Kroonilise neeruhaiguse põhjus (CKD)- Aneemia

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

I OSA.:P roteinumiline krooniline neeruhaigus on seotud punaste vereliblede eluea, deformatsiooni ja ainevahetuse muutumisega

Rosi Bissinger, Travis Nemkov jt.

Arengkehvveresuson tüüpiline komplikatsioon arenenudkrooniline neeruhaigus(CKD) ja on seotud elukvaliteedi halvenemisega¹ja suurenenud risk kardiovaskulaarsete sündmuste tekkeks²ja hospitaliseerimine,³Samuti kognitiivne langus.⁴Raskusastekehvveresuson peetud suremuse sõltumatuks ennustajaks nii dialüüsist kui ka dialüüsist mittesõltuvas CKD-s (krooniline neeruhaigus) patsiendid.⁵Neeruhaiguse patofüsioloogiakehvveresuson keeruline ja hõlmab raua ja erütropoetiini (EPO) puudust madala kvaliteediga põletiku tekitamisel, mis omakorda kahjustab normaalset erütropoteesi CKD-s (krooniline neeruhaigus) patsiendid.⁶Arenenud CKD-s (krooniline neeruhaigus), ei ole EPO vastus piisavalt madal võrreldeskehvveresus.^7,8Sellega kaasneva rauapuuduse kõrge levimus CKD-s (krooniline neeruhaigus) on häiritud raua homöostaasi tagajärg.⁹Tähelepanuta jäetud mehhanism rauakadu CKD- s (krooniline neeruhaigus) on proteinuuria, mis võib põhjustada transferriiniga seotud raua kuseteede kadu (kuni 0,3 mg/d), kui proteinuuria jõuab nefrootilisesse vahemikku.¹⁰Veel üks tegur, mis arvatakse, et see aitab kaasakehvveresusCKD-s (krooniline neeruhaigus) patsiendid on punaste vereliblede (RBC) lühenenud eluiga, mida esmakordselt kirjeldati >60 aastat tagasi.^6,11,12

Cistanche kasu: neeruhaiguse ravimine ja neerufunktsiooni parandamine

Hiljutine uuring, milles kasutati süsinikmonooksiidi hingamistesti, näitas, et RBC eluiga vähenes järk-järgult 120 päevalt 1. staadiumi CKD-ga patsientidel (krooniline neeruhaigus) kuni 60 päeva 5. staadiumi CKD-ga patsientidel (krooniline neeruhaigus).¹³Eelkõige allogeensete RBC-de ülekandmine tervetelt doonoritelt CKD-le (krooniline neeruhaigus) patsientidele järgnes ülekantud RBC-de kiire kliirens ilma hemolüüsi tõenditeta.¹²Selle vaatluse usutav mehhanism võib olla apoptoosilaadse rakusurma stimuleerimine anukleaatsetes RBC-des, mis tähistab vigastusmustrit, milles rakumembraani terviklikkust ei kahjustata ja tsütoplasma sisaldus jääb puutumata.¹⁴Rakusurma läbinud RBC-del esineb mitmesuguseid tsütoskeletaalsetest kahjustustest tulenevaid morfoloogilisi muutusi, nagu pinnaverejooksude moodustumine, membraani elastsuse kadumine ja/või rakuline dehüdratsioon.¹⁵Molekulaarsel tasandil on RBC surm seotud rakusisese Ca2þi kogunemisega, raku energia muutunud olekuga ja fosfolipiidse asümmeetria lagunemisega, mis viib lõpuks fosfatidülseriini (PS) välise plasmamembraani välismiseni.^15,16Selle tulemusena tunnevad makrofaagid ja spetsiaalsed dendriitrakud kiiresti ära PS-välised RBC-d, mis viib erütroosi fagotsütoosi ja nende katabolismini põrnas ja maksas.¹⁷Segase patofüsioloogia tõttuneeruhaigus–seostatudkehvveresusinimestel on lubatud loomkatsed, et täpselt kindlaks määrata soodustavad mehhanismid. Doksorubitsiini indutseeritud nefropaatia (DIN) 129S1/SvImJ hiirtel¹⁸ja indutseeritava podotsiinipuudusega hiired (Nphs2Dipod)¹⁹on 2 mudelit, mida iseloomustab nefrootilise ulatusega proteinuuria induktsioon mõne päeva jooksul, progresseerumine neerupuudulikkuseni 3 nädala pärast ja surm 6 kuni 7 nädala jooksul.^19–21Mõlemad hiiremudelid võtavad tõhusalt kokku inimese CKD kõik etapid (krooniline neeruhaigus). Käesolevas uuringus testisime, kas progresseeruv neerupuudulikkus nendel valkudega hiirtelneeruhaigusmõjutab RBC eluiga ja aitab kaasakehvveresus. Paralleelselt uurisime RBC fenotüüpi CKD-st saadud veres (krooniline neeruhaigus) nefrootilise valgusisaldusega patsiendid.

