Immuunreaktsioonid allogeensete võrkkesta eellasrakkude järjestikusele binokulaarsele siirdamisele klaaskehaõõnde hiirtel
Dec 11, 2023
Abstraktne:
Inimese allogeensete võrkkesta eellasrakkude (RPC) intravitreaalne siirdamine on paljutõotav võrkkesta pimestava degeneratsiooni raviks. Varasemad tööd on näidanud, et neuraalsed eellasrakud on allograftidena hästi talutavad pärast üksikuid süstimisi; aga allogeensete rakkude järjestikune kohaletoimetamine suurendab potentsiaalset peremeesorganismi sensibiliseerumise riski koos sellele järgneva siiriku immuunreaktsiooniga. Käesoleva uuringu eesmärk oli hinnata, kas immuunvastust kutsuvad esile korduvad allogeensete RPC-de intravitreaalsed siirdamised, kasutades hiire loommudelit. Süstisime hiire võrkkesta eellasrakke (gmRPC), mis olid algselt pärit C57BL/6 geneetilise taustaga doonoritelt, BALB/c retsipienthiirtele, et saada ohutusandmeid selle kohta, mida võib oodata pärast patsientide korduvat ravi allogeense inimese rakuproduktiga. . Immuunvastused gmRPC-dele olid kerged, koosnedes T-rakkudest, B-rakkudest, neutrofiilidest ja looduslikest tapjarakkudest, kusjuures makrofaagid olid selgelt ülekaalus. Loomadel, keda raviti korduvate gmRPC-de annustega, ei ilmnenud sensibiliseerimist ega ka immuunvahendatud siirikute hävimist. Vaatamata immunosupressiivse ravi puudumisele jäid allogeensed gmRPC siirikud pärast korduvat annustamist ellu, toetades seega esialgset tähelepanekut, et pigmentosa retiniitiga patsientidel on talutav allogeensete RPC-de korduv süstimine klaaskeha õõnsusse.
cistanche taime suurendav immuunsüsteem
Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin
【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Märksõnad: tüvirakud; immuuntolerantsus; immuunprivileeg; siiriku äratõukereaktsioon; intravitreaalne süstimine
1. Sissejuhatus
Retinitis pigmentosa (RP) hõlmab geneetilise pulgakoonuse degeneratsiooni klassi ja põhjustab progresseeruvat nägemiskahjustust ja lõpuks pimedaksjäämist. Enamikul juhtudest puuduvad tõestatud ravimeetmed nägemise säilitamiseks või taastamiseks; üks strateegia selle rahuldamata meditsiinilise vajaduse lahendamiseks on aga tüvirakkude siirdamine. Meie uurimisrühm on uurinud kultiveeritud inimese võrkkesta eellasrakkude (RPC) intravitreaalset süstimist, et sekkuda RP-sse terapeutilise eesmärgiga stabiliseerida haiguse progresseerumist või võib-olla muuta haiguse kulgu. RPG-sid saab tuletada ebaküpsetest võrkkestadest kudede annetamise teel või hiljuti pluripotentsetest rakuliinidest. Loommudelitega tehtud uuringud on näidanud, et need rakud on võimelised päästma fotoretseptoreid degeneratsioonist pärast silma süstimist ja samuti on nad võimelised diferentseeruma peremeessilma varraste fotoretseptoriteks. Loomkatsetest on saadud mõningaid tõendeid selle kohta, et süstitud hRPC-d võivad muutuda funktsionaalseteks integreeritud fotoretseptoriteks ja seeläbi potentsiaalselt stabiliseerida võrkkesta, asendades otse surevad rakud. Seega võivad süstitud hRPC-d ravida RP-d nii neurotroofselt kui ka raku asendusmehhanismi kaudu. Mõlemal juhul pakub see rakupõhine lähenemine ratsionaalset strateegiat RP-ga ja potentsiaalselt muude võrkkesta haigustega patsientide raviks.
Veel üks RPC-de ja võib-olla üldiselt neuraalsete eellasrakkude soodne atribuut on nende rakkude suhteline tolerantsus pärast siirdamist allotransplantaatidena, eriti kui need toimetatakse kohta, kus on immuunsüsteemi privileegid, näiteks võrkkesta [1, 2]. Sellegipoolest näitavad regeneratiivse meditsiini valdkonnas tehtud kliiniliste uuringute hiljutised ülevaated jätkuvalt laialt levinud ja olulisi väljakutseid, mis on seotud põletiku ja immuunsüsteemi äratõukereaktsiooniga [3,4], sealhulgas silmale suunatud sekkumiste puhul, nagu võrkkesta geeniteraapiad [5], samuti mõned, kuid mitte kõik rakuteraapiad [6]. Kuigi võrkkesta pigmentepiteeli (RPE) rakk on lokaalne rakutüüp, ei ole see vabastatud hülgamisprobleemidest [7–9]; seetõttu on retsipientide immuunsupressioon praegu tavapraktika [10,11]. Inimese RPC-d seevastu näivad olevat allograftidena märkimisväärselt hästi talutavad [6, 12–16], kuigi see ei laiene nende kasutamisele ksenotransplantaatidena, kus on vaja immuunsupressiooni [17]. Allogeensete RPC-de püsiva ellujäämise alus silmas hõlmab tõenäoliselt mitmeid kasutatud rakkude ja retsipientkohaga seotud tegureid [1, 8, 18, 19]. Varasemas voolutsütomeetriat kasutavas töös näitasime, et inimese närvi eellasrakud, nii ajust kui võrkkestast pärinevad, ekspresseerivad I klassi, kuid mitte II klassi peamise histokompatibilitsuse (MHC) antigeene [20,21]. Klassikaline transplantaadi äratõukereaktsiooni mehhanism hõlmab võõr-MHC II klassi molekulide mittespetsiifilist äratundmist CD4+ peremeeslümfotsüütide poolt [20–25]. Sel viisil võib II klassi molekulide puudumine võimaldada poogitud eellasrakkudel vältida selle mehhanismi kaudu vahendatud immuunsüsteemi äratõukereaktsiooni. Kuid klaaskehasiseselt süstitud hRPC-de näiline "immuunprivilegeeritud" staatus ei pruugi olla absoluutne. Kuigi hiire kesknärvisüsteemi (CNS) eellasrakud ei ekspresseeri algtasemel tuvastatavaid I või II klassi MHC molekule ja neil on allotransplantaatidena ilmne immuunprivileeg [1, 2, 20], võivad need rakud teatud tingimustel läbida immuunsüsteemi äratõukereaktsiooni. Uuringud on näidanud, et MHC antigeene saab indutseerida kesknärvisüsteemi eellasrakkude stimuleerimise kaudu gamma-interferooniga (IFN) [1,26]. Kesknärvisüsteemi eellasrakud saab tagasi lükata pärast eelnevalt siirdatud peremeesorganismi sensibiliseerimist. Seetõttu ekspresseerivad kesknärvisüsteemi eellasrakud (kaasa arvatud RPC-d) alloantigeene, mille tuvastab peremeesorganismi immuunsüsteem. Üheskoos tähendab see, et siirdatud eellasrakkude immuunprivilegeeritud staatus on ajutine ja allub moduleerimisele, nt kohalikus mikrokeskkonnas esinevate tsütokiinide poolt ja mis võivad muutuda degeneratsioonide, nagu RP, käigus. Kõigil neil põhjustel on immuunvastust mitmele intravitreaalsele RPC-süstile raske ennustada ja seda tuleb konkreetselt uurida.
cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi
Kui RPC-ravi osutub RP-s kliiniliselt edukaks, on selle kahepoolse pimestava haiguse korral mõlema silma raviks tugevad stiimulid. Vähemalt ohutuse huvides tehakse binokulaarsed ravid tavaliselt järjestikku, kusjuures kahe süstimise vahel on märkimisväärne viivitus. Pange tähele, et see allogeensete rakkude järjestikune kohaletoimetamine võib põhjustada peremeesorganismi sensibiliseerimist vastuseks esimesele süstile, mis võib põhjustada immuunsüsteemi äratõukereaktsiooni vastuseks teisele süstile. See võib kaasa tuua siirikute kadumise mõlemas silmas. Varasemad aruanded, milles uuriti hRPC-dega ühekordset subretinaalset doseerimist RP-s [27] või inimese neuraalsete eellasrakkudega doseerimist loomadel [28,29], hõlmasid immuunsupressiooni. Seetõttu kavandati järgmine uuring hiire RPC-de kui järjestikuste allotransplantaatide translatsioonilise uuringuna erineva geneetilise taustaga immuunkompetentses hiiretüves. Kuigi see ei hõlmanud inimese RPC-tooteid, viidi see töö läbi IND-i võimaldavate uuringute osana, et saada ohutusega seotud loomandmeid, st kas immuunsupressioon oleks vajalik patsientidel, kes saavad FDA registreeritud uuringutes korduvat RPC allotransplantaadi ravi.
2. Tulemused
Kahepoolse RPC süstimise immunoloogiliste tagajärgede uurimiseks allogeensetel hiirtel süstiti gmRPC-sid (C57BL/6 geneetiline taust) intravitreaalselt BALB/c retsipientide ühte silma ja teine annus RPC-sid süstiti teise silma 2 nädalat hiljem. 2-nädalane ajavahemik valiti piisavaks, et esimene transplantaat saaks esile kutsuda nii kaasasündinud kui ka adaptiivse immuunvastuse. Ükski katseloom ei saanud mingit immuunsupressiivset ravi, et oleks võimalik jälgida loomulikke füsioloogilisi immuunvastuseid.
2.1.Kliiniline vaatlus ja oftalmoloogiline läbivaatus ei näidanud kõrvalekaldeid
Katseloomade kaal mõõdeti iga gmRPC süstimise ajal. Kõik katseloomad näitasid esimese ja teise süsti vahel kaalutõusu, mis on kooskõlas üldise hea tervisega. Loomi, kes lõpetati päeval 14 ja päeval 28 ± 1 pärast teist gmRPC süstimist, uuriti läbi kirurgilise mikroskoobi. Enamiku uuritud silmade eesmised ja tagumised segmendid olid "normaalsetes piirides" (WNL). Ravimata, fiktiivselt töödeldud ja gmRPC-ga töödeldud rühmades ei ilmnenud põletiku või muude nähtavate kõrvalekallete tunnuseid, mis näitab, et gmRPC klaaskehasisene süstimine ei põhjustanud selle meetodi abil tuvastatavaid põletikulisi reaktsioone ega füüsilisi koekahjustusi. Siirdamist sisaldavad rakuklastrid olid klaaskehas nähtavad nii päeval 14 kui ka päeval 28 ± 1 pärast teist gmRPC süstimist (joonis 1). GmRPC-de korduv süstimine ei põhjustanud märgatavaid muutusi rakuklastrite suuruses, mis on kooskõlas püsiva doonorrakkude ellujäämisega. Üldist patoloogiat hinnati ka lõpp-punktis ja silmamunade suurenemist (mis viitab kasvaja moodustumisele) ega muid kõrvalekaldeid ei täheldatud.
Joonis 1. Siirdatud gmRPC-d, mis on visualiseeritud in vivo silmapõhja pildistamisel läbi kirurgilise mikroskoobi (kõik=vasak silm, OS). (A, B), võltsravi saanud loomad (võlts/võlts, S/S); (C, D), kontrolliti võltsitud parema silmaga kontrollloomi, millele järgnes gmRPC-ga töödeldud vasak silm (võlts/rakk, S/C), ja mõlema silmaga loomad, keda raviti järjestikku gmRPC-dega (rakk/rakk, C/C). vaadeldakse ja pildistatakse läbi kirurgilise mikroskoobi. Ülemine paneel (A, C, E) näitab OS-i pilte, mis on tehtud 14. päeval pärast sekundit süstimist; alumine paneel (B, D, F) näitab OS-i pilte, mis on tehtud 28. päeval pärast sekundit süstimist. Allografte nähti kahvatuvärviliste rakukimpudena (nooled), mis olid nähtavad rakuga süstitud vasaku silma klaaskehas (S/C, C/C) mõlemal ajahetkel (14. päev: (C, D); ja 28. päev: () E, F)). Sel viisil aksiaalselt vaadatuna ei ilmnenud eesmises ja tagumises segmendis peale siirikute ilmset põletikku ega täiendavaid kõrvalekaldeid.
2.2. Immunofluorestsentsmärgistus näitas immuunrakke klaaskehas
Viie peamise immuunrakutüübi (makrofaagid, neutrofiilid, looduslikud tapjarakud, T-rakud ja B-rakud) immunofluorestsentsmärgistamine viidi läbi silma krüosektsioonidega ja see näitas pärast gmRPC süstimist silma positiivset immuunrakkude infiltratsiooni (joonis 2A–F). T-rakud (CD3), B-rakud (CD45R), neutrofiilid (Ly-6G) ja looduslikud tapjarakud (CD49b) esinesid piiratud koguses gmRPC-dega süstitud silmades, samas kui aktiveeritud makrofaagid (Iba-1) ) olid peamised immuunrakud, mis reageerisid intravitreaalsetele siirikutele. Ravimata ja võltsravi saanud loomade võrreldavad koed ei näidanud silma krüosektsioonides immuunrakke, mis viitab sellele, et täheldatud immuunrakkude infiltratsioon oli vastus gmRPC siirikutele. Kooskõlas selle tähelepanekuga asusid immuunrakud gmRPC siirikuid ümbritsevas piirkonnas või gmRPC klastrites endas.
