Gomisin N pärsib melanogeneesi, reguleerides melanotsüütides PI3K/Akt ja MAPK/ERK signaaliradu

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktne: Gomisin N, on erinevates uuringutes näidatud, et ühel Schisandra Chinensises leiduval lignaanühendil on antioksüdatiivne, kasvajavastane ja põletikuvastane toime. Siin kirjeldame esimest korda gomisin N melanogeenset toimet imetajatel. rakkudes kui ka sebrakala embrüodes. Gomisin N vähendas märkimisväärselt melaniini sisaldust ilma raku toksilisuseta. Kuigi see ei olnud võimeline seene katalüütilist aktiivsust moduleerimatürosinaasin vitro,Gomisin Nalandas funktsioneerivate võtmevalkude ekspressioonitasemeidmelanogenees. Gomisin N allareguleeritud melanokortiin 1 retseptor (MC1R), adenülüültsüklaas 2, mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktor (MITF), türosinaas,türosinaasseotud valk-1(TRP-1) ja türosinaasiga seotud valk-2 (TRP-2). Lisaks näitasid Gomisin N-ga töödeldud Melan-A rakud suurenenud p-Akt ja p-ERK tasemeid, mis tähendab, et PI3K / Akt ja MAPK / ERK radade aktiveerimine võib toimida inhibeerides.melanogenees. Samuti kinnitasime, et Gomisin vähendas melaniini tootmist, represseerides MITF-i ekspressiooni,türosinaas, TRP-1 ja TRP-2hiire ja inimese rakkudes, aga ka sebrakala embrüote arengus. Kokkuvõttes järeldame, etGomisin Npärsib melaniini sünteesi, surudes maha MITF-i ja melanogeensete ensüümide ekspressiooni, tõenäoliselt moduleerides PI3K/Akt ja MAPK/ERK radu.

Märksõnad:Schisandra Chinensis;Gomisin N; lignaan;melanogenees; naha valgendamine

cistanche'il on nahka valgendav funktsioon

1. Sissejuhatus

Melaniin on pigment, mida leidub enamikus loomaorganites, sealhulgas nahas, juustes, silmades, sisekõrvas, luudes, südames ja ajus [1,2].Melanogeneeson keerukas protsess, millesse on kaasatud mitu signalisatsiooniteed. Melanokortiin 1 retseptor (MC1R) on peamine regulaatormelanogenees, mis edastab signaali oma ligandide, näiteks melanotsüüte stimuleeriva hormooni (MSH) ja adrenokortikotroopse hormooni (ACTH) kaudu [3]. Naha melaniini biosünteesivad epidermises olevad melanotsüüdid ja seejärel kantakse üle keratinotsüütidesse, kus neil on oluline roll naha kaitsmisel, neelates päikesevalguse UV-kiirgust ja püüdes kinni reaktiivseid vabu radikaale [4,5]. Melaniini sünteesi ja ülekannet nahas ja juuksefolliikulites reguleerib selle prekursorite kättesaadavus [6]. L-türosiin ja L-dihüdroksüfenüülalaniin (L-DOPA), melanogeensete ensüümide peamised substraadid, toimivad melanogeneesis ka hormoonitaoliste regulaatoritena [7]. Teisest küljest põhjustab melaniini ületootmine soovimatuid nahaprobleeme, nagu tedretähnid ja melasma [8, 9]. Melanogenees võib mõjutada normaalsete ja pahaloomuliste melanotsüütide käitumist, moduleerides rakkude elastseid omadusi [10]. Kuigi naharakkudes ekspresseeritud serotoniini ja melatoniini retseptorid mängivad rakulise homöostaasi säilitamisel võtmerolli, võib melaniini liigne tootmine kontrollimatute hormonaalsete muutuste kaudu põhjustada naha patoloogilisi seisundeid [11].

Seega on tehtud ulatuslikke jõupingutusi, et selgitada välja molekulaarsed mehhanismid, mis kontrollivad melanogeneesi kui peamist etappi hüperpigmentaarsete nahahäirete ravimisel. Lisaks erinevat tüüpinaha valgendaminemelaniini sünteesi inhibeerivad ained on tuvastatud taimede ja mittetaimsetest ekstraktidest ning neid on kaubanduslikult kasutatud kosmeetikatoodetes [12,13]. Kõige laialdasemalt kasutatavad valgendavad ained on hüdrokinoon, mekinool, arbutiin, kojiinhape, askorbiinhape ja retinohape [12,14]. Siiski on nende kasutamisel inimestel hüperpigmentatsiooni ägedate või krooniliste sümptomite ravimisel erinevad piirangud. Näiteks hüdrokinoon, kuigi seda on pikka aega kasutatud depigmentatsiooniks alates 1960. aastatest, võib põhjustada nahaärritust ja kontaktdermatiiti [15,16]. See põhjustab ka DNA kahjustusi, suurendades reaktiivsete hapnikuliikide tootmist ja eksogeense okronoosi teket imetajarakkudes [17,18]. Muud tuntudtürosinaasInhibiitoritel, nagu Kojichape ja askorbiinhape, ei ole mitte ainult halb naha läbitungimine, stabiilsus ja valgendamine, vaid need võivad pikaajalisel kasutamisel põhjustada ka tsütotoksilisust, dermatiiti ja erüteemi [19,20]. Sellega seoses on üha suurem vajadus töötada välja ohutumad ja tõhusamad valgendavad ained inimese naha hüperpigmentatsiooni raviks. Traditsioonilises meditsiinis kasutatavad looduslikud ürdid võivad olla alternatiivsed allikad uudsete valgendavate ainete tuvastamiseks, mis kontrollivad olulisi sammemelanogeneesvähemate või üldse mitte kõrvalmõjudega [21].

