka raviks ja taastumiseks, kui tuberkuloos on juba tekkinud. Mida tugevam on immuunsüsteem, seda tõhusamalt suudab keha end kaitsta tuberkuloosibatsilli rünnaku eest ja toota haigusega võitlemiseks piisavalt antikehi. Seetõttu võib piisava toitumise, õige treeningu ja positiivse suhtumise säilitamine parandada immuunsust ja soodustada taastumist.

Kokkuvõtteks võib öelda, et immuunsuse ja tuberkuloosi vahel on tugev seos. Tervise säilitamine ja immuunsuse tugevdamine on üks olulisi viise tuberkuloosi ennetamiseks ja raviks. Vaadakem elu positiivselt, hoidkem tervislikku eluviisi ja hoidkem haigustest eemal. Sellest vaatenurgast peame oma immuunsust parandama. Cistanche võib oluliselt parandada immuunsust, sest lihatuhk sisaldab mitmesuguseid bioloogiliselt aktiivseid komponente, nagu polüsahhariide, kaks seeni, Huang Li jne. Need komponendid võivad stimuleerida immuunsüsteemi Erinevat tüüpi rakke süsteemis, suurendada nende immuunaktiivsust.

Klõpsake Cistanche'i kasulikkust tervisele

Selle uuringu eesmärk oli luua immunoinformaatika lähenemisviisi abil tuberkuloosi vastane mitme epitoopi vaktsiin. Funktsionaalse rikastamise kaudu tuvastasime kaheksa M. tuberculosis'e poolt sekreteeritud valku, mis on kas vajalikud patogeneesiks, sekreteeritakse rakuvälisesse ruumi või mõlemad. Seejärel analüüsisime nende valkude epitoope ja valisime välja 16 interferooni indutseeriva toimega abistaja-T-lümfotsüütide epitoopi, 15 tsütotoksilist T-lümfotsüütide epitoopi ja 10 lineaarset B-raku epitoopi ning konjugeerisime need adjuvandi ja Pan HLA DR-siduva epitoobiga (PADRE), kasutades sobivat. linkerid.

Lisaks ennustasime selle vaktsiini tertsiaarset struktuuri, selle potentsiaalset koostoimet Toll-Like Receptor-4 (TLR4) ja immuunvastust, mida see võib esile kutsuda. Tulemused näitasid, et sellel vaktsiinil oli tugev afiinsus TLR4 suhtes, mis võib märkimisväärselt stimuleerida CD4 pluss ja CD8 pluss rakke eritama immuunfaktoreid ja B-lümfotsüüte sekreteerima immunoglobuliine, et saavutada hea humoraalne ja rakuline immuunsus. Üldiselt ennustati, et see mitme epitoopi valk on stabiilne, ohutu, väga antigeenne ja väga immunogeenne, mis võib toimida ülemaailmse tuberkuloosivastase vaktsiinina.

1. Sissejuhatus

Tuberkuloos (TB), mis on Mycobacterium tuberculosis'e põhjustatud väga nakkav haigus, on Maailma Terviseorganisatsiooni (WHO) hinnangul peamiseks surmapõhjuseks ühest nakkustekitajast [1–3]. 2021. aastal ulatus tuberkuloosi surmajuhtumite ja uute juhtumite hinnanguline arv vastavalt 1,6 miljonini ja 10,6 miljonini [4]. Praegu on tuberkuloosi kliiniline ravi suhteliselt napp ja peamiselt kasutatakse mitme antimikroobse ravimi kombinatsiooni.
See keemiaravi tsükkel on väga pikk, tavaliselt võtab see aega üheksa kuni kaksteist kuud või isegi kauem [5], mis suurendab M. tuberculosis'e ravimiresistentsete mutatsioonide riski [6,7]. Viimastel aastatel on keemiaravi muutunud vähem efektiivseks, kuna on esile kerkinud ja suureneb nende osakaalu suurenemine mitme ravimiga ja ulatuslikult ravimresistentse M. tuberculosis'e [6] tõttu. Tuberkuloosi arengu ennetamine võib olla tõhusam kui selle ravimine. Vaktsineerimine on hästi teada kui tõhus viis peremeesorganismi kaitsmiseks patogeensete bakterite eest [8].

