Endotsütoosi ja autofagia GTP energiasõltuvus vananevas ajus ja Alzheimeri tõves

Abstraktne

Suurenenud huvi vananemise jaAlzheimeri tõbi(AD) seotud autofagia kahjustused ajus tõstatavad olulisi küsimusi reguleerimise ja ravi kohta. Kuna paljud endotsütoosi ja autofagia etapid sõltuvad GTPaasidest, on vaja uusi raku GTP taseme mõõtmisi.hinnata vananemise ja AD energiaregulatsiooni. Ratiomeetriliste GTP-andurite (GEVALS) hiljutine väljatöötamine ja järeldused, et GTP tasemed ei ole rakkudes homogeensed, tõstavadGTPaaside reguleerimise uued küsimusedGTP kohaliku saadavuse järgi. Selles ülevaates tõstame esileGTP metabolismseoses Rab GTPaasidega, mis on seotud varajaste endosoomide, hiliste endosoomide moodustumisega ja lüsosomaalse transpordiga, et viia läbi kahjustatud lasti autofaagiline lagunemine. Spetsiifilised GTPaasid kontrollivad makroautofagiat (mitofaagiat), mikroautofagiat ja chaperone-mediated autofagiat (CMA). Järelduselt kontrollivad kohalikud GTP tasemed autofagiat, kui mitte ülemäära. Täiendavad kontrollitasemed tulenevad raku redoksseisundist, sealhulgas tioredoksiini osalusest. Selles ülevaates rõhutamevanusega seotud muutusedsee võiksaitavad kaasa GTP ja AD puudujääkidele. Lõpetame väljavaadetega GTP taseme tõstmiseks ja vanusega seotud oksüdatiivsete redoksnihete ümberpööramiseks, et taastada autofagia. Seetõttu võivad GTP tasemed reguleerida arvukaid GTPaase, mis on seotud endotsütoosi, autofagia ja vesikulaarse kaubitsemisega. Vananemisel võib metaboolne kohanemine istuva eluviisiga kahjustada mitokondriaalset funktsiooni, tekitades vähem GTP-d ja redoksenergiat amüloidi jatau proteostaas, sünaptiline funktsioonjapõletik.

Märksõnad GTP · Energeetika · Autofagia · MitofagiaEndotsütoos· Lüsosoomid ·Alzheimeri tõbi · Vananemine

Klõpsake siin, et hankida taimne tsistan Alzheimeri tõve vastu

GTP, teine ​​energiavaluuta, vananemises ja AD

Kõrge energiaga molekulide ATP ja GTP süntees sõltuvad mõlemad NAD pluss /NADH redoksolekust ja nende piisavast kontsentratsioonist. ATP süntees glükolüüsist põhineb peamiselt NAD-i oksüdatiivsel jõul ja redutseerivatel suhkrutel. ATP süntees oksüdatiivse fosforüülimise teel mitokondrites toimub NADH tekkega TCA tsüklis püruvaadi, glütserooli või rasvhapete redutseerimiseks hapnikuga kui elektronide transpordiahela terminaalse elektronaktseptoriga. Meie märgisteta uuringud elusate rottide või hiirte hipokampuse neuronitega näitavad vanusega seotud NAD ja NADH ammendumist, mis võib kahjustada ATP ja GTP sünteesi [1–4]. See ammendumine süvenes veelgi inimese beeta-amüloidi ja tau transgeene kandvate hiirte neuronites. Lisaks näitas TCA tsükli ensüümide surmajärgne analüüs AD aju TCA tsükli ensüümide kahjustust kuni 40 protsenti võrreldes vanusega sobitatud kontrollidega [5]. Seega võib NAD pluss ja NADH vanusega seotud energeetiline ammendumine lisaks AD-ga seotud mitokondriaalsele kahjustusele TCA ensüümide aktiivsuses lokaalselt mõjutada ATP ja GTP taset, isegi kui nende põhikontsentratsioonid olid minimaalselt mõjutatud.