Joonis 2. Infiltreerunud immuunrakkude immunomärgistamine ravirühmade kaupa. Immunofluorestsentskujutised (A) kontrollsektsioonidest (ainult sekundaarne antikeha), (B) anti-Iba-1 (aktiveeritud makrofaagide ja mikrogliia marker), (C) anti-Ly-6G (neutrofiilide marker), (D) anti-CD49b (looduslik tapjaraku marker), (E) anti-CD3 (T-raku marker) ja (F) anti-CD45R (B-raku marker) on näidatud joonisel. Piiratud punased signaalid näitavad leukotsüütide markerite positiivset antikeha märgistamist, rohelised signaalid näitavad gmRPC transplantaate ja sinised signaalid näitavad DAPI tuumamärgistust. Kollane on signaalide mittespetsiifiline kattumine, mis on kõige ilmsem fotoretseptori välimistes segmentides, millel on autofluorestsents. Ravirühmad: ravimata (TÜ), mõlemad silmad ravimata; S/S, mõlemad silmad fiktiivselt töödeldud (järgi) vehiikuliga; S/C, paremasse silma süstiti vehiiklit, millele järgnes vasak silm 50,000 gmRPC-ga ja; C/C, mõlemasse silma süstiti 50,{16}} gmRPC-d (järgemööda) 4. jaotise ajakava järgi
Iga silma immuunraku tipparvud varieerusid rakutüübi järgi (joonis 3A–E). Seevastu kahesuunaline ANOVA ei näidanud erinevusi immuunrakkude infiltratsioonis, kui võrreldi loomi, kes said ühe gmRPC süsti (võltsitud / rakud) loomadega, kes said kahepoolseid süste (rakud / rakud). See oli nii makrofaagide infiltratsiooni (anti-Iba-1 värvimine) (joonis 3A), neutrofiilide (anti-Ly-6G värvimine) (joonis 3B), looduslike tapjarakkude (CD49b värvimine) puhul ( Joonis fig 3C), T-rakud (värvimine CD3-ga) (joonis 3D) ja B-rakud (värvimine CD45R-ga) (joonis 3E).
2.3. ELISPOT ei näidanud antigeeni tagasikutsumise vastuseid
ELISPOT on viis antigeenispetsiifilise IFN-i tootva T-rakkude aktivatsiooni testimiseks. Ravi foorbool12-müristaat13-atsetaadiga (PMA) oli positiivne kontroll, mis jäljendas teist sõnumitoojat DAG-i, et aktiveerida T-raku retseptori rada ja omakorda põhjustada T-rakkude aktivatsiooni. Joonisel fig 4A–D näitasid PMA-ga töödeldud rühmad palju suuremat IFN-i täppide arvu võrreldes kontrollrühmadega, kus oli ainult reageerivaid rakke (st lümfotsüüdid CLN-dest, põrnad põrnadest). Kui reageerivaid rakke kultiveeriti koos C57BL/6 splenotsüütidega (B6 SPL), olid 14. päeva proovid võrreldavad ainult reageerivate rakkude rühmadega, ainult veidi kõrgema IFN-i täppide arvuga, mis viitab T-rakkude aktivatsiooni puudumisele (joonis 4A, B).
Joonis 3. Immuunrakkude infiltratsiooni kvantifitseerimine pärast gmRPC siirdamist. Infiltreerunud immuunrakud visualiseeriti punaste fluorestseeruvate signaalidena kuvamisväljas pärast gmRPC süstimist iga katseolukorra jaoks, loendati ImageJ abil ja kanti tulpdiagrammidesse. Andmed Iba-1 (aktiveeritud makrofaagide ja mikrogliia marker) (A), anti-Ly-6G (neutrofiilide marker) (B), anti-CD49b (looduslikud tapjarakkude marker) (C), antikehad anti-CD3 (T-rakkude marker) (D) ja anti-CD45R (B-rakkude marker) (E) on näidatud joonisel. Kahesuunalisi ANOVA teste kasutati võltsitud/raku ja raku/raku rühmade vahelise olulisuse testimiseks; p väärtused olid: (A) p < {{10}}.4492, (B) p < 0.9376, (C) p < 0.119{{18 }}, (D) p < 0,6411 ja (E) p < 0,7201 (ükski ei olnud oluline).
Selle testiga allogeensete doonorrakkude testimisel ei ilmnenud gmRPC-sid intraperitoneaalselt süstitud loomade (IP rühm) reageerivatel rakkudel antigeeni tagasikutsumise vastust, kuna proovid ei näidanud rohkem T-rakkude aktivatsiooni IFN-i täppide arvuga võrreldes võltsloomadega, keda kunagi ei eksponeeritud. gmRPC-dele (võlts/võlts). Samuti ei ilmnenud loomadel, kellele süstiti intravitreaalselt gmRPC-sid, kas üks kord (võlts/rakk) ega korduvalt (rakk/rakk), mingeid antigeenide tagasikutsumise vastuseid. Ühel juhul tundusid vastused korduvale gmRPC annustamisele vaiksemad (joonis 4B). Need tulemused näitasid koos, et gmRPC-del on väga madal antigeensus. Pange tähele, et C57BL / 6 splenotsüüdid sobitati gmRPC-de geneetilise taustaga. Ootamatult suurendasid alternatiivsed stimulaatorrakud gmRPC-d IFN-i täppide arvu kõigis katserühmades võrreldes negatiivsete kontrollrühmadega (joonis 4A–D). Võimalik selgitus võib olla gmRPC-d, mis põhjustavad selles testis kõrge tausta. Oluline on see, et töötlemata, fiktiivselt töödeldud, ühekordse gmRPC süstimise ja korduva gmRPC süstimise rühmade vahel ei olnud erinevust, mis taas viitas antigeeni tagasikutsumise vastuste puudumisele.
Joonis 4. ELISPOTi kvantifitseerimine pärast gmRPC siirdamist. ELISPOT testid määrati järgmistesse rühmadesse: kontroll, ainult reageerivad rakud (katseloomade emakakaela lümfisõlmedest (CLN) või põrnast (SPL) eraldatud T-rakke sisaldavad lümfotsüüdid või splenotsüüdid; PMA, forbooliga {{1} töödeldud reageerivad rakud }müristaat13-atsetaat (PMA) ja Ca-ionofoor; B6 SPL, reageerijarakud, mis on segatud C57BL/6 loomadelt eraldatud splenotsüütidega; gmRPC-d, samad reageerivad rakud segatuna gmRPC-dega. (A), Responsorrakud olid splenotsüüdid katseloomadest, kes surmati päeval 14 pärast teist gmRPC-de süstimist. (B) Reageerivad rakud olid katseloomade CLN-idest pärit lümfotsüüdid, kes surmati 14. päeval pärast teist gmRPC-de süstimist. (C) Reageerivad rakud olid nende katseloomade splenotsüüdid, kes surmati päeval 29 pärast teist gmRPC-de süstimist.(D) Reageerivad rakud olid katseloomade CLN-idest pärit lümfotsüüdid, kes surmati 29. päeval pärast teist gmRPC-de süsti. Kahesuunalisi ANOVA teste kasutati olulisuse (*) testimiseks võlts/raku ja raku/raku rühmade vahel; p väärtused olid: (A) p < 0,5332, (B) p < 0.0001 (oluline), (C) p < 0,0207 ( oluline) ja (D) p < 0,3355.
3. Arutelu
Tüvirakkude tehnoloogia kui võrkkesta degeneratiivsete haiguste ravimise vahendi vastu on olnud märkimisväärne huvi ja meie rühm on uurinud allogeensete hRPC-de kasutamist RP-s. Andmete kogumiseks potentsiaalsete immuunmõjude kohta, kui inimese allogeenset RPC toodet manustatakse klaaskehasisese süstimise teel, viisime läbi käesoleva loomkatse, kasutades siirikutena C57BL/6 taustaga gmRPC-sid ja peremeestena BALB/c hiiri. Neid erinevaid geneetilisi taustasid kasutati allogeensete hRPC-dega järjestikuse ravi modelleerimiseks ja esialgsete ohutusandmete saamiseks enne inimestel katsetamist.
