AIMP{0}}tuletatud peptiidi (AdP) ja optimeeritud hüdrosooli funktsionaalsed fragmendid nende paikseks sadestumiseks Box-Behnkeni disaini järgi

Abstraktne:

Aminoatsüül-tRNA süntetaasi kompleksiga interakteeruv multifunktsionaalne proteiin 1 (AIMP1) tuletatud peptiid (AdP) on välja töötatud naha vananemisvastase kosmeetilise koostisainena, arvestades selle fibroblaste aktiveerivaid (FA) ja melanotsüüte inhibeerivaid (MI) funktsioone. Siiski oli AdP paikseks manustamiseks vajalik sobiv strateegia selle madala läbilaskevõime tõttu. Selles uuringus määrati AdP FA- ja MI-domeenid (vastavalt FA-AdP ja MI-AdP) funktsionaalse domeeni kaardistamise teel, kus testiti mitme AdP fragmendi aktiivsust fibroblastidel ja melanotsüütidel, ning hüdrosoolil põhineva paikse manustamise teel. nende AdP fragmentide jaoks valmistati süsteem ette. Hüdrosooli abiaine koostis optimeeriti viskoossuse ja kuivamiskiiruse maksimeerimiseks, kasutades Box-Behnkeni disaini. FA-AdP-ga laetud hüdrosooli kunstlikku nahale sadestumist hinnati Strat-M membraaniga (STM) varustatud Keshary-Chieni difusioonirakkude abil.

Fluorestseeruva värvainega märgistatud FA-AdP kvantifitseerimine STM-is viidi läbi infrapuna-fluorestsentskujutise abil. Optimeeritud hüdrosool näitas 127- korda suuremat peptiidide ladestumist STM-is kui vaba FA-AdP (p < 0,05). See töö viitab sellele, et FA- ja MI-AdP on vastavalt kortsudevastase ja valgendava tegevuse aktiivsed domeenid ning hüdrosooli võib kasutada paljulubava kosmeetilise koostisena AdP-de nahale viimiseks.

Uuringus leiti, et mida kõrgem on türosinaasi aktiivsus, seda rohkem toodetakse melaniini. Melaniini liigne tootmine võib põhjustada pigmenteerunud nahahaigusi, nagu tedretähnid, kloasmid, vanuselaigud ja melanoom. Eksperimentaalsed andmed näitavad, et kui Cistanche deserticola glükosiidide üldkontsentratsioon on vahemikus {{0}}.5-3.0mg·mL-1, on efekt türosinaasi aktiivsusele Sellel on inhibeeriv toime ning sellel on hea annuse ja toime suhe vahemikus 0,5–2,0 mg·mL-1, seega võib teada, et Cistanche'il on valgendav toime.

Klõpsake Cistanche'i kasulikkust tervisele

Märksõnad:

AIMP{0}}tuletatud peptiid (AdP); kosmeetiline peptiid; Box-Behnken disain; hüdrosool; peptiidide paikne manustamine

1. Sissejuhatus

Naha vananemine, mida iseloomustavad kortsude ja laigulise pigmentatsiooni teke ning naha kare ja kuivus, on keeruline bioloogiline protsess, mida põhjustavad mitmesugused sisemised ja välised tegurid [1,2]. Ekstratsellulaarne maatriks (ECM), mitte-rakuline struktuurikomponent, mis koosneb erinevatest biomakromolekulidest, on tihedalt seotud naha vananemisprotsessiga [3–5]. Kollageen, naha ECM-i põhikomponent, killustub pidevalt ja väheneb nahas vananemise tõttu [6,7]. Killustunud kollageen kahjustab naha struktuurset terviklikkust ja metaboolset funktsiooni, tekitades kortse [8,9]. Melaniini liigne ladestumine epidermises on teine ​​peamine naha vananemise tunnus, mille tagajärjeks on naha pigmentatsioon. See protsess on põhjustatud melanotsüütide soovimatust aktiveerumisest UV-kiirguse all [10,11].

