Kuidas Artemether ameliorates neerukahjustust - I osa

Rohkem information:ali.ma@wecistanche.com

Artemether leevendab neeru kahju, taastades redoksilise tasakaalustamatuse mitokondriaalse täiustamine funktsioon adriamütsiini nefropaatias hiirtel

Peng xun Han, et al

neeron suure energianõudlusega organ, mis on rikas eriti mitokondrite poolestNeerutorukujulised rakud. Esilekerkivad tõendid viitavad sellele, et mitokondriaalne düsfunktsioon, redoksiline tasakaalustamatus ja neerukahjustused on Omavahel. Artemetheril on bioloogilised efectid, suunates mitokondreid ja eksponeerides potentsiaali terapeutiline väärtusneertõbi. Kuid aluseks olevad molekulaarsed mehhanismid ei ole olnud täielikult välja selgitatud. See uuring viidi läbi, et teha kindlaks artemetheri efects Adriamycininduced nefropaatia ja uuriti ka võimalikke mehhanisme. In vivo, adriamütsiin loodi nefropaatia hiire mudel ja hiiri raviti artemetheriga või ilma 2 nädalat. In vitro, NRK-52E rakud stimuleeriti TGF-β1-ga ja neid töödeldi koos või ilma artemether 24 h. SiisNeeruHinnati kahjustusi ja rakkude muutusi. Tulemused näitasid, et et artemether vähendas kuseteede valgu eritumist, taastas podotsüütide muutused, nõrgestas patoloogilised muutused ja leevendatudNeerutorukujuline vigastus. Artemether vähendas ka TGF-β1 mRNA ekspressiooni taset, pärssis torukujulist vohamist, taastas torukujuliste rakkude fenotüübid ja massihävitusrelvade levikuga seotud signaalimisteede allasurumine. Lisaks taastati artemetherNeeruRedox tasakaalustamatus, suurenenud mtDNA koopia number ja parem mitokondriaalne funktsioon. Kokkuvõtteks võib öelda, et me esitanud esialgsed tõendid selle kohta, et artemether leevendab neerukahjustust, taastades redoksilise tasakaalustamatuse ja mitokondriaalse funktsiooni parandamine Adriamütsiini nefropaatias hiirtel. Artemether võib olla paljulubav neeruhaiguse raviks mõeldud aine.

Kroonilineneertõbi(CKD) on muutumas ülemaailmseks tervisekoormuseks ja seda iseloomustavad uriini kõrvalekalded, morfoloogilise struktuuri muutused ja halvenenudNeerufunktsioon1. On hädavajalik uurida CKD patogeneesi ja töötada välja tõhusad ravimid, mis aeglustavad selle progresseerumist.

Suure energiavajadusega organinaneeron rikas mitokondrite poolest, eritiNeerutorukujulised rakud. Mitokondreid peetakse raku jõujaamaks ja nad osalevad paljudes rakuprotsessides. Esilekerkivad tõendid viitavad sellele, et mitokondriaalsel düsfunktsioonil on keskne rollneerud sissežürii2. Kogukonnapõhises populatsioonis täheldati negatiivset seost mitokondriaalse DNA (mtDNA) koopianumbri vahel perifeerses veres ja mikroalbuminuria levimuse vahel3. Kuseteede eritumise metaboloomika uuring jaNeerugeeniekspressiooni analüüs näitas, et sidrunhappe tsükli aktiivsus on CKD patsientidel halvenenud4. Mitokondrid on rasvhapete oksüdatsiooni peamine koht. Tubulointerstitsiaalse fibroosiga inimestel ja hiiremudelitel avastati defektne rasvhapete oksüdatsioon. Rasvhapete ainevahetuse taastamine geneetiliste või farmakoloogiliste meetoditega takistas oluliselt neerufbroosi progresseerumist5.

Oksüdatiivne stress on määratletud kui tasakaalustamatus reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tekkes, mis ületab rakkude/kudede võimet neid detoksifitseerida või tükeldada. Paljud uuringud on näidanud, etneerredoksseisund soodustab fibrogeenseid radu ja viib lõpuksNeeruebaõnnestumine6. Mitokondrid on peamine rakulise ros-i allikas ja reguleerivad redoksbilanssi koostöös teiste organellidega7. Redoksiline tasakaalustamatus, mitokondriaalne düsfunktsioon janeerKahjuNad on omavahel seotud. Kuid nende tegurite aluseks olevad molekulaarsed mehhanismid jäävad kättesaamatuks.

Artemether on artemisiniini derivaat, millel on parem biosaadavus ja mida kasutatakse laialdaselt malaariavastases ravis8,9. Varasemad uuringud on näidanud, et artemisiniini derivaatidel on viirusevastane, seenevastane, vähivastane ja diabeedivastane toime10–15. Mitmed uuringud on näidanud, et artemetheri bioloogilised mõjud on seotud mitokondrite reguleerimisega16–18. Täpseid mehhanisme ei mõisteta siiski täielikult.