GTP hüdrolüüsist saadav energia on sama, mis ATP hüdrolüüsil, kuid GTP-d kasutatakse spetsiifiliste ensüümide selektiivsuse tõttu erinevatel eesmärkidel kui ATP-d. GTP kontsentratsioonid rakkudes on keskmiselt kümme korda madalamad kui millimolaarne ATP. GTP on mitmete energiast sõltuvate rakuliste valkude sünteesi ja vesikulaarse kaubitsemise protsesside peamine regulaator, mis hõlmab endotsütoosi ja autofaagiat. Hinnanguline rakkude GTP kogukontsentratsioon imetajarakkudes on vahemikus 250–700 μM [6], kuid vaba GTP vähirakkude eendites on lähemal 30 μM [7]. Peamised GTP-ga toidavad valgud hõlmavad membraani lõhustumise ja sulandumise dünamiine, väikseid regulatoorseid GTPaase ja mikrotuubuleid, nagu allpool kirjeldatud. Lisaks de novo sünteesile inosiinist IDMPH2 ja ksantosiinist GMPS-i poolt on GTP rakulised allikad peamiselt lokaliseeritud nukleosiiddifosfaatkinaasid (NDPK-d), mis pärinevad mittemetastaatilistest geenidest (NME; mõnikord nimetatakse ka NM23), mis muudavad ATP GTP-ks [8]. NME geeniperekonnas on vähemalt kümme liiget, kuid ainult neljal esimesel on nukleosiiddifosfaatkinaasi aktiivsus. Alleni ajuatlase kohaselt ekspresseeritakse NME1 kuni 4 tugevalt ja selektiivselt hiire ja inimese hipokampuses, kus AD-s on mälu halvenenud. NME1–3 on tsütoplasmaatilised, samas kui NME4 on mitokondriaalsed. Kuna vananemine ja AD mõjutavad nii erinevaid endotsütoosi kui ka autofagia protsesse, eeldame, et ülesvoolu muutused mõjutavad mõlemat, võib-olla vanuse ja AD-ga seotud tagajärgi, mis tulenevad GTP taseme piiramisest nendes amüloidikriitilistes funktsioonides.

GTP taseme mõõtmine

Kuigi GTP reguleerib mitmeid rakkude ellujäämise jaoks olulisi protsesse, on GTP taseme mõõtmine elusrakkudes füsioloogilistes ja patoloogilistes tingimustes keeruline, kuna on suur ringlus ja nii valguga seotud kui ka vaba olek. Bianchi-Smira glia et al. [9] kirjeldasid uudset geneetiliselt kodeeritud GTP-andurit (GEVAL), mis põhineb kollasel fluorestsentsvalgul, mis tuvastab GTP-vaba ja GTP-ga seotud kontsentratsiooni ratiomeetrilised muutused in vitro ja in vivo. Hiljuti teatas sama rühm mehhanismist GTPaasi Rac1 reguleerimiseks rakuinvasioonis inimese melanoomi rakuliini poolt, mida juhib kohalik GTP tootmine [7], ja vaatas läbi nende metoodika [10]. Nagu näeme selles ülevaates, mängib GTP endotsütoosi ja amüloidi töötlemisega seotud autofagia ajal üliolulist rolli. Praegu uurime vanusega seotud GTP muutusi A töötlemisel kolmekordse transgeense 3xTg-AD hiire hipokampuse neuronite primaarsetes kultuurides ja selle mõju autofagia muutustele. Joonisel 1 on näidatud esialgsed tulemused GEVAL530 transfektsioonist primaarsetesse täiskasvanud neuronitesse sellest AD hiiremudelist võrreldes mittetransgeensete hiire neuronitega. Nagu on täheldanud Bianchi-Smiraglia jt. [7], näeme vaba GTP mõõtmisel GTP ebaühtlast jaotumist soma protsessides ja servades (joonis 1Aa), kusjuures 3xTg-AD neuronites on vaba GTP tase madalam (joonis 1Ac). Nagu on kirjeldatud jaotises 10, tõstis nende neuronite eeltöötlemine NAD pluss-prekursori nikotiinamiidiga vaba GTP taset (joonis 1Ab, d). Nendes katsetes kasutatud GEVAL530 530-µM Kd viitab sellele, et kohalik vaba GTP kontsentratsioon on mõne korra piires 530 µM. Joonisel fig 1B uurisime seotud GTP-d, mis näib olevat lokaliseeritud vesiikulites ja suurenenud nikotiinamiidi toimel (joonis 1Bf, h), eriti 3xTg AD neuronites. Esialgsed tõendid näitavad, et NME1 siRNA-ga töödeldud neuronid alandavad oma vaba GTP taset (Santana Martinez, avaldamata). Täiendavad uuringud täiskasvanud neuronitega kogu vanuses määravad kindlaks GTP defitsiidi vanuse sõltuvuse ja võime neid ravida NAD pluss-prekursoritega. Arvestades GTP olulist rolli endotsütoosi ja autofagia vesikulaarsetes kaubitsemisprotsessides ning esialgseid tõendeid GTP muutuste kohta AD-sarnase geneetikaga, kirjeldatakse järgmistes jaotistes nende protsesside üksikasju ning vananemise ja Alzheimeri tõve mõju neile. Selle ülevaate tulemus tõstab esile vajaduse uute meetodite järele, nagu GEVAL sondid, et mõõta otseselt seotud ja vaba GTP ning kogu GTP kontsentratsiooni muutusi.