Nii on välja töötatud naha vananemisvastased kosmeetilised koostisained, mis keskenduvad kortsude ja naha pigmentatsiooni vähendamisele. Hiljuti tõusid kosmeetikavaldkonnas tähelepanu keskpunktiks mitmesugused tsütokiinidest ja kasvufaktoritest saadud peptiidid nende vananemisvastase toime tõttu [6,12].

On teada, et aminoatsüül-tRNA süntetaasi kompleksiga interakteeruvad multifunktsionaalsed valgud (AIMP) moodustavad aminoatsüül-tRNA süntetaasidega (ARS) multi-süntetaaside kompleksi (MSC). See MSC toimib valgu translatsioonimasina olulise komponendina [13]. Selle valguperekonna liikmete hulgas on AIMP1 pälvinud kosmeetika valdkonnas palju tähelepanu, arvestades selle haavade paranemise aktiivsust [14, 15]. Sekreteeritud AIMP1 indutseerib ERK-sõltuva raja kaudu haavakahjustuses fibroblastide kollageeni sünteesi, mis viib kiire traumajärgse paranemiseni [16]. Lisaks stimuleerib AIMP1 mesenhümaalseid tüvirakke proteiinkinaasi B (PKB) vahendatud kateniini aktiveerimise ja allavoolu interaktsioonide kaudu, suurendades MSC-de taset vereringes [17].

Huvitav on see, et need AIMP1 erinevad rakuvälised funktsioonid omistatakse selle struktuuri erinevatele piirkondadele. Näiteks soodustab see valk fibroblastide proliferatsiooni oma 6–46 aminohappelise piirkonna kaudu [18]. Seega töötati selle piirkonna AIMP1-tuletatud peptiid (AdP; INCI nimi: sh-oligopeptide 5/sh-oligopeptide 5 SP) naha vananemisvastase kosmeetikavahendina. Eelmise uuringu kohaselt on AdP-l kaks funktsiooni, nimelt fibroblastide aktiveeriv ja melanotsüüte inhibeeriv toime [13]. Nende funktsioonide aktiivsete domeenide kohta pole aga teatatud.

Peptiidide kohaletoimetamine läbi naha on naha kaitsva olemuse tõttu keeruline. Naha füsioloogiline roll on barjäär keskkonnategurite, nagu UV-valgus, mikroorganismid ja ksenobiootikumid, vastu [19]. Sarvkiht (SC) on naha välimine kiht ja koosneb kristallilisest lipiidmaatriksist, mis on põimitud korneotsüütidega [20]. SC all annab nahale struktuurse terviklikkuse elujõuline epidermis, mis koosneb stratum granulosum, stratum spinosum ja stratum basale. Nende kihtide hulgas on SC peptiidi kohaletoimetamise peamine takistus, kuna see koosneb väga hüdrofoobsest lipiidmaatriksist ja tihedalt pakitud korneotsüütidest.

Selle probleemi lahendamiseks on tehtud mitmeid katseid, sealhulgas liposoome, mikroemulsiooni, iontoforeesi, elektroporatsiooni ja mikronõela [21–25]. Kuid kõige usaldusväärsem ja reprodutseeritavam meetod naha kohaletoimetamise parandamiseks kasutab läbitungimise parandajaid [26]. Selles uuringus võeti kasutusele etanool, peptiidide läbitungimise parandaja [27]. Lisaks valiti hüdrosoolil põhineva paikse manustamissüsteemi valmistamiseks mittetoksiline paksendaja naatriumkarboksümetüültselluloos (CMC). CMC on tänapäeval kõige sagedamini kasutatav tselluloosi derivaat, mille rakendused hõlmavad kosmeetikat, toidu lisaaineid, paberit, tekstiili ja farmaatsiatooteid [28]. CMC-d toodetakse polüsahhariidide, nagu tärklis, puuvillalintrid ja kašupähklipuu karboksümetüülimise teel, mis muudab vees lahustuvaks, keemiliselt stabiilseks, mittetoksiliseks, bioloogiliselt ühilduvaks ja biolagunevad omadused [29].

