Cistanche Deserticola veest ekstraheeritavate polüsahhariidide immunostimuleeriv toime taimse abiainena in vitro ja in vivo

Sissejuhatus

Vaktsiinid on olulised haiguste tõrjeks või ennetamiseks. Äsja loodud ja praegu väljatöötatavad vaktsiinid on kõrgelt puhastatud rekombinantsed antigeenid, millel on suurem ohutus, kuid puhastatud antigeenid ei suuda stimuleerida rahuldavat immuunvastust võrreldes nõrgestatud või inaktiveeritud patogeenipreparaatidega. Adjuvantide abil võivad vaktsiinid kutsuda esile püsivaid immuunvastuseid [1,2]. Mõlema vaktsiini puhul on laialdaselt mures uued võimsad adjuvandidareng ja inimeste tervis. Praeguseks on tuvastatud ja põhjalikult uuritud erinevaid adjuvante. Need adjuvandid annavad vaktsiinidele mitmeid eeliseid, sealhulgas nõutava antigeenide koguse vähendamine, normaalsete immuunvastuste jaoks vajalike immuniseerimiste arvu minimeerimine ja kiiremate, laiemate ja tugevamate immuunvastuste esilekutsumine.3–5]. Kuigi on välja töötatud palju tugevaid adjuvante, nagu lipopolüsahhariid (LPS) ja Freundi täielik adjuvant (FCA), ei kasutata neid nende toksilisuse tõttu laialdaselt. Seetõttu on kliiniliseks kasutamiseks litsentsitud vaid mõned adjuvandid, näiteks Alum [6]. Üldiselt tuleks välja töötada tõhusamad ja ohutumad adjuvandid, et edendada paremaid profülaktilisi ja terapeutilisi vaktsiine nakkus- ja mittenakkushaiguste vastu.

LOODUSLIK TUBULOOS IMmuunsuse PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ohutus on abiainete väljatöötamisel oluline tegur. Hiina rohtsed koostisosad hõlmavad toitaineid ja olulisi aktiivseid komposiite, nagu fenoolühendid ja polüsahhariidid, mis võivad toimida võimsate immunostimulantidena [7–9]. Nende hulgas on traditsiooniliste Hiina ürtide polüsahhariide nende immunostimuleeriva toime ja madala toksilisuse tõttu laialdaselt uuritud. Näiteks on inuliin immuunadjuvant ilma teiste adjuvantide, nagu FCA, toksilisuseta. AdvaxTM delta inuliini adjuvant on samuti edukalt suurendanud vaktsiini immunogeensust [10,11]. Astragalus, hiina keeles tuntud ka kui Huangqi ja ladina keeles Radix Astragali, on laialt levinud kogu maailmas. Polüsahhariid on üks selle peamisi aktiivseid koostisosi, mis vastutab immunomoduleeriva toime eest. Eksperimentaalsed uuringud on näidanud, et Astragaluse polüsahhariidil on tugev immunomoduleeriv toime nii in vitro kui ka in vivo [12, 13]. Lycium barbarum polüsahhariidid vaktsiini adjuvandina näitasid samuti head paranemist ja stimuleerivat toimet [14, 15]. Need uuringud näitasid, et Hiina taimsed polüsahhariidid olid ideaalsed kandidaadid adjuvantide väljatöötamiseks.

Cistanche deserticolaYC Ma (CD, hiina keeles "Rou Cong Rong") on väärtuslik traditsiooniline Hiina ravimtaim, mida oma suurepärase toonilise toime tõttu peetakse tavaliselt "kõrbete ženšenniks". Seda levitatakse Xinjiangi kuivades või poolkuivades piirkondades. Hiinas on selle kuivatatud lihakat vart kasutatud toniseeriva toiduna sadu aastaid [16, 17]. Paljude aastate jooksul on keedetud CD-d kasutatud toniseeriva toiduna, et ravida ülepingest põhjustatud kahjustusi, mis viitab sellele, et see on suukaudseks manustamiseks ohutu. Seda taime peetakse laialdaselt selle laiaulatuslike meditsiiniliste funktsioonide tõttu. Hiljutised fütokeemilised ja farmakoloogilised uuringud näitasid, et polüsahhariidid olid peamised bioloogiliselt aktiivsed komponendid ja neil on erinevad bioloogilised mõjud, sealhulgasimmunomoduleeriv toime, antioksüdantne toime ja põletikuvastane toime[18–21]. Siiski teatati harva Xinjiangi C. deserticola veega ekstraheeritavate polüsahhariidide immuunsüsteemi tugevdavast toimest.

On hästi teada, et DC-d on olulised antigeeni esitlevad rakud (APC), mis annavad signaale, mis on vajalikud immuunvastuste algatamiseks ning kaasasündinud ja adaptiivsete rakkude moduleerimiseks. Mõned adjuvandid, mis parandavad DC-de antigeeni omastamist, võivad suurendada kaasstimuleerivaid või MHC molekule jatõsta immuunsust. Kui DC-de küpsemine algab, toodetakse rohkem kaasstimuleerivaid molekule ja tsütokiine ning DC-del on erinevad fenotüübid [22, 23].