Vastuste täielikuks hindamiseks ei saanud peremeesloomad immunosupressiivset ravi. Võrdlesime ühe gmRPC süstiga tekitatud immuunvastuseid järjestikuse kahepoolse doseerimisega vastavalt kirjeldatud süstimisgraafikule. Oftalmoloogilised uuringud ei näidanud põletikku ega muid märkimisväärseid erinevusi loomarühmade vahel, kes said ühe doosi gmRPC-sid või 2 annust gmRPC-sid, mis viitab sellele, et kas retsipiente ei tekitanud esmane gmRPC-ravi tundlikkust või oli sensibiliseerimine peen. Immunomärgistamise tulemused näitasid, et kõik viis uuritud immuunrakutüüpi, nimelt T-rakud (CD3), B-rakud (CD45R), makrofaagid (Iba-1), neutrofiilid (Ly-6G) ja looduslikud tapjarakud ( CD49b), oli infiltreerunud silma ja oli suunatud RPC siirikutele pärast siirdamist. Sellest hoolimata oli see infiltratsioon suhteliselt mõõdukas ja kuigi teised rakutüübid olid tuvastatavad, koosnes see valdavalt Iba-1-positiivsetest makrofaagidest. T-rakke, B-rakke, neutrofiile ja looduslikke tapjarakke oli väga piiratud arv. Huvitaval kombel oli üksikute ja korduvate RPC-siirikute ellujäämine samaväärne, ilma siirikute kadumiseta mõlemal juhul, hoolimata makrofaagide olemasolust. Üldiselt viitab see sellele, et nii kaasasündinud kui ka adaptiivsed immuunvastused geneetiliselt erinevatele RPC-dele olid mõõdukad, kuigi immuunsupressiooni ei kasutatud. Lisaks ei näidanud ELISPOT testi tulemused gmRPC-ga töödeldud rühmades antigeeni tagasikutsumise vastuseid, mis on kooskõlas väitega, et T-rakud ei mängi olulist rolli C57BL/6 hiirte gmRPC transplantaatide äratõukereaktsioonis. Jällegi täheldati gmRPC transplantaatide makrofaagide infiltratsiooni, kuigi see ei olnud seotud klassikalise immuunsüsteemi äratõukereaktsiooniga seotud siiriku olulise hävinguga [22–24].
Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi
Üheskoos näitavad need tähelepanekud olukorda, mis erineb selgelt teistes kudedes levinud laialdaselt tunnustatud T- ja B-rakkude poolt vahendatud allogeensetest siirdamise äratõukereaktsioonidest. Sellele olukorrale võivad kaasa aidata mitmed tegurid. Ühelt poolt peetakse silmas "immuunsusega privilegeeritud" ala, kuigi seda, mil määral jagab klaaskeha selliseid omadusi sarvkesta ja võrkkestaga, on vähem uuritud ja võib-olla ka vaidlusi tekitavam. Teisest küljest näib, et RPC-de endi immunogeensus on allotransplantaatidena võrreldes sagedamini uuritud rakutüüpidega vähenenud. Nagu oleme varem näidanud, puudub hiire RPC-del MHC klassi I ja II antigeenide algtaseme ekspressioon, kuigi need on indutseeritavad tsütokiinide stimulatsiooni kaudu. See MHC ekspressiooni puudumine võib aidata kaasa nende rakkude ellujäämisele pärast siirdamist. Sellegipoolest toetab immuunrakkude olemasolu siirikutes kontseptsiooni, et siiriku taluvus ei ole selles keskkonnas passiivne ja tuleneb aktiivsest immunoregulatoorsest nähtusest. Siinkohal tuleb rõhutada, et sama tüüpi immuunrakkude infiltratsioon esines juba pärast üksikuid süstimisi ja seda ei süvendanud korduv annustamine, mis rõhutab meie järeldust, et siirikute immuunrakkude infiltratsioon, eriti makrofaagide poolt, ei olnud varasemate uuringute tulemus. peremeesorganismi sensibiliseerimine. Selle katse parameetrite piires ei paistnud korduv annustamine vähendavat transplantaadi üldist elujõulisust, mis oli kooskõlas püsiva efektiivsuse võimalusega terapeutilises kontekstis. Alternatiivsed parameetrid, nagu erinevad süstidevahelised intervallid, võivad immuunrakkude aktiivsust suurendada või vähendada määral, mis oleks kliinilise rakenduse jaoks asjakohane. Kas infiltraatide rakulised koostisosad, sealhulgas makrofaagide ülekaal, kehtiksid ka inimeste puhul, on ebaselge. Lisaks ei pruugi nende allograftide ellujäämine sõltuda normaalsest võrkkestast, millel on terve vere-võrkkesta barjäär. Siin kasutatavad BALB/c vastuvõtjad on albiinod ja vastuvõtlikud valguskahjustustele [30]. Veelgi enam, püsivat ellujäämist on korduvalt täheldatud varasemates töödes erinevate võrkkesta degeneratsiooni mudelitega (nt [31]).
Võrreldes siiriku ellujäämisega on siirikutes olevate rakkude elujõulisus keerulisem. Teadaolevalt on kesknärvisüsteemi eellasrakkude kadu, mis toimub kiiresti pärast siirdamist, tõenäoliselt mitmete tegurite tõttu, sealhulgas kasvufaktori järsk ärajätmine. Kui dissotsieerunud rakud on silma sattunud, ühinevad need sfääritaolisteks agregaatideks, mille keskpunktid näivad pakkuvat kasvuks suboptimaalset mikrokeskkonda, võib-olla vaskularisatsiooni puudumise ja toitainete difusiooni probleemide tõttu. Makrofaagide ilmne tropism RPC-siirikute jaoks võib olla mittespetsiifiline vastus nende elujõuliste rakkude esinemisele transplantaatide sisemuses, kusjuures makrofaagid toimivad oma rollis rakujäätmete püüdjatena. Alternatiivina võivad täielikult elujõulised RPC-d makrofaage aktiivselt meelitada, nt kemoatraktiivsete tsütokiinide ekspressiooni kaudu, misjärel peremeesrakud puutuvad sekundaarselt kokku mitteelujõuliste doonorrakkude jääkidega. Oluline on see, et nendes konkreetsetes seadetes täheldatud makrofaagide infiltratsiooni astmel ei näi olevat negatiivseid tagajärgi siiriku või peremeesorganismi võrkkesta jaoks, erinevalt vastustest rakuliste allograftidele immuunsüsteemita privilegeeritud kohtades [4]. Lõpuks väärib mainimist, et siin esitatud tulemused, kuigi need piirduvad hiire mudeliga, võivad avaldada mõju inimeste tööle. Erinevalt hiirest teame, et inimese kultiveeritud RPC-d ekspresseerivad algtasemel MHC I klassi antigeenide tugevat taset; seetõttu on võrdlus kahtlemata esialgne. Sellegipoolest on huvitav märkida, et subretinaalsete hRPC transplantaatide kliiniline testimine Hiina rühmas [13] ja ka meie rühma intravitreaalne hRPC siirdamine on seejärel näidanud allograftide püsivat ellujäämist immunosupressioonita RP (JC) patsientidel. -01, [32], avaldamata andmed). See juhtus ka pärast mõlema silma järjestikust süstimist (JC-01 Extension, avaldamata andmed), analoogselt siin esitatud tööga. Lisaks täheldati siiriku ellujäämist JC-02 [33] järeluuringus, kus samasse silma manustati järjestikuseid korduvaid annuseid [34]. Kokkuvõttes näitavad need leiud, et immuunsupressioon ei ole alati vajalik neuraalsete eellasrakkude siirdamise korral, eriti silma, kuigi selle nähtuse ja selle aluseks olevate regulatiivsete mehhanismide piire tuleb veel selgitada.