Hüdrosooli koostis optimeeriti, kasutades reageerimispinna metoodikat (RSM), et tagada nahale manustamiseks sobiv viskoossus ja kuivamiskiirus. See statistiline meetod nõuab palju vähem katsetamist ja aega, et saavutada toote kriitilised kvaliteediatribuudid, võrreldes OFAT-meetoditega [30,31]. RSM annab ka sõltumatute muutujate olulisuse ja nende vastasmõju [32]. Selles uuringus kasutatud Box-Behnkeni disain (BBD) kuulub RSM-i ja sellel on teiste RSM-i kujundustega võrreldes palju eeliseid, mis nõuavad kolme või nelja muutujaga juhul vähem käitamist [33]. Lisaks saab BBD vältida kombineeritud tegurite äärmusi, kuna mudeli koostamiseks kasutatakse serva keskpunkti andmeid [34].

Selles uuringus määrati AdP fibroblastide aktiveerivad ja melanotsüüte inhibeerivad domeenid (vastavalt FA- ja MI-AdP), et käsitleda funktsionaalset eraldamist. FA-AdP fragment laaditi optimeeritud hüdrosooli ja selle kunstlikku naha sadestumist hinnati infrapuna-fluorestsentskujutise tehnikaga.

2. Tulemused

2.1. AIMP{2}}tuletatud peptiidi (AdP) funktsionaalsed fragmendid

AdP, {{0}} kuni 46- AIMP1 jäägifragmendil on nahaga seotud rakus kaks funktsiooni (st fibroblastide aktiveeriv ja melanotsüüte inhibeeriv toime). Funktsionaalseks eraldamiseks kasutati AdP fragmendid (Fr1: 6–20, Fr2: 10–24, Fr3: 14–28, Fr4: 18–32, Fr5: 26–40 ja Fr6: 32–46 AIMP1 jäägi fragmenti). toodetud tahkefaasilise sünteesi teel ja testitud fibroblastide ja melanotsüütide peal. AdP (FA-AdP) fibroblasti aktiveeriva domeeni uurimiseks määrati pärast iga fragmendi töötlemist kollageeni induktsioon ja rakkude proliferatsioon. Fr3 näitas kollageeni sünteesil ja fibroblastide proliferatsioonil AdP-ga sarnast induktsiooniaktiivsust (joonis 1a, b). Võrreldes EGF-iga (1 µg/ml), oli Fr3 (0,1 µg/ml) kollageeni indutseerimise ja fibroblastide proliferatsiooni osas vastavalt 15 protsenti ja 10 protsenti tugevam.

AdP (MI-AdP) melanotsüüte inhibeeriva domeeni tuvastamiseks töödeldi AdP (Fr1–6) fragmente -MSH-indutseeritud melanotsüütidega. Nende hulgas näitas Fr4 -MSH ja AdP indutseeritud melaniini sünteesi võrreldavat inhibeerimist (joonis 1c). Veelgi enam, võrreldes albumiiniga (10 µM), avaldas Fr4 (1 µg/mL) melaniini sünteesi 35 protsenti suuremat inhibeerivat toimet.

Joonis 1. AIMP1-tuletatud peptiidi (AdP) fibroblasti aktiveeriva (FA) ja melaniini inhibeeriva (MI) domeeni kaardistamine: (a) Eesnaha fibroblaste töödeldi EGF-iga (1 µg/ml), AdP-ga ({ {5}},1 µg/mL) ja AdP fragmendid (Fr1–Fr6; 0,1 µg/mL). Pärast 24-tunnist inkubeerimist määrati ELISA meetodil kultiveerimissöötmes I tüüpi prokollageen; (b) pärast 48-tunnist inkubeerimist viidi läbi CCK{13}}analüüs, et jälgida eesnaha fibroblastide proliferatsiooni; (c) -MSH-ga (0,5 µM) eelnevalt töödeldud melanotsüüte töödeldi albumiiniga (At, 10 µM), AdP (1 µg/mL) ja AdP fragmentidega ( Fr1–Fr6, 1 µg/ml). Pärast 48-tunnist inkubeerimist mõõdeti rakusisest melaniini. Andmed on esitatud kui keskmine ± standardhälve (SD) (n=3). * p < 0,05 ja ** p < 0,01, erinevad oluliselt kontrollist.