Selles uuringus kasutasime kõigepealt seda, kas WPCD võib soodustada DC-de aktiveerimist TLR4 signaaliraja kaudu in vivo. Kuna DC-d olid seos kaasasündinud ja adaptiivsete immuunvastuste vahel, oletasime, et WPCD poolt stimuleeritud DC-de aktiveerimine mõjutab adaptiivse immuunsuse tulemust. Uurisime spetsiifilist immuunvastust ovalbumiinile (OVA) hiirtel, keda raviti WPCD-ga, sealhulgas IgG, IgG1 ja IgG2a alamklassi tiitreid, T- ja B-proliferatsiooni ning tsütokiini tootmist. Uurisime, kas WPCD-ravi suurendaks DC-de ja Treg-rakkude aktiivsust nende hiirte põrnas. Meie leiud tõestasid C. deserticola looduslike polüsahhariidide potentsiaalset immunomoduleerivat toimet ja laiendasid selle rakendusala.

materjalid ja meetodid

Loomad

Kaheksa kuni kümne nädala vanused C57BL/6, BALB/c või ICR emased hiired osteti Xinjiangi meditsiiniülikooli esimesest haiglast (Urimuqi, Xinjiang, Hiina). Hiiri hoiti patogeenivabades tingimustes vastavalt Xinjiangi loomade tervise ja heaolu ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise komitee (ACUC) juhistele. Loomkatsete protseduurid kiitis heaks Xinjiangi ülikooli AUCC.

Vesiekstraktide ekstraheerimine

C. deserticola on taim Hiinas Xinjiangi provintsis. Toorpolüsahhariid saadi veega ekstraheerimise ja etanooliga sadestamise teel. Lühidalt, 100 g kuivatatud C. deserticola jahvatati pulbriks ja seejärel filtriti. Pulbrit keedeti püstjahutiga toatemperatuuril korduvalt petrooleetriga ja seejärel keedeti veevaba etanooliga 1 tund, et eemaldada värvilised koostisosad ja lipiidid. Jääke ekstraheeriti kolm korda keeva veega ja ekstraktid ühendati, tsentrifuugiti kiirusel 4000 p/min 10 minutit ja keedeti püstjahutiga 60 °C juures 4 tundi. Lahusele lisati toorpolüsahhariidide sadestamiseks neli korda mahus 95% etanooli. Toorpolüsahhariidid lahustati uuesti destilleeritud vees ja töödeldi valkude eemaldamiseks Sevage'i reagendiga. Ekstraktid lahustati PBS-is ja steriliseeriti läbi 022- μm filtri. Lõpuks oli WPCD kogusuhkrusisaldus 59, 58%, nagu näitas fenool-väävelhappe analüüs [24].

DC-de genereerimine

BM-DC-d genereeriti vastavalt eelnevalt kirjeldatud meetodile väikeste modifikatsioonidega [25]. C57BL/6 hiirte luuüdi DC-d loputati välja RPMI -1640 täieliku söötmega (Gibco), millele oli lisatud 10% vasika loote seerumit (Hyclone). Kogutud rakud suspendeeriti uuesti RPMI-1640 söötmes, mis sisaldas 50 µM -merkaptoetanooli (Sigma, St Louis, MO) ja 20 ng/ml hiire GM-CSF-i (Peprotech, Rocky Hill, NY) ning inkubeeriti 37 ˚ juures. C 5% CO2 atmosfääris. Pool söötmest asendati värske GM-CSF-i sisaldava söötmega iga 1–2 päeva järel. Rakud koguti 6. päeval, töödeldi erinevate annustega WPCD ja LPS-iga (100 ng/ml) (Sigma, St Louis, MO) 24 tundi ning seejärel hinnati voolutsütomeetria abil.

DC-de küpsemise ja T-rakkude aktivatsiooni tuvastamine in vitro

WPCD in vitro küpsemise mõju BM-DC-dele hinnati FAC-de fenotüübianalüüsi tulemuste põhjal. 7. päeval indutseeriti C57BL/6 BM-DC-d GM-CSF juuresolekul ja seejärel töödeldi erineva kontsentratsiooniga WPCD-ga (0.01, 0.{{ 11}}2, 0,05, 0,1 ja 0,2 mg/mL) 12 tundi kolmes eksemplaris. Positiivse kontrollina kasutati LPS-i (100 ng/ml). Pärast seda, kui BM-DC-d pesti PBS-is ja mittespetsiifilise antikeha sidumise vältimiseks kasutati Fc Blocki (BD Biosciences, CA), värviti rakud PBS-is, kasutades sobivat FITC-, PE- või APC-konjugeeritud CD40, CD11c, CD{ {23}}, CD80 ja MHC-II antikehad (BD) 20 minutit temperatuuril 37 ˚C. Värvitud rakud tuvastati FACs Calibur (BD) abil. Andmete analüüs viidi läbi FlowJo tarkvaraga (Tree Star).