Joonis 1 GEVAL530 anduriga transfekteeritud keskealiste hiirte primaarsete hiirte hipokampuse neuronite suhtemeetrilised GTP mõõtmised Neuronite valevärvilised pikslite kaupa ratiomeetrilised kujutised näitavad GTP ebaühtlast jaotumist. (a) Keskealise (14 kuud) mittetransgeense (NTg) liigne vaba-GTP/seotud-GTP servades ja apikaalne dendriit võrreldes (c) keskealise (10 kuud) 3xTg-AD neuroniga. (b, d) Vaba GTP suurenemine 2 mM nikotiinamiidiga töödeldud neuronites 24 tunni võrra. (e, g) Töötlemata neuronitel on vesikulaarselt seotud GTP, mis suureneb (f, h) neuronites, mida on töödeldud 2 mM nikotiinamiidiga 24 tunni võrra

Endotsütoos: GTP-sõltuvus vananemises ja AD

Endotsütoosiprotsessis sisendab rakk makromolekule ja ligandiga seotud retseptoreid ja pinnavalke, sealhulgas amüloidi prekursorvalku (APP) [11] (joonis 2A). Kahest peamisest endotsüütilisest rajast toimub plasmamembraani sisseehitatud APP omastamine peamiselt klatriini vahendatud omastamise kaudu (joonis 2B.1), mitte kooleteroolirikaste plaastrite kaudu (joonis 2B.2). Kuid hüdrofoobne A jaotub plasmamembraanis lipiidiparvede kolesteroolirikasteks laikudeks, millele järgneb caveola rada [12] (joonis 2B.2). Mõlemal juhul kogunevad dünamiin-GTPaasi kompleksid invaginatsiooni ajal, et katalüüsida GTP-st sõltuvat membraani kõverust lõplikuks sulandumiseks ja küpsete vesiikulite vabastamiseks plasmamembraanist [13–15]. Kohalikku GTP tankimist katalüüsivad NME1 ja 2 nukleotiidfosfaatkinaasid, mis seonduvad dünamiiniga [16]. Varajane endosoomi Rab5 GTPaasi otsus eksotsütoosi ja retseptori ringlussevõtu suunas või muundumine hiliseks endosoomi Rab7 GTPaasiks lagunemiseks.

Rab5 GTPaasi peetakse varase endosoomi markeriks [17]. Rab5 valk esineb plasmamembraanis, klatriiniga kaetud vesiikulites ja varajastes endosoomides (joonis 2). Huntingtoni tõve raku- ja fysimudelites osaleb Rab5 autofagosoomide moodustamises, et reguleerida autofagiat ja kõrvaldada toksiline mutantne huntingtiin [18]. Rab5 inhibeerimine vähendab autofagiat reguleerivate proteaaside Atg5-Atg12 konjugatsiooni, mille tulemuseks on autofagosoomide moodustumise vähenemine. Atg12-Atg5 konjugaat soodustab Atg8 lipiidimist ja lipiiditud Atg8 hõlbustab autofagosoomide moodustumist ja selektiivset lasti äratundmist autofagia ajal [19].