CKD (krooniline neeruhaigus) jaaneemia: CISTANCHE

MEETODID

Üksikasjalik teave materjalide ja meetodite kohta on esitatud täiendavates materjalides ja meetodites.

Hiireuuringud

Katsed viidi läbi mõlemast soost 8-nädalaste metsiku tüübiga 129S1/SvImJ hiirtega (Charles River). DIN-i indutseeris ühekordne doksorubitsiini (14,5 mg/g kehakaalu) süstimine, nagu eespool kirjeldatud.^18,22Doksorubitsiini müelotoksilise toime kontrollimiseks, mis ei olnud seotud nefropaatia arenguga, allutati samale raviprotokollile ka doksorubitsiinresistentsed C57BL/6 hiired.²³Lisaks viidi sarnaseid katseid läbi 8-nädalastel hiirtel, kellel oli indutseeritav podotsiini kustutamine (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G] 8Jhm*Tg[tetO-cre]1Jaw) või Nphs2Dipod hiirtel, keda raviti doksütsükliiniga 14 päeva.¹⁹Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt laboriloomade hooldamise ja kasutamise riiklikele terviseuuringute juhendile ja Saksamaa loomade heaolu seadusele kohalike omavalitsuste heakskiidul (Regierungspräsidium Tübingen, kinnitusnumbrid M12/17 ja M17/19G). Hiireuuringute eksperimentaalne disain on välja toodud täiendavas joonises S1.

Patsientidel

Patsiendiuuring viidi läbi kooskõlas Helsingi deklaratsiooniga ja selle kiitis heaks Tübingeni ülikooli haigla kohalik eetikakomitee (556/2018BO2). Liitium-hepariini vere- ja uriiniproovid saadi patsientidelt, kellel oli nefrotiline valgurikas ja säilitatud glomerulaarne filtreerimiskiirus (GFR; 1.–2. etapp; n 1/4 10) ning vähenenud GFR-iga (CKD) patsientidelt ( CKD )krooniline neeruhaigus) etapp 3–5; n 1/4 15) Tübingeni ülikooli haiglas. Kontrollrühmana andis tübingeni ülikooli haigla verepank vett vanuse ja sooga sobitatud tervetelt vabatahtlikelt (n 1/4 25). Kõik inimproovid koguti pärast informeeritud nõusolekut. Patsientide kliinilised omadused on välja toodudTabel 1.

Tabel 1 | CKD (krooniline neeruhaigus) patsientide ja tervete veredoonorite omadused

Voolutsütomeetria analüüsid

RBC rakusurma erinevad parameetrid määrati kindlaks kaastsütomeetriaga.¹⁴RBC eluea määramiseks in vivo süstiti 25 ml 5,6-karboksüfluorestseiini diatsetaat succinimidyl ester [5(6)-CFDA, SE] värvainet kontsentratsiooniga 9,96 mM (solubiliseeritud dimetüülsulfoksiidis) metsiku tüüpi 129S1/SvImJ retroorbitaalsesse plexusesse ja doksorubitsiini süstitud hiirtesse, nagu eespool kirjeldatud.24 Näidatud ajahetkedel tõmmati hiirte retroorbiidilisest pleksusest verd, ja 5(6)-CFDA, SEþ rakkude protsent tuvastati tsütomeetria analüüsi abil. Lõpuks analüüsiti andmeid FlowJo tarkvara (FlowJo LLC) abil.

RBC deformatsioon ja osmootne gradient ektatsütomeetria

RBC deformeeritavust mõõdeti laseriga optilise pöörlemisraku analüsaatoriga (LORCA Max Sis; RR Mehhatroonika), mida on üksikasjalikult kirjeldatud mujal.²⁵Osmootse gradient ektatsütomeetria (kosmos võib) analüüse tehti ka LORCA Max Sis abil ja mõõdeti deformatsiooni erinevates osmootsetes tingimustes.²⁶