In vitro DC-de küpsemise katses koguti ka rakukultuuri supernatandid, et analüüsida IL-12 ja TNF-d, kasutades tsütokiinitesti komplekte (Boster, Wuhan, Hiina) vastavalt tootja juhistele. Neeldumist 450 nm juures mõõdeti ELISA plaadilugejaga (Bio-Rad, USA). Tsütokiinide kogused proovides arvutati rekombinantsete tsütokiinide standardkõverate abil vastavalt lineaarse regressioonimeetodile.

Nende allogeense stimuleeriva aktiivsuse testimiseks viidi läbi segalümfotsüütide reaktsiooni (MLR) eksperiment vastavalt eelmisele meetodile [26] MTT (Sigma, St Louis, MO) testiga. Lühidalt, stimulaatorrakkudena kasutatud C57BL/6 hiirte BM-DC-d koguti 7. päeval RPMI-1640 söötmes pluss GM-CSF ja töödeldi erinevate kontsentratsioonidega WPCD-ga 12 tundi temperatuuril 37 ˚C. Rakud pesti ja suspendeeriti uuesti RPMI{10}} söötmes enne 24-süvendiplaadile plaatimist. BALB/c hiirtelt eraldati üksikute plenotsüüdide suspensioonile reageerivad rakud. BM-DC-d segati splenotsüütidega vastavalt suhetele 1:5 ja 1:10. Rakke kultiveeriti 37 ˚C juures 5% CO2 atmosfääris kolm päeva kolmes eksemplaris. LPS-ravi kasutati positiivse kontrollina. Seejärel lisati kultuuridele viimaseks 4-tunniseks kultiveerimiseks 20 μL MTT-d. T-rakkude proliferatsiooni analüüsiks mõõdeti neeldumised mõõtelainepikkusel (490 nm) ja võrdluslainepikkusel (650 nm). Kõiki proove mõõdeti taustakontrolliga.

LOODUSLIK CISTANCHE TUBULOSA TEIE IMMUUNSÜSTEEMI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ravi TLR4 inhibiitoriga in vitro

BM-DC-sid töödeldi 5 μM TAK-242-ga (TLR4 inhibiitor, Medchemexpress Inc. USA) 1 tund ja seejärel kultiveeriti koos erinevate kontsentratsioonidega WPCD (100 ja 200 ug/mL) 12 tundi. Golgi Stopi olemasolul või puudumisel kolmes eksemplaris. Positiivses kontrollis lisati LPS. Rakud ja supernatandid tuvastati pinnamarkerite CD86 ja CD40 analüüsimiseks FAC-ga ning tsütokiinide TNF-a ja IL-12 analüüsimiseks ELISA abil.

Immuniseerimise protokoll

Ägeda mürgisuse test

Selle uuringu suukaudse ägeda toksilisuse testis kasutati 40 tervet täiskasvanud ICR-hiirt. ICR-hiiri hoiti enne doseerimist tühja kõhuga (toitu, kuid mitte vett üleöö). WPCD-d manustati suukaudselt vastavalt 0, 50, 500 või 5000 mg/kg kehakaalu kohta igale loomale 7 päeva jooksul. Kontrollrühma kaasati soolalahusega ja maarjaga töödeldud hiired. Loomi jälgiti iga päev 14 järjestikuse päeva jooksul. Hiiri jälgiti individuaalselt, et registreerida suremus ja kliinilised tunnused. Lisaks mõõdeti kogu katse vältel kehakaalu ning toidu- ja veetarbimist. 14. päeval arvutati põrna või harknääre indeks (põrna või tüümuse kaal/kehakaal) × 10.

WPCD immunomoduleeriva aktiivsuse tuvastamine in vivo.

Et uurida, kas WPCD-l on immunomoduleeriv toime, kasutati mudelantigeenina ovalbumiini (OVA) (Sigma) ja emased ICR-hiired jaotati juhuslikult 7 rühma (negatiivne kontrollrühm (0,9% NaCl ja WPCD 400 ug). ) ja positiivne kontroll (maarjas 200 ug OVA-ga)). Hiirtele manustati subkutaanselt kaks korda ainult 10 ug OVA-ga või WPCD-d koos OVA-ga vastavalt annusele 20, 100 või 400 ug 2-nädalase intervalliga. Vereproovid ja põrn võeti pärast revaktsineerimist, et tuvastada IgG tiitrid, IgG alamklassid, splenotsüütide proliferatsioon ja tsütokiinid, DC-de pinnamarkerid ja Treg-i sagedus.

