Olles tuvastanud tõsiasja, et ouabaini senolüütiline toime sõltub rakutüübist

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Ouabaiini põhjustatud K * / Nat homöostaasi häired põhjustavad erinevaid füsioloogilisi reaktsioone kontroll- ja vananevates A549 ja END-MSC-des

Olles tuvastanud tõsiasja, et ouabaiini senolüütiline toime on rakutüübist sõltuv, püüdsime edasi selgitada, mis võib olla aluseks hMSC-de ja A549 vastuste ilmnenud erinevustele. Selleks analüüsisime END-MSC-de ja etoposiidi oksüdatiivse stressi põhjustatud vananemist. -indutseeritud A549 vananemine täpsemalt.künomooriumi eelisedErinevate südameglükosiidide peamine molekulaarne toimemehhanism on Nat/K pluss -ATPaas [44]. Nat/K pluss -ATPaas on plasmamembraani ensüüm, mis pumpab naatriumi rakust välja, pumbates samal ajal rakku kaaliumi kontsentratsioonigradientide vastu. ja osaleb seega K pluss ja Na plus homöostaasi säilitamises. Seetõttu küsisime, kas kahte tüüpi kontroll- ja vananevate rakkude vahel võib esineda erinevusi basaal- ja ouabaiini poolt indutseeritud ioonide homöostaasis.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Ouabaiini põhjustatud K pluss ja Na plus homöostaasi häired peaksid lõpuks viima plasmamembraani potentsiaali hajumiseni. Seega kasutasime mitteerututavate rakkude transmembraanse potentsiaali mõõtmiseks spetsiifilist fluorestsentssondi DiBAC4 (3). Selle värvaine suurenenud fluorestsents peegeldab membraani depolarisatsiooni.kõrbehüatsintIgas testitud rakutüübis kutsus ouabaiin esile ennustatava membraani depolarisatsiooni, mis kinnitas ioonide tasakaalustamatust (joonis 10a). Eelkõige täheldasime kontroll- ja vananevates END-MSC-des võrreldavat membraani depolarisatsiooni taset, samas kui vananevat A549 iseloomustas oluliselt rohkem depolariseeritud membraan võrreldes A549 kontrollrakkudega.

Teised ioonse dereguleerimise olulised tagajärjed on mitokondriaalse membraani potentsiaali (MP) muutused.

Seega, kasutades fluorestsentssondi JC-1, hindasime ouabaiiniga töötlemisel kontroll- ja vananevates rakkudes MMP-d. Eraldi tuleks rõhutada, et vananevaid rakke iseloomustab tavaliselt vähenenud MMP, mis peegeldab mitokondrite talitlushäireid, energia metabolismi muutusi ja rakusiseste reaktiivsete hapnikuliikide taseme tõusu [45]. Nagu oodatud, oli MMP vananevates END-MSC-des ja A549 rakkudes madalam kui kontrollrakkudes,

kuigi see langus ei mõjutanud vananevate rakkude elujõulisust (joonised Id, 6a, 10b).flavonoidide ekstraheerimise meetod pdfSarnaselt ülaltoodud tulemustele indutseeris ouabaiin väljendunud MMP depolarisatsiooni vananevas A549-s võrreldes nende prolifereeruvate kolleegidega, samas kui kontroll- ja vananevate END-MSC-de mõju MMP-le oli minimaalne (joonis 10b). Selles osas kirjeldatud tulemuste kokkuvõttes võime järeldada, et Na plus / K pluss -ATPaasi blokeerimine ouabaiini poolt põhjustab plasmamembraani dramaatilist depolarisatsiooni ja MMP langust vananeva A549 korral, vastupidiselt vananevale END-MSCS-ile.

Muutused K pluss impordi mehhanismides vahendavad vananevate END-MSC-de ouabaiiniresistentsust

Et selgitada mehhanisme, mis vahendavad ouabaiinist põhjustatud muutusi membraani polarisatsioonis ja MMP-s vananevate A549 ja END-MSC-de vahel, kasutasime täiustatud bioinformaatilist lähenemisviisi. Analüüsi eesmärk oli paljastada võimalikud transkriptoomilised tunnused, mis vahendavad rakutüübist sõltuvat ouabaiini resistentsust või vananevate rakkude tundlikkust. Teisisõnu esitasime küsimuse: kuidas END-MSC-de (ouabaiini suhtes resistentsed rakud) vananemine erineb A549 (ouabaiini suhtes tundlikud rakud) vananemisest? Sellele küsimusele vastamiseks kasutasime kolme sõltumatut RNA sekveneerimise (RNA-Seq) andmekogumit. Esimene oli RNA-Seq analüüs