4. Materjalid ja meetodid
4.1. Rakukultuur
Selle allogeense uuringu doonorrakkudeks valiti varem iseloomustatud gmRPC-d [31]. Algselt eraldati gmRPC-d GFP-transgeensetest C57BL/6 hiirtest, mida oli geneetiliselt modifitseeritud, et ekspresseerida täiustatud rohelist fluorestsentsvalku (GFP). GFP valgu ekspressioon gmRPC-des pakkus huvi selle poolest, et see võimaldab transplantaatide visualiseerimist pärast süstimist ilma täiendava märgistamise vajaduseta. Käesoleva uuringu jaoks kasvatati gmRPC-sid Advanced DMEM/F12-s, millele oli lisatud N-2 lisandit (1:100, Life Technology, Carlsbad, CA, USA), Glutamax-1 (1:100, Life Technology). , Carlsbad, CA, USA) ja EGF (20 ng/ml, rekombinantne, Human, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ning inkubeeriti 37 °C ja 5% CO2 juures. Rakke hoiti segasuspensioonis/lõdvalt seotud kolooniates katmata koekultuuri kolbides. Rakud passeeriti trüpsiniseerimise teel TrypLE Select CTS-iga (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), mis oli lahjendatud 1:5 PBS-is ühe minuti jooksul ja neutraliseeriti 10-kordse lisatud trüpsiini mahu võrra. Raku-trüpsiini segu tsentrifuugiti 140 g juures 2 minutit toatemperatuuril, supernatant eemaldati ja rakusade resuspendeeriti värskes söötmes enne külvamist koekultuuri kolbidesse soovitud kontsentratsioonis. Rakkude kontsentratsioon ja elujõulisus määrati trüpaansinise värvimisega; loendused viidi läbi Countessi (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ja hemotsütomeetriga.
Intravitreaalsete süstide jaoks resuspendeeriti rakusade BSS PLUS®-is 50K rakku/µl. Rakkude kontsentratsiooni ja elujõulisust hinnati enne ja pärast süstimist. Süstitud annus oli 50,000 rakku silma kohta süstimise kohta. Annus ja vehiikul valiti meie varasemate uuringute põhjal.
4.2. Katseloomad
Käesoleva uuringu eesmärk oli uurida võimalikke allogeenseid immuunvastuseid, mis on indutseeritud allogeensete RPC-de korduva intravitreaalse süstimisega. Retsipientloomad olid BALB/c hiired, kes erinevad geneetiliselt C57BL/6 hiirtest, kellelt gmRPC-d eraldati. Vähemalt kolme looma kasutamist ravitud katserühma kohta peeti igal ajahetkel vajalikuks, et võimaldada hinnata rühmade vahel statistilist olulisust tulemuste muutujate ja võimalike loomade kadude osas katseperioodi jooksul. Lisaks, arvestades paljusid lisategureid, mis võivad potentsiaalselt mõjutada katsetulemust, nagu ebaõnnestunud rakkude süstimisprotseduur või võimalik hõõrdumine loomade võitluse tagajärjel, viidi süstimisprotseduurid läbi viiel loomal rühmas, et tagada statistilise analüüsi jaoks vajalike miinimumarvude täitmine.
cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi
Tabelis 1 on näidatud neli loomarühma, mis on ette valmistatud iga nelja aja (4, 7, 14 ja 28 päeva) jaoks, mil viiakse läbi histopatoloogia, sealhulgas immunofluorestsentsi hindamine. Kaks täiendavat loomade rühma, kellele süstiti intraperitoneaalselt 10ˆ6 gmRPC-d, valmistati positiivseks kontrolliks mõlemaks ELISPOTi hindamise ajapunktiks (14 ja 28 päeva). Tabelis 2 on iga rühma jaoks kavandatud hindamised kokku võetud.
Tabel 1. Katserühmad.
Tabel 2. Hindamise ajapunktid.
4.3. Intravitreaalne süst
GmRPC-sid manustati intravitreaalse süstimise teel. Pärast tuimastamist kanti süstitava looma mõlemasse silma Mydriatsüüli (1% tropikamiidi oftalmoloogiline lahus) ja fenüülefriini (2,5% oftalmoloogiline lahus). Kui adekvaatne müdriaas oli saavutatud, hoiti looma käsitsi kinni ja looma pead pöörati, et joondada süstitava silma silma telg kirurgilise mikroskoobi optikaga, et visualiseerida silma tagumist segmenti (st klaaskeha ja võrkkesta). . Silm tehti õrnalt käsitsi, surudes silmalaugudele ja 31G nõela insuliinisüstal kasutati, et torgata õrnalt läbi nina alumises kvadrandis limbuse kõrval asuv sklera. Poleeritud klaasist mikropipeti ots, mis sisaldas doonorrakke (või vehiikli kontrolli), viidi otse visualiseerimisel läbi sisselõike klaaskeha õõnsusse. Hoolitseti selle eest, et läätse või tagumise segmendi struktuure ei rikutaks. Ainuüksi rakke või kandjaid süstiti 1 mikroliitrises mahus. Pärast silmasisese rõhu tasakaalustamiseks tehtud mitu hetke pausi eemaldati pipeti ots järk-järgult silmast, kõik otsese visualiseerimise all. Täheldati mis tahes silmasisest verejooksu koos asukohaga. Pärast süstimist pandi loom taastumiseks puhtasse puuri, mis oli vooderdatud värske ühekordselt kasutatava padjaga, mis oli suunatud absorbendiga pool üles/plastikust alla. Taastumist hõlbustas soojenduspadi ja seda kontrollis looma liikumisvõime. Pärast ärkamist viidi loom operatsioonijärgsesse puuri, kus oli ad libitum juurdepääs veele. Loomi jälgiti iga päev pärast operatsiooni visuaalselt. Silmasisese süstimisega seotud märke täheldati minimaalselt või üldse mitte.
Pärast protseduuri jälgiti loomi opereeritud silma hõõrumise, turritava karva või püsiva letargia suhtes, mis kõik andsid põhjust koheseks eutanaasiaks. Võitluse käigus saadud haavade tõttu lõpetati kaks looma. Kõik teised loomad lõpetati kavandatud lõpp-punktides. Eutanaasia viidi läbi CO2 sissehingamise teel.