OVA-spetsiifiliste antikehade tuvastamine

OVA-spetsiifilisi IgG tiitreid ja alamklasse uuriti ELISA meetodil vastavalt eelmisele meetodile [27]. ELISA plaadid (Nunc, Thermo Fisher Scientific) kaeti üleöö ja seejärel blokeeriti. Seerumiproove lahjendati järjestikku IgG tiitri analüüsiks või IgG1 ja IgG2a tuvastamiseks (Southern Biotech, Inc.). Seejärel inkubeeriti plaate PBST-ga, mis sisaldas HRP-konjugeeritud hiirevastast IgG-d, IgG1-d ja IgG2a-d, 1 tund 37 °C juures. Kolorimeetriline reaktsioon töötati välja tetrametüülbensidiiniga (TMB) ja seejärel mõõdeti neeldumised 450 nm/655 nm juures ja väljendati optilise tiheduse (OD) ühikutes.

Splenotsüütide proliferatsiooni ja tsütokiini tuvastamine

Splenotsüütide proliferatsioon määrati MTT testiga. 21. päeval pärast esimest vaktsineerimist saadi üksiku splenotsüütide suspensioon. Rakke kultiveeriti RPMI-1640 söötmes 96-süvendiga plaatidel vastavalt kontsentratsioonile 1 × 106 rakku süvendi kohta kolmes eksemplaris. Kultuure stimuleeriti OVA-ga (lõppkontsentratsioon 10 ug/mL), ConA-ga (lõppkontsentratsioon 5 ug/ml) (Sigma, St Louis, MO) ja LPS-ga (lõppkontsentratsioon 100 ng/ml) 48 tundi temperatuuril 37 ˚C. . Rakke kultiveeriti 48 tundi ja igasse süvendisse lisati 20 μL (5 mg/ml) MTT-d (Sigma, St Louis, MO) ja inkubeeriti veel 4 tundi. Pärast 50 μL DMSO lisamist igasse süvendisse, et peatada värvide teke (Sigma), loeti plaadid 570 nm juures mikrotiiterplaadi lugejaga (BioRad, CA, USA). Splenotsüütide proliferatsiooni väljendati stimulatsiooniindeksina (SI), mis oli stimuleeritud süvendi ja stimuleerimata süvendi OD570 nm suhe.

IL-4 ja IFN-i saagiseid T-rakkudes mõõdeti intratsellulaarse tsütokiini värvimisega vastavalt avaldatud protokollile väikeste muudatustega [27, 28]. Ühe splenotsüüdi suspensioon valmistati 21. päeval pärast esimest vaktsineerimist. Pärast punaste vereliblede lüüsimist inkubeeriti splenotsüüte (2 × 106 rakku/ml) OVA-ga (10 ug/mL) 4-tunniseks stimulatsiooniks ja Golgi stopp (BD) lisati 12-tunniseks inkubeerimiseks, PMA oli positiivne. kontroll. Rakud koguti, pesti PBS-ga, värviti CD4-FITC/CD8-FITC-ga ning fikseeriti ja permeabiliseeriti Cytofix/Cytoperm komplektiga (BD) vastavalt tootja juhistele. Intratsellulaarne tsütokiinide värvimine viidi läbi sobiva kontsentratsiooniga IL-4-PE või IFN- -APC antikehadega temperatuuril 4 °C 20 minutit. Värvitud rakud tuvastati FAC-idega. Andmete analüüs viidi läbi FlowJo-s.

DC-de küpsemise ja Treg-rakkude hindamine põrnas

Hiirte splenotsüütide DC-küpsemise analüüsimiseks viidi läbi rakupinna värvimine CD11c-PE, CD40-FITC ja CD80-APC antikehadega. 3. päeval pärast esimest vaktsineerimist saadi üksiku splenotsüütide suspensioon (1 x 106 rakku/ml) ja rakke värviti topelt. Fluorestsentsi intensiivsust mõõdeti FACs Caliburiga ja mõõdetud andmeid analüüsis FlowJo.

Et jälgida, kas WPCD võib CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg rakkude sagedust alandada. Ühe splenotsüüdi suspensioon valmistati 7. päeval pärast teist vaktsineerimist. Splenotsüüt (2 × 106 rakku/ml) värviti rakupinda CD4-APC antikehaga, millele järgnes tuumatsütokiini värvimine sobivate CD25-FITC ja Foxp3-PE antikehadega. hiire reguleeriva T-rakkude värvimiskomplektiga (eBiosciences) vastavalt tootja juhistele. CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg-rakkude sagedust testiti FAC-idega. Andmete analüüs viidi läbi FlowJo-s.

Statistiline analüüs

Mitme katserühma erinevuste analüüsimiseks viidi läbi ühesuunalised dispersioonanalüüsi (ANOVA) testid (Tukey's Multiple-Comparison Test). Kõik väärtused on väljendatud keskmisena ± SD. P< 0.05 is believed to be statistically significant. The statistical analyses were performed using Prism 5.0 software.