Schisandra chinensis, tuntud ka kui põhjamaise peene maitsega marja, leidub looduslikult Kirde-Hiinas, Kaug-Ida Venemaal, Jaapanis ja Koreas [22]. Seda taime on traditsioonilises idamaise meditsiinis pikka aega kasutatud ööpimeduse, nahapõletuse, aseptilise põletiku ja maksahaiguste raviks [23,24]. On näidatud, et S. chinensise puuviljaekstraktil ja selle lignaanühenditel on hiire rakuliinides erinevad farmakoloogilised toimed. Näiteks Schisandra A-l ja C-l on antioksüdatiivne toime, samal ajal kui Schisandra B-l on anti-fibrootiline, põletikuvastane, antioksüdantne ja anti-apoptootiline toime [25]. Teine lignaaniühendGomisin N(Joonis 1A) on teatatud, et see pärsib oksüdatiivsest stressist põhjustatud apoptoosi, inhibeerides tsütokroom C vabanemist mitokondritest tsütoplasmasse, kaspaas 3 ja PARP lõhustumist ning Ca2 pluss-indutseeritud mitokondriaalset läbilaskvust H9c2 roti kardiomüotsüütides [7, 8]. Huvitaval kombel on mitmed hiiremudeleid ja inimese naharakuliini kasutanud uuringud näidanud S. chinensise terapeutilist potentsiaali nahahaiguste ravis. Lee et al. teatas, et S. chinensise vilja metanooliekstrakt leevendas kontaktdermatiidi sümptomeid, vähendades paikselt manustatuna põletikueelsete tsütokiinide, nagu TNF- ja IFN-i tootmist [8,24]. Kang et al. näitas, et Schisandra Fructus veeekstrakt inhibeeris IKB aktivatsiooni, pärssides seeläbi TNF-, IL-6 ja GM-CSF tootmist inimese nuumrakuliinis HMC-1 [26]. Need leiud viisid meid oletama et S. chinensis lignans võib mõjutada naharakkude funktsioone laiemalt. Selles uuringus püüdsime uurida naha oletatavaid rolle.Gomisin N, üks peamisi S. Chinensise lignaanühendeid, reguleeridesmelanogenees, hinnates seeläbi selle võimalikku kasutamist kosmeetikavahendina. Siin me teatame sellestGomisin Ninhibeerib melaniini biosünteesi ilma rakulise toksilisuseta inimese ja hiire rakkudes, samuti sebrakala embrüodes.

2. Tulemused

2.1. Gomisin N mõju melaniini moodustumisele ja rakkude elujõulisusele

Et kontrollida Gomisin N mõjumelanogenees, töötlesime hiire melanotsüüte erineva kontsentratsioonigaGomisin N72 tundi ja seejärel hinnati melaniini sisalduse muutusi. Gomisin N-ravi vähendas melaniini sisaldust nii normaalses melanotsüütide rakuliinis Melan-A kui ka B16F10 melanoomi rakkudes annusest sõltuval viisil, ilma raku toksilisuseta (joonis 1B, C). Me täheldasime, et Gomisin N inhibeeris -MSH-indutseeritud melaniini tootmist B16F10 rakkudes, mis oli võrreldav PTU-ga töötlemisel saadud tulemustega [27] (joonis 1C). Et hinnata, kas melaniini vähendamine pärastGomisin Nravi on tingitud türosinaasi aktiivsuse vähenemisest, teostasime normaalsetes inimese epidermaalse melanotsüütide (NHEM) rakkudes L-DOPA värvimise testi. Nagu on näidatud joonisel 1E, ilmnes Gomisin N-ga töödeldud NHEM-rakkudes L-DOPA tase võrreldes töötlemata rakkudega madalamal. Siiski ei olnud Gomisin N inhibeeriv toime melaniini tootmisele inimese melanoomi MNT-1 rakkudes märkimisväärne (joonis 1D). .

2.2. Gomisin N mõju türosinaasi aktiivsusele

Et uurida, kasGomisin Npärsibtürosinaasaktiivsust in vitro, kasutasime seente türosinaasi ja B16 melanoomi rakulüsaate. Positiivse kontrollina kasutati kojichapet, tuntud türosinaasi inhibiitorit. Kui seda töödeldi seente türosinaasiga, samal ajal kui kojiinhape vähendas oluliselt ensümaatilist aktiivsust, ei põhjustanud gomisin N L-DOPA muundumist dopakroomiks (joonis 2A). Kui aga raviti B16 melanoomirakkudega, põhjustas gomisiin N languse. sissetürosinaasrakulüsaadi aktiivsus annusest sõltuval viisil (joonis 2B). Lisaks, kui seda töödeldakse koos -MSH-ga B16 rakkudes,Gomisin Npööras ümber -MSH-ga stimuleeritud dopakroomi moodustumise suurenemise (joonis 3C). Märkimisväärselt näis, et gomisin N oli raku inhibeerimisel tõhusam kui kojichape.türosinaasi aktiivsusB16 rakkudest -MSH stiimulil. Need leiud viitavad sellele, et hiire ja inimese rakkudes täheldatud GomisinN inhibeeriv toime melaniini tootmisele (joonis 1) ei tulene selle funktsioonist otseselt inhibeerida türosinaasi katalüütilist aktiivsust. Siiski on siiski võimalik, et Gomisin N reguleerib türosinaasi või teiste valkude ekspressiooni, mis mängivad võtmerollimelanogenees.

2.3. Gomisin N mõju MC1R signaaliraja inaktiveerimisele

Püüdsime selgitada mehhanismi, mis vastutab GomisinN inhibeeriva toime eest melaniini tootmisele. Me põhjendasime sedaGomisin Nvõib reguleerida signaalvalke, mis on seotudmelanogeneesja seeläbi pärsib melaniini sünteesi. Melanokortiin 1 retseptor (MC1R) on amelanotsüütiline G-valguga seotud retseptor, mis toimib melaniini sünteesi võtmeregulaatorina. MC1R aktiveerimine selle ligandi -MSH või adrenokortikotroopse hormooni (ACTH) poolt põhjustab adenülüültsüklaasi aktiivsuse suurenemist, mis omakorda reguleerib üles intratsellulaarse cAMP taset [2,3]. Järelikult suureneb MITF-i transkriptsioonitase proteiinkinaasi-C (PKA) / reageeriva elementi siduva valgu (CREB) raja kaudu [2, 28]. Gomisin N regulatiivse mõju hindamiseks MC1R signaaliülekanderajale kontrollisime MC1R ja selle allavoolu signaalimolekulide ekspressioonitaset pärast Melan-A rakkude töötlemist Gomisin N-ga. Täheldasime, et Gomisin N reguleeris oluliselt nii MC1R kui ka adenülüültsüklaas 2 valgu taset. annusest sõltuval viisil (joonis 3A–C). Nagu oodatud,Gomisin N-töödeldud rakkudel ilmnes ka MITF-i ja selle teadaolevate sihtmärkide türosinaasi, TRP-1 ja TRP-2 valgu taseme langus (joonis 3A, D–G). Need leiud viitavad sellele, et Gomisin N inhibeerib melaniini tootvaid ensüüme, inaktiveerides MITF-i MC1R signaaliraja kaudu.