4.4. Oftalmoloogiline läbivaatus
A Leica Ultimate Red Reflex Surgical Microscope was used for ophthalmic examination and photography of experimental mice. Sedation was performed with a Ketamine Hydrochloride/Xylazine Hydrochloride mixture (50–100 mg/mL Ketamine, 5–10 mg/mL Xylazine) administered by intraperitoneal injection. After sedation, topical mydriatics (Tropicamide, Phenylephrine) were applied to the eye(s) to be imaged in 5 min intervals until adequate mydriasis was achieved, as determined via pupil diameter (>2,5 mm) ja reaktsioon valgusstimulatsioonile. Pilgutamise kaotuse kompenseerimiseks kanti mõlemasse silma vastavalt vajadusele hüpromelloosi (Gonak) lahust, et vältida sarvkesta kuivamist. Pildistamisprotseduuri jaoks asetati anesteseeritud loomad soojenduspadjale ja asetati rinnaku lamavasse asendisse. Protseduuri lõpus saavutati atipamesooli (0,1–1 mg/kg) intraperitoneaalse süstimisega anesteesia osaline pöördumine.
4.5. Histopatoloogia
Kahe järjestikuse siiriku (üks kummassegi silma) saanud loomade immuunvastuseid hinnati mõlema silma histopatoloogia abil 4., 7., 14. ja 28. ± 1. päeval pärast teise silma süstimist. Hiired, keda raviti vastavalt tabelile 1, lõpetati tabelis 2 toodud ajakava alusel. Loomad surmati süsinikdioksiidi sissehingamise teel. Südame perfusioonid viidi läbi katseloomadel 2% paraformaldehüüdiga (PFA) fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS). Seejärel koguti kõik silmamunad ja lasti leotada 2% PFA/PBS-is 48 tundi temperatuuril 4 °C. Fikseeritud silmamunad töödeldi läbi sahharoosi gradiendi (10% sahharoosi PBS-is 1 tund toatemperatuuril, 20% sahharoosi PBS-is 1 tund toatemperatuuril ja 30% sahharoosi PBS-is temperatuuril 4 °C üleöö), enne kui need sisestati OCT sööde krüosektsiooniks. Silmade krüosektsioonid (10 µm) värviti Harrisoni hematoksüliini ja eosiiniga (H&E), et visualiseerida võrkkesta mikroanatoomiat ja leida süstitud doonorrakud.
GmRPC-ga töödeldud rühmade puhul hinnati krüosektsioone GFP+ (doonor)rakkude immunofluorestsentsi abil. Silmades esinevate spetsiifiliste immuunrakkude tüüpide tuvastamine viidi läbi märgistamise teel järgmiste spetsiifiliste primaarsete antikehadega: CD3 (T-lümfotsüütide marker) [35], CD45R (B-lümfotsüütide marker) [36], Iba-1 (aktiveeritud makrofaagide ja mikrogliia marker) [37], Ly-6G (neutrofiilide marker) [38] ja CD49b (looduslik tapjarakkude marker) [39]. Krüosektsioone pesti kolm korda toatemperatuuril PBS-is ja blokeeriti 0,03% Triton X-100 ja 10% tavalise kitseseerumiga PBS-is (NGS; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA). 1 h toatemperatuuril. Roti hiirevastane CD3 (lahjendus 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), roti hiirevastane CD45R (1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), küüliku hiirevastane Iba{{ 26}} (lahjendus 1:400, Wako Chemicals, Richmond, VA, USA), roti hiirevastane Ly-6G (lahjendus 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ja rotivastased -hiire CD49b (lahjendus 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) kanti proovidele ja inkubeeriti üleöö 4 kraadi juures. Proove pesti uuesti PBS-s 3 korda toatemperatuuril. Alexa-Fluoriga konjugeeritud sekundaarseid antikehi (kitse anti-roti Alexa-Flour-568 ja kitse küülikuvastast Alexa-Flour-568, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) kanti proovidele 1 tunniks toatemperatuuril. Seejärel pesti kõiki proove PBS-s veel kolm korda toatemperatuuril. Katteklaasid paigaldati DAPI Fluoromount-G abil (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) ja slaidid jäeti üleöö toatemperatuuril kuivama.
4.6. ELISPOT ja MLR analüüsid
RPC-spetsiifilisi mälu T-rakke jälgiti 2 ja 4 nädalat pärast esimest siiriku paigaldamist ensüümiga seotud immunosorbentpunkti (ELISPOT) testi abil. Eksperimentaalsed rühmad moodustati iga ajapunkti jaoks vastavalt tabelitele 1 ja 2. ELISPOT test püüab sekreteeritud valgud spetsiifilisele antikehaga kaetud mikroplaadile ja seda saab kasutada mälu T-rakkude aktiveerimise määramiseks, tuvastades T-raku IFN sekretsiooni. Eksperimentaalne näit on IFN-täppide arv mikroplaadil. Olemasolevate IFN-laikude arv näitab aktiveeritud T-rakkude arvu. Alloreaktiivsete T-rakkude esinemissagedust hinnati 48-tunnise leukotsüütide segareaktsiooni (MLR) läbiviimisega 96-süvendiga Multiscreen-IP plaatidel (Millipore, Burlington, MA, USA). Responderrakud olid lümfotsüüdid/splenotsüüdid, mis sisaldasid T-rakke, mis olid puhastatud emakakaela lümfisõlmedest (CLN) ja katseloomade põrnadest, ning stimulaatorrakud olid algselt C57BL/6 hiirtelt saadud gmRPC-d. ELISPOT analüüsid viidi läbi standardprotokolli alusel. 96-süvend Multiscreen-IP plaate niisutati steriilsetes tingimustes 15 µL 35% etanooliga süvendi kohta. Plaate pesti kolm korda steriilse PBS-ga, enne kui kanti plaatidele 100 µl IFN-i püüdvat antikeha (kloon AN-18, eBioscience, San Diego, CA, USA), mis oli lahjendatud PBS-is (2 µg/ml). Plaate inkubeeriti üleöö 4 kraadi juures, enne kui plaatidele viidi MLR analüüsid. Püüdvate antikehadega kaetud plaate pesti kolm korda PBS-ga ja blokeeriti seejärel RPMI1640-ga 2 tundi temperatuuril 37 °C.