Selles uuringus uurisime artemetheri rolli adriamütsiini nefropaatias (AN) ja uurisime selle aluseks olevaid mehhanisme.

Cistancheon heaneerKahju

Klõpsake Cistanche ekstrakti pulbrit neerukahjustuse korral

Tulemused

Artemether vähendas kuseteede valgu eritumist ja taastas podotsüütide muutused.

Proteinuuria on markerNeeruKahjuja sõltumatu riskifaktor CKD progresseerumiseks. Nagu on näidatud joonisel 1a, suurenes võrreldes kontrollrühmaga kuseteede valgu eritumine AN-rühmas märkimisväärselt ja vähenes oluliselt artemetheri raviga. Podotsüüdid mängivad olulist rolli proteinuuria moodustumisel. Seetõttu loendasime WT-1 positiivsete rakkude arvu (mis näitab podotsüütide arvu) ja mõõdetud jalaprotsessi laiust (FPW) glomeruluses. Tulemused näitasid, et podotsüütide arv vähenes ja FPW suurenes märkimisväärselt AN-rühma hiirtel (joonis 1b–e). Artemetheri ravi ilmselt taastas need podotsüütide muutused (joonis 1b–e).

Joonis 1. Artemether vähendas kuseteede valgu eritumist ja taastas podotsüütide muutused. a) Kvantifitseerimine ja kuseteede valgu eritumise statistiline analüüs erinevates rühmades. n = 6 rühma kohta. b) WT-1 loendamine positiivsed rakud glomeruluse kohta igas rühmas. n = 6 rühma kohta. c) FPW mõõtmine erinevates rühmades. n = 3 rühma kohta. d) WT-1 immunostainingu representatiivsed kujutised igas rühmas. Skaala riba, 20 μm. e) Tüüpilised TEM-pildid, mis näitavad jalaprotsesside morfoloogilisi muutusi. Skaalariba, 500 nm. **P<0.01 and=""><0.001 versus="" control;=""><0.05,><0.01 and=""><0.001 versus="">

Cistancheon heaneerKahju

Artemether leevendas patoloogilisi muutusi ja neerutorukujulisi vigastusi.

Selle uuringu lõpus olid AN-rühma hiirtel silma paigusegmentaalne glomeruloskleroos (joonis 2a,j), torukujuline vigastus (joonis 2b,k) ja tubulointerstitsiaalne fibroos (joonis 2c,l). Artemetheri ravi leevendas oluliselt neid patoloogilisi kahjustusi (joonis 2a–c,j–l). Kooskõlas torukujuliste patoloogiliste muutustega suurenesid kuseteede Kim-1 ja NGAL tasemed, mis on kaks torukujulist vigastuste biomarkerit, AN-rühmas märkimisväärselt ja artemether vähendasid neid oluliselt (joonis 2d,e). Lisaks suurenes oluliselt fibroosiga seotud mRNA (fibronektiin: FN, α-silelihaste aktiin: α-SMA, kollageen: COL I ja COL III) tase oluliselt ka AN-rühma hiirtel ja seda reguleeriti artemetheri raviga (joonis 2f–i). Kooskõlas nende molekulaarsete ja patoloogiliste muutustega vähendas artemether oluliselt suurenenud seerumi kreatiniini ja BUN-i AN-rühmas (joonis 9a,b).

Joonis 2. Artemether nõrgestas patoloogilisi muutusi jaNeerutorukujuline vigastus. A)glomeruloskleroosi, b) torukujulise vigastuse ja c) interstitsiaalse fibroosi hindamine igas rühmas. Kuseteede (d)NGAL ja e) Kim-1 eritumise kvantifitseerimine erinevates rühmades. MääramineNeerumRNA ekspressioonitasemed (f) FN, g)α-SMA, h) COL I ja i) COL III erinevates rühmades qPCR-i ja normaliseerumise alusel majapidamise geeniβ-aktiini vastu. j, k) PAS-i värvimise representatiivsed kujutised glomeruli (skaalariba, 20 μm) ja tubulite jaoks (skaalariba, 50 μm). l) Massoni trikroomse värvimise representatiivsed kujutisedNeerutubulointerstitium. Skaala riba, 50 μm. n = 6 rühma kohta. *P<0.05,><0.01 and=""><0.001 versus="" control;=""><0.05,><0.01 and=""><0.001 versus="">

Artemether inhibeeris torukujuliste rakkude vohamist.