Teine Rab{0}}vahendatud autofagia soodustav tegur on fosfatidüülinositool-3-kinaas (PI3K). PI3-kinaasi kompleks inhibeerib autofagiat, aktiveerides Akt/mTOR-signaaliraja [20]. PI3K kompleksi P110 alaühik reguleerib Vps34 kompleksi katalüütilist aktiivsust, et soodustada PI3P teket [21]. See samm on autofagosoomide moodustamiseks hädavajalik. P110 edendab üleminekut Rab{12}} SKT-lt Rab5-GTP-le. P110 üleekspressioon leevendab autofagilist puudulikkust pärast Rab5-st, Vps34-st ja Beclin1-st koosneva makromolekulaarse kompleksi aktiveerimist, mis omakorda viib autofagosoomide moodustumiseni [22]. Nende spetsiifiliste valkude sihtimine võib selgitada terapeutilisi võimalusi AD patoloogia leevendamiseks.

Joonis 2 Amüloidi prekursorvalgu (APP) endotsütoos. Agregatsioonile kalduva A rohelise varjundiga 770 jäägist koosneva APP valgu N-terminaalne osa nõuab BACE ja Gamma peptidaaside poolt lõhustamist. B APP endotsütoos. (1) Plasmamembraanist sisepunga moodustumine, mis on korraldatud klatriini poolt koos endoproteaaside BACE ja 훾-sekretaasiga. Dünamiini toetatud endotsütoos saab NME1 poolt kohaliku GTP. (2) Kolesterooliga rikastatud mikrodomeenid (lipiidiparved) seovad parenhüümist adsorbeeritud A-ks või A-ks töödeldud APP-d. (3) Varajane endosoom tõmbab ligi GTPaasi Rab5, mille tunneb ära teine ​​GTPaas Rab11, et vahendada (4) retseptorite endotsüütilist ringlussevõttu tagasi plasmamembraanile. Alternatiivina (5) vahendab Rab7 segregatsiooni varakult hilistesse endosoomidesse, võimaldades APP edasist töötlemist ja A akumuleerumist. (6) Endosoomi hiline liitmine (7) lüsosoomiga sisu lagundamiseks. Osa agregeeritud A-st võib olla seedimise suhtes resistentne ja endosoomide katkemise korral võib A koguneda tsütosooli.

Membraaniga seotud Rab5 on võtmetegur Mon1-Ccz1-sõltuva Rab7 aktiveerimise ja Rab7-sõltuva membraanifusiooni otseses soodustamises [23]. Mon1-Ccz1 on heterodimeerne guaniini nukleotiidivahetusfaktori GEF-kompleks, mis aktiveerib Rab5. Rab5 GEF-i esmaspäeva{11}}vahendatud nihkumine toob kaasa Rab5 nihkumise Rab7 poolt. C-Vps kompleks toimib Rab7 jaoks GEF-ina ja soodustab Rab7 üleminekut SKT-ga seotud olekust GTP-ga seotud olekusse Rab7 aktiveerimiseks. Ultraviolettkiirguse resistentsusega seotud geen (UVRAG) stimuleerib Rab7 aktivatsiooni UVRAG-C-Vps interaktsiooni kaudu Rab7 GDP/GTP vahetuse kaudu [24]. Veel üks autofagilise protsessi regulatiivne punkt on homotüüpne liitmine ja vaakumisvalgu sorteerimise (HOPS) kompleks, mis aktiveerib membraani liitmise ajal pärmi vakuolaarse Ypt-Rab GTPaasi [25]. Üks HOPS-kompleksi kuuest alaühikust on C-klassi vakuolaarsete valkude sorteerimise (C‐Vps) kompleks, mis sisaldab Vps11, Vps16, Vps18 ja Vps33. Rab7 hilised endotsüütilised vesiikulid sulanduvad seejärel lasti lagunemiseks lüsosoomidega (joonis 2).