2.2. FA- ja MI-AdP tsütotoksilisuse ja immunogeensuse testid

Kuna ohutuse küsimus on kosmeetikavaldkonnas oluline, viidi läbi FA-AdP ja MI-AdP (st vastavalt Fr3 ja Fr4) tsütotoksilisuse ja immunogeensuse testid. Nende peptiidide ohutuse tagamiseks töödeldi suures koguses FA-AdP või MI-AdP, et saavutada 100 korda efektiivne kontsentratsioon. Keratinotsüütides ei näidanud FA-AdP ja MI-AdP tsütotoksilisust kuni 100 µg/ml (joonis 2a). Immunogeensuse testide jaoks töödeldi FA-AdP ja MI-AdP monotsüütides. Nagu on näidatud joonisel fig 2b, ei erinenud peptiidiga töödeldud rühmade TNF-i tase kontrollrühma omaga võrreldes (joonis 2b).

Joonis 2. FA-AdP ja MI-AdP mittetsütotoksilisus ja mitteimmunogeensus: (a) FA-AdP ja MI-AdP tsütotoksilisuse testimiseks inkubeeriti keratinotsüüte (HaCaT rakke) doksorubitsiiniga (Dox, 1{{ 29}} µM), AdP (100 µg/ml), FA-AdP (10 või 100 µg/mL) ja MI-AdP (10 või 100 µg/ml). Pärast 24-tunnist inkubeerimist määrati tsütotoksilisus CCK-8 testiga; (b) immunogeensuse testi jaoks kasutati monotsüüte (THP-1 rakke). Pärast 12-tunnist inkubeerimist LPS-iga (50 ng/mL), AdP (100 µg/mL), FA-AdP (10 või 100 µg/ml) ja MI-AdP (10 või 100 µg/mL) on TNF-tase mõõdeti ELISA meetodil kultiveeritud söötmes. Andmed on esitatud keskmisena ± SD (n=3). ** p < 0,01, erineb oluliselt teistest.

2.3. AdP hüdrosooli viskoossus

Et demonstreerida AdP paremat paikset manustamist läbi sarvkihi (SC), valmistati ja hinnati FA-AdP-ga laetud hüdrosoolpreparaadid, mis koosnesid CMC-st, etanoolist ja glütseriinist. AdP hüdrosoolide viskoossuse väärtused jäid vahemikku 116,1–267,1 cps (tabel 1).

Viskoossuse väärtused suurenesid, kui CMC (x1), etanooli (x2) ja glütseriini (x3) kontsentratsioonid muutusid madalatelt kõrgetele väärtustele. Koefitsiendid x1, x2, x3 ja x2·x3 kodeeritud regressioonivõrrandis olid vastavalt 28,25, 32,91, 30,16 ja 19,53, mis näitab, et lineaarsetel liikmetel on viskoossusele olulisem mõju kui interaktsiooni termin. Tegelikud, korrigeeritud ja prognoositud määramiskoefitsiendi (R 2 ) väärtused olid vastavalt 0,9049, 08668 ja 0,7364. Nende väärtuste sarnasus viitab sellele, et mudel ei olnud liiga paigaldatud. Reaktsioonipinna graafikud, mis näitavad sõltumatute muutujate mõju hüdrosooli viskoossusele, on esitatud joonisel 3. Nagu ülalmainitud võrrandist eeldati, avaldasid CMC, etanooli ja glütseriini kontsentratsioonid viskoossusele positiivset mõju.