Kõik analüüsiplaadid sisaldasid järgmisi kontrolle: rakke ei sisaldanud süvendeid, rakke sisaldavaid süvendeid ilma stimulatsioonita ja süvendeid, mis sisaldasid rakke koos forbool-{0}}müristaat13-atsetaadiga (PMA). ja Ca-ionofoor positiivsete kontrollidena. PMA-ravi toimib positiivse kontrollina, matkides teist sõnumitoojat DAG-i, et aktiveerida T-raku retseptori rada ja omakorda põhjustada T-rakkude aktivatsiooni, kusjuures Ca ionofoor hõlbustab kaltsiumiioonide sisenemist rakkudesse. Plaate inkubeeriti 36 tundi 37 °C juures enne värvireaktsiooni. Plaate pesti PBS-iga, mis sisaldas {{10}}.01% Tween 20 kuus korda ja seejärel 100 µL tuvastamisantikeha (kloon R64A2, eBioscience, San Diego, CA, USA), lahjendati Igasse süvendisse kanti PBS-s (0,5 ug/ml). Plaate inkubeeriti temperatuuril 37 °C veel 2 tundi. Plaate pesti uuesti 0,01% Tween 20-ga PBS-s. Iga süvendi kohta kanti 100 ui Streptavidin-AP-d (lahjendus 1:1000, Invitrogen) ja plaate inkubeeriti 45 minutit toatemperatuuril. Kõiki plaate pesti kolm korda uuesti 0,01% Tween 20 lahusega PBS-is ja ainult PBS-iga veel kolm korda. Lõpuks lisati igasse süvendisse värvimiseks 100 µl BCIP/NBT (Sigma Aldrich, München, Saksamaa). Kõiki plaate pesti põhjalikult kraaniveega ja kuivatati enne andmete analüüsi.
cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi
5. Kokkuvõtted
See uuring näitab, et allogeensete RPC-de järjestikused binokulaarsed siirikud klaaskehaõõnde ei kutsu hiirel esile klassikalist immuunsüsteemi äratõukereaktsiooni. Kuigi tunnistatakse, et neid allogeenseid histoloogilisi uuringuid ei saanud läbi viia inimese RPC kliinilise tootega, näivad andmed olevat kooskõlas kliinilise ohutusuuringu tulemustega (jCyte, JC-01E, avaldamata andmed), milles retiniidiga patsiendid. pigmentosa sai mitte-samaaegseid kahepoolseid süste ilma immunosupressiivse ravita. Kuigi kahte uuringut on raske otseselt võrrelda, on märkimisväärne, et mõlema üldised tulemused näitasid allografti ellujäämise osas sarnasust.
Viited
1. Hori, J.; Ng, TF; Shatos, M.; Klassen, H.; Streilein, JW; Noortel, MJ närvirakkude eellasrakkudel puudub immunogeensus ja nad on allograftidena hävitamisele vastu. Tüvirakud 2003, 21, 405–416. [CrossRef] [PubMed]
2. Klassen, H.; Schwartz, PH; Ziaeian, B.; Nethercott, H.; Young, MJ; Bragadottir, R.; Tullis, GE; Warfvinge, K.; Narfstrom, K. Arenevast kassi ajust eraldatud närviprekursorid näitavad võrkkesta integreerumist pärast siirdamist düstroofse kassi võrkkestale. Vet. Oftalmool. 2007, 10, 245–253. [CrossRef] [PubMed]
3. Salado-Manzano, C.; Perpina, U.; Straccia, M.; Molina-Ruiz, FJ; Cozzi, E.; Rosser, AE; Canals, JM Kas immunoloogiline reaktsioon on neurodegeneratiivsete haiguste rakuteraapia kitsaskoht? Esiosa. Raku neuroosci. 2020, 14, 250. [CrossRef]
4. Petrus-Reurer, S.; Romano, M.; Howlett, S.; Jones, JL; Lombardi, G.; Saeb-Parsy, K. Immunoloogilised kaalutlused ja väljakutsed regeneratiivse rakuteraapia jaoks. Commun. Biol. 2021, 4, 798. [CrossRef]
5. Bucher, K.; Rodriguez-Bocanegra, E.; Dauletbekov, D.; Fischer, MD Immuunvastused võrkkesta geeniteraapiale, kasutades ade ilma seotud viirusvektoriteta – mõju ravi edukusele ja ohutusele. Prog. Retin. Eye Res. 2021, 83, 100915. [CrossRef]
6. Singh, MS; Park, SS; Albini, TA; Canto-Soler, MV; Klassen, H.; MacLaren, RE; Takahashi, M.; Nagiel, A.; Schwartz, SD; Bharti, K. Võrkkesta tüvirakkude siirdamine: ohutuse ja potentsiaali tasakaalustamine. Prog. Retin. Eye Res. 2020, 75, 100779. [CrossRef]
7. Kamao, H.; Mandai, M.; Okamoto, S.; Sakai, N.; Suga, A.; Sugita, S.; Kiryu, J.; Takahashi, M. Inimese indutseeritud pluripotentsetest tüvirakkudest pärinevate võrkkesta pigmendi epiteeli rakulehtede iseloomustus kliiniliseks kasutamiseks. Stem Cell Rep. 2014, 2, 205–218. [CrossRef]
8. Sugita, S.; Kamao, H.; Iwasaki, Y.; Okamoto, S.; Hashiguchi, T.; Iseki, K.; Hayashi, N.; Mandai, M.; Takahashi, M. T-rakkude aktiveerimise inhibeerimine võrkkesta pigmendi epiteelirakkude poolt, mis on saadud indutseeritud pluripotentsetest tüvirakkudest. Uurige. Oftalmool. Vis. Sci. 2015, 56, 1051–1062. [CrossRef]
9. McGill, TJ; Stoddard, J.; Renner, LM; Messaoudi, I.; Bharti, K.; Mitalipov, S.; Lauer, A.; Wilson, DJ; Neuringer, M. Allogeenne iPSC-st tuletatud RPE rakutransplantaadi rike pärast siirdamist subretinaalsesse ruumi ahvilistel. Uurige. Oftalmool. Vis. Sci. 2018, 59, 1374–1383. [CrossRef]
10. Sugita, S.; Mandai, M.; Kamao, H.; Takahashi, M. RPE rakkude siirdamise immunoloogilised aspektid. Prog. Retin. Eye Res. 2021, 84, 100950. [CrossRef]
11. Nair, DSR; Thomas, BB tüvirakkudel põhinevad võrkkesta degeneratiivsete haiguste ravistrateegiad. Curr. Stem Cell Res. Seal. 2022, 17, 214–225. [CrossRef] [PubMed]
12. Martinez Velazquez, LA; Ballios, BG Molekulaar- ja rakuteraapia järgmine põlvkond pärilike võrkkestahaiguste raviks. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11542. [CrossRef]
13. Liu, Y.; Chen, SJ; Li, SY; Qu, LH; Meng, XH; Wang, Y.; Xu, HW; Liang, ZQ; Yin, ZQ Inimese võrkkesta eellasrakkude siirdamise pikaajaline ohutus retiniidi pigmentosa patsientidel. Stem Cell Res. Seal. 2017, 8, 209. [CrossRef] [PubMed]
14. Wang, Y.; Tang, Z.; Gu, P. Võrkkesta degeneratsiooni tüvi- / eellasrakkudel põhinev siirdamine: kliiniliste uuringute ülevaade. Cell Death Dis. 2020, 11, 793. [CrossRef] [PubMed]
15. Saksa keel, OL; Vallese-Maurizi, H.; Soto, TB; Rotstein, NP; Politi, LE Retina tüvirakud, lootused ja takistused. World J. Stem Cells 2021, 13, 1446–1479. [CrossRef]
