Gossypitrin, looduslikult esinev flavonoid, attenuates raua poolt indutseeritud neuronaalne ja mitokondriaalne kahjustus 3. osa

Võtkeoscar.xiao@wecistanche.comRohkem infot

4. Materjalid ja meetodid 4.1.Reaktiivid

Kõik reaktiivid saadi Sigma-Aldrich Corp.-ist (St. Louis, MO, USA). Goside laolahendused valmistati ette DMSO-s ja lisati rakukultuuridele või mitokondriaalsetele preparaatidele 1/1000 (o/o) lahjenduste juures.

Palun klõpsake siin, et rohkem teada saada

4.2.Taimne materjal

Taimsed materjalid (lilled) Talipariti elatumist (Sw.)(Syn. Hisbiscus elatus Sw.) (Malvaceae)koguti 2020. aasta märtsis uurimis- ja bioloogilise hindamise keskuse, farmaatsia- ja toiduteaduste instituudi, La Lisa, Havanna, Kuuba ümbritsevatest piirkondadest. Neid kinnitasid Camagüey ülikooli herbaria "Ignacio Agramonte Loynaz" spetsialistid, kuhu paigutati vautšeri isendid: G. Pardo., HPC-12 520 (HIPC).

Cistanche võib parandada immuunsust

4.3. Ekstrakti ja proovi ettevalmistamine

etanoolneväljavõtted valmistati Telatumi punastest lilledest, nagu varem teatatud [29]. Pärast rotoevaporatsiooni puhastati tahked ained taaskristalliseerumisprotseduuridega[29]. Isoleeritud ühendeid iseloomustasid 1D 'H(400 MHz) ja 13C (100 MHz) NMR abil. NMR-andmetöötlus viidi läbi MestReNova tarkvaraversiooniga 6.1.0-6224 Windowsi jaoks (lisamaterjalid, joonised S1-S3). Gosist kogutud NMR-andmeid võrreldi varasemate tulemustega [56].

4.4. UV/Vis ja IR spektroskoopilised uuringud

UV/Vis spektrid viidi läbi 10 mm optilise tee pikkusega kvartsküvettides ja neeldumine registreeriti UV-Vis-Vis-visspektrofotomeeterUltrospec 2100 Pro Amersham BioSci'st (Little Chalfont, UK) ühendas arvutiga, millel on toatemperatuuril Wave Scan Software (SWIFT I, 1.2). Gosi ja mustioonide vahelist koostoimet mõõdeti UV/Vis spektri muutuste jälgimisega. Töö meetodit kasutati Gosi ja Fe(II) iooni stöhhiomeetrilise suhte määramiseks. Gosi ja Fe(lI) laolahendused valmistati iga päev vastavalt metanooli- ja fosfaadipuhvris. IR-spektrid registreeriti JASCO FI/IR-440 spektromeetril vahemikus 4000-400 cm-I, kasutades proovide valmistamiseks kaaliumbromiidi graanuleid.

4.5. Rakukultuurid

HiirhipokampusHT-22 rakke (ATCC) kasvatati DMEM-keskkonnas, mida täiendati 10% FCS-i, L-glutamiini (1 mM) ja penitsilliini/streptomütsiiniga (1%) ning säilitati 37 °C juures niisutatud 5%CO2 inkubaatoris. Rakud(2×104 rakk/kaev) külvati 96-kaevulistesse plaatidesse (Nunc, Roskilde, Taani), 200 μL kultuurikeskkonnas 24 h juures 37C juures.

4.6.Rakkude oksüdatsioonikahjustuste esilekutsumine ja ravi gos

Gosi (0,001-100 μM) neuroprotektiivset toimet testiti HT-22-l 24 h koos Gosi või Troloxi (500 μM), FeCl2 (100μM) ja tsitraadiga (1 mM) kaasinkubatsiooni teel. Pärast 24 tunni möödumist eemaldati raku supernatant ja mõõdeti rakkude elujõulisust [3-(4,5-dimetüülthiasool-2-yl)-2,5-difenüül tetrazolium bromiid] (MTT)kolorimeetriline analüüs.

4.7. Rakkude elujõulisuse analüüs

Pärast ravi inkubeeriti rakud (2× 104) 10 uM MTT-ga 3 h juures 37C juures. Värviline MTT derivaat lahustati seejärel 50 μL-s DMSO-s ja neelduvus loendati 570 nm-le mikroplaadilugeril (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Saksamaa). Rakkude elujõulisust väljendatakse protsendina töötlemata rakkude kontrolli vastu.