2.4. AdP hüdrosooli kuivamiskiirus

Hüdrosooli massikadu kuivatamisel on näidatud joonisel 4a ja kuivatuskiiruse konstandi (k) väärtused arvutati edukalt, sobitades nende andmetega esimest järku mudelit (R 2 > 0.951; tabel 1). ). K-väärtused jäid vahemikku 0.0083–0,0242 min−1 ja k (y2) redutseeritud mudelivõrrand kodeeritud ühikutes on järgmine:

mis koosneb ainult terminitest, millel on oluline mõju k-väärtustele (p < 0.{{10}}5; tabel 2). Positiivsed koefitsiendid x2 ja x2 × 2 viitavad sellele, et k-väärtused suurenesid etanooli kontsentratsiooni tõustes, samas kui x3 liikme negatiivne koefitsient näitas selgelt glütseriini kuivatamist pärssivat toimet. Selle mudeli tegelikud, kohandatud ja prognoositud R 2 väärtused olid vastavalt 0,9839, 0,9775 ja 0,9659, mis kinnitab, et mudel suudab seletada k-väärtusi rohkem kui 98 protsenti ilma liigselt sobitamata. Vastuse pinna graafikud, mis näitavad seost sõltumatute muutujate ja hüdrosooli k-väärtuste vahel, on esitatud joonisel 4 bd. Tähelepanuväärne on see, et kuigi interaktsiooniliikmel x1·x2 on negatiivne koefitsiendi väärtus, oli etanooli kontsentratsiooni üldine mõju k-väärtustele katsetingimustes positiivne.

2.5. AdP hüdrosooli optimeerimine komposiidi soovitavuse põhjal

Optimeerimisgraafikud, mis näitavad soovitud funktsioone, on näidatud joonisel 5. Maksimaalne liitsoovitavus (D) 0,8912 saadi CMC, etanooli ja glütseriini kontsentratsioonidel 0,229 protsenti (w) /v), vastavalt 50 protsenti (v/v) ja 20 protsenti (maht/maht). 1-le lähedane D-väärtus viitab sellele, et nii viskoossus kui ka k saavutasid tervikuna soodsad (st maksimeeritud) tulemused. Viskoossuse (d1) ja k (d2) individuaalsed soovitavad väärtused olid vastavalt 1.{12}} ja 0,79429, mis tähendab, et ülaltoodud hüdrosooli koostis on viskoossuse maksimeerimisel tõhusam kui k. Pange tähele, et kuigi CMC ja glütseriini kontsentratsioonidel oli viskoossusele ja k-le vastupidine mõju, näitas ainult CMC kontsentratsiooni termin D-funktsiooni maksimumpunkti. Etanooli kontsentratsiooni termin näitas meie katsetingimustes ainult positiivset mõju.

2.6. Kunstliku naha ladestumise uuring

Fluorestseeruva värvainega märgistatud FA-AdP hüdrosooli Strat-M membraani (STM; tehisnaha) sadestumist jälgiti lähi-infrapuna fluorestsentsi (NIR) kujutisega (joonis 6). Optimeerimisuuringute tulemuste põhjal oli märgistatud FA-AdP-ga täidetud hüdrosool, mis sisaldas CMC-d, etanooli ja glütseriini kontsentratsioonides 0,229% (w/v), 50% (maht/maht). v) ja lõplikuks preparaadiks valiti 20% (maht/maht). 8-tunnisel inkubeerimisel oli hüdrosooliga töödeldud STM-i keskmine fluorestsentsi intensiivsus 127- korda kõrgem kui vaba FA-AdP (st lahus topeltdeioniseeritud vees) töödeldud STM-i omast (p < 0,05). Variatsioonikoefitsiendi (CV) väärtused olid aga kahe rühma vahel võrreldavad (vastavalt 10,6 protsenti ja 14,8 protsenti FA-AdP-ga täidetud hüdrosooli ja vaba FA-AdP puhul), mis toetab väljatöötatud hüdrosooli dramaatilist võimendavat toimet. .