Rakkude kasvu seisundi määramiseksneer, teostasime immunohistokeemiat rakkude vohamise markerite jaoks, mis paljunevad raku tuumaantigeeni (PCNA) ja Ki-67. Tulemused näitasid, et PCNA ja Ki-67 positiivsed torukujulised rakud suurenesid AN-rühma hiirtel märkimisväärselt ja artemether vähenes oluliselt (joonis 3b–e). TGF-β1 on rakkude vohamise kriitiline regulaator. Võrreldes kontrollrühma hiirtega on TGF-β1 mRNA märgatav reguleerimineNeerukude täheldati AN-rühma hiirtel ja seda reguleeriti oluliselt artemetheri raviga (joonis 3a).

Joonis 3. Artemether alandas TGF-β1 mRNA ekspressiooni taset ja pärssis torukujulist vohamist. a) Neeru TGF-β1 mRNA avaldise taseme määramine igas rühmas. b, c) PCNA ja Ki-67 positiivsed torukujulised rakud mm2 kohta erinevates rühmades. d, e) PCNA ja Ki-67 esinduslikud pildid immunostaining igas rühmas. Skaala riba, 20 μm. n = 6 rühma kohta. **P<0.01 and=""><0.001 versus="" control;=""><0.01 and=""><0.001 versus="">

Artemether taastas torukujulise raku fenotüübi ja pärssis vohamisega seotud signaalradasid.

Tüüpilise epiteeli fenotüübi markerina vähenes E-kadherin (fosfo S838+S840) AN-rühmas märkimisväärselt ja artemether (joonis 4a, b,f,j). Te proliferatsiooniga seotud signaalid Erk1/2, p38 ja S6RP aktiveeriti AN-rühma hiirtel ja neid inhibeeris artemether (joonis 4a,c–e,g– i,k). Et teha kindlaks, kas artemetheri mõju torukujulistele rakkudele vahendas TGF-β1, viisime läbi in vitro uuringu. NRK-52E rakud inkubeeriti 10 ng/ml TGF-β1-ga koos artemetheriga või ilma 24 h. Võrreldes töötlemata rühmaga suurendas TGF-β1 oluliselt rakkude elujõulisust (joonis 5a) ning indutseeris Erk1/2 ja S6RP aktivatsiooni (joonis 5b,e,h,c,f,i). Artemetheri annuse teshellcubation vähendas sõltuvalt rakkude elujõulisust (joonis 5a) ning inhibeeris Erk1/2 ja S6RP aktivatsiooni kontsentratsiooniga 200 μM (joonis 5b,e,h,c,f, i). P38 signaali aktiveeris veidi TGF-β1 stimulatsioon, kuid mitte märkimisväärsel määral. Artemetheri sekkumine ei mõjutanud ka p38 signalisatsiooni (joonis 5d, g,j).

Joonis 4. Artemetheri mõju torukujulistele rakufenotüübile ja vohamisega seotud signaalradadele. (a–i) Lääne blot ribad ja kvantitatiivne analüüs p-E-cadherin (S838+S840), E-cadherin, p-Erk1/2 (Tr202/Tyr204), Erk1/2, p-p38 MAPK (Tr180/Tyr182), p38 MAPK, p-S6RP (Ser235/236) ja S6RPneerIgas grupis. j, k) P-E-kadheriini (S838+S840) ja p-S6RP (Ser235/236) representatiivsed immunohistokeemilised värvimispildidneer. Pildid näitasid, et neid valke väljendatakse peamiselt neerutuubulites. Skaala riba, 20 μm. n = 6 rühma kohta. *P<0.05 and=""><0.01 versus="" control;=""><0.05,><0.01 and=""><0.001versus>

Joonis 5. Artemetheri mõju rakkude elujõulisusele ja levikuga seotud signaaliradadele in vitro. a) Lahter elujõulisust analüüsiti MTT analüüsiga pärast töötlemist TGF-β1-ga ja artemetheri erinevaid kontsentratsioone 24 h. n = 6 rühma kohta. *P< 0.05="" vs.="" tgf-β1:0="" +="" art:="" 0="" group;=""><0.001 vs.="" tgf-β1:(10+dmso)="" +="" art:="" 0="" group.="" (b–d)="" representative="" western="" blot="" bands="" of="" p-erk1/2="" (tr202/tyr204),="" erk1/2,="" p-s6rp="" (ser235/236),="" s6rp,="" p-p38="" mapk="" (tr180/tyr182),="" and="" p38="" mapk="" after="" treatment="" with="" the="" indicated="" amount="" of="" artemether="" and="" tgf-β1.="" (e–j)="" bar="" graphs="" present="" the="" fold="" change="" of="" these="" proteins="" after="" normalization="" to="" β-actin.="" n="3" per="" group.=""><0.05 versus="" tgf-β1:0+art:="" 0="" group;=""><0.05 versus="" tgf-β1:10+art:="" 0="">

Cistancheon heaneerKahju

Artemetheri mõju neeru redokskaalule.