Tulemused WPCD soodustas BM-DC-de küpsemist ja funktsiooni in vitro

Adaptiivse immuunsuse määrab DC-de aktiveerimine, sealhulgas kaasstimuleerivate molekulide ja tsütokiinide tüübid [29, 30]. Esialgu uurisime, kas WPCD võib soodustada kaasstimuleerivate molekulide ekspressiooni. Vastavalt erinevatele WPCD annustele BM-DC-d

manustati C57BL/6-st. Analüüsiti CD11c, CD86, CD80, CD40 ja MHC-II ekspressioonitasemeid rakkudes (joonis 1). SSC ja FSC-ga suletud rakud näitasid, et WPCD erinevate annustega töötlemine ei muutnud BM-DC-de morfoloogiat (andmeid pole näidatud). CD86, CD80 ja CD40 ekspressioonitasemed olid oluliselt ülesreguleeritud annusest sõltuval viisil võrreldes ravimata rühmaga ja saavutasid platoo WPCD annuse 20 ug/ml all, kuid erinevus oli ei ole LPS-rühmaga võrreldes oluline (joonised 1A–1C). MHC-II ekspressioonitase tõusis oluliselt maksimaalse väärtuseni annuse 50 ug/ml juures (joonis 1D). Rakupinna markerite analüüsitulemused näitasid, et LPS-i või WPCD-ga töödeldud DC-d näitasid oluliselt suurenenud CD86, CD80, CD40 ja MHC-II ekspressioonitasemeid ning soodustasid fenotüübilist küpsemist.

Mõned adjuvandid võivad suurendada kaasstimuleerivaid molekule DC-del või indutseerida otseselt tsütokiinide sekretsiooni. IL-12 ja TNF- on peamised tsütokiinid Th1 immuunvastuse aktiveerimisel. Analüüsime tsütokiini saagist BM-DC-des pärast WPCD-ravi. Pärast seda, kui BM-DC-sid töödeldi erineva sisuga WPCD-ga 12 tundi, koguti supernatant, et tuvastada ELISA komplektiga IL-12 ja TNF-sisaldus. WPCD võib annusest sõltuvalt suurendada IL-12 (joonis 2A) ja TNF- (joonis 2B) tootmist. Tulemused näitasid, et WPCD võib esile kutsuda DC-de funktsionaalse küpsemise.

Immuunvastuse korral on vaja DC-sid funktsionaalselt aktiveerida. Seejärel kutsusid täielikult küpsed DC-d esile allogeensete T-rakkude proliferatsiooni kõrgema taseme. Seetõttu uuris MLR DC-de funktsionaalset reaktsiooni WPCD-le. WPCD-indutseeritud DC-de allostimuleeriv võime, mis on sarnane LPS-iga, suurenes märkimisväärselt annusest sõltuval viisil näidatud suhtega (joonised 2C ja 2D). Tulemused näitasid, et WPCD parandas antigeeni esitlust ja optimeeris T-raku vastust MLR abil in vitro.

WPCD soodustas DC-de küpsemist TLR4 raja kaudu

Ülaltoodud tulemustest võib järeldada, et WPCD poolt aktiveeritud BM-DC-d näitasid sarnaseid DC-de pinnamolekuli ekspressioone LPS-iga (TLR4 ligand). Seega oletasime, et WPCD aktiveerib BM-DC-d TLR4 raja kaudu. Pärast seda, kui BM-DC-sid töödeldi TAK-242-ga (TLR4 inhibiitor) ja kultiveeriti koos WPCD ja LPS-ga 12 tundi, ilmnes CD40, CD{10}}, TNF-a või IL{12. }} tuvastati FAC või ELISA abil. Nagu on näidatud joonistel 3A ja 3B, põhjustas TAK-242-ravi LPS-i või WPCD-ga indutseeritud CD40 ja CD86 oluliselt allareguleeritud ekspressioonid ning IL-12 või tsütokiinide tootmise. TNF-a oli samuti oluliselt vähenenud (joonised 3C ja 3D). Tulemused näitasid, et WPCD võib aktiveerida alalisvoolu küpsemise TLR4 raja kaudu.

WPCD suurendas humoraalset ja rakulist immuunsust

Võrdluseks hindasime WPCD mõju humoraalse immuunvastuse esilekutsumisele OVA-ga immuniseeritud hiirtel. Enne vaktsineerimist ja 14. ja 21. päeval

35 ja 49 pärast esimest vaktsineerimist koguti verd IgG tiitri ja IgG alamklasside seerumi tuvastamiseks ELISA abil. IgG antikeha vastus OVA-le suurenes WPCD manustamise annuse (100 ja 400 ug) suurenemisega annusest sõltuval viisil (joonis 4). Optimaalne kontsentratsioon oli 100 ug/ml WPCD ja see suurendas IgG vastuseid kaks korda võrreldes ainult OVA-ga päevadel 21, 35 ja 49 (joonis 4A). OVA-spetsiifiliste IgG1 ja IgG2a antikehade tasemete märkimisväärne tõus WPCD manustamisel alla 20 ja 100 ug saavutati võrreldes OVA rühmaga seerumis 35. päeval (joonis 4B). Vahepeal soodustas Alum immuniseeritud hiirtel ainult OVA-spetsiifiliste IgG ja IgG1 antikehade ekspressioonitasemeid. WPCD üksi ei vallandanud OVA-spetsiifilisi antikehi. Ülaltoodud tulemused näitasid, et WPCD tekitas kõrgemaid antikehade tiitreid ja tasakaalustatumaid Th1/Th2 vastuseid kui Alum.