3. Arutelu

Funktsionaalse domeeni määramiseks lõigati AdP lahti. AdP fibroblastide aktiveeriv domeen (FA-AdP, sh-oligopeptiid 84) ja AdP melanotsüüte inhibeeriv domeen (MI-AdP, sh-oligopeptiid 91 SP) osutusid vastavalt 14–28 ja 18–32 AIMP1 jäägiks. . Hoolimata nende järjestuste 66-protsendilisest homoloogiast, näitasid need kaks peptiidi nahaga seotud rakkudes erinevaid funktsioone, mida võib seletada sekundaarsete / tertsiaarsete struktuuride või interaktsioonipartnerite erinevusega. Iseloomulikud kolmemõõtmelised struktuurid võimaldavad isegi kõrge homoloogiaga peptiididel omada selget bioloogilist aktiivsust, pakkudes erinevaid interaktsiooniliideseid [35]. Samal ajal on FA-AdP ja MI-AdP 15-aminohappe (aa) pikkusega peptiidid, mis on palju lühemad kui AdP (41-aa pikkusega peptiid). Üldiselt on kärbitud peptiididel eeliseid, nagu lihtsa ja kulutõhusa sünteesi teostatavus ja naha läbitungimise parandamine, mis viitab sellele, et FA-AdP ja MI-AdP on atraktiivsed kosmeetilised koostisosad.

Kuid eelmise uuringu kohaselt tuleb need peptiidid naha vananemisvastase toime avaldamiseks toimetada pärisnahka, kus asuvad fibroblastid [13]. Seega töötati selle kohaletoimetamise probleemi lahendamiseks välja hüdrosool-tüüpi preparaadid. Etanooli ja glütserooli kasutati kärbitud AdP-ga täidetud hüdrosooli põhikomponentidena. Etanool on kosmeetikatööstuses sageli kasutatav läbitungimise parandaja, mis võib parandada peptiidide nahale jõudmist mitme mehhanismi abil. Etanool võib muuta nahakoe füüsilist seisundit või isegi ekstraheerida mõningaid SC kihti moodustavaid lipiide, mille tulemuseks on peptiidivoo paranemine läbi naha [36]. Peale selle võib etanool suurendada peptiidi kontsentratsiooni pärast manustamist selle kiire kadumise tõttu aurustumisel või naha imendumisel. Sellest tulenev peptiidi üleküllastumine võib anda suurema naha kohaletoimetamise potentsiaali [26]. Etanool võib peptiidi tungimise ajal ka otse nahka tõmmata [37].

Kuigi etanooli kontsentratsiooni kuni 80 protsenti saab kasutada ilma nahaärrituseta [38], piiras CMC sadestumine kõrge etanooli kontsentratsiooni korral selle maksimaalse sisalduse hüdrosoolis selles uuringus 50 protsendini. Glütseriin võib samuti parandada peptiidi kohaletoimetamise efektiivsust, mille aluseks on SC-kihi hüdratsioon [39]. Naha niisutamine võib suurendada hüdrofiilsete ühendite, sealhulgas peptiidide perkutaanset imendumist [26].

Veelgi enam, viskoossus ja k-väärtused võivad mõjutada ka peptiidi kohaletoimetamise efektiivsust ja kasutamise mugavust [40,41]. Täpsemalt on kõrgem viskoossus tihedalt seotud hüdrosooli pikema nahapeetusega ning kiirem kuivamiskiirus tagab peptiidide kontsentratsiooni gradiendi kiire arengu hüdrosooli ja naha vahel [40,41]. Vastavalt Ficki esimesele difusiooniseadusele tuleb peptiidi suurima voo saamiseks maksimeerida mõlemad omadused. Seega peeti viskoossust ja k-väärtusi selles uuringus kriitilisteks kvaliteedinäitajateks (CQA). Piisava viskoossuse saavutamiseks lisati hüdrosoolile paksendajana CMC. Kuna aga CMC sadestub kõrge kontsentratsiooniga etanooli juuresolekul, ei lisatud CMC-d rohkem kui 0,3 protsenti.

Huvitav on see, et isegi selle madala kontsentratsiooni korral avaldas CMC meie eeluuringus negatiivset mõju kuivamiskiirusele (andmeid pole näidatud), mis viitab vajadusele süstemaatilise lähenemisviisi järele selle optimeeritud sisu saavutamiseks. Seetõttu võeti kasutusele BBD, et hinnata põhjalikumalt hüdrosooli koostiste ja CQA-de vahelist seost. Selle seose põhjal saadi optimeeritud kompositsioon, mis näitab maksimeeritud D-väärtust.