2.4. Gomisin N mõju Akt ja ERK1/2 fosforüülimisele melan-A rakkudes

On teada, et PI3K/Akt ja MAPK/ERK rajad osalevad melanogeneesis transkriptsiooniliselt või transkriptsioonijärgselt reguleerivas MITF-is [29,30]. Et hinnata, kas GomisinN mõjutab neid signalisatsiooniteid, hindasime Akt ja ERK1 / 2 fosforüülimise staatust Western blot analüüsiga. Nagu on näidatud joonisel 3H–J, ravitakse suure doosiga (30 µM).Gomisin Nsuurendas oluliselt nii Akt kui ka ERK fosforüülimist. Need andmed näitavad, et Gomisin N inhibeeriv toime onmelanogeneeson tõenäoliselt seotud P13K/Akt ja MAPK/ERK radadega.

2.5. Gomisin N pärssis sebrakala embrüote melanogeneesi

Järgmisena püüdsime uurida, kas Gomisin N inhibeerib tõhusaltmelanogeneesin vivo. Selleks töödeldi sebrakala embrüoid Gomisin N-ga 72 tundi kontsentratsioonides 1, 10, 20 ja 30 µM ning seejärel mõõdeti melanogeensete valkude ekspressioonitasemeid. Me täheldasime, et ravi Gomisin N inhibeeris melaniini moodustumist sebrakala embrüote arengus.Gomisin N-töödeldud embrüotel ilmnes melaniinisisalduse vähenemine kontsentratsioonist sõltuval viisil võrreldes töötlemata kontrolliga (joonis 4). Samuti leidsime, et valgu tasetürosinaas, MITF, TRP-1 ja TRP-2 vähenesid ravi Gomisin N-ga (joonis 5). Need tulemused näitavad, et Gomisin N inhibeerib melanogeneesi in vivo, reguleerides transkriptsioonifaktorit MITF ja selle sihtmärketürosinaas, TRP-1 ja TRP-2.

2.6. Gomisin N muutis rapamütsiini poolt indutseeritud melanogeneesi inimese MNT-s-1

Kuigi Gomisin N inhibeeris oluliseltmelanogeneesMelan-A ja B16 rakkudes ning inzebrakala embrüodes ei täheldanud me selle mõju inimese MNT-1 melanoomirakkudele. Eeldasime, et Gomisin N toime võib olla tuvastatav MNT-1 rakkudes tingimustes, kus melanogeneesi reguleerib sobiv stiimul. On näidatud, et rapamütsiin indutseerib melanogeneesi, suurendades türosinaasi aktiivsust ja MITF-i, türosinaasi, TRP-1 ja TRP-2 [31] valgu taset, osaliselt autofagia aktiveerimise kaudu [32]. Jälgime tasettürosinaas, MITF, TRP-1 ja TRP-2 MNT-1 rakkudes Western blot analüüsiga, pärast koostöötlemist Gomisin N andrapamütsiiniga. Rapamütsiinravi indutseeris oluliselt MITF-i, TRP-1 ja TRP-2 tasemeid, kuid ei mõjutanudtürosinaastasemed (joonis 6). Kuid ravi Gomisin N muutis oluliselt rapamütsiini mõju MITF-ile, TRP-1 ja TRP-2-le kontsentratsioonist sõltuval viisil. Vastupidine mõjuGomisin Nrapamütsiini vastu oli paljulubavam kontsentratsioonidel 20 ja 30 µM kui 10 µM. Need tulemused viitavad sellele, et gomisin N inhibeeribmelanogeneesinimese MNT-1 melanoomirakkudes, reguleerides transkriptsioonifaktorit MITF ja selle sihtmärke TRP-1 ja TRP-2.

3. Arutelu

Melaniini põhiülesanne on kaitsta naharakke UV-kiirguse eest [33–35]. Hüperpigmentatsioon, mis tuleneb melaniini ületootmisest nahas, põhjustab soovimatuid kosmeetilisi probleeme ning on seotud dermatiidi ja nahavähiga. Mitmed aruanded on soovitanudmelanogeneeskui metastaatilise melanoomi ravi oluline sihtmärk [36, 37]. Seega on kasvav vajadus välja töötada melanogeenseid aineid, mis reguleerivad melanogeneesi ilma raku toksilisuseta [38]. Naha melanogeneesis osaleb mitu rada [39,40]. Ligandiga seondumisel suurendab MC1R adenülüültsüklaasi aktiivsust, mis seejärel suurendab cAMP rakusisest taset [41,42]. On laialdaselt teatatud, et PKA/CREB raja cAMP-sõltuv aktiveerimine suurendab MITF-i transkriptsioonitasemeid, suurendades seeläbi melaniini sünteesi [43]. MITF toimib selgroogsetel kolme peamise melanogeense ensüümi türosinaasi, TRP-1 ja TRP-2 pearegulaatorina [3, 21, 44]. Need ensüümid on transmembraansed valgud, mis paiknevad melanotsüütide melanosomaalses membraanis. Türosinaas reguleerib kiiruse piiramise sammumelanogeneesmuutes L-türosinaasi L-DOPA-ks [23]. TRP-1 ja TRP-2 mängivad samuti olulist rolli melaniini sünteesis, kuigi nende funktsioone ei mõisteta täielikult.