Splenotsüütide proliferatsioon on veel üks rakulise immuunsuse näitaja. ConA stimuleerib T-rakke ja LPS stimuleerib B-rakkude proliferatsiooni. 21. päeval pärast esimest vaktsineerimist saadi üksiku splenotsüüdi suspensioon, mida stimuleeriti vastavalt OVA (10 ug/ml), OVA323-339 (10 ug/mL) peptiidiga, ConA (5 ug/mL) ja LPS-ga. 5 ug/ml) 48 tunni jooksul. Seejärel mõõdeti T-rakkude proliferatsiooni MTT meetodil. WPCD võib oluliselt soodustada OVA-antigeeni, Con A-mitogeeni ja LPS-i mitogeeni poolt stimuleeritud splenotsüütide proliferatsiooni OVA ja WPCD-ga immuniseeritud hiirtel (joonis 5) ning WPCD optimaalne kontsentratsioon oli 100 ug/ml. Need andmed näitasid, et WPCD kui vaktsiini adjuvant OVA-ga immuniseeritud hiirtel võib tõhusamalt indutseerida T-rakkude ja B-rakkude aktivatsiooni kui Alum.

Kõik testitud WCPD adjuvandid, mis olid koostatud OVA vaktsiinidega, tekitasid võrdselt tugeva humoraalse ja rakulise immuunsuse (joonised 4 ja 5). Nende andmete põhjal analüüsisime WPCD mõju edasiseks hindamiseks OVA-spetsiifiliste T-abistaja (Th) raku vastusele täiendavalt tsütokiini ekspressioonid CD8+ ja CD4+ T-rakkudes voolutsütomeetria abil (joonis 6). . 21. päeval pärast esimest vaktsineerimist isoleeriti üks hiirte splenotsüüt ja seejärel kultiveeriti koos OVA-ga (10 ug/ml). IL-4 saagis CD4+ T-rakkudes rühmas, kellele manustati 100 ug OVA/WPCD-d, oli oluliselt suurem kui OVA/Alum rühmas ja OVA rühmas ning sarnane PMA omaga (joonis 6A). Lisaks suurenes IFN-i saagis CD8+ ja CD4+ T-rakkudes oluliselt ka hiirtel, kellele manustati OVA/WPCD-d (20, 100 ja 400 ug) (joonised 6B ja 6C). Võrreldes Alum-adjuvandiga näitas WPCD paremat võimet indutseerida T-rakkudest IL-4 ja IFN-sekretsiooni.

WPCD-stimuleeritud DC-de küpsemine ja vähenenud Treg-i sagedus in vivo DC-d on tunnistatud kõige tugevamateks APC-deks, mis on seotud primaarsete immuunvastuste algatamisega. Seega uurisime 3. päeval pärast esimest vaktsineerimist ka WPCD mõju CD40-le ja CD80-le DC-dele hiirte põrnas (joonised 7A ja 7B). 100-ug OVA/WPCD rühma hiired tekitasid DC-del oluliselt kõrgemaid CD40 ja CD80 tasemeid kui OVA/Alum rühma hiired. Need andmed näitasid, et WPCD võib aktiveerida DC-sid ja indutseerida hiirtel alalisvoolu küpsemist. Tregirakud suudavad tasakaalustada tolerantsust ja immuunvastuseid. Edasiseks uurimiseks, kuidas WPCD immuunvastust moduleeris, värviti hiirte põrnas olevad Treg-rakud hiire reguleeriva T-rakkude värvimiskomplektiga. 21. päeval pärast esimest vaktsineerimist täheldati CD25+ Foxp3+ Treg-rakkude sageduse vähenemist CD4+ T-rakkude koguarvus (joonis 7C). Võrreldes OVA ja OVA / Alum rühmadega näitas WPCD rühm oluliselt vähenenud Tregi sagedust.

WPCD ohutuse hindamine hiirtel

Suukaudse ägeda mürgisuse hindamiseks viisime läbi ägeda mürgisuse testi. Hiirtel, kellele manustati suukaudselt 5000 mg/kg kehakaalu kohta, ei ilmnenud ebanormaalset käitumist ega kõrvaltoimeid ning toksilisuse hindamise testis ei leitud suremust. Erinevate hiirte rühmade vahel, kellele manustati erinevaid WPCD annuseid, ei registreeritud olulist erinevust kehakaalu tõusus, tüümuse indeksis ja põrnaindeksis ning neil ei olnud olulist erinevust (tabel 1). 14 päeva pärast suremust ei täheldatud. Seetõttu oli WPCD LD50 väärtus üle 5000 mg kehakaalu kg kohta.

Et testida, kas WPCD-l oli negatiivne mõju hiirte kasvule enne ja pärast subkutaanset vaktsineerimist, määrati iga hiire kehamass (tabel 2). Hiirte järgneval vaatlusel ei täheldatud kõrvaltoimeid ega ebanormaalset käitumist. Lisaks ei näidanud WPCD-ga manustatud hiirte ja soolalahuse või OVA / Alum'iga manustatud hiirte kehakaal olulist erinevust. Need vaatlustulemused näitasid, et WPCD manustamine oli ohutu.