Praegu on enam kui 100 aastat tagasi välja töötatud Bacillus Calmette-Guérin (BCG) ainus kliiniliselt heakskiidetud tuberkuloosivaktsiin [9]. Kahjuks kaitseb BCG ainult vastsündinuid ja imikuid ning on noorukite ja täiskasvanute vastu suures osas ebaefektiivne [2,10], kuigi WHO andmetel olid 2021. aastal 89 protsenti tuberkuloosi juhtudest täiskasvanud [4]. Seetõttu on tungiv vajadus töötada välja uudne ja tõhus tuberkuloosivastane vaktsiin, eriti noorukite ja täiskasvanute jaoks.

TB vaktsiini väljatöötamist raskendavad mitmed mükobakterite tunnused, nagu latentne infektsioon, püsivus ja immuunvastuse kõrvalehoidmine [11–13]. Ideaalne tuberkuloosivaktsiin peaks olema välja töötatud nii, et see oleks suunatud nende omaduste eest vastutavatele valkudele/radadele M. tuberculosis'es ja suudab tõhusalt indutseerida CD4 pluss ja CD8 pluss T-rakkude poolt vahendatud immuunvastuseid [14].

Peale selle peaks tõhus vaktsiin olema suunatud ka peremeesorganismi peamistele histokompatibiliseerimiskompleksidele (MHC), mis on väga polümorfsed [15]. Need omadused seavad vaktsiini mitmekülgsusele väga kõrged nõuded, mida ilmselgelt ei ole võimalik saavutada ühe loodusliku valguga. Mitme epitoopi vaktsiin, rekombinantne valk, mis koosneb kattuvatest epitoopide (peptiidide) seeriast [16], on uut tüüpi vaktsiinikandidaat, mis võib lahendada ülaltoodud probleeme.

Viimastel aastatel on mitme epitoobiga vaktsiinid pälvinud palju tähelepanu, kuna neil on suurem immuunsus ja väiksem allergeensus kui tavalistel vaktsiinidel [17,18]. Praegu on mitme epitoobiga vaktsiinid välja töötatud paljude patogeensete mikroorganismide, sealhulgas Shigella spp. [19], suu- ja sõrataudiviirus [20], Helicobacter pylori [21,22], B-hepatiidi viirus [23], Toxoplasma gondii [24], Leishmania infantum [25], Nipah viirus [26], Onchocerca volvulus [27], Pseudomonas aeruginosa [28] ja leukoosiviirus [29].

Eelkõige on COVID{0}} pandeemia esilekerkimine tugevdanud selle tehnoloogia rakendamist [16,30–32]. Mis puutub tuberkuloosi, siis on välja töötatud mitmed mitme epitoobiga vaktsiinid, mis on suunatud loomupäraselt aktiivse tuberkuloosi [33–39] ja latentse tuberkuloosi vastu [40,41]. Nende hulgas kavandati kolm vaktsiinikandidaati DNA kujul [34, 36, 40] ja kaks neist ühendasid rekombinantsete vaktsiinide genereerimiseks valgu karkassi epitoope [34, 36].

Tuleb märkida, et mõne ülalnimetatud mitme epitoopi vaktsiini kandidaatvalgud valitakse juhuslikult ja nende vaktsiinide populatsiooni katvus nõuab täiendavaid uuringuid.

Veelgi enam, kavandati kaks laia populatsiooniga mitme epitoobiga tuberkuloosivaktsiini kandidaati, üks epitoop valiti immunogeensete eksosoomide vesiikulite valkude hulgast, millel on patogeensed omadused [39] ja teine ​​ei keskendu kandidaatvalkudele, vaid valib otseselt kõrgelt konserveerunud ja eksperimentaalselt valideeritud. epitoobid immuunepitoopide andmebaasist (IEDB) [38]. Siiski puudub neil kandidaatvalkudel funktsionaalne rikastus ja vaktsiinikandidaatide võimet indutseerida interferooni (IFN-) sekretsiooni tuleb veel parandada.