Selles uuringus näitas S. chinensis'e lignaanühend Gomisin N depigmenteerivat toimet ilma raku toksilisuseta. Gomisin N inhibeeris melaniini sünteesi nii kultiveeritud imetajate rakuliinides kui ka sebrakala embrüodes. Gomisin N näis olevat tõhusam kui positiivne kontroll PTU, mis pärsib melaniini tootmist Melan-A rakkudes (joonis 1B). Gomisin N vähendas melaniini sisaldust kontsentratsioonist sõltuval viisil. Võrreldes töötlemata kontrollrühmaga oli 10 uMGomisin Nvähendas melaniini sisaldust umbes 40 protsenti, ilma raku toksilisuseta. 10-µM Gomisin N melanogeenne toime oli võrreldav 100-µM PTU omaga Melan-A rakkudes. Sarnaselt näis, et Gomisin on tugevam kui PTU -MSH-ga aktiveeritud B16F10 rakkudes, kus 5- ja10-µM Gomisin N toime oli võrreldav 10- ja {{12 }}µM PTU vastavalt (joonis 1C). Gomisin N-ga töödeldud NHEM-rakkudes oli L-DOPA tase vähenenud, mis viitab sellele, et GomisinN inhibeeribtürosinaasaktiivsus kultiveeritud rakkudes (joonis 1E). Need leiud ajendasid meid täiendavalt uurima aluseks olevat mehhanismi, mille abil gomisin N inhibeerib melanogeneesi.

Uurisime, kasGomisin Nmoduleerib otseselt katalüütilist aktiivsusttürosinaasin vitro. Erinevalt Kojinhappest ei näidanud Gomisin N pärssivat toimet seente türosinaasi aktiivsusele (joonis 2A). Kuid raku türosinaasi aktiivsust B16 melanoomi rakulüsaatides reguleeris Gomisin N märkimisväärselt nii MSH-raviga kui ka ilma (joonis 2B, C). Leiti, et Gomisin N raku türosinaasi aktiivsuse inhibeerimine MSH stiimuli korral on olulisem kui positiivse kontrolli Kojic acid (joonis 2C).

Eeldasime, et Gomisin N melanogeenne funktsioon võib ilmneda türosinaasi ja türosinaasiga seotud valkude (TRP-de) transkriptsioonilise või posttranskriptsioonilise regulatsiooni kaudu. Selle kinnitamiseks mõõtsime signaalmolekulide ekspressioonitasemeid MC1R rajal, mis on peamise määraja. melaniini tootmise kogus ja kvaliteet melanotsüütides. Eeldatavasti täheldasime, et Gomisin N vähendas MC1R ja adenülüültsüklaaside 2 taset Melan-A rakkudes (joonis 3A–C). LisaksGomisin Nvähendas MITF-i ja selle sihtvalgu, sealhulgas türosinaasi, TRP-1 ja TRP-2 ekspressiooni (joonis 3A, D–G). Need tulemused viitavad sellele, et melaniini sisalduse vähenemine Gomisin N-ga töötlemisel tuleneb MC1R raja deaktiveerimisest.

Teisest küljest võivad PI3K/Akt ja MAPK/ERK rajad MITF-i fosforüülida ja seeläbi selle aktiivsust post-transkriptsiooniliselt moduleerida [45]. Kuid PI3K/Akt ja MAPK/ERK radade aktiveerimise üldine mõjumelanogeneeson vastuoluline. Nii PI3K/Akt kui ka MAPK/ERK rajad aktiveeritakse inimese melanoomides konstitutiivselt akumuleerunud mutatsioonide tõttu [46]. C2-tseramiidi poolt vahendatud depigmentatsioon Mel-Ab rakkudes toimub teadaolevalt p-Akt taseme languse kaudu [47]. On mitmeid looduslikke ühendeid, mis aktiveerivad melanogeneesi, suurendades p-ERK taset B16 melanoomirakkudes [28]. Seevastu on ka tõendeid selle kohta, et kõrgenenud p-ERK ja p-Akt tase pärsib melaniini sünteesi [28,48]. Melanogeneesi keerukuse reguleerimist saab osaliselt seletada asjaoluga, et fosforüülimine suurendab MITF-i transkriptsioonilist aktiivsust, kuid kutsub samal ajal esile MITF-i ubikvitsioonist proteosoomist sõltuva lagunemise [26, 49–51]. Meie andmed näitasid, et nii p-Akt kui ka p-ERK tasemed olid Gomisin N-ga töödeldud Melan-A rakkudes ülesreguleeritud (joonis 3H – J). See tähendab, et PI3K / Akt ja MAPK / ERK rajad võivad kaasa aidata melaniini tootmise pärssimisele.

Lisaks kinnitasime Gomisin N melanogeenset aktiivsust sebrakala in vivo mudelis. Gomisin N-ga töödeldud sebrakala embrüod näitasid melaniini pigmentatsiooni olulist vähenemist (joonis 4). Lisaks vähendas Gomisin N taset märkimisväärselttürosinaas, MITF, TRP-1 ja TRP-2 sebrakala embrüote arendamisel. Need leiud viitavad ühiselt selleleGomisin Nindutseerib depigmentatsiooni, vähendades MITF-i ja melanogeensete ensüümide ekspressiooni in vivo. Gomisin N melanogeenset toimet kinnitati ka rapamütsiiniga stimuleeritud inimese melanoomi MNT-1 rakkudes. Kuigi Gomisin N põhjustas MNT-1 rakkude melaniinisisalduses vaid väikseid muutusi (joonis 1D), oli see efektiivne rapamütsiini poolt indutseeritud MITF, TRP-1 ja TRP-2 ülesreguleerimise ümberpööramiseks kontsentratsioonist sõltuval viisil (joonis 6A, C–E). Kokkuvõttes regulatiivne mõjuGomisin NMITF-il ja melanogeensetes ensüümides leiti reprodutseeritavalt hiire ja inimese rakkudes ning sebrakala embrüodes.

Kokkuvõtteks võib öelda, et see töö viitab sellele, et Gomisin N-il võib olla romaanina suur potentsiaalnaha valgendamineagent. Gomisin N näib inhibeerivatmelanogeneesrepresseerides MITF-i ekspressiooni MC1R raja kaudu, selle asemel, et otseselt moduleerida katalüütilist aktiivsust.türosinaasja TRP-d. Kuigi üksikasjalikke mehhanisme tuleb veel selgitada, on Gomisin N-indutseeritud depigmentatsioon tõenäoliselt seotud PI3K / Akt ja MAPK / ERK radade aktiveerimisega (joonis 7).