Arutelu

Adjuvandid on vaktsiinide põhikomponendid [31]. Tänu genoomika ja proteoomika edusammudele tuvastatakse üha rohkem rekombinante ja sünteetilisi vaktsiinimolekule. Seetõttu on vaja rohkem abiaineid ja preparaate. Mõned tugevad adjuvandid on üldiselt seotud suurenenud toksilisusega, näiteks FCA. Seetõttu on vaja leida ohutu preparaat, mis sisaldab erinevaid sünergistlikke komponente, mis viivad lõpuks esile soovitud immuunvastuse.Hiina ürtide polüsahhariidid on mittetoksilisedja ei näita olulisi kõrvalmõjusid [32,28]. Teatud vaktsiini jaoks on vaja ohutut adjuvanti.

Cistanche deserticola on oluline toniseeriv ravimtaim ja seda leidub laialdaselt kuivadel maadel ja soojades kõrbetes Loode-Hiinas. Cistanche deserticola on laialdaselt mures selle bioaktiivsuse, sealhulgas immunomoduleeriva, antioksüdatiivse, antibakteriaalse ja kasvajavastase toime tõttu [20,21]. Teatavaid edusamme on tehtud Cistanche deserticola struktuuri iseloomustamise ja immunoloogilise aktiivsuse osas, mis on hea kandidaat adjuvantide väljatöötamiseks. Hindasime eksperimentaalselt WPCD adjuvandi toimet ja mehhanismi in vitro ja in vivo. WPCD subkutaanne manustamine soodustas märkimisväärselt humoraalset ja rakulist immuunvastust, suurendades seerumi antikehi ja lümfotsüütide proliferatsiooni, suurendades tsütokiinide ekspressiooni, suurendades DC küpsemist ja vähendades CD4+ CD{{5} sagedust. } Foxp3+ Treg-lahtrid.

DC-d on peamised APC-d naiivsete T-rakkude praimimiseks. DC-de aktiveerimine on adjuvantide jaoks oluline. Adjuvantide ja vaktsiinide hindamiseks kasutatakse sageli DC-sid, eriti hiire luuüdist pärinevaid DC-sid. Voolutsütomeetria võimaldab eristada rakke, mis on pärast antigeeni hõivamist aktiveeritud, ümbritsevatest rakkudest. FCM analüüsis agregatsiooni aste stimuleeritud

rakud on immunomodulaatorite ohutuse hindamise kaudne näitaja [3]. Seega võivad WPCD adjuvandi aktiivsuse andmed DC-des in vitro anda väärtuslikku teavet loommudelite jaoks. BM-DC mudeli põhjal tuvastati MHC-II, CD86, CD80 ja CD40 ekspressioonitasemed, tsütokiinide tootmine ja allogeensete T-rakkude proliferatsioon WPCD optimaalses kontsentratsioonivahemikus. MHC-II, CD86, CD80 ja CD40 ekspressioonitasemed olid BM-DC-des ülesreguleeritud ning TNF-a ja IL-12 saagised suurenesid annusest sõltuval viisil. Täheldati allogeenset T-rakkude proliferatsiooni. BM-DC-de morfoloogiat ei muudetud. Indutseerides BM-DC-de aktivatsiooni ja põletikuliste tsütokiinide sekretsiooni in vitro, võib WPCD adjuvant märkimisväärselt suurendada antigeeni kogust ja APC-de arvu ning stimuleerida T-rakke sekreteerima IFN-d, mis aitab kaasa immunomoduleeriva aktiivsuse suurenemisele.

ErinevadHiina rohtsed polüsahhariididon võimelised aktiveerima immuunsüsteemi ja omavad suurepäraseid adjuvandi võimeid, stimuleerides alalisvoolu küpsemist TLR4 raja kaudu [33, 28]. Seega eeldame, et TLR4 osaleb WPCD-indutseeritud DC-de küpsemise signaalirajas. Ootuspäraselt vähendas TLR4 inhibiitorravi TNF-a ja IL-12 oluliselt. Lisaks takistas TLR4 raja pärssimine ka CD40 ja CD80 ekspressiooni DC-del, mis näitab, et DC-de küpsemine sõltus TLR4-st. Seetõttu on ilmne, et TLR4 osaleb WPCD-indutseeritud DC-de küpsemises.

LOODUSLIK TUBULOOS IMmuunsuse PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Adjuvantide ja vaktsiinipreparaadi optimaalne annus määratakse empiiriliselt paljudes katsetes. WPCD adjuvandi ja OVA antigeenide annuse-vastuse suhte uurimiseks hiirtel valisime BM-DC-de in vitro eelnevalt teatatud andmete põhjal erinevad WPCD annused, et manustada ICR hiirtele kaks korda subkutaanselt. Leidsime, et WPCD suurendas oluliselt OVA-spetsiifiliste antikehade saagist ja kutsus esile tasakaalustatud Th1/Th2 immuunvastuse koos IgG1 ja IgG2a taseme tõusuga. Eelkõige oli IgG2a tase kõrgem kui Alum'iga optimaalses annuses töödeldud tase. Seetõttu saavutas WPCD madalamate süstidega spetsiifiliste antikehade kõrgema taseme ja suurema efektiivsuse.