Histoloogiline uurimine

Hematoksüliini ja eosiini värvimiseks värviti spleens ja reieluud hematoksüliini ja eosiiniga. Kõik slaidid värviti primaarse antikehaga Ter119 (BD Pharmingen; lahjendus 1:500). Perioodiliseks happe-Schiffi värvimiseks on 2,5 mm paksused viiludNeerudvärviti perioodilise happe-Schiffi reaktiivi (Carl Roth) ja hematoksüliiniga (Abcam). May-Grünwald-Giemsa värvimine (Pappenheimi meetod) viidi läbi RBC kuju muutuste määramiseks, nagu eespool kirjeldatud.²⁷Glomeruli isoleerimine toimus biotinülatsiooni lähenemisviisi ja rakkude sorteerimise abil.¹⁹Podotsiini valkude avastamiseks kasutati Sigma antikeha (P0372).¹⁹Roti-Mount Fluor Care 4,6-diamidino-2-fenüülindool (DAPI; Carl Rothi) kasutati tuumade värvimiseks.

Ülikõrge jõudlusega vedelkromatograafia-massispektromeetria metabolomeetria metaboloomika hiire RBC-dest

Analüüsid tehti nii, nagu varem avaldatud.²⁸Lühidalt öeldes kasutab analüütiline platvorm Vanquishi ülikõrge jõudlusega vedela kromatograafia süsteemi (Thermo Fisher Scientific), mis on ühendatud veebis Q Exactive massispektromeetriga (Thermo Fisher Scientific).

Cistanche ravib aneemiast põhjustatud neeruhaigust

Statistilised analüüsid

Andmed esitatakse aritmeetikana tähendab SEM-i või kvartiilidevahelise vahemikuga mediaanina (25.–75. protsentiil), kusjuures n tähistab vastavalt kasutatud loomade või kaasatud patsientide arvu. Andmeid testiti normaalsuse suhtes Kolmogorovi-Smirnovi testi, D'Agostino testi ja Shapiro-Wilki testiga. Dispersioonid analüüsiti Bartletti testiga võrdsete erinevuste suhtes. Tukey või Dunn multiple-comparison posttest, paaritu Student t-test või Mann-Whitney U test viidi läbi GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). P< 0.05="" with="" 2-="" tailed="" testing="" was="" considered="" statistically="" significant.="" additional="" graphs="" were="" plotted="" through="" graphpad="" prism="">

TULEMUSED

Eksperimentaalne valkjas neeruhaigus indutseeribkehvveresushiirtel Pärast induktsioone tekkis 129S1/SvImJ hiirtel DIN ja Nphs2Dipod hiirtega nefrootilise ulatusega proteinuuria (joonis 1a ja täiendav joonis S2C) ning progresseeruv neerupuudulikkus, mida iseloomustab kõrge plasma karbamiidi tase alates 20. päevast (joonis 1b ja täiendav joonis S2D). Esimese 10 päeva jooksul kogesid hiired astsiidiga kehakaalu tõusu (joonis 1c ja täiendav joonis S2E), mis peegeldas seriini proteaaside või proteinuuria eritumisest põhjustatud naatriumipeetust.¹⁸Pärast naatriumipeetuse spontaanset pöördumist kaotasid need hiired pidevalt kaalu. DIN-ga hiirtel ja hiirtel Nphs2Dipod näitasid 10 päeva pärast jäädvustatud kerged mikroskoopia pildid tüüpilisi histomorfoloogilisi muutusi, mis on kooskõlas fokaalse segmentaalse glomerulaarse skleroosiga (joonis 1d ja täiendav joonis S2B). Need puudusid doksorubitsiini süstitud C57BL/6 hiirtel (joonis 1d). Doksorubitsiinravi põhjustas hemoglobiini, RBC arvu ja hematokriti (joonis 1e–g) tugeva languse alates 10. päevast alates 129S1/SvImJ ja C57BL/6 hiirtel, mis viimastel normaliseerusid 20. ja 30. päeval. Seevastu 20. ja 30. päeval arenesid doksorubitsiini süstitud 129S1/SvImJ ja podotsiini puudulikkusega hiired progresseeruvakskehvveresus, mida iseloomustab vähenenud keskmine korpuskulaarne maht (joonis 1h) ja vähenenud hemoglobiin (täiendav joonis S2F), mis viitab sellele, etkehvveresuson seotud progresseeruva neerupuudulikkusega, mitte doksorubitsiini raviga.