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Materjalid

RPMI1640 osteti firmalt Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, USA). Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM), veise loote seerum (FBS) ja penitsilliin-streptomütsiin (PS) osteti firmalt Hyclone (Carlsbad, CA, USA). Melanotsüütide kasvusööde osteti ettevõttest PromoCell (Heidelberg, Saksamaa). Fenüülmetüülsulfonüülfluoriid (PMSF), 12-O-tetradekanoüülforbool-13-atsetaat (TPA), kojihape, 1-fenüül-2-tiouurea (PTU), seene türosinaas, 3,{{ 9}}dihüdroksü-l-fenüülalaniin (L-DOPA), -MSH, dimetüülsulfoksiid (DMSO) ja paraformaldehüüd osteti ettevõttest SigmaChemical Co. (St. Louis, MO, USA).Gomisin Nühendi andis Chul Young Kim (Hanyangi ülikool, Ansan, Korea). Rapamütsiin osteti firmalt Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

4.2. Rakukultuur

Hiire melanoomi rakuliin B16F10 saadi Korean Cell Line Bankist (Soul, Korea). Hiire melanotsüütide Melan-A rakud [52] olid helde kingitus dr Byeong Gon Leelt (SkinResearch Institute, Amore Pacific Co., Yongin). -si, Korea). Inimese MNT-1 melanoomirakke andis heldelt Aeyeong Lee (Dongguki ülikooli meditsiinikolleegium, Goyang-si, Korea). Primaarsed normaalsed inimese epidermaalsed melanotsüüdid (NHEM) osteti ettevõttest PromoCell (Heidelberg, Saksamaa). Melan-A rakke kasvatati RPMI 1640 söötmes (Gibco, Carlsbad, CA, USA), millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i, 1 protsenti PS-i ja 200 nM TPA-d. Melan-A rakkude ja NHEM rakkude säilitamiseks kasutati DMEM-i, millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i ja 1 protsenti PS-i. Kõiki rakke inkubeeriti 37 °C juures 5% CO2 inkubaatoris.

4.3. Melaniini sisalduse mõõtmine

Melan-A rakud külvati 24-süvendiga plaadile (1 × 105 rakku süvendi kohta), töödeldiGomisin Nja seejärel inkubeeriti 72 tundi. 72 tunni pärast mõõdeti melaniinisisaldust, nagu eelnevalt kirjeldatud [53]. Lühidalt, pärast söötme eemaldamist pesti rakke kolm korda PBS-ga. Seejärel lisati igasse süvendisse melaniini lahustamiseks naatriumhüdroksiidi lahust (1 ml, 1 N). Neeldumist lainepikkusel 405 nm mõõdeti mikroplaadilugejaga. Seda analüüsi korrati B16F10 rakkudega (2 × 104 rakku süvendi kohta) ja MNT{10}} rakkudega, järgides sama meetodit.

4.4. Western blot analüüs

Melan-A rakud külvati 100 mm tassidesse (1 × 106 rakku tassi kohta) ja töödeldi 1, 5 või 10 uM.Gomisin Nkolm päeva 37 ◦C juures. Rakke pesti PBS-ga ja koguti seejärel kaabitsa abil. Eraldatud rakud pandi 1 ml PBS-i ja tsentrifuugiti kiirusel 7500 pööret minutis 5 minutit. Pärast ülemise lahuse eemaldamist lüüsiti rakusademed lüüsipuhvriga (50 mM Tris-HCl, pH 8.{15}}, 0,1% SDS, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,02 protsenti naatriumasiidi, 0,5 protsenti naatriumdesoksükolaati, 100 µg/mL PMSF, 1 g/ml aprotiniini) 24 tundi temperatuuril 4 °C. Koguvalgud ekstraheeriti ultratsentrifuugi abil kiirusel 12, 000 pööret minutis 30 minutit temperatuuril 4 °C. Valgusisaldust mõõdeti Bradfordi testiga. Valgud (30 ug) eraldati 10% naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesi (SDS-PAGE) geeliga ja kanti üle anitrotselluloosmembraanile. Membraan blokeeriti 1 tund 5% kooritud piimaga Tris-puhverdatud soolalahuses koos Tween-20 (TBST) ja inkubeeriti seejärel 12 tundi temperatuuril 4 ◦C primaarsete antikehadega, mis olid suunatud -tubuliinile (Santa Cruz, CA, USA ), MITF (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), türosinaas (Cell Signaling), ERK (Cell Signaling), fosfo-ERK (Cell Signaling), AKT (Cell Signaling), fosfo-AKT (Cell Signaling), MC1R ( Santa Cruz), adenülüültsüklaasid 2 (Santa Cruz), TRP-1 (Santa Cruz) ja TRP-2 (Santa Cruz). Pärast primaarsete antikehade eemaldamist pesti membraane kolm korda TBST-ga ja inkubeeriti sekundaarsete antikehadega. antikehi (küüliku anti-kitse IgG-HRP; hiire küülikuvastane HRP, Santa Cruz) 1 tund. Membraanid töödeldi tugevdatud kemoluminestsentsreagendiga, kasutades ChemiDoc XRS plus pildisüsteemi (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Ribade densitomeetriline analüüs viidi läbi Image MasterTM 2D Elite tarkvara (versioon 3.1, GE Healthcare, Chicago, IL, USA) abil.

4.5. Türosinaasi aktiivsuse test

Gomisin N inhibeeriva toime hindamiseks seenteletürosinaasaktiivsus, türosinaasi inkubeeriti 1, 5 või 10 uMGomisin Nvõi positiivne kontroll Kojic acid. Iga proov lahustati metanoolis. L-DOPA (8,3 mM) ja seente türosinaas (125 U) lahjendati 80 mM fosfaatpuhvris (pH 6,8). 40 µL igast proovist ja 120 µL L-DOPA-d segati 96-süvendiga plaadil, millele järgnes 40 µL lahjendatud seene türosinaasi lisamine. Seejärel inkubeeriti plaate 15 minutit ja neeldumist mõõdeti 490 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat.

