Gossüpitriin, looduslikult esinev flavonoid, nõrgendab rauast põhjustatud neuronaalseid ja mitokondriaalseid kahjustusi: 2. osa

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

2.5. Gos-Fe(I) komplekside tuvastamine

Usutav hüpotees ülaltoodud tulemuste selgitamiseks on see, et Gos moodustab Fe (ll)-ga mööduva kompleksi, mis hõlbustab selle oksüdeerumist hapnikuga. See üleminekukompleks võib oma elektrone toimetada kergemini kui Fe ()-tsitraat, luues Fe (Ill) stabiilsema kompleksi. Joonisel 6A on kujutatud Gos tüüpiline spekter maksimaalse neeldumisega 276, 332 ja 38{14}} nm juures (must joon). Fe () lisamine kutsus esile kontsentratsioonist sõltuva maksimaalse neeldumispiikide languse ja uue ilmumise 500 nm lähedal (joonis 6A). Gosi spektrist pärinevate spektrite massiivi esinemist kinnitas isosbestilise punkti olemasolu λiso=405 nm juures (vt mustad punktid), mis näitab keemilist tasakaalu (kompleks) vabade ja komplekssete Go-de vahel. Sisend (joonis 6A) näitab kompleksi moodustumist stöhhiomeetriaga 2:1 (Gos-raud). Selliste Gos-raua komplekside stöhhiomeetria määrati Jobi meetodil, mis näitab murdepunkti molaarsuhte 0,5 juures.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Täiendavad tõendid raua ja Gos-i vahelise korrelatsiooni kohta saadi IR-spektroskoopia abil (joonis 6B). Vaba Gos-i ja selle rauakompleksi puhul peeti vahemikus 3000-4000 cm- asuvat lairiba vesiniku venituseks. seotud hüdroksüülrühmad veemolekulide olemasolu tõttu. Vaba Gos'i v(C=O) venitusrežiim esineb 1654 cm-I juures, mis on nihutatud 1636 cm-Iupon kompleksi moodustumise suunas. See tulemus viitab sellele, et Fe (Ⅱ) on korrelatsioonis karbonüülhapnikuga [31]. Veelgi enam, v (Fe-O) venitava vibratsiooni olemasolu 630 cm-I juures kinnitab raud-Gosi kompleksi moodustumist, kuna vabal Gosil sellist riba ei esine.

Joonis 6.(A) Fe(II) mõju Gos UV-VIS spektrile (200-600 nm). Inkubatsioonisegu, mis sisaldas 125 mM sahharoosi, 65 mM KCl, 10 mM HEPES puhvrit (pH 7,2), 2 mM tsitraati ja Gos 1,6 μM. Fe (I) kontsentratsioonid ülalt alla olid {{12} }}, 0.16, 0.32, 0.48, {{20}}.64, 0.8, 0.96 ja 1.12 μM.Inset∶ Jobi graafik Gos-Fe（II） kompleksi jaoks konstantsel kogukontsentratsioonil 【Fe（D）】 pluss 【Gos】=1,6 μM. Must täpp tähistab isosbestilist punkti. Alla- ja ülesnooled näitavad neeldumisväärtuste vähenemist ja suurenemist vastavalt 380 ja 500 nm juures. Katsed viidi läbi 28 kraadi juures. Skaneerimiskiirus oli 2 nm/sA baasjoon, mis määrati inkubatsioonisegu pluss 1,6 µM Fe (I) (B) Gos ja Gos-Fe (I) infrapunaspektrid. Näidatud on tüüpilised näited.

2.6. Gos takistas Fe(III) redutseerimist askorbaadiga

Raua raua olek, mida soodustab Gos, kujutab endast usutavat antioksüdantset mehhanismi, kuna see takistab Fe (II) katalüütilist aktiivsust. Sellegipoolest saab Fe (III) looduslike redutseerivate ainete, nagu askorbaat, abil uuesti oma raudvormiks redutseerida. Viimane võiks bioloogilisi süsteeme uuesti laadida Fe(II-ga), mis osaleb Fenton-Haber-Weissi reaktsioonides, tekitades äärmiselt reaktiivse · OH radikaali. Nende võimaluste uurimiseks kasutasime 1,{3}}fenantroliini, et mõõta Fe(II) moodustumise taset Gos lahuses (100 μM), mida oli töödeldud 2 mM askorbaadi ja erinevate Fe(II) kontsentratsioonidega ({{6}). } μM). Joonis 7 näitab, et Gos puudumine võimaldas Fe(II)-ks Fe(II)-ks maksimaalset redutseerimiskiirust (must joon kaldega 5,85×10-3); kuid seda protsessi aeglustas Gos (1-min inkubeerimine, roheline joon) ja pärast 5-minutilist inkubeerimist Gosiga vähenes Fe(I) vähenemise kiirus askorbaadi toimel peaaegu 3 korda (punane joon kaldega 2,04 × 10-3). See tulemus näitab Gosi võimet inhibeerida askorbaadi vahendatud Fe() redutseerimist Fe(I)-ks