Joonis 6 Etoposiidist indutseeritud A549 vananemismudeli valideerimine. Vananevatel A549 rakkudel on võrreldes kontrollrakkudega proliferatsiooni kadu, suurenenud raku suurus, c autofluorestsentsi tase ja d SA-b-Gal aktiivsus. e P53 ja Rb fosforüülimise tasemed ning p21 ja HMGBI valkude ekspressioonitasemed kontroll- ja vananevas A549-s. Esitatud väärtused on keskmised ± SD. Mitme rühma puhul kasutati ühesuunalise ANOVA võrdlusi, n=3, ns ei ole oluline,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c,="" and="" d="" welch's="" test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001.>flavonoididKujutiste skaalaribad on 500 μm. GAPDH-d kasutati meie poolt teostatud kontroll- ja vananevate END-MSC-de laadimiskontrollina. Teine oli GEO-st alla laaditud kontroll- ja vananeva A549 andmekogum [43]. Pange tähele, et vananemist indutseerivad tingimused langesid kokku käesolevas uuringus ja südameglükosiidide poolt indutseeritud senolüüsi pilootuuringutes rakendatud tingimustega. Ja kolmas andmestik oli kontroll- ja vananeva IMR-90 jaoks, mis saadi otse südameglükosiide kui senolüütiliste ühendite uuringust [25]. Oluline on see, et IMR-90 osutus altid ouabaiinist põhjustatud analüüsile. Tuleb märkida, et ainult kahe END-MSC ja A549 jaoks olulise andmestiku võrdlemine tooks lõpuks kaasa ebaõiged tulemused, kuna sellises analüüsis oleks END-MSC ja A549 vananemisprotsessi vahel otsitav erinevus eristamatu nende poolt vahendatud variatsioonidest. mitmekesised tehnilised partiiefektid (st sekveneerimismasina tüüp, proovi töötingimused). Partiiefektide minimeerimiseks võrdlesime üht andmekogumit ouabaiini suhtes resistentsete rakkude (END-MSC) ja kahte ouabaiini suhtes tundlike rakkude (A549, IMR-90) jaoks. Täiendava võrdleva analüüsi asjakohasuse kinnitamiseks teostasime GO terminiga "raku vananemine" (GO 0090398) seotud geenide alamhulga põhikomponentide analüüsi, tuginedes kokkuvõtlikule andmekogumile, mis sisaldas kõigi kolme kirjeldatud katse proove. Tõepoolest, iga rakutüübi proovid rühmitati kahte eraldi rühma - kontroll- ja vananevatesse rühmadesse (joonis 10d).

cistanche võib vananemisvastane

Ouabaiini suhtes resistentsete ja tundlike rakkude vananemise ajal erinevalt ekspresseeritud geenide (DEG) analüüsimiseks koostasime statistilise mudeli, mis võttis kokku kaks ennustajat ja nende koostoime. Analüüsi skemaatiline esitlus on näidatud joonisel 10c. Lühidalt, mudeli esimene ennustaja jagas kõik proovid kontrolli ja vananemise alarühmade kaupa, teine ​​ouabaiini resistentsuse või ouabaiini tundlikkuse järgi ja mudeli viimane komponent peegeldas mõlema ennustaja koostoime. Viimase muutuja diferentsiaalekspressiooni testimise tulemus on esitatud täiendavas tabelis 1.

Seejärel viisime läbi geenikomplekti rikastamise analüüsi (GSEA) bioloogiliste protsesside (BP) geeniontoloogia (GO) terminites (täiendav tabel 2). Märkimisväärselt rikastatud protsesside hulgas leidsime, et kaaliumiioonide import ja katioonide transmembraanse transpordi positiivne regulatsioon on ouabaiini suhtes resistentsete END-MSC-de vananemise ajal ülesreguleeritud võrreldes ouabaiini suhtes tundlike rakkude vananemisega (joonis 10e). ). Nende protsessidega seotud põhiliste rikastamisgeenide loendid hõlmasid KCNJ2, KCNJ14, KCNJ8, SLC12A7, SLC12A8, WNK4, mis olid vananevates END-MSC-des oluliselt ülesreguleeritud (joonis 10f). KCNJ geenide poolt kodeeritud valgud on sissepoole suunatud alaldi tüüpi kaaliumikanalid, millel on suurem kalduvus võimaldada kaaliumil voolata pigem rakku kui rakust välja.hesperidiini kasutamineSLC12 katiooniga ühendatud kloriidi transporterite perekond. WNK4 geen kodeerib seriini / treoniini kinaasi, mis toimib naatriumiga seotud kloriidi kaastransporterite aktivaatorina ja kaaliumiga seotud kloriidi kotransporterite inhibiitorina. Need leiud koos võimaldasid oletada, et vananevad END-MSC-d suudavad taastada ammendunud intratsellulaarse K pluss tasemed tõhusamalt kui vananevad A549 rakud ja saavad seega hakkama ouabaiinist põhjustatud ioonide tasakaalustamatusega.