4.8.Mitokondriaalse membraani potentsiaal (△Y)Analüüs HT-22 rakkudes

Mitokondriaalnemembraanipotentsiaali hinnati fluorestseeruva katioonilise sondi rhodamine 123 rakkude säilitamise põhjal [57,58]. Pärast 2 h raua/askorbaadi vigastust Gosi (0,001-100 μM) või Troloxi (500 μM) puudumisel (kontroll) või Troloxi (500 μM) puudumisel (kontroll) inkubeeriti neuronaalsed rakud (2×10*) 10 minutit 1 μM rhodam 123-ga. Pärast tsentrifuugimist ja elustamist 1 ml 0,1% Triton X-100-s määrati sondi kontsentratsioon supernatandis mikroplaadilugeja (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Saksamaa) abil 505/535 nm ergastus-/emissiooni lainepikkuse paaril. Andmeid väljendatakse protsentidena võrreldes töötlemata rakkude kontrolliga.

4.9.ATP analüüs

Rakulise ATP määras firefly luciferin/luciferase analüüsisüsteem [59] samadel tingimustel kui AY. Bioluminestsentsi mõõdeti Sigma-Aldrichi analüüsikomplektiga vastavalt tootja juhistele, kasutades mikroplaadilugeja luminestsentsi võimalust (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Saksamaa).

4.10.Loomad

Isased Wistari rotid (200 g)saadi laborioratooriumi loomade tootmise keskusest (CENPALAB vastavalt hispaaniakeelsele akronüümile Havanna, Kuuba) ja neid hoiti loomahooldusasutuses 1 nädal enne katseid temperatuurikontrollitavas keskkonnas (22–24 °C), 12-h heleda/tumeda tsükliga ning juurdepääsuga toidule ja veele ad libitumile.

4.11.Mitokondriaalne isolatsioon

Roti eesaju mitokondrid isoleeriti diferentsiaalse tsentrifuugimisega, nagu eespool kirjeldatud [60]. Digitoniini kasutati 10%, mida kasutati sünaptosoomide häirimiseks ja mittesünaptosomaalsete pluss sünaptosomaalsete mitokondrite segu saamiseks. Kogu protseduur viidi läbi temperatuuril 4 °C. Hingamiskontrolli suhe (seisund 3/seisund 4 hingamissagedus) oli alati vahemikus 4,5 kuni 6,0, mõõdetuna 5 mM suktsinaadiga substraadina.

4.12. Pideva jälgimise mitokondriaalsed analüüsid

Mitokondriaalse membraani potentsiaal määrati spektrfluorimeetriliselt, kasutades 10 μM safraniini O sondina 【58,61】 mikroplaadilugeris (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Saksamaa) 495/586 nm ergastus-/emissiooni lainepikkustel; need analüüsid viidi läbi 0,1 mM EGTA ja 2 mM K, HPOA juuresolekul. Mitokondriaalset turset hinnati spektrofotomeetriliselt ilmse neeldumise vähenemisest 540 nm juures. Analüüside jaoks olid mitokondrid pingestatud 5 mM kaaliumsüktsinaadiga (pluss 2,5 uM rotenoon) standardses keskkonnas, mis koosnes 125 mM sahharoosist, 65 mM KC-st ja 10 mM HEPES-KOH-st, pH 7,4-st, 30 °C juures.

4.13.Lipiidide peroksüdatsioonianalüüsid

Lipiidide peroksüdatsiooni hinnati malondialdehüüdi (MDA) põlvkonnast [28,62]. Mitokondrid (1 mg/ml) puutusid kokku 4 mM tert-butüülhüdroproperoksiidiga või 50uM Fe(II)pluss 1 mM naatriumtsitraadiga temperatuuril 37 °CC.MDA kontsentratsioon arvutati selle summutuskoefitsiendi abil (c = 1,56×105 M-1.cm-1).

4.14. Fe(II) kontsentratsiooni määramine

Fe(II.I) kontsentratsioon määrati 10 mM fosfaadipuhvris pH 6,5(2 ml) punase kompleksi moodustumisega 1,10-fenantroomiga (5 mM), nagu eespool kirjeldatud [24,28].