Joonis 7. Gos inhibeerib Fe(ⅢI)-redutseerimist askorbaadi toimel roti maksa mitokondrite puudumisel. Katsetingimused: 125 mM sahharoosi, 65 mM KCl, 10 mM HEPES puhver (pH 7,2), 1 mM tsitraati, Gos 100 µM. Katsed viidi läbi 28 kraadi juures. Pärast 1- või 5-minutilist Gos-Fe(I) inkubeerimist lisati askorbaat (4 mM) ja 5 mM 1,10-fenantroliini. Jooned esindavad kolme analüüsi.

2.7. Gos kaitseb 2-desoksüriboosi oksüdatiivse lagunemise eest

Et dokumenteerida Gosi võimet toimida eelistatavalt rauale vabade radikaalide asemel, viidi läbi konkurentsiuuringud, et hinnata Gos'i ja kahe · OH püüduri (DMSO ja salitsülaat) tõhusust 2,8 või 28 mM 2-deoksüriboosi raua eest kaitsmisel. -vahendatud oksüdatiivne kahjustus (joonis 8).·OH-püüdurid 20 mM juures kaitsesid 28 mM 2-desoksüriboosi oluliselt vähem kui 2,8 mM2-desoksüriboosi (p<0.05), as="" expected.="" gos="" was="" equally="" effective="" in="" preventing="" oxidative="" degradation="" of="" both="" 2.8="" and="" 28="">

Joonis 8. Gos ja · OH püüdjate dimetüülsulfoksiidi (DMSO) ja salitsülaadi mõju Fe(II)-EDTA pluss askorbaadi poolt indutseeritud 2,8 või 28 mM 2- desoksüriboosi oksüdatiivsele kahjustusele. Lahuseid inkubeeriti 30 min 37 kraadi juures ja need sisaldasid 10 mM fosfaatpuhvrit (pH 7,2), 2-desoksüriboosi (2,8 või 28 mM), 150 µM EDTA-d ja 50 µM Fe（ⅢI） Reaktsioonid alustati askorbaadi lisamisega lõppkontsentratsioonini 2 mM. Tulbad näitavad keskmisi ± SD (n=3). Kontrollid sisaldavad ainult DMSO-d (0,001 protsenti), mis on lahusti kontsentratsioon Gos proovides. Ühepoolset t-testi kasutati *p jaoks<0.05, n.s.,="">

3. Arutelu

Mitmete neurodegeneratiivsete seisundite, sealhulgas isheemilise ja hemorraagilise insuldi korral vabanev raud kutsub esile aju raua homöostaasi deregulatsiooni, mis viib neuroloogilise kahjustuse patofüsioloogiani [4,32-34]. Subtsellulaarsel tasemel näib mitokondriaalne kahjustus olevat seotud raua poolt vahendatud neuronite surmaga [10,15,35-38]. Prekliinilised tõendid toetavad raua kelaatijate, peamiselt deferoksamiinmesülaadi kasutamise eeliseid neurodegeneratsiooni, sealhulgas igat tüüpi insuldi vastu [7,16]. Kuid nende kõrge hind ja kättesaamatus ning klassikaliste rauakelaatorite mitmesugused kahjulikud mõjud on viinud looduslike kelaatorite kasutamiseni düshomeostaasi raua juhtimiseks [39, 40].