Muutused Rab 5 ja Rab 7 endosomaalses kaubitsemises hiiremudelites ja AD-s

AD hiiremudelites, millel on mutatsioonid amüloidi prekursorvalgus (APP) või A-d tootvas preseniliinis, näib endosoomi-autofagosoomi-lüsosoomi rada reguleerimata osaliselt lüsosoomide hapestumise halvenemise tõttu, mis ei suuda proteaasi ja lipaase piisavalt aktiveerida [26]. AD hiiremudelites märgistavad A-d sisaldavad suured perinukleaarsed kehad autofagosoomi markeriga LC3, mis on kolokaliseerunud Rab7 ja hiliste endosomaalsete ja lüsosomaalsete komponentidega. Selle põhjuseks võib olla kaitsva ülesreguleerimise ebaõnnestumine või patoloogiline kahjustus. 3xTg-AD hiirtest kasvatatud neuronites kogu vanusevahemikus leidsime, et agregeeritud vesikulaarne A suureneb koos vanusega 30–50 korda, kõige silmatorkavamalt Rab{8}}märgistatud varajastes endosoomides ja mitokondrites, aga ka Rab{{9} }märgistatud hilised endosoomid ja autofagosoomid [27]. A 42 ja A 45 lumepallitaoline kogunemine viitab sellele, et vanad neuronid ei suutnud nende pikemate A agregaatide autofagilist lagunemist lõpule viia. Me oletame, et vanade neuronite energiatootmise halvenemine piirab autofagia lõpuleviimise energeetilist võimekust. Võrreldes tasemega noores hipokampuses ja ajukoores, langes 7–12-kuu vanuste APP/PS1 hiirte hipokampuses Rab7 tase koos Beclin1 ja Rubiconi aktivaatorite vähenemisega ning Rubiconi inhibiitori suurenemisega [28]. Nooremas hipokampuses ja igas vanuses ajukoores aktiveerib Beclin1 Rab7, samas kui Rubicon inhibeerib Rab7 aktiveerimist, pärssides UV-kiirgusresistentsusega seotud geenivalgu (UVRAG) ja vaakumvalgu sorteeriva geeni (Vps) interaktsiooni. Rab7 defitsiit pärmis ja puuviljakärbestes põhjustab autofagosoomide massilist kuhjumist [29]. Rab7 knockdown inaktiveerib ka mTORC1 / S6K1 ja mTOR-i lokaliseerimise hilistes endosoomides [30]. Huvitaval kombel ei muuda endotsüütide inimkaubanduse teiste etappide pärssimine mTORC1 aktiivsust, mis viitab sellele, et intaktsed hilised endosoomid on mTORC1 signaaliülekande jaoks autofagias üliolulised. See on oluline põhjus, miks mTOR-i sihtimine ei pruugi aeglustada vananemist ega AD-d.

Rab 5 ja Rab7 valkude ja mRNAde piirkondlikult selektiivne ülesreguleerimine AD korral viitab selektiivsele panusele haiguse patoloogiasse või ebapiisavale kaitsemehhanismile [31]. A akumuleerub peamiselt Rab7-positiivsetesse hilistesse endosoomidesse ja neuronaalsete rakkude autofaagilistesse vakuoolidesse [32] vanusega seotud viisil [27], põhjustades A internaliseerumist ja sellele järgnevat Rab7 suurenemist, käivitades neuronaalse degeneratsiooni [33]. Hilise endotsüütide raja blokeerimine Rab7 supressiooniga kutsub esile A-sõltuva amüloidfibrillide moodustumise rakupinnal, põhjustades endosomaalset suurenemist [34], mille tulemuseks on Rab7 kiirenenud ringlussevõtt ja A endotsüütiline kaubitsemine lüsosoomidesse lagunemiseks [35]. Iysosomaalse proteolüüsi pärssimine võib samuti mõjutada autofagiliste organellide aksonite retrograadset transporti, põhjustades AD-sarnast aksonaalset düstroofiat [36]. Praktilised sekkumised Rab{14}}vahendatud autofagia edendamiseks võivad aga AD progresseerumist edasi lükata või tagasi pöörata. Näited hõlmavad üleminekut istuvast seisundist treeningule, Vahemere dieeti ja energiat suurendavaid ühendeid, nagu NAD-i lähteained, et tekitada redoksnihe [4] (jaotis 10). Teine võimalus on kummaline avastus, et guanosiinmonofosfaatreduktaasi 1 (NADPH-sõltuv GMPR1) tase on AD ajus suurenenud, mis võib ise alandada GTP taset ja tõsta AMP signaaliülekannet [37]. Tau neurofibrillaarsed puntrad vähenesid, kui see aktiivsus AD hiirtel pärssis.