4.15.Hapniku tarbimise seire

Fe(II.I) oksüdatsiooniga seotud O tarbimist mõõdeti Clarki tüüpi elektroodiga (Hansatech Instruments, Pentney, King's Lynn, Uk) 1,3 ml klaaskambris, mis oli varustatud magnetsegajaga, 30 °C juures. Hapnikutarbimise määr (ROC) väljendati nmol O2/ml minutis.

4.16.2-desoksüriboosi oksüriboosi oksüdatsioon Assaly

Hüdroksüülradikaalide moodustumist hinnati pärast 2-desoksüriboosi lagunemist MDA-ks, mis arvutati selle väljasuremise koefitsiendi (e=1,56×10° M-1·cm-) põhjal, nagu varem teatatud [26,27].

4.17. Gos-Fe(II) Komplekside avastamine

Fe(II.I)(FeCl,0.4-1.6 μM)lisati 2 ml(10 mM)fosfaadipuhvrile(pH 6.5), mis sisaldas 2 mM tsitraati ja 1,6 μM gos. Hitachi 2001 spektrofotomeetris (Hitachi, Tokyo) tehti lainepikkuse skaneerimine 200-600 nm 28 °C juures.

4.18. Statistiline analüüs

Kasutati GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA). Statistiline analüüs viidi läbi ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes Student-Newman-Keulsi posthoc test paari-tarkade võrdluste jaoks. Tulemused p-ga<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" half-effective="" or="" inhibitory="" concentrations="" were="" estimated="" following="" a="" non-linear="" regression="">

Lisamaterjalid: Internetis on saadaval järgmised materjalid. Joonis S1:lH-NMR(400 MHz)gossypitriini spekter DMSO-dos, joonis S2:13C-NMR(101 MHz)gossypitriini spekter DMSO-d-s, joonis S3: Gossypitriini HSQCspectrum in DMSO-dg. Tabel S1: "H (400 MHz) ja 13C (100 MHz) gossypitriini andmed võrreldes eelmise aruandega.

Autori kaastööd:Kontseptualiseerimine, G.LP.-A.; metoodika, M.A.B.-V., R.F.D., Y.M.-P.ja G.L.P.-A.; valideerimine, M.A.B.-V., J.M.-P., Y.M.-P. ja R.F.D.; ametlik analüüs, Y.M-P, J.M.-P, R.F.-A. ja G.L.P-A.; uurimine, M.A.B.-V, A.A.-L., D.A.-A., Y.M.-P., R.F.D.ja G.L.P-A.; Andmete kureerimine, M.A.B.-V.YM.-P.J.M.-P.ja R.F-A.; kirjutamine — algne eelnõu ettevalmistamine, M.A.B.-V.; kirjutamine – läbivaatamine ja toimetamine, IM.-P, R.F-A., Y.M.-P ja G.L.P.-A.; visualiseerimine, Y.M.-P. ja G.L.P-A.; järelevalve, G.L.P.-A.; rahastamise omandamine, G.L.P.-A.Kõik autorid on lugenud ja nõustunud käsikirja avaldatud versiooniga.

Rahastamine: seda uuringut rahastas VLIR (Belgia); toetuse number CU2018TEA457A103 ja ministerio de Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente (Kuuba); toetuse number PN223LH010-035. APC-d rahastas VLIR (Belgia); toetuse number CU2018TEA457A103.

Institutsioonilise revisjonikomisjoni avaldus:Uuring viidi läbi Helsingi deklaratsiooni suuniste kohaselt ja selle kiitis heaks Kuuba Havanna Ülikooli farmaatsia- ja toiduaineteaduste instituudi institutsionaalse eetika komitee (protokolli kood IFAL-CEI 087-2019, oktoober 2019).

Informeeritud nõusoleku avaldus: ei kohaldata. Andmete saadavuse avaldus: ei kohaldata.

Tunnustused:Seda tööd toetasid osaliselt Vlaamse Interuniversitaire Raad (VLIR)-Belgia/Ministerio de Educacion Superior (MES)-Kuuba projekt CU2018TEA457A103, mis kattis ka artikli töötlemise tasud, ja projekt PN223LH010-035 filmist "Ministerio de Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente (Kuuba), Programa de Ciencias Basicas y Naturales". Huvide konfliktid: autorid ei deklareeri huvide konflikti.

Proovide saadavus: ühendite proovid on saadaval vastavalt autorilt.