Eelnev uuring on järeldanud, et epitoopide ratsionaalset optimeerimist saab saavutada MHC sidumisvõime ja epitoobi võime reageerida T-raku retseptoritega kombinatsiooniga [42]. Lisaks ennustasid nad, et tsütotoksilisi T-lümfotsüüte (CTL) A1, A2, A3, A24 ja B7 siduvate epitoopidega vaktsiinide katvus on peamistes etnilistes rühmades (mustad, asiaadid, hispaanlased ja kaukaaslased) peaaegu 100 protsenti.

Seni pole aga tuberkuloosivaktsiini väljatöötamiseks sarnast lähenemist olnud. Selles uuringus töötasime välja väga valiva mitme epitoopi sisaldava TB vaktsiini, kasutades kaheksa funktsiooniga rikastatud valgu erinevaid antigeenseid omadusi. Kimäärse vaktsiini kandidaadil on 15 CTL epitoopi, 16 abistaja T-lümfotsüütide (HTL) epitoopi, millel on IFN- -indutseerivad omadused, ja 10 lineaarset B-raku epitoopi. Immunoinformaatika analüüs näitas, et see vaktsiinikandidaat oli kõikehõlmav, muutes selle potentsiaalseks nurgakiviks tuberkuloosivastase strateegia saavutamisel.

2. Materjalid ja meetod

2.1. Valkude valik ja järjestuse otsimine

TB-vastase mitme epitoopi vaktsiini konstrueerimiseks valisime esmalt välja M. tuberculosis'e kompleksi valgud, mis on salvestatud IEDB andmebaasi [43] ja on valideeritud MHC I ja II klassi siduvate epitoopidena. M. tuberculosis H37Rv tüvest pärinevate valkude aminohappejärjestused (esmastruktuur) saadi UniProti andmebaasist [44]. Tulevaste antigeenide joondamisest sõltumatud füüsikalis-keemilistel omadustel põhinevad ennustused saadi VaxiJen 2.0 serverist [45], mis läbis valgujärjestuste automaatse ja ristkovariantsi (ACC) transformatsiooni peamiste aminohapete ühtseks vektoriks. antigeensuslävi on 0,4 iga bakteriaalse valgu jaoks [45,46].

Valkude funktsionaalset annotatsiooni hinnati annotatsiooni, visualiseerimise ja integreeritud avastamise andmebaasi (DAVID) 6.8 abil [47]. Sekreteeritud valke rikastati täiendavalt kahe kategooria abil: ekstratsellulaarne ruum ja patogenees vastavalt andmebaaside DAVID ja BioCyc [48] kaudu. Homo sapiens GRCh38.p13 proteoom laaditi FASTA-vormingus alla riiklikust biotehnoloogiateabe keskuse (NCBI) andmebaasist [49]. BLASTp-d kasutati sekreteeritud valkude ja H. sapiens'i valkude homoloogia (E-väärtus =1e-5) ennustamiseks.

2.2. T-raku epitoobi ennustamine

Epitoopide ennustamine ja valimine on mitut epitoopi sisaldavate vaktsiinide loomisel üliolulised etapid. MHC I molekulid seovad lühikesi peptiide (9–11 aminohapet), kuna ühest ahelast koosnevate MHC I molekulide peptiide siduv lõhe on suletud [50]. CTL epitoopide ennustamiseks kasutati vabalt ligipääsetavat NetMHCpan-4.1 [51], mis kasutab NNAlign_MA-d, et genereerida protsentuaalne järjestus (protsentuaalne järjestus), mis põhineb MHC I sidumisafiinsuse ja elueeritud ligandide kombinatsioonil. .