Kerge kognitiivse kahjustuse progresseerumisel AD-ks olid nii endosomaalsed Rab5 kui ka Rab7 ekspressioonid hipokampuse CA1 neuronites ülesreguleeritud, mõõdetuna transkriptsioonilise mikrokiibi abil [31]. Rab5-positiivsete endosoomide suurenemist seostati neurofibrillaarsete puntrate ja amüloidi ladestumisega. Neurotroofsed tegurid, nagu närvikasvufaktor (NGF) seonduvad nende Trk retseptoritega ja sisenevad Rab{5}}positiivsetesse endosoomidesse, et algatada allavoolu signaaliülekanne [38]. Huvitav on märkida, et signaaliülekande endosoom säilib Rab5 varajaste endosoomidena ega arene nende pikkades aksonites liikumise ajal Rab7 hilisteks endosoomideks [39]. See erinevus eristab retseptori vahendatud signaali edastamist endosoomide töötlemisest autofagia suunas [40]. Pärast NGF-i aktiveerimist värbab TrkA Rab5-GAP-i, et muuta GTP-Rab5 kiiresti GDP-Rab5-ks, et hoida GTP-Rab5 taset kontrolli all, mis hoiab ära Rab5 konversiooni Rab7-ks, mille tulemuseks on NGF/TrkA signaaliülekande ja enneaegne lagunemine.

Rab5 funktsioon on AD varases faasis kahjustatud [41]. Rab5 püsiv hüperaktiveerimine soodustas endotsüütilist rada hiliste endosoomide, lüsosoomi sulandumise ja autofagia suunas, mille tulemuseks oli neurotroofse faktori signaaliülekande enneaegne lagunemine ja neuronaalne atroofia. Vps35 ja Vps26, kaks peamist retromeeri valku, vähenesid ka AD ajus [42]. Vps26 seondub SorLA-ga, mis on sorteerimisretseptor, mis kontrollib APP-i liikumist endosoomidest Golgi. Vps retromeeri valkude vähenemine põhjustab ebanormaalset Vps-SorLA kompleksi, mis takistab APP-i kaubitsemist, mis takistab APP-i akumuleerumist endosoomides, kus see allub beeta-sekretaasile. APP fosforüülimise jäljendamine S655 juures APP 653YTSI656 basolateraalse motiivi raames võib aga suurendada APP otsimist retromeeri vahendatud protsessis, põhjustades APP lüsosomaalse sihtimise vähenemist ja Abeta produktsiooni vähenemist [43]. Täispika APP ja APP fragmendi-CTF suurenemine võib omakorda tõsta Rab5 GTPaasi aktiivsust, kutsudes esile varajaste endosoomide suurenemise [44]. Huvitav on see, et APP-CTF-ide poolt indutseeritud neuronaalset atroofiat saab päästa domineeriv-negatiivne Rab5 mutant nii in vitro [39] kui ka in vivo [45].

Vananemise tulemuseks on hiliste endosoomide ammendumine, hiline endotsüütiline düsfunktsioon ja lüsosoomide fusiooni halvenemine. AD korral suureneb A endotsütoos laienenud Rab5 varajasteks endosoomideks. Rab7 roll AD-s on veel selgelt välja selgitamata, kuna on täheldatud nii Rab7 varajast ülesreguleerimist kui ka hilist allareguleerimist, mis mõjutavad närvirakkude tervist mõlemas suunas. Nagu rõhutasid Bianchi-Smiraglia jt. [7] ei võimalda homogenaatides mõõdetud raku kogu GTP-d hinnata Rab GTPaaside jaoks kohapeal saadaolevat vaba GTP-d. Tasuta GTP meetmetest ei ole veel teatatud, seega on nende võimalik roll vanuse ja AD-ga seotud endotsütoosi kahjustustes uurimata. Seetõttu on oluline mõõta vaba GTP-d elusrakkudes ja vaba GTP variatsioonide mõju endotsütoosile vanuse ja AD mudelite funktsioonina.

Küsi lisa:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: pluss 86 15292862950

pood:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop