Cistanche Tubulosast puhastatud ehhinakosiidi loodusliku bioaktiivse ühendi tavaliste maksametaboliitide tuvastamine Ⅱ

Abstraktne:Metaboliitide tuvastamine, ühendi varajases staadiumis, on vaja hinnatateadmised ravimite ohutuse ja efektiivsuse farmaatsia parandamiseks. Isegi kui ravimon turule lastud, metaboliitide identifitseerimine ja pidev hindamine on olemasturustamisjärgse tühistamise ohu vältimiseks. Glükosiid, ravimcistanche, omab laialdaselt dokumenteeritud toitainelist kasu, sealhulgasantioksüdant,kasvajavastane, anti-vananemine, hüpolipideemiacjamao limaskesta kaitsev toime. HiljutiehhinakosiidA on teatatudpeamise loodusliku bioaktiivse ühendina HE seeneniidistikus funktsionaalse toidu arendamiseks.Neuroloogilistes uuringutes tarbimineehhinakosiidRikastatud HE seeneniidistik demonstreerib sedaolulist toitainelist toimetAlzheimeri tõbi, Parkinsoni tõbijaisheemiline insult.

Cistanche ehhinakosiidi funktsioonide kohta lisateabe saamiseks klõpsake siin

Sestesimest korda uurisime metaboolset protsessiehhinakosiidMolekul ja tuvastas selle metaboliididroti ja inimese maksa S9 fraktsioonist. Kasutades vedelikkromatograafiat/kolmekordset kvadrupoolmassikvantitatiivse analüüsi spektromeetriga täheldasime, et 75,44 protsenti ehhinakosiidist. A metaboliseerus60 minuti jooksul rottidel ja 32,34 protsenti Francine A-st metaboliseerus 120 minuti jooksul inimese S9-s. Kasutadesüliefektiivne vedelikkromatograafia/kvadrupoolne lennuaja massispektromeetria (UPLC)QTOF/MS) Francine A metaboliitide tuvastamiseks tuvastati viis tavalist metaboliiti,ja hinnati nende võimalikke struktuure. Ehhinakosiidi metaboolse protsessi mõistmineja selle metaboliitide profiilide andmebaasi loomine aitab edendada toitainete kasutamist jaseotud biomarkerite avastamine tulevikus.

1. Sissejuhatus

Maksa peetakse kehas suuruselt teiseks elundiks [1]. Pärast sööki ja ravimeidsuuõõne kaudu seedetrakti siseneda, imendub seedetrakti pilusseeditavad toitained ja ravimid. Portaalveeni süsteem võtab vastu kogutud verevooluseedetrakti kaudu ja siseneda maksa toitainete eeltöötlemiseks,metaboliidid ja ravimimolekulid [2,3]. Ainevahetus jaguneb sageli kaheks faasiks abiokeemiline reaktsioon. I faas hõlmab oksüdatsiooni, redutseerimist või hüdrolüüsi ensüümide pooltkeha. II faas osaleb konjugatsioonis väikeste endogeensete ainetega, keeratesneed muutuvad hästi lahustuvateks metaboliitideks, võimaldades metaboliite siinusesse eksportidaneerude puhastamiseks või sapisse, mis seejärel organismist erituburiini või väljaheitega [4–6]. Metaboliitide tuvastamine ravimite avastamise varases staadiumison vajalik teadmiste hindamiseks farmatseutiliste omaduste, ohutuse jabioaktiivse molekuli efektiivsus. Metaboliitide ja reaktiivsete vaheühendite identifitseerimineviitab vajadusele vältida uuritavates ühendites struktuurseid modifikatsioonehilisemad toksilised tagajärjed. Isegi kui ravim on olnud turul, identifitseeriminemetaboliitide hindamine ja hindamine on vajalik, et vältida nende turustamisjärgset ohtutagasivõtmine [7,8]. Seetõttuin vitro, S9 fraktsioonide analüüs pakub mitmeid eeliseidvõrreldes aeganõudvagain vivouuringud: (1) need on suure läbilaskevõimegasõelumine ja automatiseerimine;(2) kasutadesS9 fraktsioon võimaldab testida suuri koguseidühendid ravimite avastamiseks lühikese aja jooksul; (3) aitab vähendada loomade kasutamist [9]. 