Türosinaasaktiivsust B16 melanoomi rakulüsaatides mõõdeti koos -MSH-ga või ilma, nagu on eelnevalt kirjeldanud Ohguchi et al. [54], väikeste muudatustega. Rakulüsaat valmistati nii, nagu on kirjeldatud ülalpool Western blot analüüsi osas. Supernatandi valkude üldsisaldus mõõdeti Bradfordi testiga, kasutades standardina veise seerumi albumiini [55]. Võrdne kogus valke lahjendati ja kasutati türosinaasi aktiivsuse testis.

inhibeerivad türosinaasi aktiivsust

4.6. L-DOPA värvimine NHEM-rakkudes

NHEM-rakud külvati {{0}}süvendiga plaadile ja inkubeeriti 72 tundi Gomisin N-ga. Rakud fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga 40 minutit, millele järgnes töötlemine 0,1% Triton X{-ga. {6}} 2 minutiks. Igasse süvendisse lisati L-DOPA (0,1 protsenti), millele järgnes 2-tunnine inkubeerimine. Pärast lahuse eemaldamist pesti rakke kaks korda PBS-ga. Pildid pildistati mikroskoobiga.

4.7. Sebrakala katsed

Sebrakala embrüod saadi Zebrafish Resource Bankist (Daegu, Korea). Embrüoid töödeldi Gomisin N-ga 72 tundi. Depigmenteeriv toimeGomisin Nsebrakala embrüodel vaadeldi stereomikroskoobi all. Western blot analüüsi jaoks lüüsiti Gomisin N-ga töödeldud embrüod lüüsipuhvriga, millest valmistati üldvalgud, nagu eespool mainitud.

5. Kokkuvõtted

Meie tulemus toetab seisukohta, et Gomisin N-l on suur potentsiaal kasutada funktsionaalse toiduna janaha valgendamineagent.Gomisin Non S. Chinensise üks peamisi lignaaniühendeid. Tegelikult S. Chinensis on taimne ravim, mida kasutatakse paljude inimeste haiguste raviks. Siiski on vaja täiendavaid epidemioloogilisi uuringuid, et tõestada Gomisin N ohutust nahale. Järelikult suudavad in vivo uuringud ja kliinilised uuringud selgemalt näidata GomisinNi efektiivsust. Kokkuvõtteks võib öelda, et see uuring viitab selleleGomisin Nvõib olla potentsiaalne hüpopigmentaaraine ja loodusliknaha valgendaminekosmeetikatööstuse kandidaat.

cistanche parandab valgendamist

Viited

1. Alaluf, S.; Atkins, D.; Barrett, K.; Blount, M.; Carter, N.; Heath, A. Epidermise melaniini mõju inimese nahavärvi objektiivsetele mõõtmistele. Pigment Cell Res. 2002, 15, 119–126. [CrossRef] [PubMed]

2. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, eKr; Askarian-Amiri, ME Signalisatsioonirajad melanogeneesis. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Melaniini pigmentatsioon imetajate nahas ja selle hormonaalne regulatsioon. Physiol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [CrossRef] [PubMed]

4. Herrling, T.; Jung, K.; Fuchs, J. Melaniini roll vabade radikaalide kaitsjana nahas ja selle roll vabade radikaalide indikaatorina juustes. Spectrochim Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2008, 69, 1429–1435. [CrossRef] [PubMed]

5. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Roszkowski, K.; Filipiak, J.; Slominski, AT Melaniini sisaldus melanomametastaasides mõjutab kiiritusravi tulemust. Oncotarget 2016, 7, 17844–17853. [CrossRef] [PubMed]

6. Slominski, A.; Wortsman, J.; Plonka, PM; Schallreuter, KU; Paus, R.; Tobin, DJ Juuksefolliikulite pigmentatsioon.J. Uurige. Dermatol. 2005, 124, 13–21. [CrossRef] [PubMed]

7. Slominski, A.; Zmijewski, MA; Pawelek, J. L-türosiin ja L-dihüdroksüfenüülalaniin kui melanotsüütide funktsioonide hormoonitaolised regulaatorid. Pigment Cell Melanoma Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

8. Lee, AY Hiljutised edusammud melasma patogeneesis. Pigment Cell Melanoma Res. 2015, 28, 648–660. [CrossRef][PubMed]9. Speeckaert, R.; van Gele, M.; Speeckaert, MM; Lambert, J.; van Geel, N. Hüperpigmentatsioonisündroomi bioloogia. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 512–524. [CrossRef] [PubMed]

10. Slominski, RM; Zmijewski, MA; Slominski, AT Melaniini pigmendi roll melanoomi korral. Exp. Dermatol.2015, 24, 258–259. [CrossRef] [PubMed]11. Slominski, A.; Wortsman, J.; Tobin, DJ Naha serotoniinergiline/melatoninergiline süsteem: kindlustab koha päikese all. FASEB J. 2005, 19, 176–194. [CrossRef] [PubMed]

12. Sarkar, R.; Arora, P.; Garg, KV kosmeetikatooted hüperpigmentatsiooni jaoks: mis on saadaval? J. CtaneousAesthet. Surg. 2013, 6, 4–11. [CrossRef] [PubMed]

13. Miyamura, Y.; Coelho, SG; Wolber, R.; Miller, SA; Wakamatsu, K.; Zmudzka, BZ; Ito, S.; Smuda, C.;Passeron, T.; Choi, W.; et al. Inimese naha pigmentatsiooni ja ultraviolettkiirguse reaktsioonide reguleerimine. Pigment Cell Res. 2007, 20, 2–13. [CrossRef] [PubMed]

14. Davis, EK; Callender, VD Põletikujärgne hüperpigmentatsioon: nahavärvi epidemioloogia, kliiniliste tunnuste ja ravivõimaluste ülevaade. J. Clin. Aesthet. Dermatol. 2010, 3, 20–31. [PubMed]

15. Sales-Campos, H.; Souza, PR; Peghini, eKr; da Silva, JS; Cardoso, CR Ülevaade oleiinhappe moduleerivast mõjust tervisele ja haigustele. Mini. Rev. Med. Chem. 2013, 13, 201–210. [CrossRef] [PubMed]

16. Parvez, S.; Kang, M.; Chung, HS; Cho, C.; Hong, MC; Shin, MK; Bae, H. Nahadepigmenteerivate ja helendavate ainete uuring ja mehhanism. Phytother. Res. 2006, 20, 921–934. [CrossRef] [PubMed]

17. Luo, L.; Jiang, L.; Geng, C.; Cao, J.; Zhong, L. Hüdrokinoonist põhjustatud genotoksilisus ja oksüdatiivne DNA kahjustus HepG2 rakkudes. Chem. Biol. Suhelda. 2008, 173, 1–8. [CrossRef] [PubMed]