Päringujärjestuse "protsentuaalne järjestus" määrati, võrreldes selle ennustusskoori vastava MHC ennustusskooride jaotusega, mis arvutati juhuslikult valitud natiivsete peptiidide komplekti kasutades. Epitoope, mille protsendiasetus oli < 0,5 protsenti, peeti tugevateks sidujateks, samas kui epitoope, mille protsendiasetus oli < 2 protsenti, peeti nõrkadeks sidujateks [51].

Kuigi serveris saab ennustada kuni 12 supertüüpi MHC I klassi epitoopi, kasutasime ainult A1, A2, A3, A24 ja B7, kuna need viis supertüüpi katavad 100 protsenti peamistest inimrassidest [42] . Valisime tugevad sideained ja ennustasime nende antigeensust kasutades VaxiJen2.0 [45], seejärel ennustasime I klassi immunogeensust, kasutades rahvusvahelist epitoopide andmebaasi (IEDB) [52], mis kasutab 3-kordset ristvalideerimist.

Lõpuks järjestasime epitoobid, mis olid nii antigeensed kui ka immunogeensed vastavalt protsendi järjestusele, ja valisime välja 15 madala skooriga epitoopi, kolm iga supertüübi jaoks ja vähemalt ühe iga kandidaatvalgu jaoks, välja arvatud kandidaatvalk, millel ei saanud olla tugevat CTL-i siduvat epitoopi. mis on antigeenne ja immunogeenne. Lõpuks ennustati NetMHC-4.0 põhjal iga CTL epitoobi IC50 väärtused [53].
II klassi MHC molekulid seonduvad antigeensete peptiididega ja saadud kompleksi saab HTL ära tunda. Tavaliselt on antigeensete peptiidide pikkus vahemikus 12 kuni 20 aminohappejääki, kuid sageli täheldatakse peptiide pikkusega 13 kuni 16 aminohappejääki [54].

{{0}}meerid olid M. tuberculosis'e kõige levinumad MHC II epitoobid ja need on hoiustatud IEDB-s. Selle tulemusena kasutasime NetMHCIIpan-4.0 [51,55], et ennustada 15-mer peptiidide seondumist inimese leukotsüütide antigeeni-DR (HLA-DR), HLADQ, HLA-DP, ja H-2-1 alleel. Prognoos põhines ka NNAlign{11}}MA-l, mille protsendiasetus oli < 2 protsenti ja < 10 protsenti, mida peeti vastavalt tugevaks ja nõrgaks sidujaks [51].

Samuti ennustasime 15-mer IFN-i indutseerivaid epitoope kandidaatvalkude jaoks, kasutades IFNepitope-serverit [56], mis kasutab tugivektori masina hübriidmeetodit, mis võimaldab peptiidis IFN- -indutseeriva peptiidi/epitoobi virtuaalset skriinimist. raamatukogu, mis koosneb IFN- -indutseeritavatest ja mitteindutseeritavatest MHC II sideainetest, mis aktiveerivad T-abistajarakke. Seejärel ennustasime IFN-i indutseerivate epitoopide antigeensust [45] ja lõpuks valisime välja 16 kõige ebasoodsamat epitoopi, mis olid tugevalt MHC-II siduvad, IFN-i indutseerivad ja antigeensed.

Oluline on märkida, et signaalpeptiidid eemaldati kandidaatvalkudest enne epitoobi ennustamist. Selles uuringus skriiniti signaalpeptiide, kasutades SignalP 5.0 [57] ja TargetP2.0 [58].

2.3. Lineaarne B-raku epitoobi ennustamine

Lineaarsete B-rakkude epitoopide (16-meeride) ennustamiseks kasutati ABCpred [59,60] vaikelävega 0,51. Lisaks kasutasime ennustustulemuste usaldusväärsuse suurendamiseks ka BepiPred 2.{11}} [61] lineaarsete B-rakkude epitoopide ennustamiseks. Nendest kahest tarkvarast saadud epitoobid allutati täiendavalt antigeensuse ennustamisele, kasutades VaxiJen2.0 [45]. Lõpuks valisime kõrgete ABCpredi skooride ja antigeensuse põhjal kümme lineaarset B-raku epitoopi, kusjuures iga kandidaatvalgu jaoks valiti vähemalt üks epitoop.

2.4. Kimäärsete omadustega mitme epitoopi vaktsiinikandidaadi konstrueerimine

Kavandatud mitme epitoobiga vaktsiin sisaldab ühte HBHA (hepariini siduv hemaglutiniini) adjuvanti, ühte Pan HLA DR-siduvat epitoopi (PADRE), 15 CTL, 16 HTL, 10 lineaarset B-raku epitoopi ja ühte His × 6 märgist (joonis 1). 3). Linkereid kasutati epitoopide ühendamiseks, ühendusepitoopide tekke ärahoidmiseks ning üksikute epitoopide protsessi ja regeneratsiooni suurendamiseks kimäärsetes vaktsiinides [62].

Selle vaktsiinikandidaadi konstrueerimiseks paiknes HBHA adjuvant (UniProt ID: P9WIP9) N-otsas ja ühendati EAAAK linkeri kaudu allavoolu PADRE-ga. Seejärel seoti GPGPG linkerite poolt ühendatud HTL epitoobid PADRE-ga. Veelgi enam, AAY linkeriga ühendatud CTL epitoobid ühendati HTL epitoopidega HEYGAEALERAG linkeri kaudu, mis samuti liitus CTL epitoobiüksusega lineaarsete B-raku epitoopidega, mis olid seotud KK linkerite abil. Lõpuks kinnitati kimäärse valgu C-otsa His × 6 märgis.

2.5. Antigeensus, allergeensus ja füüsikalis-keemilised omadused

Mitme epitoopi vaktsiini ja kaheksa komponendi valgu antigeensust ennustas VaxiJen 2.0 server [45], samas kui nende valkude allergeensust ennustas AllerTOP 2.0 server [ 63]. AllerTOP 2.0 kasutab allergeenide klassifitseerimiseks aminohapete E-deskriptoreid, valgujärjestuste ACC transformatsiooni ja k-lähimaid naabreid (kNN).

Meetod saavutas 5-kordse ristvalideerimisega 85,3-protsendilise täpsuse. Selle mitme epitoobiga vaktsiini füüsikalis-keemiliste omaduste, nagu poolestusaeg, isoelektriline punkt, ebastabiilsuse indeks, alifaatne indeks ja hüdropaatilisuse suur keskmine (GRAVY) ennustamiseks kasutati ExPASy ProtParam serverit [64].
Lisaks hinnati mitme epitoobiga vaktsiini peptiidi lahustuvust proteinSol (PROSO II) serveriga [65], mis põhines klassifikaatoril, mis kasutas ära peened erinevused TargetDB hästituntud lahustumatute valkude ja nii TargetDB kui ka PDB lahustuvate valkude vahel. 66]. Kui hinnati 10-kordse ristvalideerimisega, saavutas selle täpsus 71.0 protsenti (ROC kõvera alune pindala=0,785).

2.6. Immuunsuse simulatsioon

Immuunvastuse profiili ja vaktsiini immunogeensuse iseloomustamiseks viidi läbi in silico immuunsimulatsioonid, kasutades C-ImmSim serverit [67]. C-ImmSim ennustab immuunsüsteemi interaktsioone, kasutades peptiidide ennustamiseks masinõppetehnikatest tuletatud positsioonispetsiifilisi hindamismaatrikse.
See simuleerib samaaegselt kolme sektsiooni, mis esindavad kolme erinevat imetajatel leitud anatoomilist piirkonda: (i) luuüdi, kus simuleeriti vereloome tüvirakke, et toota uusi lümfotsüüte ja müeloidrakke; (ii) harknääre, kuhu valiti autoimmuunsuse vältimiseks naiivsed T-rakud; ja (iii) lümfisüsteemi organ nagu lümfisõlmed.

Vaktsiini tõhusaks ettevalmistamiseks ja võimendamiseks järgisime [68] lähenemisviisi, kus kaks süsti tehti neljanädalase vahega. Kõik simulatsiooni parameetrid määrati vaikeväärtustele, ajasammudeks määrati 10 ja 94 (iga sammu pikkus on kaheksa tundi).

2.7. Häiritud piirkonna prognoosimine

Sisemiselt korrastamata piirkonnad (IDR) esinevad paljudes valkudes. Häiritud piirkonda ennustati DISOPRED3 [69] abil, mis kasutab korrastamata jääkide tuvastamiseks DISOPRED2 ja kahte teist masinõppepõhist moodulit, mis on koolitatud suurte IDR-idega. Nad olid siis anno

2.8. Sekundaarse ja tertsiaarse struktuuri ennustamine

Kavandatud vaktsiini sekundaarse struktuuri ennustas PSIPRED 4.{1}} server [70], mis kasutab esmalt PSI-BLAST-i päringuvalguga tihedalt seotud järjestuste tuvastamiseks. Selle vaktsiini tertsiaarne struktuur ennustati Iterative Threading Assembly Refinement (I-TASSER) serveri abil [71].

ITASSERi modelleerimisel on neli peamist sammu; a) keermestusmalli identifitseerimine; b) iteratiivne struktuuri koostamise simulatsioon; c) mudeli valik ja täiustamine; ja d) struktuuripõhine funktsionaalne annotatsioon [72,73].

I-TASSER genereeris viis mudelit, mida sõeluti ProSA-webi [74] abil ja edasiseks täiustamiseks valiti madalaima Z-skooriga mudel. ProSA-web võrdleb esialgsesse eelarveprojekti deponeeritud eksperimentaalselt kontrollitud struktuuridest saadud mudeliskoore. Kohalik kvaliteediskoori graafik aitab tuvastada mudeli probleemsed piirkonnad ja samad skoorid olid esindatud värvikoodiga 3D-struktuuri esitlemisel. See on kasulik varajaseks struktuuri kindlaksmääramiseks ja täpsustamiseks.

2.9. Tertsiaarse struktuuri täpsustamine

ITASSERi saadud vaktsiinikandidaadi "jämedat" 3D mudelit viimistleti kahes etapis, kasutades kahte serverit; kõigepealt ModRefineriga [75], millele järgnes GalaxyRefine [76]. ModRefiner kasutab C-jälgi, et mõjutada kaheastmelise aatomitaseme energia minimeerimisega saadud valkude ehitust ja täpsustamist.

Esiteks kasutati põhiahela konstrueerimiseks C-jälgi, millele järgnes külgahela rotameeride ja selgroo aatomite täpsustamine, kasutades füüsika- ja teadmistepõhiseid liitjõuvälju. GalaxyRefine kasutab usaldusväärsete põhistruktuuride loomiseks mitut malli, samas kui ebausaldusväärsed silmused või terminalid genereeriti optimeerimispõhise modelleerimisega.

2.10. Tertsiaarse struktuuri valideerimine

Vaktsiini kandidaadi täiustatud struktuur kinnitati PROCHECKi [77] ja MolProbity [78] andmebaasidest genereeritud Ramachandrani graafikutega. Ramachandrani graafikud hindavad valkude selgroo konformatsiooni, jagades aminohappejäägid kaheks piirkonnaks: lubatud ja keelatud. PROCHECK kasutab valgustruktuuride netokvaliteedi hindamiseks stereokeemiat, võrreldes neid sama eraldusvõimega rafineeritud struktuuridega ja esitades seejärel täiendavat analüüsi vajavad piirkonnad.

Molprobity kinnitab lokaalseid ja globaalseid makromolekulide (valgud ja nukleiinhapped) mudeleid röntgeni-, NMR-, arvutus- ja krüoEM-kriteeriumide seguga [79]. Vesiniku paigutuse ja kõigi aatomite kontaktanalüüsi optimeerimise võimsust ja tundlikkust kasutatakse laialdaselt kovalentse geomeetria ja väändenurga kriteeriumide uuendatud versioonis [80].