Vananevate END-MSC-de ekraan on kõrgendatud

apoptoosiresistentsus võrreldes kontrollrühmadega, samas kui vananev A549 mitte

Intratsellulaarse K plusi roll rakusurma reguleerimisel on hästi teada [46]. Ilmunud erinevused vananevate END-MSC-de ja A549 rakkude vahel võimes säilitada rakusisest K pluss homöostaasi ajendasid meid võrdlema mõlema rakutüübi vananemise ajal omandatud üldist stressiresistentsust. On teada, et eksogeensete pingetega kaasneb ioonse homöostaasi häire, mis põhjustab erinevate ioonide, sealhulgas K plussi, kiiret vahetust raku ja selle keskkonna vahel [46]. Stressi tekitavate mõjude tagajärjed sõltuvad suuresti rakkude võimest taastada sobiv rakusisene ioonide tasakaal. Nagu on näidatud joonistel 10e, f, kaasnes END-MSC-de vananemisega K pluss impordi ülesreguleerimine, mis viitab sellele, et

Joonis 10 Ouabaiini suhtes resistentsed vananevad END-MSC-d on võimelised taastama ouabaiini poolt põhjustatud K plus/Nat homöostaasi häireid tõhusa K pluss impordi kaudu, samas kui ouabaiini suhtes tundlikel vananevatel rakkudel see võime puudub. a Kontroll- ja vananevate END-MSC-de ja A549 rakkude membraanipotentsiaali määramine enne ja 24 tundi pärast ouabaiiniga töötlemist, kasutades fluorestsentssondi DiBAC4 (3). b Kontroll- ja vananevate END-MSC-de ja A549 rakkude mitokondriaalse membraani potentsiaali hindamine enne ja 24 tundi pärast ouabaiiniga töötlemist, kasutades fluorestsentssondi JC-1. c Kolme sõltumatu RNA-Seq andmestiku võrdleva bioinformaatilise analüüsi kavandamine.d Põhikomponentide analüüs GO terminiga "raku vananemine" (GO 0090398) seotud geenide alamhulga jaoks, mis põhineb kolme sõltumatu RNA-Seq andmekogumi kombineeritud andmetel. . e GSEA tulemused erinevalt ekspresseeritud geenide kohta ouabaiini vahendatud analüüsi (END-MSC) suhtes resistentsete rakkude ja ouabaiini vahendatud analüüsi suhtes tundlike rakkude (A549 ja IMR-90) vahel katioonide transmembraanse transpordi positiivse reguleerimise kohta ja „Kaaliumioonid impordivad bioloogilisi protsesse. f Soojuskaart, mis kajastab tuumade rikastamise geene "katioonide transmembraanse transpordi positiivse reguleerimise" ja "kaaliumioonide impordi" bioloogiliste protsesside jaoks. Väärtused on keskmised±SD. Statistilist olulisust hinnati Studenti t-testiga: ns ei ole oluline,*lk<><><>

vananemise areng END-MSC-d suurendavad nende võimet taastada K pluss tasemeid. Huvitaval kombel ei suutnud me avaldada sarnast tendentsi A549 vananemise suhtes, seega ei tundunud A549 omandavat vananemise progresseerumise ajal mingeid spetsiifilisi omadusi, mis on seotud K * impordiga. Kirjanduslike andmete kohaselt soodustab stressist põhjustatud intratsellulaarse K* vähenemine ja võimetus selle taset taastada kaspaaside ja nukleaaside aktiveerumist ning seega peetakse seda proapoptootiliseks teguriks [46].