ehhinakosiid on söödav tsitanche, mis elab mägistel aladelAasia kirde territooriumid [10], Euroopas ja Põhja-Ameerikas [11]. TA kuulubBasidiomycota (Phylum), Agaricomycetes (klass), Russulales (järgu), Hericiaceae (sugukond),ja Hericium (perekond). On dokumenteeritud, et HE näitab laia valikut kasulikke omadusiomadused, sealhulgas antioksüdant, kasvajavastane, vananemisvastane, hüpolipideemiline ja mao limaskestakaitseefektid [12–14]. 1994. aastal avaldasid Kawagishi jt. avastas, et diterpenoidehhinakosiidA, B ja C HE seeneniidistikus võivad soodustada tähtede tootmistrakuliinid roti ajus ja närvikasvufaktori (NGF) sünteesi stimuleerimine [15]. ehhinakosiidA võib avaldada neuroprotektiivset toimet ja nõrgendada oksüdatiivset stressiinsult [16], Alzheimeri tõbi [17], Parkinsoni tõbi [18], isheemiline insult ja depressioon in vivo[19,20]. Lisaks võib ehhinakosiid A läbida vere-aju barjäärirotid, et toetada HE mütseeli kui neurotervise parandamise funktsionaalse toidu arengut [21]. See söödav tsitanche mütseel on muutunud teadlaste seas kuumaks probleemikspüüdes mõista selle olulist rolli kesk- ja perifeersete närvide arengus, diferentseerumine, kasv ja taastumine [22]. Hiljutised uuringud on samuti näidanudet ehhinakosiid A-ga rikastatud HE on potentsiaalselt kasulikud Alzheimeri ja Parkini tõve ravispoja haigus [23–25]. Siiski ei ole üheski uuringus käsitletud ehhinakosiid A võimalikku ainevahetustbiomarkerid, mis võivad sellele toitainelisele toimele kaasa aidata.

Selles uuringusehhinakosiidÜhend puhastati ehhinakosiid A-ga rikastatud HE-stseeneniidistik ja metaboliseeriti, kasutades kahte erinevat maksa S9 fraktsiooni: rott ja inimene. Kasutadesvedelikkromatograafia / kolmekordne kvadrupoolne massispektromeeter (HPLC-QQQ/MS) quan jaoksehhinakosiidi A titatiivne analüüs ja üliefektiivne vedelikkromatograafia/kvadrupoollennuaja massispektromeetria (UPLC-QTOF/MS) ehhinakosiidi metaboliitide tuvastamiseksA igal ajahetkel. Meie eesmärk on mõista ehhinakosiidi A ainevahetuse kiirust ja teha kindlaksselle metaboliitide profiilide andmebaas, mis aitab edendada toidulisandite kasutamistja potentsiaalsete ravimite uurimine tulevikus.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Materjalid ja reaktiivid

HE tüvi (BCRC 35669) saadi Bioresources Collectionist jaToiduainetööstuse uurimis- ja arendusinstituudi uurimiskeskus, Hsinchu, Taiwan.Tüve kasvatati esmalt kaldenurgas, enne kui viidi üle kartulidekstroosileagarplaat kell 26◦C 15 päeva. 15. päeval viidi HE kultuurid üle 1,3 liitrissevedel sööde (2-liitristes kolbides). Vedelkultuuri loksutati kiirusel 120 p/min 25◦C jaoks5 päeva. Järgmisena suurendati neid 500-liitristes 20-tonnistes fermentaatorites 5 päevaks ja 12 päevaks,vastavalt. Söötme pH reguleeritakse väärtusele 4,5 ja see sisaldab 4,5 protsenti glükoosi, 0,5 protsentisojaoa pulber, {{0}},25 protsenti pärmiekstrakti, 0,25 protsenti peptoon ja 0,05 protsenti MgSO4. Lõpuks HEseeneniidistikud koguti 20-tonnise fermentatsiooniprotsessi lõpus. Need toorainedlüofiliseeriti, jahvatati pulbriks ja säilitati eksikaatoris. ehhinakosiid A oli siisekstraheeritud HE-st ja kvantifitseeritud vastavalt varasematele uuringutele [26]. Metanool (LC-MShinne) saadi firmast Merck (Darmstadt, Saksamaa); atsetonitriil (LC-MS klass), sipelghapesaadi hape (FA, LC-MS klass, 98% puhtus) ja ammooniumatsetaat (98% puhtus).Honeywellilt (Honeywell Burdick ja Jackson, Muskegon, MI, USA). Roti maks S9fraktsioon saadi firmalt Moltox (Boone, NC, USA). Inimese maksa S9 fraktsioon olisaadud firmast Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA).

2.2. Roti ja inimese maksa S9 fraktsioon

komplekti soovitusele. Valmistatud lahust hoiti temperatuuril 4 °C◦C kuni ehhinakosiidini Aühend (10µM), millele järgnes aktiveerimine 37-s◦C veevann. Kuimetaboolne aeg oli jõudnud oma ajapunktidesse, 150µL lahust eemaldatipõhilahust ja kustutati kahe mahuosa jääkülma ACN lisamisega. Peatatudlahus kantakse seejärel edasiseks metaboliitide analüüsiks QTOF-i.

2.3. Seadmed ja tingimused

HPLC-QQQ/MS analüüs viidi läbi Agilent 1100 seeria HPLC süsteemiga (Agilent, Palo Alto, CA, USA) koos API 3000 kolmekordse kvadrupoolse massispektromeetriga(Applied Biosystems, Warrington, Ühendkuningriik), turbo-assisted ion spray (ESI) ionisatsioonigaallikas positiivses ionisatsioonirežiimis. Kromatograafiline eraldamine viidi läbi anAgilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm× 100 mm× 3.5 µm). Kolonni temperatuur olihoitakse 22◦C. Liikuv faas koosnes veest, mis sisaldas 0,1 protsenti sipelghapet(A) ja metanool (B). Kasutati gradientelueerimist, alustades 70 protsendist B, suurendades 100 protsendiniB 5 minuti jooksul, hoidke 3 minutit 90 protsendiga B, vähendades B 70 protsendini 0,1 minuti jooksul jauuesti tasakaalustamine 70% B juures 2,9 minutit. Kaashind 350µRakendati l/min ja maht10-stµL-le süstiti.

Tuvastamine viidi läbi ioniseeriva pingega pluss 4500 V. Iooniallika temperatuurmäärati 350-le◦C, ülikõrge puhtusastmega lämmastikuga kardingaasina (7 psi). Nebulisaatori gaas oli8 psi. Muud massist sõltuvad parameetrid, nagu deklastrimispotentsiaal (DP), sissepääsIga ühendi potentsiaal (EP), fokusseerimispotentsiaal (FP) ja kokkupõrkeenergia (CE) olidmääratakse positiivses režiimis standardlahuste abil. Mitme reaktsiooni jälgimine(MRM) viidi läbi, kasutades kokkupõrkegaasina lämmastikku (2 psi) ja ooteajaga200 ms iga ülemineku jaoks. ehhinakosiid A tuvastati üleminekute jälgimise teelm/z 443.200 → 301.200, 283.200. Andmeid analüüsiti tarkvara Analyst 1.4.2 abil (AppliedBiosystems, Concord, ON, Kanada) ja GraphPad (Prism 8.0.0.).

UPLC-QTOF/MS analüüs viidi läbi Agilent 1290 Infinity II UPLC süsteemiga(Agilent, Palo Alto, CA, USA), mis on ühendatud Agilent 6546 kvadrupoolse lennuaja massigaspektromeetria (Agilent, Palo Alto, CA, USA). Viidi läbi kromatograafiline eraldaminePhenomenex Kinetexil® C18 LC kolonn (3 mm× 100 mm× 1.7 µm). Veergtemperatuuri hoiti 40 kraadi juures◦C. Liikuv faas A koosnes vett sisaldavast0,1 protsenti (v/v) sipelghape positiivses režiimis, 0,1 protsenti (v/v) sipelghape ja 10 mM CH3COONH4 negatiivses režiimis. Liikuvaks faasiks B oli atsetonitriil. Alustades kasutati gradientelueerimist5 protsendiga B ja hoides 0,5 minutit, suurendades 5,5 minuti jooksul 50 protsendini B, suurendades 100 protsendiniB 10 minuti jooksul ja hoidke 6 minutit. Kaashind 400µL/min rakendati ja amaht 2µL-le süstiti.

Agilent 6546 kvadrupoolne lennuaja massispektromeetria oli varustatud elektriseadmegatropihustusionisatsiooni (ESI) allikas. Andmete kogumine oli Mass Hunteri kontrolli alltööjaama tarkvara. Tüüpilised tööallika tingimused positiivsetes ja negatiivsetes ioonidesESI režiim optimeeriti järgmiselt: ioonipihustuspinge (ESIpluss/ESI−) olid4000 V/3000 V; gaasi temperatuur oli 320◦C; kuivatusgaasi lisakiirus oli 8 l/min; nebulisaatori rõhk oli45 psi; mantli gaasi temperatuur oli 350◦C; mantligaasi lisakiirus oli 12 l/min; kokkupõrgeenergia oli 10, 20, 40 ja 60 V. Metaboliidid tuvastati Agilent MassHunteri abilBiotransformatsiooni tarkvara (versioon B.04.{1}}) (Santa Clara, CA, USA). Kromatogrammidlähteaine ja tuvastatud metaboliitide massispektrid ekstraheeriti Agilenti abilMassHunteri kvalitatiivse analüüsi tarkvara (versioon B.05.00) (Santa Clara, CA, USA).

Küsi lisa:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp pluss 86 15292862950