18. Enguita, FJ; Leitao, AL Hüdrokinoon: Keskkonnareostus, toksilisus ja mikroobide vastused. BioMed Res. Int. 2013, 2013, 542168. [CrossRef] [PubMed]

19. Draelos, ZD Nahka kergendavad preparaadid ja hüdrokinoonide poleemika. Dermatol. Seal. 2007, 20 308–313. [CrossRef] [PubMed]

20. Koo, JH; Lee, I.; Yun, SK; Kim, HU; Park, BH; Park, JW Seebistatud õhtupriimulaõli vähendab melanogeneesi B16 melanoomirakkudes ja vähendab UV-indutseeritud naha pigmentatsiooni inimestel. Lipiidid 2010, 45, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

21. Cordell, GA; Colvard, MD Loodustooted ja traditsiooniline meditsiin: paradigma sisselülitamine. J. Nat. Prod.2012, 75, 514–525. [CrossRef] [PubMed]

22. Panossian, A.; Wikman, G. Schisandra Chinensise Baili farmakoloogia: ülevaade Venemaa teadusuuringutest ja kasutusviisidest meditsiinis. J. Ethnopharmacol. 2008, 118, 183–212. [CrossRef] [PubMed]

23. Chen, P.; Pang, S.; Yang, N.; Meng, H.; Liu, J.; Zhou, N.; Zhang, M.; Xu, Z.; Gao, W.; Chen, B.; et al. Schisandrin B kasulikud mõjud südamefunktsioonile müokardiinfarkti hiirte mudelis. PLoS ONE 2013, 8, e79418. [CrossRef] [PubMed]

24. Lee, HJ; Jo, S.; Ryu, J.; Jeong, HS; Lee, G.; Ryu, MH; Jung, MH; Kim, H.; Kim, BJ SchisandraChinensis Turczi efektid. puuvilju dinitrofluorobenseeni poolt indutseeritud kontaktdermatiidi korral hiirtel. Mol. Med. Aruanne 2015,12, 2135–2139. [CrossRef] [PubMed]

25. Chun, JN; Cho, M.; Seega ma.; Jeon, JH Schisandra Chinensise puuviljaekstrakti ja selle lignaanide kaitsev toime südame-veresoonkonna haiguste vastu: molekulaarsete mehhanismide ülevaade. Fitoteraapia 2014, 97, 224–233.[CrossRef] [PubMed]

26. Kang, OH; Chae, HS; Choi, JH; Choi, HJ; Park, PS; Cho, SH; Lee, GH; Niisiis, HY; Choo, YK;Kweon, OH; et al. Schisandra Fructuse veeekstrakti mõju tsütokiinide vabanemisele inimese nuumrakuliinist. J. Med. Toit 2006, 9, 480–486. [CrossRef] [PubMed]

27. Poma, A.; Bianchini, S.; Miranda, M. L-türosiini poolt indutseeritud mikrotuumade tootmise inhibeerimine fenüültiouurea poolt inimese melanoomirakkudes. Mutat. Res. 1999, 446, 143–148. [CrossRef]

28. Kim, HJ; Kim, IS; Dong, Y.; Lee, IS; Kim, JS; Kim, JS; Woo, JT; Cha, BY Tsirsimariini melanogeneesi indutseeriv toime mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktori ja türosinaasi ekspressiooni suurenemise kaudu. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 8772–8788. [CrossRef] [PubMed]

29. Busca, R.; Abbe, P.; Mantoux, F.; Aberdam, E.; Peyssonnaux, C.; Eychene, A.; Ortonne, JP; Ballotti, R. Rasmediates the cAMP-dependent activation of extracellular signal-regulated kinases (ERK) melanotsüütides.EMBO J. 2000, 19, 2900–2910. [CrossRef] [PubMed]

30. Busca, R.; Ballotti, R. Tsükliline AMP on naha pigmentatsiooni reguleerimise võtmesõnum. Pigment Cell Res.2000, 13, 60–69. [CrossRef] [PubMed]

31. Hah, YS; Cho, HY; Lim, TY; Park, DH; Kim, HM; Yoon, J.; Kim, JG; Kim, CY; Yoon, TJ Melanogeneesi indutseerimine rapamütsiini poolt inimese MNT-1 melanoomirakkudes. Ann. Dermatol. 2012, 24, 151–157. [CrossRef][PubMed]

32. Yun, WJ; Kim, EY; Park, JE; Jo, SY; Bang, SH; Chang, EJ; Chang, SE Mikrotuubulitega seotud valgusahel 3 osaleb melanogeneesis MITF-i ekspressiooni reguleerimise kaudu melanotsüütides. Sci. Report.2016, 6, 19914. [CrossRef] [PubMed]

33. Spritz, RA; Kuulmine, VJ, Jr. Pigmentatsiooni geneetilised häired. Adv. Humm. Genet. 1994, 22, 1–45. [PubMed]

35. Kadekaro, AL; Chen, J.; Yang, J.; Chen, S.; Jameson, J.; Pöörake, VB; Cheng, T.; Kadakia, M.; Abdel-Malek, Z. -melanotsüüte stimuleeriv hormoon pärsib oksüdatiivset stressi inimese melanotsüütides ap53-vahendatud signaaliraja kaudu. Mol. Cancer Res. 2012, 10, 778–786. [CrossRef] [PubMed]

35. Wasmeier, C.; Hume, AN; Bolasco, G.; Seabra, MC Melanosoomid lühidalt. J. Cell Sci. 2008, 121 3995–3999. [CrossRef] [PubMed]

36. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Carlson, JA; Slominski, AT Melanogenees mõjutab III ja IV staadiumi melanoomiga patsientide üldist ja haigusvaba elulemust. Humm. Pathol. 2013, 44, 2071–2074. [CrossRef] [PubMed]

37. Slominski, A.; Kim, TK; Brozyna, AA; Janjetovic, Z.; Brooks, DL; Schwab, LP; Skobowiat, C.; Jozwicki, W.; Seagroves, TN Melanogeneesi roll melanoomi käitumise reguleerimisel: Melanogenees stimuleerib HIF-1 ekspressiooni ja HIF-sõltuvaid kaasnevaid radu. Arch. Biochem. Biophys. 2014, 563,79–93. [CrossRef] [PubMed]