Kooskõlas selle soovitusega näitasime ülaltoodud RNA-seq andmekogumite bioinformaatilist analüüsi kasutades END-MSC-de vananemise ajal apoptoosiga seotud protsesside olulist allareguleerimist võrreldes A549 ja IMR-ga-90 (joonis lla) . Veelgi enam, A549 ja IMR-90 vananemist iseloomustab proapoptootiliste geenide, sealhulgas BAD, BAX, BOK, BAK-1 ja NOXA oluline ülesreguleerimine (joonis 11b). Need andmed näitavad, et END-MSC-d omandavad vananemise ajal apoptoosikindla fenotüübi, samas kui vananevad IMR-90 ja A549 muutusid apoptoosile kalduvaks (joonis 11b). Selle tähelepaneku tugevdamiseks analüüsisime täiendavalt mikrokiibi andmekogumit kontrolli ja replikatiivsete vananevate AD-MSC-de jaoks, mis säilitasid ka vananemise ajal ouabaiini resistentsuse, nagu ülal näidatud (joonis 4g). Apoptoosiga seotud geenide ekspressioonitasemete analüüsimisel täheldasime vananevate AD-MSC-de erinevat apoptoosikindlat fenotüüpi, mis sarnanes vananevate END-MSC-de omaga (täiendav joonis S8a, b).

Transkriptoomilise analüüsi tulemuste kontrollimiseks hindasime RT-PCR abil apoptoosi ja K pluss impordiga seotud geenide ekspressioonitasemeid mõlemat tüüpi vananevates rakkudes - END-MSC-des ja A549-s (täiendav joonis S9). Lisaks analüüsisime sama geeniloendi ekspressiooni, kasutades teisi ouabaiiniresistentseid ja ouabaiinitundlikke rakulisi mudeleid, doksorubitsiiniga töödeldud vananevaid DP-MSC-sid ja etoposiidiga töödeldud vananevaid SK-Help (täiendav joonis S9). Nagu on näidatud täiendaval joonisel S9, näitasid mõlemat tüüpi ouabaiiniresistentsed rakud vananevad END-MSC-d ja DP-MSC-d sarnaseid geeniekspressiooni mustreid, täpsemalt KCNJ2, SLC12A ja WNK4, mis osalevad K pluss taastamises, olid ülesreguleeritud, proapoptootiline BAX oli alareguleeritud, samas kui antiapoptootiline MCL-I oli ülesreguleeritud. Veelgi enam, samade geenide ekspressioonimuster erines ouabaiinitundliku A549 ja SK-Hep1 puhul täheldatust. Need tulemused kinnitavad meie transkriptoomilisi andmeid ja kinnitavad järeldust erinevate rakutüüpide vananemise ajal omandatud erinevate apoptoosiprofiilide kohta.

Järgmisena testisime, kas täheldatud erinevused apoptoosi taustal END-MSC-de ja A549 vananemise ajal võivad mõjutada vananevate rakkude üldist stressiresistentsust. Selleks hindasime rakkude elujõulisust oksüdatiivse stressi ja staurosporiini korral, mida tavaliselt kasutatakse apoptoosi esilekutsumiseks. Tõepoolest, vananevad END-MSC-d osutusid mõlemale pingele oluliselt vastupidavamaks võrreldes nende kontrollkaaslastega (joonis 1lc). Seevastu A549 rakud näitasid vastupidist olukorda, kuna vananevad rakud kaldusid olema tundlikumad stressist põhjustatud rakusurma suhtes (joonis 11d). See tähelepanek nihutab olemasolevat paradigmat, et suurenenud surmakindlus on mis tahes tüüpi vananevate rakkude ühine tunnus, mis näitab selle ilmset rakuspetsiifilisust.

Ülaltoodud andmete põhjal eeldasime, et vananevate END-MSC-de apoptoosi "kaitse" vähendamine peaks looma edasiseks analüüsiks soodsad tingimused. Sellega seoses keskendusime BCL-2 perekonna valkude tuntud antiapoptootilisele liikmele – MCL-1, kuna selle ekspressioon oli apoptoosi suhtes resistentsetes vananevates END-MSC-des ülesreguleeritud (joonis 1lb ja täiendav joonis 1). S9a). Selleks eeltöötlesime kontroll- ja vananevaid END-MSC-sid spetsiifilise MCL-1 inhibiitoriga A-1210477 ja seejärel rakendasime analüüsi esilekutsumiseks südameglükosiide. Pange tähele, et A-1210477 ise ei mõjutanud kontrollrakkude proliferatsioonivõimet ega vananevate rakkude elujõulisust, nagu on näidatud kasvukõveratel (joonis 1le). Hilisem südameglükosiidide kasutamine viis elujõuliste rakkude arvu vähenemiseni, kuid see mõju oli vananevates ESC-des tugevam (joonis 11f). Seetõttu soodustas MCL-1 inhibeerimine A-1210477-ga vananevaid ESC-sid ouabaiinist põhjustatud surma suunas, mis viitab analüüsile. Viimased tõendid END-MSC-de vananemise ajal omandatud apoptoosiresistentsuse kohta on sisemine barjäär südameglükosiidide poolt käivitatud tõhusa analüüsi jaoks.