16. Karamali, F.; Behtaj, S.; Babaei-Abraki, S.; Hadady, H.; Atefi, A.; Savoj, S.; Soroushzadeh, S.; Najafian, S.; Nasr Esfahani, MH; Klassen, H. Fotoretseptori degeneratsiooni potentsiaalsed terapeutilised strateegiad: tee nägemise taastamiseks. J. Transl. Med. 2022, 20, 572. [CrossRef]
17. Semo, M.; Haamedi, N.; Stevanato, L.; Carter, D.; Brooke, G.; Young, M.; Coffey, P.; Sinden, J.; Patel, S.; Vugler, A. Inimese võrkkesta eellasrakkude efektiivsus ja ohutus. Tõlk. Vis. Sci. Technol. 2016, 5, 6. [CrossRef]
18. Mochizuki, M.; Sugita, S.; Kamoi, K. Silma immunoloogiline homöostaas. Prog. Retin. Eye Res. 2013, 33, 10–27. [CrossRef]
19. Yamasaki, S.; Sugita, S.; Horiuchi, M.; Masuda, T.; Fujii, S.; Makabe, K.; Kawasaki, A.; Hayashi, T.; Kuwahara, A.; Kishino, A.; et al. Inimese ESC- ja iPSC-st tuletatud võrkkesta madal immunogeensus ja immunosupressiivsed omadused. Stem Cell Rep. 2021, 16, 851–867. [CrossRef]
20. Klassen, H.; Schwartz, MR; Bailey, AH; Inimese ja hiire multipotentsete neuraalsete eellasrakkude poolt ekspresseeritud noorte MJ pinnamarkerite hulka kuuluvad tetraspaniinid ja mittevalgulised epitoobid. Neurosci. Lett. 2001, 312, 180–182. [CrossRef]
21. Klassen, H.; Ziaeian, B.; Kirov, II; Young, MJ; Schwartz, PH Võrkkesta eellasrakkude eraldamine surmajärgsest inimkoest ja võrdlus autoloogsete aju eellasrakkudega. J. Neurosci. Res. 2004, 77, 334–343. [CrossRef]
22. Ingulli, E. Raku äratõukereaktsiooni mehhanism siirdamisel. Pediatr. Nephrol. 2010, 25, 61–74. [CrossRef]
23. Issa, F.; Schiopu, A.; Wood, KJ T-rakkude roll transplantaadi äratõukereaktsioonis ja siirdamise taluvuses. Ekspert Rev. Clin. Immunol. 2010, 6, 155–169. [CrossRef] [PubMed]
24. Nasr, M.; Sigdel, T.; Sarwal, M. Transplantaadi äratõukereaktsiooni diagnostika edusammud. Ekspert Rev Mol. Diagnoos. 2016, 16, 1121–1132. [CrossRef] [PubMed]
25. Klassen, H.; Imfeld, KL; Ray, J.; Young, MJ; Gage, FH; Berman, MA Täiskasvanud hipokampuse eellasrakkude immunoloogilised omadused. Vis. Res. 2003, 43, 947–956. [CrossRef] [PubMed]
26. Weinger, JG; Weist, BM; Põimitud, WC; Klaus, SM; Walsh, CM; Lane, TE MHC mittevastavus põhjustab viiruse poolt indutseeritud demüelinisatsiooni mudelis seljaaju siirdamise järel neuraalse eellasrakkude äratõukereaktsiooni. Tüvirakud 2012, 30, 2584–2595. [CrossRef] [PubMed]
27. ReNeuron, L. First-in-human Phase I/IIa, Open-label, Subretinaalselt siirdatud inimese võrkkesta eellasrakkude (hRPC) ohutuse ja talutavuse perspektiivuuring pigmentretiniidiga (RP) patsientidel. Kliiniline uuring nr NCT02464436. Saadaval Internetis: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02464436 (kasutatud 27. veebruaril 2023).
28. Lu, B.; Lin, Y.; Tsai, Y.; Girman, S.; Adamus, G.; Jones, MK; Shelley, B.; Svendsen, CN; Wang, S. Inimese neuraalse eellasrakkude siirdamine degenereerunud võrkkestasse ei kahjusta siiriku esialgset ellujäämist ega terapeutilist efektiivsust. Tõlk. Vis. Sci. Technol. 2015, 4, 7. [CrossRef] [PubMed]
29. Jones, MK; Lu, B.; Girman, S.; Wang, S. Rakupõhised ravistrateegiad võrkkesta degeneratiivsete haiguste asendamiseks ja säilitamiseks. Prog. Retin. Eye Res. 2017, 58, 1–27. [CrossRef] [PubMed]
30. Bell, BA; Kaul, C.; Bonilha, VL; Rayborn, ME; Shadrach, K.; Hollyfield, JG BALB/c hiir: standardse vivaariumvalgustuse mõju võrkkesta patoloogiale vananemise ajal. Exp. Eye Res. 2015, 135, 192–205. [CrossRef]
31. Klassen, HJ; Ng, TF; Kurimoto, Y.; Kirov, I.; Shatos, M.; Coffey, P.; Noored, MJ Multipotentsed võrkkesta eellased väljendavad arengumarkereid, diferentseeruvad võrkkesta neuroniteks ja säilitavad valguse vahendatud käitumise. Uurige. Oftalmool. Vis. Sci. 2004, 45, 4167–4173. [CrossRef]
32. jCyte, Inc. Inimese võrkkesta eellasrakkude (jCell) ühekordse intravitreaalse süstimise ohutus retiniidi pigmentosa korral. Kliiniline uuring nr NCT02320812. Saadaval Internetis: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02320812 (kasutatud 24. veebruaril 2023).
33. jCyte, Inc. Inimese võrkkesta eellasrakkude klaaskehasisese süstimise ohutus ja tõhusus retiniidi pigmentosaga täiskasvanutel. Kliiniline uuring nr NCT03073733. Saadaval Internetis: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03073733 (kasutatud 24. veebruaril 2023).
34. jCyte, Inc. Inimese võrkkesta eellasrakkude (rakkude) korduva klaaskehasisese süstimise ohutus pigmentretiniidiga täiskasvanud subjektidele. Kliiniline uuring nr NCT04604899. Saadaval Internetis: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04604899 (kasutatud 24. veebruaril 2023).
35. Oudejans, JJ; van der Valk, P. T-rakkude ja NK-rakkude neoplasmide immunohistokeemiline klassifikatsioon. J. Clin. Pathol. 2002, 55, 892. [CrossRef] [PubMed]
36. Tostanoski, LH; Chiu, YC; Gammon, JM; Simon, T.; Andorko, JI; Bromberg, JS; Jewell, CM Kohaliku lümfisõlmede mikrokeskkonna ümberprogrammeerimine soodustab süsteemset ja antigeenispetsiifilist tolerantsust. Cell Rep. 2016, 16, 2940–2952. [CrossRef] [PubMed]
37. Jurga, AM; Paleczna, M.; Kuter, KZ Diferentsiaalsete mikrogliia fenotüüpide üldiste ja eristavate markerite ülevaade. Esiosa. Raku neuroosci. 2020, 14, 198. [CrossRef] [PubMed]
38. Li, JC; Zou, XM; Yang, SF; Jin, JQ; Zhu, L.; Li, CJ; Yang, H.; Zhang, AG; Zhao, TQ; Chen, CY Neutrofiilide ekstratsellulaarsed püünised osalevad maovähiga patsientide vähiga seotud tromboosi tekkes. Maailm J. Gastroenterool. 2022, 28, 3132–3149. [CrossRef]
39. Kee, BL Looduslike tapjarakkude arendamine ja ILC1. Encycl. Immunobiol. 2016, 1, 140–148.