Optimeeritud hüdrosooli hinnati selle AdP-de nahale toimetamise tõhususe järgi. Siiski ei soovitata kosmeetikatoodete katsetamisel kasutada tavalisi loomanahka kasutavaid uuringumudeleid [42]. Alternatiivina loomanahale võeti kasutusele sünteetiline membraan STM, millel on inimese nahaga sarnane struktuur. Lipiididega kaetud tihe pealmine kiht meenutab SC-d. Pealmise kihi all on kaks polüeetersulfooni (PES) kihti toestatud polüolefiinist mittekootud maatriksiga. Need struktuurid jäljendavad vastavalt dermist ja nahaalust kudet [43]. Pärast kunstliku naha sadestumise uuringut hinnati STM-i proove NIR-kuvamisseadme abil, et määrata FA-AdP sadestumine. NIR-pildistamine annab teavet STM-i peptiidide sadestumise kogumahu kohta peaaegu koheselt. Lisaks, kuna see meetod ei nõua proovide hävitavat eeltöötlust, nagu homogeniseerimine, ekstraheerimine ja kontsentreerimine, saab tervete proovide fluorestsentsi intensiivsust ruumilise teabe abil visualiseerida. Täheldatud dramaatiline FA-AdP ladestumise suurenemine kunstnahas viitab sellele, et väljatöötatud hüdrosooli võiks kasutada paljutõotava paikse AdP-de kohaletoimetamise süsteemina naha vananemisvastaseks raviks.

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Rakukultuur ja reaktiivid

Eesnaha fibroblaste (HFF-1), keratinotsüüte (HaCaT) ja melanotsüüte (B16F10) kasvatati DMEM söötmes, millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit (FBS) ja antibiootikume (100 U/mL penitsilliini ja 100 µg/ml streptomütsiini). ). THP-1 rakke kultiveeriti RPMI 1640 söötmes, millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i ja antibiootikume (100 U/ml penitsilliini ja 100 µg/ml streptomütsiini). Rakke kultiveeriti temperatuuril 37 ◦C niisutatud atmosfääris 5% CO2 juures. Kõik peptiidid sünteesiti tahkefaasilise sünteesi meetodil, nagu meie rühm on varem teatanud [13]. Blanose™ naatriumkarboksümetüültselluloos 7LP EP (CMC; 90,5 kDa) osteti ettevõttest Ashland (Schaffhausen, Šveits). Glütseriin ja etanool saadi ettevõttelt Samchun Chemical Co., Ltd. (Soul, Korea). Alexa Fluor™ 647 NHS ester osteti firmast Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Strat-M membraan (STM) saadi firmalt EMD Millipore Co. (Billerica, MA, USA). Fosfaatpuhverdatud soolalahus (PBS) osteti ettevõttelt Lonza Group Ltd. (Basel, Šveits). Kõik muud reaktiivid olid analüütiliselt puhtad ja osteti kaubanduslikest allikatest.

4.2. Kollageeni ELISA

Eesnaha fibroblastirakud (HFF-1; 5 × 104 rakku süvendi kohta) külvati 24-süvendiga kultiveerimisplaadile. Enne peptiidiga töötlemist eelinkubeeriti rakke seerumivaba DMEM söötmega 6 tundi. Rakke töödeldi AdP, hEGF-iga (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja AdP fragmentidega 24 tundi. Pärast 24-tunnist töötlemist koguti sööde kollageeni ELISA testi jaoks. Söötmes sisalduv I tüüpi prokollageen määrati Procollagen I tüüpi ELISA komplektiga (Takara, Kusatsu, Jaapan) vastavalt tootja juhistele. I tüüpi prokollageeni kogus söötmes normaliseeriti kontrollrühma I tüüpi prokollageeni kogusega.

4.3. Proliferatsiooni test

Eesnaha fibroblastirakud (HFF-1; 3 × 103 rakku süvendi kohta) külvati 96-süvendiga plaadile ja kultiveeriti. Rakud asendati seerumivaba söötmega ja seejärel töödeldi AdP, hEGF ja AdP fragmentidega 48 tundi. Rakkude proliferatsioon määrati CCK-8 testiga (Dojindo, Kumamoto, Jaapan) vastavalt tootja juhistele. Proliferatsioon normaliseeriti kontrollrühma proliferatsiooniga.