Arutelu

Käesolevas uuringus testisime südameglükosiidide, nimelt ouabaiini ja bufaliini, senolüütilist toimet hMSC-dele. Hiljuti tuvastati mõlemal ühendil selektiivne tsütotoksiline toime erineva päritoluga vananemisrakkudele (onkogeen-/teraapia-indutseeritud vananemismudelid), sealhulgas primaarsed rakud IMR-90, HUVEC, ARPE-19, T/ C-28 ja vähirakud SK-Help,A549,SK-Mel-5,MCF7,HCT116, HaCat,H1299,U373-MG,H1755[25,26]. Ootamatult ei suutnud avaldada ouabaiini ega bufaliini eelistatavat tsütotoksilist toimet vananevatele END-MSC-dele võrreldes kontrollrühmaga. Oluline on see, et analüüsi puudumist kontrolliti rasvkoest, hambapulbist ja Wartoni želeest saadud hMSC-de ning erinevate vananemismudelite abil. Viimane viis meid ettepanekuni, et hMSC-de ühine tunnus võib olla resistentsus südameglükosiidide poolt indutseeritud analüüsi suhtes. Samal ajal suutsime indutseerida apoptoosi eelistatavalt vananeva A549 ja SK-Help puhul, taasesitades sellega asjakohastes artiklites kirjeldatud südameglükosiidide senolüütilist toimet [25, 26]. Kuna saadaval on rakud, mis on resistentsed ja tundlikud ouabaiini poolt indutseeritud analüüsi (ouabaiini suhtes resistentne / ouabaiini suhtes tundlik), siis püüdsime selgitada selle erinevuse aluseks olevaid põhilisi põhjuseid. Südameglükosiidide toime ühine molekulaarne mehhanism on seondumine Nat/K pluss -ATPaasiga ja selle aktiivsuse blokeerimine. ATP hüdrolüüsimisega tagab see ensüüm Na plusi väljapumpamise rakust ja K plusi rakkudesse importimise ning seeläbi füsioloogilise elektrokeemilise gradiendi, ioonse homöostaasi, raku pH ja raku mahu säilitamise, mis on rakkude ellujäämiseks ja funktsioneerimiseks olulised [47]. Seetõttu oletasime, et ouabaiini senolüütiline võime võib sõltuda K pluss / Nat tasakaalustamatuse tõsidusest töödeldud rakkudes. Kooskõlas selle soovitusega avastasime, et ouabaiin kutsus esile plasmamembraani selgema depolarisatsiooni ja MMP languse ouabaiini suhtes tundlikus vananevas A549-s.