Joonis 1 | Neerufunktsioon ja avalik aneemia doksorubitsiini süstitud 129S1/SvImJ hiirtel.a–d) Doksorubitsiin-süstitud 129S1/SvImJ hiirtel tekkis a) kõrge proteinuuria, b) plasma karbamiidi kontsentratsiooni järkjärguline suurenemine, c) mööduv kehakaalu tõus ja d) tüüpilised histomorfoloogilised muutused, mis viitavad fokaalsegmendilisele glomerulaarsele skleroosile 10. päeval (perioodiline happe-schiffi värvimine; bar 1/4 10 mm). (e–h) Lisaks arenesid need hiiredkehvveresusreflflected poolt (e) vähenenud hemoglobiini tase, (f) madalam punaste vereliblede (RBC) numbrid, (g) vähenenud hematokriti tase ja (h) vähenenud keskmine korpuskulaarne maht. a–d) Doksopitsiini süstitud C57BL/6 hiirtel ei olnud mingeid märke neerukahjustusest ja (nt)kehvveresus10. päeval normaliseerus 20. ja 30. päeval. Aritmeetika tähendab, et näidatakse SEM-i. *P< 0.05,="" **p="">< 0.01,="">< 0.001,and="" ****p="">< 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" #p=""><0.05, ##p="">< 0.01,="" ###p="">< 0.001,="" and="" ####p="">< 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" to="" the="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="">< 0.05,="" §§p="">< 0.01,="" §§§p="">< 0.001,="" and="" §§§§p="">< 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="">

Eksperimentaalse proteiinse neeruhaiguse aneemia ei ole põhjustatud erütropoeeside kahjustamisest

Mõlemad aneemilised hiiremudelid näitasid ringlevate retikulotsüütide osakaalu märkimisväärset suurenemist (joonis 2a ja täiendav joonis S3C). Plasma EPO kontsentratsioonid suurenesid dramaatiliselt 10. päeval 129S1/SvImJ-l din ja tervete C57BL/6 hiirtega, kuid normaliseerusid uuesti 20. ja 30. päeval (joonis 2b). Podotsiini puudulikkusega hiirtel suurenesid EPO plasma EPO kontsentratsioonid 10. päeval ja suurenesid 20. ja 30. päeval (täiendav joonis S2H). Luuüdi ja põrna histoloogilistes analüüsides suurenes erütroidsete lähterakkude arv müeloidsete lähteainetega võrreldes 30. päeval (joonis 2d–g), osutades stimuleeritud erütropoeeesile aneemilistel 129S1/SvImJ hiirtel DIN-ga.

Joonis 2 | Erütropoeeesi stimuleeritakse doksorubitsiini süstitud 129S1/SvImJ aneemiaga hiirtel.a)Kehvveresusdoksorubitsiini süstitud 129S1/SvImJ hiirtel esines vaatamata retikulotsüütide arvu suurenemisele 20. ja 30. päeval. b) Plasma erütropoetiini kontsentratsioon suurenes 10. päeval väga doksorubitsiini süstitud 129S1/SvImJ ja C57BL/6 hiirtel, kuid normaliseerus uuesti 20. ja 30. päeval. c–e) C) müeloidsete ja d) erütroidrakkude absoluutarvude kvantifitseerimine luuüdis. Müeloidsete ja erütroidrakkude suhe tervetes ja doksorubitsiini süstitud 129S1/SvImJ hiirtes luuüdis näitas suuremat erütroidsete lähterakkude arvu doksorbitsiini süstitud 129S1/SvImJ hiirtel 30. päeval. (f,g) f) põrn ja g) luuüdi histoloogia näitasid erütroidide lähterakkude suurenemist, mida täheldati isegi madalamate suurenduste korral doksorubitsiini süstitud 129S1/SvImJ hiirtel (paremal paneelil) võrreldes tervete hiirtega (vasakpoolsed paneelid) 30. päeval. (f,g) Ter119 immunohistochemistry (alumised paneelid) toetas hematoksüliini ja eosiini (H&E) leide. Ter119 on positiivne erütroidsetes lähteainetes (nukleated cells) ja punastes verelibledes (mittenukleated rakud). Baar 1/4 100 mm; komplektid 1/4 25 mm. Aritmeetika tähendab, et näidatakse SEM-i. *P< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" and="" ***p="">< 0.001="" indicate="" significant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" ##p="">< 0.01="" and="" ####p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" to="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="">< 0.05,="" §§p="">< 0.01,="" and="" §§§§p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="">

KasuCistanche: neeruhaiguse ravimine ja neerufunktsiooni parandamine

Vähenenud RBC eluiga on aneemia peamine põhjus eksperimentaalses proteorilises neeruhaiguses