2.11. Katkendlikud B-raku epitoobid

ElliPro abil ennustati natiivse valgu struktuuri katkendlikke B-raku epitoope [81]. ElliPro rakendab kolme algoritmi valgu kuju ligikaudseks määramiseks ellipsoidina, arvutab jääkide väljaulatuvuse indeksi (PI) ja koondab naaberjäägid nende PI väärtuste põhjal. ElliPro annab igale väljundepitoobile skoori, mida kirjeldatakse kui epitoobijäägi keskmist PI väärtust. Ellipsoid, mille PI väärtus on 0,9, koosneb 90 protsendist sisalduvatest valgujääkidest, ülejäänud 10 protsenti jääkidest asuvad väljaspool ellipsoidi. Iga epitoobijäägi jaoks arvutatakse PI väärtus suurimast võimalikust ellipsoidist väljaspool asuva jäägi massikeskpunkti järgi.

2.12. Kimäärsete valkude molekulaarne dokkimine

Kavandatud vaktsiini (ligandi) molekulaarne dokkimine Toll-Like Receptor-4 (TLR4) (PDB ID: 3FXI) immuunretseptoriga viidi läbi Patchdocki abil [82]. Seejärel viimistleti 10 parimat mudelit FireDocki abil [83]. PatchDock asendab molekulide Connolly punktipinna kujutise nõgusate, kumerate ja lamedate laikudega.

Seejärel hinnati mudeleid geomeetrilise sobivuse ja aatomi desolvatsiooni põhjal. [82]. FireDock optimeerib jäiga keha külgahelate konformatsioone ja orientatsiooni ning genereerib sidumisenergial põhineva 3D-rafineeritud kompleksi väljundi [83]. Valisime dokkimiskompleksiks Firedocki esimese mudeli, mis põhineb globaalsel energial. Lõpuks ennustati PRODIGY serveri abil dokkimiskompleksi sidumisenergia ja dissotsiatsioonisisaldus [84].

2.13. Molekulaardünaamika simulatsioon

Molekulaarsed dünaamilised simulatsioonid viidi läbi valkudel, kasutades kiiret ja vabalt ligipääsetavat veebiserverit, sisemiste koordinaatide normaalrežiimi analüüsiserverit (iMODS) [85] ning järjepidevad ja optimaalsed dokkimistulemused saadi PatchDock-FireDocki serverist. Sisemistes koordinaatides genereerib normaalrežiimi analüüs (NMA) makromolekulaarse funktsiooni jaoks kriitilisi kollektiivseid liikumisi. iMODS esitleb mehhanisme nende režiimide uurimiseks nagu vibratsioonianalüüs, liikumisanimatsioonid ja trajektooride muutmine, mis viidi läbi peaaegu interaktiivselt erinevatel eraldusvõimetel [85].

2.14. Vaktsiini pöördtõlge, koodonite optimeerimine ja in silico kloonimine

Vaktsiinikandidaadi tõhusaks ekspresseerimiseks Escherichia coli rakkudes genereeriti cDNA in silico koodonite optimeerimise ja pöördtõlke abil, kasutades Java koodoni kohandamise tööriista (JCAT) [86].

Optimeerimine hõlmas (i) rho-sõltumatute transkriptsiooniterminaatorite vältimist, ii) prokarüootsete ribosoomide sidumissaitide vältimist, (iii) restriktsiooniensüümide NcoI ja XhoI lõikamissaitide vältimist, mis toimivad cDNA sisestamisel N-terminaalse ja C-otsa restriktsioonisaitidena. vaktsiini malli ja (iv) ainult osalist optimeerimist, et rakendada saidile suunatud mutageneesi. Koodoni kohanemisindeks (CAI) ja GC sisu ennustasid cDNA kvaliteeti, kasutades His × 6 märgise järele sisestatud opaal-stoppkoodonit (TGA). Seejärel integreeriti kimäärse vaktsiinikandidaadi optimeeritud DNA fragment pET-28a( plus ) pöördahelasse, kasutades SnapGene'i tööriista [87].

For more information:1950477648nn@gmail.com