Üldiselt näidati, et Nat/K pluss -ATPaasi inhibeeriv mõju rakkude ellujäämisele on rakutüübispetsiifiline. Näiteks näidati, et ouabaiin võimendab apoptoosi lümfotsüütides, Jurkati rakkudes ja koerte epiteelirakkudes, samas kui see ei suutnud sarnasele modulatsioonile vaatamata indutseerida roti aordi epiteelirakkudes, roti ajugraanulirakkudes ja sea neeru proksimaalsetes tubulaarsetes LLC-PK1 lümfotsüütides surma. katioonsuhtest [48-54]. Üks proapoptootilise ouabaiini toime kavandatud mehhanismidest on intratsellulaarse ammendumine, mis soodustab apoptootilist kahanemist, kaspaaside aktiveerimist ja apoptootilise programmeerimise algatamist [46, 47]. Arvestades võrreldavat K pluss kadu, kuid vastupidist mõju surma esilekutsumisele, mis saadi ouabaiiniresistentsete ja ouabaiini suhtes tundlike mudelite puhul, pakkusime välja erinevused katioonide kompensatsioonisüsteemides. Intratsellulaarse K pluss taseme langus peaks sisuliselt viima K pluss impordi aktiveerimiseni ekstratsellulaarsest ruumist, et kompenseerida selle katiooni puudumist. Seetõttu võib K pluss taastamise efektiivsus olla ouabaiini ravi korral apoptoosi eelsoodumuse aluseks. Selle soovituse testimiseks kasutasime kompleksset bioinformaatilist analüüsi, milles võrreldi transkriptoomiliste signatuuride muutusi ouabaiini suhtes resistentsete rakkude (END-MSC) ja ouabaiini suhtes tundlike rakkude (A549 ja IMR{13}}) vananemise ajal. END-MSC-de vananemise ajal täheldasime kaaliumiioonide impordiga seotud protsesside tugevat ülesreguleerimist, samas kui oua-bain-tundliku A549 ja IMR{18}} vananemise ajal jäid need protsessid muutumatuks või isegi vähenesid. Selle põhjal võime oletada, et vananevad END-MSC-d saavad tõhusalt toime tulla ouabaiini poolt indutseeritud K pluss kahanemisega aktiivsete katioonide importimise süsteemide kaudu, mis takistab apoptoosi esilekutsumist. Vastupidi, meie voolutundlikud vananevad A549 ja IMR{24}} näivad olevat vähem võimelised ületama K pluss kaotust ja on seega apoptoosile vastuvõtlikud. Selle eelduse kasuks kutsus ouabaiin esile plasma ja mitokondriaalsete membraanide olulisema depolarisatsiooni vananevad A549 rakud, mis näitavad selgelt väljendunud ioonide tasakaalustamatust, mis on tüüpiline surevate rakkude jaoks.

Selle asemel, et olla ouabaiinist põhjustatud apoptoosi ainulaadne omadus, on intratsellulaarse K pluss sisalduse langus tõenäoliselt mitmesuguste stresside (nt staurosporiinravi ja oksüdatiivne stress) põhjustatud apoptootilise surma ühine tunnus [46]. Sellest tulenevalt peaks vananeva A549 vähenenud võime taastada tsütoplasmaatilist K plussi lõppkokkuvõttes viima üldise stressiresistentsuse vähenemiseni. See arusaam on aga vastuolus rakkude vananemise kaasaegse definitsiooniga, mis väidab, et vananevad rakud on apoptoosi suhtes väga vastupidavad [16]. Eraldi tuleks rõhutada, et suurenenud apoptoosiresistentsus oli analüütika arendamise aluseks [16, 17].

Esimene mainimine vananevate rakkude suurenenud stressiresistentsuse kohta pärineb aastast 1995, kui leiti, et replikatiivsed vananevad fibroblastid on seerumi eemaldamise suhtes resistentsemad kui kontrollrühmad [55]. Sellele esialgsele uuringule järgnes piiratud arv uuringuid, mis näitasid, et vananevad rakud on UV-valguse, staurosporiini, tapsigargiini ja muude stresside suhtes vastupidavamad kui nende prolifereeruvad kolleegid [56, 57]. Kuid me pole kaugeltki esimesed, kes tõstatavad küsimuse suurenenud apoptoosiresistentsuse kui vananevate rakkude üldise tunnuse kohta. Seega teatati 2003. aastal avaldatud ülevaates, et "... apoptoosiresistentsus ei ole vananevate rakkude üldine tunnus, mis võib sõltuvalt rakutüübist ja apoptootilistest stiimulitest olla ka apoptootilisele kalduvusele..."[58]. Tõepoolest, mitmed andmed näitasid vananevate rakkude suuremat tundlikkust stressist põhjustatud apoptoosi suhtes kui kontrollrakkudel [59-61]. Näiteks vananevad HUVEC-id olid kontrollrakkudega võrreldes rohkem altid oksüdeeritud LDL-i või TNFa poolt indutseeritud apoptoosile [61]. Vaatamata ilmsele poleemikale ilmnes viimane kahtlus 2015. aastal ja kõlas järgmiselt: "Tundub kahtlane, et globaalne apoptoosiresistentsus on vananevate rakkude üldine tunnus"[62]. Samal aastal avaldati esimene uuring, mis paljastas analüüsi [16]. ]. Selles uuringus tõstsid autorid esile ellujäämist soodustavate geenivõrkude suurenenud ekspressiooni vananevates rakkudes, mis aitas kaasa nende suurenenud resistentsusele apoptoosi suhtes. Seega esindasid senolüütikumid algselt ravimeid, mis olid suunatud valkudele, mis kaitsesid vananevaid rakke apoptoosi eest. Analüütika avastamine koos vananenud rakkude INK-ATTAC transgeensete hiirtega eemaldamise muljetavaldavate tulemustega vallandas uuringute hoo, milles otsiti uusi hemolüütilise aktiivsusega ühendeid [16-26,63]. Viimase kahe aasta jooksul on avaldatud analüütika kohta palju arvustusi [13-15,64-66]. Kuid alates 2015. aastast ei olnud vananevate rakkude suurenenud apoptoosiresistentsus vaieldav, kuigi tegelikult seda nendes uuringutes ei testitud.