38. Kim, HJ; Lee, JH; Shin, MK; Hyun Leem, K.; Kim, YJ; Lee, MH Gastrodia elata ekstraktoni melanogeneesi pärssiv toime HM3KO melanoomirakkudes. J. Cosmet. Sci. 2013, 64, 89–98. [PubMed]

39. Hemesath, TJ; Hind, ER; Takemoto, C.; Badalian, T.; Fisher, DE MAP kinaas seob transkriptsioonifaktori Microphtalmia c-Kit signaaliülekandega melanotsüütides. Loodus 1998, 391, 298–301. [PubMed]

40. Hind, ER; Ding, HF; Badalian, T.; Bhattacharya, S.; Takemoto, C.; Yao, TP; Hemesath, TJ; Fisher, DELineage-spetsiifiline signaalimine melanotsüütides. C-komplekti stimuleerimine värbab p300/CBP mikroftalmiasse.J. Biol. Chem. 1998, 273, 17983–17986. [CrossRef] [PubMed]

41. Bertolotto, C.; Abbe, P.; Hemesath, TJ; Bille, K.; Fisher, DE; Ortonne, JP; Ballotti, R. Microphthalmiagene toode signaalimuundurina cAMP-indutseeritud melanotsüütide diferentseerumisel. J. Cell Biol. 1998, 142 827–835. [CrossRef] [PubMed]

42. Pogenberg, V.; Ogmundsdottir, MH; Bergsteinsdottir, K.; Schepsky, A.; Phung, B.; Deineko, V.; Milewski, M.; Steingrimsson, E.; Wilmanns, M. Piiratud leutsiini tõmbluku dimerisatsioon ja melanotsüütide pearegulaatori MITF DNA äratundmise spetsiifilisus. Genes Dev. 2012, 26, 2647–2658. [CrossRef] [PubMed]

43. Flaherty, KT; Hodi, FS; Fisher, DE Geenidest ravimiteni: melanoomi suunatud strateegiad. Nat. Rev. Cancer2012, 12, 349–361. [CrossRef] [PubMed]

44. Lee, TH; Seo, JO; Baek, SH; Kim, SY Resveratrooli pärssiv toime melaniini sünteesile ultraviolett-B-indutseeritud pigmentatsiooni korral meriseanahas. Biomol. Seal. 2014, 22, 35–40. [CrossRef] [PubMed]

45. Su, TR; Lin, JJ; Tsai, CC; Huang, TK; Yang, ZY; Wu, MO; Zheng, YQ; Su, CC; Wu, YJ Melanogeneesi inhibeerimine gallushappega: PI3K/Akt, MEK/ERK ja Wnt/-cateninsignaling radade võimalik kaasamine B16F10 rakkudesse. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 20443–20458. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Yajima, I.; Kumasaka, MY; Thang, ND; Goto, Y.; Takeda, K.; Yamashita, O.; Iida, M.; Ohgami, N.; Tamura, H.; Kawamoto, Y.; et al. RAS/RAF/MEK/ERK ja PI3K/PTEN/AKT signaalimine pahaloomulise melanoomi progresseerumise ja ravi korral. Dermatol. Res. Harjuta. 2012, 2012, 354191. [CrossRef] [PubMed]

47. Kim, DS; Kim, SY; Moon, SJ; Chung, JH; Kim, KH; Cho, KH; Park, KC Ceramide pärsib rakkude proliferatsiooni AKT/PKB inaktiveerimise kaudu ja vähendab melaniini sünteesi Mel-Ab rakkudes. Pigment Cell Res. 2001, 14, 110–115. [CrossRef] [PubMed]

48. Kim, JH; Baek, SH; Kim, DH; Choi, TY; Yoon, TJ; Hwang, JS; Kim, MR; Kwon, HJ; Lee, CHD Melaniini sünteesi allareguleerimine A abil ja selle rakendamine in vivo välgumudelile. J. Investig. Dermatol. 2008, 128, 1227–1235. [CrossRef] [PubMed]

49. Hartman, ML; Czyz, M. MITF melanoomi korral: selle väljenduse ja aktiivsuse taga olevad mehhanismid. Cell Mol.Life Sci. 2015, 72, 1249–1260. [CrossRef] [PubMed]

50. Kim, DS; Hwang, ES; Lee, JE; Kim, SY; Kwon, SB; Park, KC sfingosiin-1-fosfaat vähendab melaniini sünteesi pideva ERK aktiveerimise ja sellele järgneva MITF-i lagunemise kaudu. J. Cell Sci. 2003, 116,1699–1706. [CrossRef] [PubMed]

51. Xu, W.; Gong, L.; Haddad, MM; Bischof, O.; Campisi, J.; Jah, ET; Medrano, EE Mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktori MITF valgu tasemete reguleerimine seoses ubikvitiini konjugeeriva ensüümiga hUBC9. Exp. Cell Res. 2000, 255, 135–143. [CrossRef] [PubMed]

52. Bennett, DC; Cooper, PJ; Hart, IR Mittekasvajaliste hiire melanotsüütide sari, mis on süngeensed B16 melanoomiga ja vajavad kasvuks kasvaja promootorit. Int. J. Cancer 1987, 39, 414–418. [CrossRef][PubMed]

53. Meira, WV; Heinrich, TA; Cadena, SM; Martinez, GR Melanogenees pärsib hingamist B16-F10 melanoomirakkudes, samas suurendab mitokondriaalsete rakkude sisaldust. Exp. Cell Res. 2017, 350, 62–72. [CrossRef][PubMed]

54. Ohguchi, K.; Tanaka, T.; Iliya, I.; Ito, T.; Iinuma, M.; Matsumoto, K.; Akao, Y.; Nozawa, Y. Gnetol kui potentsirosinaasi inhibiitor perekonnast Gnetum. Biosci. Biotehnoloogia. Biochem. 2003, 67, 663–665. [CrossRef] [PubMed]

55. Uchida, R.; Ishikawa, S.; Tomoda, H. Türosinaasi aktiivsuse ja melaniini pigmentatsiooni pärssimine 2-hüdroksütürosooli poolt. Acta Pharm. Sinica B 2014, 4, 141–145. [CrossRef] [PubMed]