PS välistamine RBC plasmamembraani välisvoldikul on rakusurma näitaja ja erütro fagotsütoosi soodustaja.¹⁴RBC-rakkude surm kvantifitseeriti V-seotud pinna PS fluorestsents-aktiveeritud rakkude sorteerimise analüüside abil.¹⁴Värskelt rebenenud veres oli 20. päeval DIN-ga hiirtel PS-d paljastavate rakkude osakaal >4 korda suurem (4,16% ja 0,86%) võrreldes tervete hiirtega (1,00% ja 0,11%) (joonis 3a). Samamoodi näitasid Nphs2Dipodi hiired ps-kiirguse ligikaudu 2-kordset suurenemist (1,27% ja 0,20%) võrreldes tervete hiirtega (0,58% ja 0,05%) 30. päeval (täiendav joonis S3A). On teada, et RBC-d kõrvaldatakse ringlusest põrnas elavate makrofaagide poolt.17 See tähelepanek võib seega selgitada Nphs2Dipod hiirte (täiendav joonis S2G) suuremat põrna ja kehakaalu suhet, kus RBC-d lagunevad kaks korda rohkem kui terved C57BL/6 hiired. Kuna nefrootilise ulatusega proteinuuria põhjustab düsproteineemiat,29 uurisime täiendavalt, kas suurenenud RBC-rakkude surma võib stimuleerida DIN-ga hiirte plasma komponent. Nagu on kujutatud joonisel 3b, oli PS kokkupuude 10. ja 20. päeval inkubatsiooni järel kaks korda suurem (30 minutit 37. minutil)^OC) tervetest RBC-dest doksorubitsiini süstitud 129S1/ SvImJ hiirte plasmas võrreldes tervete hiirte plasma inkubeerimisega. Ca2þi sissevool RBC-desse, mida vahendavad pingega väravaga ja pingest sõltumatud mitteselektiivsed katioonikanalid,^30,31on RBC rakusurma üks peamisi reguleerijaid. 20. ja 30. päeval DIN-iga hiirtelt 20. ja 30. päeval kogutud RBC-des suurenes rakusisene Ca2þi kontsentratsioon (joonis 3c); see nähtus recapitulated Nphs2Dipod hiirtel 20. päeval (täiendav joonis S3B). Mõlemas hiiremudelis oli PS-positiivsete RBC-de protsendi märkimisväärne negatiivne korrelatsioon, mille raskusaste olikehvveresushemoglobiinisisalduses (joonis 3d ja täiendav joonis S3D). Lisaks oli märkimisväärne seos neerukahjustusega, mis kajastus plasma karbamiidi kontsentratsioonis (joonis 3e ja täiendav joonis S3E) ning vähemal määral proteinuuriaga (joonis 3f ja täiendav joonis S3F). RBC kahjumi kompenseerimisekskehvveresus, stimuleeriti uute pöördtrummelahjude moodustumist mõlemal hiirel, mida näitas tsirkuleerivate retikulotsüütide suurenenud protsent, ning see oli märkimisväärselt korrelatsioonis RBC-sid paljastavate polüesterstaabide ulatusega (joonis 3g ja täiendav joonis S3G).

Joonis 3 | Hiirtel, kellel on doksorubitsiinist põhjustatud nefropaatia, tekib suurenenud punaste vereliblede (RBC) surm, mida vahendab rakusisese kaltsiumi taseme tõus.a) Fosfatidüülseriini (PS) välistamist, mis kajastab RBC surma, suurendati 20. ja 30. päeval pärast doksorubitsiinist põhjustatud nefropaatia esilekutsumist. b) Tervete RBC-de inkubeerimine plasmas, mis on võetud 10. ja 20. päeval nendest hiirtest, viis PS-välistuseni. c) PS välismõjuga kaasnes suurenenud rakusisene RBC-de kaltsiumisisaldus, mis võeti 20. ja 30. päeval pärast induktsiooni. (d–g) PS-d paljastavate RBC-de protsent oli korrelatsioonis hemoglobiini tasemega, neerukahjustusega, mida näitas e) plasma karbamiidi kontsentratsioon ja f) proteinuuria, samuti (g) retikulotsüütide moodustumisega. (d–g) Andmed hõlmavad iga terve 129S1/SvImJ ja 129S1/SvImJ ja 129S1/SvImJ hiire iga ajapunkti (0, 10, 20 ja 30 päeva) doksorubitsiini poolt indutseeritud nefropaatiaga. Aritmeetika tähendab, et näidatakse SEM-i. **P< 0.01,="" ***p="">< 0.001,="" and="" ****p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" (in.)="" 129s1/svimj="" mice;="" #p="">< 0.05,="" ##p="">< 0.01,="" and="" ####p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" to="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §§§§p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="" creatinine;="" mfi,="" mean="" fluorescence="">

KasuCistanche: neeruhaiguse ravimine ja neerufunktsiooni parandamine

KLÕPSAKE SIIN II OSANI.