Huvitaval kombel avastasime ouabaiini suhtes resistentsete rakkude (END-MSC) ja ouabaiini suhtes tundlike rakkude (A549 ja IMR-90) transkriptoomiliste signatuuride võrdlemisel, et ainult END-MSC-de vananemisega kaasnes märgatavate rakkude omandamine. anti-apoptootiline profiil. Vastupidi, A549 ja IMR-90 vananemist iseloomustab proapoptootiliste geenide, sealhulgas BAD, BAX, BOK, BAK-1, NOXA ja nii edasi, oluline ülesreguleerimine. Oluline on see, et neid tulemusi pikendati teiste ouabatiini suhtes resistentsete rakkude DP-MSC-de abil. Ühest küljest annavad need tulemused täiendava molekulaarse seletuse ouabaiini poolt indutseeritud analüüsi puudumisele hMSC-des ja teisest küljest näitavad selgelt, et A459 ja IMR -90 muutuvad vananemise ajal eelsoodumuseks apoptoosi tekkeks. Pange tähele, et meie andmed apoptoosiga seotud geenide transkriptoomiliste muutuste kohta vananeva IMR-i{18}} korral langesid kokku Guerrero jt artiklis avaldatud tulemustega, kuid mida ei käsitletud kontrolli ja vananeva IMR-i andmekogudena. {19}} rakku pärinesid sellest uuringust [25]. Selles uuringus esitatud soojuskaardi täpne analüüs näitas BAX, BAD, BAD, BAKI ja NOXA ülesreguleerimist senises IMR-is{22}} võrreldes kontrollrakkudega. Veelgi enam, Baar et al. näitas ka proapoptootiliste geenide "ootamatut" ülesreguleerimist ja antiapoptootiliste geenide allareguleerimist vananevas IMR-is-90, mainides, et vananev IMR-90 tuleks apoptoosi läbimiseks ette valmistada [21].

Vaatluse tugevdamiseks võrdlesime kontroll- ja vananevate END-MSC-de ja A459 resistentsust kõige tavalisemate apoptoosi indutseerivate stiimulite-oksüdatiivse stressi ja staurosporiiniga. Meie bioinformaatilise analüüsi tulemuste kohaselt osutusid vananevad END-MSC-d palju stressikindlamaks kui kontrollrakud. Samal ajal näitas vananev A549 vastupidist reaktsiooni, mis oli mõlemat tüüpi stressi tekitavatele stiimulitele pisut vastuvõtlikum kui kontrollrakud. Seetõttu võib südameglükosiidide senolüütilist toimet, vähemalt A549 puhul, vahendada selle päritoluga vananevate rakkude eelsoodumus apoptoosile võrreldes nende kontrollrühmadega, samas kui ouabaiini poolt indutseeritud senolüüsi puudumist hMSC-des võib seletada rakkude suurenemisega. üldine apoptootiline resistentsus nende rakkude vananemise ajal. Veelgi enam, "antiapoptootilise kaitse" nõrgenemine MCL-1 inhibeerimisega soodustas END-MSC-sid südameglükosiidide poolt indutseeritud senolüüsi tekkeks. Kuigi me suutsime saavutada soovitud END-MSC-de senolüüsi MCL-i inhibeerimisega{12}}, ei tundu strateegia konkreetsete apoptootiliste geenide ekspressiooni moduleerimiseks, et soodustada vananevate hMSC-de senolüüsi, kuigi paljulubav, kuna ekspressioon konkreetsete anti- või pro-apoptootiliste geenide dünaamika võib erineva päritoluga rakkudes erineda. Usume, et ouabaiiniresistentsuse eest vastutab nn "anti-apoptootilise" profiili omandamine raku vananemise ajal, mitte aga konkreetsete anti- või pro-apoptootiliste geenide muutused, sellega seoses võib kogu profiili vahetamise võimalus. tunduvad mõistlikumad.