Uued vaktsiinid nõuavad tugevate rakuliste reaktsioonide esilekutsumist, mis hõlmavad antikehi, T-abistajarakke (Th) ja tsütotoksilisi T-lümfotsüüte (CTL). Terapeutilise vaktsiini eesmärk on esile kutsuda tugevamaid T-raku vastuseid. Ideaalne adjuvant suurendab vaktsiini tõhusust ja soodustab rakuvahendatud immuunsust, põhjustamata toksilisi mõjusid [34]. Immuniseeritud hiirte mudelite vaatluste hulgas põhjustas WPCD OVA-spetsiifilise ja mittespetsiifilise splenotsüütide proliferatsiooni suurenemise võrreldes Alum-iga. Mõned adjuvandid reguleerivad tsütokiine ja immuunsüsteemi üles. Näiteks võivad saponiinid stimuleerida rakkude poolt vahendatud immuunvastuseid antigeenile, mis tavaliselt indutseerib ainult antikehi. Hiirte immuunsuse taseme kaudseks hindamiseks valisime indikaatoriteks IL-4 ja IFN-. WPCD võib indutseerida rohkem IL-4 ja IFN-sekretsiooni kui Alum. Seega täheldati WPCD-ga vaktsineerimise tulemusena tugevaid abistaja-T-rakkude vastuseid ja tsütokiini sekretsiooni, mis viitab sellele, et WPCD võib tõhusamalt stimuleerida lümfotsüüte eritama Th1--tüüpi tsütokiini ja Th{12}}-tüüpi tsütokiini kui Alum.

Antigeeni esitlust mõjutavad adjuvandid võivad mõjutada keerulisi immuunprotsesse. Treg-rakud võivad moduleerida Th1 ja Th2 vastuseid [35]. WPCD sobiv annus võib soodustada DC-de küpsemist hiirtel, suurendades CD80 ja CD40 ekspressioonitasemeid ning võimendades OVA antigeeni esitlemise võimet varases immuunvastuses. DC-de aktiveerimise ja Tregi sageduse eksperimentaalsed tulemused näitasid, et WPCD kutsus esile DC-de küpsemise ja vähendas hiirte põrnas Treg-i sagedust. Need tulemused näitasid, et WPCD suurendas OVA vaktsiinide efektiivsust, suurendades antigeeni esitlevate rakkude sihtimist ja soodustades T-rakkude spetsiifilist aktivatsiooni.

Adjuvantide väljatöötamisel on raske vastava infektsiooni vastu sobivat immuunvastust selektiivselt esile kutsuda. Sobival adjuvandil peaks olema inimestele või loomadele vähe kõrvalmõjusid ja toksilisust. Seega tuleks kaaluda WPCD ohutust, sealhulgas koheseid ja pikaajalisi kõrvaltoimeid. Selles uuringus uurisime WPCD ägedat toksilisust ja WPCD negatiivset mõju hiirte kasvuvõimele 110 päeva jooksul. WPCD ägeda toksilisuse tulemused näitasid, et kehakaalul, harknääre indeksil või põrnaindeksil ei olnud olulist erinevust. WPCD LD50 väärtus oli üle 5000 mg kehakaalu kg kohta. Hiirte eksperimentaalse järgneva vaatluse käigus ei leitud hiirtel kõrvaltoimeid ega ebanormaalset käitumist. Need tulemused näitasid, et WPCD oli ohutu.

Kokkuvõtteks võib öelda, et selles uuringus näitas WPCD, Xinjiangist pärit C. deserticolast ekstraheeritud toorpolüsahhariid, mõningaid adjuvantide omadusi. Näiteks suurendas WPCD nii Th1 kui ka Th2 vastuseid, aktiveerides DC-sid, suurendades antikeha vastuseid ja parandades tsütokiinide tootmist. Lisaks uurisime WPCD efektiivsuse mehhanismi, analüüsides DC-de küpsemist ja funktsiooni TLR4 raja kaudu in vitro . Ainult WPCD-ga ravitud hiirtel ilmset kõrvaltoimet ei täheldatud. Seega oli WPCD-l suurem immunostimuleeriv aktiivsus rakulistes ja humoraalsetes immuunvastustes. Adjuvandid on mitme ühendi segu. Mitme toorekstrakti segul võib olla suurem kasulik mõju kui ühel taimeekstraktil. WPCD ekstrakte on vaja süstemaatiliselt uurida, testida nende tõhusust ja ohutust ning selgitada välja nende toimemehhanismid.

LOODUSLIK TUBULOOS IMmuunsuse PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%