Cistanche võib parandada immuunsust

Gosi kaitsvat toimet näidatakse raua/tsitraadi seguga inkubeeritud HT-22 rakkudel ja roti-aju mitokondritel, kus leidsime tugeva kaitse raua põhjustatud oksüdatiivsete kahjustuste eest. Hiire hipokampuse HT-22 rakud, mis puutusid kokku raua ülekoormusega (24 tundi), näitasid elujõulisuse vähenemist, mis oli tihedalt seotud mitokondriaalse membraani varajase potentsiaali hajumise ja ATP vähenemisega (vastavalt joonis 2A-C). See viitab sellele, et mitokondriaalne kahjustus aitab kaasa neuronaalsele letaalsusele. Tõepoolest, meie tingimustes peaks vähemalt osa neuronitesse üles laaditud Fe (II) jõudma organellidesse, kuna rauast põhjustatud neuronite surmale eelnes mitokondriaalse funktsiooni kadu. Seega on näidatud, et raua ülekoormus kutsub esile hiire hipokampuse HT-22 rakusurma ja mitokondriaalse killustumise [41,42]. Samuti suurendab pidev raua kokkupuude mitokondriaalse ROS-i tasemega dopamiinergilises neuroblastoomi SHSY5Y rakkudes [43]. Peale selle kontrolliti pärast 100 uM raudraudaga kokkupuudet ulatuslikku raua sissevoolu hipokampuse neuronitesse ja mitokondriaalseid kahjustusi [36]. Siin täheldasime, et rauast mõjutatud hipokampuse neuronite elujõulisuse Gos-indutseeritud säilimine on tihedalt seotud nende mitokondriaalse membraanipotentsiaali ja ATP taseme säilimisega.

Nagu intaktsete rakkude puhul, põhjustas otsene mitokondriaalne kokkupuude raudraudaga organellide ulatuslikku turset, membraanipotentsiaali hajumist ja ATP kadu (vastavalt joonis 3A–C). Selles katsekeskkonnas suutis Gos kaitsta rauaga ülekoormatud mitokondrid, mis väljendus ülalnimetatud parameetrite säilimises. Selles mõttes on täheldatud, et raua mikromolaarse kontsentratsiooniga koormatud mitokondrites toimus mitokondriaalse läbilaskvuse ülemineku pooride avanemine ja △Y hajumine viisil, mis on tundlik raua kelaatimise suhtes, kuid ei sõltu katalaasi antioksüdantsest toimest |44]. Huvitav on see, et Mito-Tempo antioksüdant kaitseb hipokampuse neuronites raua ülekoormuse kahjustuste eest, eemaldades mitokondriaalse superoksiidi aniooni radikaali ja säilitades mitokondriaalse morfoloogilise terviklikkuse ja membraanipotentsiaali [36]. Hiljuti kirjeldasime selle flavonoidi antioksüdantset toimet ja selle võimet kaitsta PC12 rakke keemilise hüpoksia põhjustatud surma eest [29], kus jõuti järeldusele, et Gosi vabade radikaalide püüdmine ja antioksüdantne võime on osaliselt seotud kaitsega raua vahendatud vastu. HT-22 ja mitokondriaalsed kahjustused. Gosi paranenud efektiivsus raua poolt vahendatud lipoperoksüdatsiooni vastu võrreldes tertbutüülhüdroperoksiidi vahendatud lipoperoksüdatsiooniga (vastavalt joonis 4A, B) viitab aga tugevalt sellele, et selle rauaga interakteeruv võime on peamine mehhanism raua põhjustatud kahjustuste vastu.

Gos-Fe interaktsiooni edasiseks iseloomustamiseks viidi läbi mitu raku- ja mitokondritevaba katset. Me täheldasime, et kui polüfenooli inkubeeriti koos Fe (II)-ga, väheneb metalliioonide kontsentratsioon, samal ajal kui hapnikutarbimise kiirus suurenes (joonis 5A-C). Need mõjud viitavad sellele, et Gos eemaldab tsitraadikompleksist Fe (II) ja oksüdeerib selle raudvormiks protsessis, mis nõuab elektroni aktseptorina O2. Järelikult soodustab Gos Fe (II) kontsentratsiooni langust, mis võib Fentoni reaktsioonide kaudu takistada hüdroksüülradikaale. Kuna Gos-Fe(II) kompleks võimaldab asjakohaste redutseerivate ainete, nagu askorbaat, oksüdeerimist, mille tulemuseks on Fe(II) moodustumine/regenereerimine, suutsime näidata, et Gos inhibeerib askorbaadi poolt vahendatud Fe(II) redutseerimist. kuni Fe(II).

Hüpotees, et Gos interakteerub tugevalt rauaga, leidis ka siin kinnitust spektroskoopiliste tehnikate abil ja kinnitas varasemaid tulemusi, kus erinevad massiivid

Gos-raua kompleksstöhhiomeetriat iseloomustati elektronide spin-ionisatsiooni massispektroskoopia abil [45].

Need tulemused näitasid Gosi kaitsvat toimet raua vahendatud neuronite kahjustuste vastu, tõenäoliselt interakteerudes raua ioonidega, takistades selle osalemist katalüütiliselt reaktiivsete hapnikuliikide moodustumisel. Lisaks viitab see mööduva laenguülekande kompleksi moodustumisele Fe (Ⅱ) ja Gos vahel, mis kiirendab Fe (II) oksüdatsiooni ja stabiilsema Fe (III)-Gos kompleksi moodustumist, mis ei saa osaleda lipiidide levimisfaasis. peroksüdatsioon. Veelgi enam, bioloogiliselt oluline redutseerija, nagu askorbaat, ei suutnud redutseerida raudrauda Gos-i juuresolekul, piirates teatud raudioonide ringlussevõtus osalevate flavonoidide prooksüdantset omadust. [30]. Mikromolaarsetes kontsentratsioonides Gos oli 2-desoksüriboosi raua vahendatud oksüdatsiooni ennetamisel tõhusam kui klassikalised püüdurid. Seda kõrget efektiivsust võib seostada redoksaktiivse Gos-Fe(II)/() moodustumisega, nagu me varem täheldasime ka teiste polüfenoolide puhul, mis parandasid nende toimimist antioksüdandina nende interaktsioonil rauaga erinevates in vitro oksüdatiivsete kahjustuste paradigmades. 22,46-48].

On kindlaks tehtud, et kelaativad ained, mis sisaldavad ligandina hapnikku (oksoligand, O2-), võivad kelaatida rauda ja soodustada Fe(I) oksüdeerumist, Fe(II) stabiliseerumist ja sellest tulenevalt vähendada selle vähendav potentsiaal49]. Füsioloogilise pH juures moodustavad katehhoolid kergesti termodünaamiliselt stabiilseid bis-komplekse raudraudaga, mida soodustavad ligandide madalad kontsentratsioonid. Katehhooliosa olemasolu Gosi struktuuris viitab sarnasele interaktsioonimehhanismile rauaga, mis võib selgitada neuronaalsete rakkude ja mitokondrite rauast põhjustatud kahjustuste eest saavutatud kaitset. Sellega seoses näitasime ka varem, et mangiferiin ja guttiferoon A stimuleerivad raudmetalli oksüdatsiooni ja takistavad raua redutseerimist [23, 24, 26-28].

Gosi võime rauda kelaatida võib samuti kutsuda esile signalisatsiooniradasid, mis aitavad kaasa neuroprotektsioonile. Näiteks on prolüülhüdroksülaasi domeeni ensüümid (PHD), klassikalised hüpoksia indutseeritav faktor-lalfa (HIF-1o) hüdroksüülimist modifitseerivad ensüümid normoksia korral tuvastatud kui raua kelaatijate kriitilised sihtmärgid, mis on paljudes kliiniliselt kasulikud. neuroloogilised häired [50,51]. See on arusaadav, kuna PHD sõltub kahevalentsest rauast kui sidestustegurist [52]. HIF-la reguleerib mitmeid neuroprotektsioonis osalenud geene, nagu eNOS, VEGF ja EPO[53]. Lisaks võib PHD inhibeerimisest tulenev HIF-i aktiveerimine ära hoida oksüdatiivse stressi poolt vahendatud mitokondriaalset kahjustust ja apoptoosi, sõltumata selle rollist transkriptsioonifaktorina [54].

Ferroptoosi, hiljuti iseloomustatud rauast sõltuvat reguleeritud rakusurma, on pakutud mehhanismina, mille kaudu hemorraagilise kahjustusega kokku puutunud neuronid surevad [8]. Mitokondriaalne düsfunktsioon oli hiljuti seotud ferroptoosirakkude surmaga [55]. Seetõttu võib ferroptoosi pärssimine, mis säästab mitokondriaalset funktsiooni rauakahjustuste eest, olla ka usutav mehhanism neuroprotektsiooniks Gosi poolt kaitstud raua vahendatud neuroloogiliste häirete vastu, mis vääriksid täiendavat tähelepanu. Tuleb teha täiendavaid uuringuid Gosi eeldatava kasuliku mõju kohta rauaga seotud neurodegeneratsiooni in vivo loommudelitele, et pakkuda seda flavonoidi terapeutilise sekkumisena raua homöostaasi dereguleerimisest põhjustatud ajukoe kahjustuste vastu.