Meie järeldused, mis rõhutavad hMSC-de vananemise ajal omandatud apoptoosiresistentsust kui tõhusa analüüsi sisemist barjääri, võivad ulatuda kaugemale südameglükosiididest. Eelkõige leiti, et vananevad hMSC-d on teiste senolüütiliste ühendite suhtes resistentsed. Tõepoolest, olemasolevaid tõendeid analüüsides leidsime, et mitmesugused nimetatud senolüütilise toimega ühendid, sealhulgas navitoklaks, nikotiinamiidi ribosiid, danasoolgeldanamütsiin, ganetespiib, fisetiin, BCL-XL inhibiitorid, kvertsetiin, etomoksiir, antimütsiin A, FOXO4-DRI ,17-DMAG osutus ebaefektiivseks inimese vananevate preadipotsüütide (fibroblastitaoliste prekursorrakkude, mis pärinevad inimese rasvkoest) ja hMSC-de sihipärasel eemaldamisel luuüdist [17-19, 36, 40]. Andmed hMSC-de analüüsi puudumise kohta on mõnevõrra vastuolus in vivo hiirte mudelite abil saadud inspireerivate tulemustega, mis näitavad positiivseid tulemusi analüütika süsteemsel rakendamisel [37, 38]. Näiteks näidati, et vananevate süljenäärme tüvirakkude kliirens ABT263 abil võib ära hoida kiiritusravist põhjustatud kserostoomiat [38]. Lisaks parandas vananevate luuüdi MSC-de eemaldamine kvertsetiini abil luuüdi moodustumist [37]. Oluline on see, et näidati, et erinevalt hMSC-dest vananevad hiired ja roti MSC-d reageerivad analüütikale. Näiteks kvertsetiin, kvertsetiin-tina＋dasatiniib ja ABT263 eemaldasid märkimisväärselt vananevaid hiire MSC-sid [16]. Samuti on näidatud, et 17-DMAG vähendab oluliselt vananevaid bmMSC-sid progeroidse hiire mudelis [19]. Seetõttu arvatakse, et nendes uuringutes kirjeldatud erinevate organite ja süsteemide toimimise paranemine on vananevate hiire tüvirakkude sihipärase eemaldamise tagajärg. Kuid need analüüsid ei ole veel näidanud hMSC-de funktsionaalset noorendamist. Selline ilmne erinevus hiirte ja inimese MSC-de tundlikkuse vahel analüüsi suhtes viitab sellele, et senolüütilise ravi täiustused ei pruugi liikide lõikes säilida. Senolüütilise ühendi UBX0101 kohta saadud tulemusi võib pidada heaks illustratsiooniks, mis kinnitab viimast väidet. On näidatud, et see aine puhastab hiiremudelis osteoartriidi vananevaid rakke, mis vähendas oluliselt valu ja soodustas kahjustatud kõhre paranemist [20]. Kahjuks ei suutnud UBX0101 II faasi kliinilistes uuringutes leevendada haiguse progresseerumist ja valu mõõduka kuni kulgeva valuliku osteoartriidiga patsientidel [67-69]. Sarnaseid probleeme tekitab senolüütiline kombinatsioon dasatiniib-querce-tina[68].

Kokkuvõttes tuleneb saadud andmetest kaks olulist järeldust. Esimene näitas, et südameglükosiidid ei suuda vananevat hMSC-d puhastada. Analüüsi puudumist võib vahendada efektiivne K pluss raku import ja suurenenud apoptoosiresistentsus vananevates hMSC-des. Viimane on fundamentaalsem ja näitab, et apoptoosiresistentsus ei ole vananevate rakkude üldine tunnus, kuna vananemise ajal omandavad mõned rakud "apoptoosikindla" fenotüübi, teised aga mitte. Oluline on see, et südameglükosiidid saaksid tõhusalt puhastada ainult apoptoosile kalduvaid vananevaid A549 rakke. Selle põhjal võime oletada, et teiste senolüütiliste lähenemisviiside tõhusus võib sõltuda sellest, kas vananevad rakud on tõepoolest apoptoosi suhtes resistentsed võrreldes nende prolifereeruvate kolleegidega. Lõpuks, kuigi "analüütika" on kuum teema ja avaldatakse palju inspireerivaid andmeid, tuleks analüüsi tõhusust käsitlevatesse järeldustesse suhtuda ettevaatlikult, kuna rakkude vananemise heterogeensus jääb endiselt "mõistatuseks".

See artikkel on välja võetud ajakirjast Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x