Kontrollrühmaga võrreldes vähenesid redoksiga seotud ensüümid, sealhulgas kataas, superoksiidi dismutaasi 2 (SOD2) ja glutatiooni peroksüdaas 1 (GPX1), AN-rühmas märkimisväärselt ja suurenesid oluliselt artemetheri raviga (joonis 6a–d). Immunohistokeemiline värvimine näitas, et neid ensüüme ekspresseeriti peamiselt neerutuubulites ja ekspresseeriti harva glomerulis. Nende levik tubulites näitas ka konkreetset mustrit. Katalaasi väljendati peamiselt kortiko-medullaarses ristmikus, SOD2 väljendus peamiselt medullas ja GPX1 väljendus peamiselt ajukoores (joonis 6f–h). Kooskõlas redoksilise tasakaalustamatuseganeer,KuseteedeH2O2 eritumine suurenes AN-rühmas märkimisväärselt ja seda vähendas artemether (joonis 6e). Artemether suurendas mitokondriaalset massi ja parandas mitokondriaalset funktsiooni. AN-rühma hiirtel täheldati pingest sõltuva anioonkanali (VDAC) kadu, välise mitokondriaalse membraani 20 (TOM20), tsütokroom c oksüdaasi IV (COX IV) ja mitokondriaalse transkriptsioonifaktori A (Tfam) kadu ning neid mõjusid suurendas artemetheri ravi (joonis 7a–e). Kuna Tfami valk mängib olulist rolli mtDNA koopianumbrite säilitamisel, mõõtsime igas rühmas mtDNA koopianumbreid. Kooskõlas Tfami vähenemisega vähendati an-rühmas ka mtDNA koopiate arvu ja seda suurendas artemether (joonis 7g–l). Lisaks täheldati AN-rühmas madalamat neeru mitokondriaalset H2O2 vabanemiskiirust, mida suurendas artemetheri ravi (joonis 7f).

Joonis 6. Artemetheri efects onneerredoksbilanss ja kuseteede H2O2 eritumine. a) Lääne blot pildid kuvab igas rühmas katalaasi, SOD2 ja GPX1 neeruvalgu taset. (b–d) Riba graafikud näitavad volti nende valkude muutus pärast normaliseerimist β-aktiiniks. n = 4 rühma kohta. e) kuseteede H2O2 eritumine erinevates Rühmad. n = 6 rühma kohta. (f–h) Neerukataasi, SOD2 ja GPX1 representatiivsed immunostaining-pildid Iga grupp. Skaalariba, 200 μm. *P<0.05 and=""><0.001 versus="" control;=""><0.05 and=""><0.001 versus="">

Artemether reguleeris prootoni leket ja AMPK signaalimist.

Et uurida artemetheri otsest mõju mitokondritele, viisime Seahorse XF analüsaatori abil läbi mitokondriaalse stressitesti. Võrreldes ravimata rühmaga ei mõjutanud TGF-β1 stimulatsioon prootoni leket ega ATP tootmist (joonis 8a–c). Seevastu artemetheri töötlemine suurendas oluliselt prootoni leket ja vähendas ATP tootmist (joonis 8a–c). Nagu on näidatud joonisel 8d,e, aktiveeris AMPK signaali artemether. Lisaks näitas in vivo uuring, et valgu (UCP2) mRNA tasemete lahtisidumineneerartemether (joonis 8f) on neid märkimisväärselt reguleerinud.

Joonis 8. Artemetheri efects prootonlekkel ja AMPK signaalimisel. a) Rakuline mitokondriaalne hingamine mõõdeti Seahorse XF24 rakuvälise vooluanalüsaatoriga pärast rakkude töötlemist näidatud kogusega artemetherist ja TGF-β1-st 24 h. (b, c) Ribagraafikud esitavad prootoni lekke ja ATP arvutuse tootmine erinevates rühmades vastavalt tootja protokollile. n = 5 rühma kohta. d, e) Esindaja Lääne blot pildid ja kvantitatiivne analüüs p-AMPK (Tr172) korda muutus pärast TGF-β1 ja artemether ravi 24 h. n = 3 rühma kohta. f) UCP2 neeru mRNA ekspressioonitase igas rühma hiirtes normaliseerus majapidamise geeni β-aktiini vastu. n = 6 rühma kohta. #P<0.05 and=""><0.001 versus="" tgf-β1:10+art:="" 0="" group;=""><0.05 versus="">

Vajuta siia II osani

Pärit: "Artemether leevendabneerKahjutaastades redoksilise tasakaalustamatuse mitokondriaalse täiustamine funktsioon adriamütsiini nefropaatias hiirtel"Peng xun Han, et al

---Teaduslikud aruanded | (2021) 11:1266