4.4. Melaniini mõõtmine

Melanotsüüdid (B16F10; 1 × 105 rakku süvendi kohta) külvati 6-süvendiga plaadile ja kultiveeriti. Melaniini sünteesi indutseerimiseks kasutati melaniini indutseerijat -MSH (0,5 uM). AdP-d ja AdP fragmente töödeldi -MSH-ga (0,5 uM) 48 tundi. Intratsellulaarset melaniini ja türosinaasi aktiivsust jälgiti, nagu eelnevalt teatatud [13]. Lühidalt, melanotsüüdid (1 × 105 rakku) lüüsiti 1 N NaOH-ga temperatuuril 70 °C 1 tund. Intratsellulaarne melaniin määrati lüüsitud proovides 490 nm lainepikkuse neeldumise järgi, kasutades mikroplaadilugejat (Synergy 2, BioTek, Winooski, VM, USA).

4.5. Tsütotoksilisuse ja immunogeensuse testid

FA-AdP ja MI-AdP ohutust kontrolliti tsütotoksilisuse ja immunogeensuse osas. Peptiidide tsütotoksilisuse testimiseks külvati keratinotsüüdid (HaCaT; 3 × 103 rakku süvendi kohta) 96-süvendiga plaadile ja kultiveeriti. Rakke inkubeeriti doksorubitsiini (Dox, 10 µM), AdP (100 µg/ml), FA-AdP (10 või 100 µg/ml) või MI-AdP (10 või 100 µg/mL). Pärast 24-tunnist inkubeerimist määrati tsütotoksilisus CCK-8 testiga (Dojindo) vastavalt tootja juhendile. Peptiidide immunogeensust hinnati TNF-ELISA abil. THP-1 rakud (5 × 104 rakku süvendi kohta) külvati 24-süvendiga plaadile. Rakke eelinkubeeriti 1% FBS-i sisaldava söötmega 6 tundi. Pärast eelinkubeerimist töödeldi rakke 10 ng/ml LPS, AdP ja AdP fragmentidega. Pärast 12-tunnist töötlemist koguti konditsioneeritud sööde TNF-ELISA testi jaoks. TNF-i kogust konditsioneeritud söötmes hinnati inimese TNF-ELISA komplektiga (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) vastavalt tootja juhistele. TNF-i kogus konditsioneeritud söötmes normaliseeriti kontrollrühma TNF-i kogusega.

4.6. FA-AdP-laetud hüdrosooli valmistamine

FA-AdP hüdrosoolpreparaadid valmistati CMC, glütseriini ja etanooli abil. CMC lahustati kuumas topeltdeioniseeritud vees (DDW; 80 °C), segades pidevalt kiirusel 700 p/min 3 tundi, et valmistada 3-protsendiline (mass/maht) töölahus. Glütseriin ja etanool segati CMC lahusega, kasutades homogenisaatorit (Ultra-Turrax T-25, IKA Works GmbH & Co. KG, Staufen, Saksamaa) kiirusel 14, 000 pööret minutis 5 minutit. Segule lisati DDW-s lahustatud FA-AdP, et saada lõplik preparaat FA-AdP kontsentratsiooniga 20 uM.

4.7. Hüdrosooli optimeerimise eksperimentaalne disain

FA-AdP hüdrosooli füüsikalis-keemiliste omaduste optimeerimiseks kasutati Box-Behnkeni disaini (BBD). Sõltumatuteks muutujateks valiti CMC (x1), etanooli (x2) ja glütseriini (x3) kontsentratsioonid. Nende tegurite mõju hüdrosooli viskoossusele (y1) ja kuivamiskiiruse konstandile (y2) hinnati kolmel tasemel. Sealhulgas kolm kordust kesklinnas, viidi läbi 15 katset. Eksperimentaalsed kombinatsioonid on esitatud tabelis 1. Kõige paremini sobivad ruutmudelid loodi Minitab® 18.1 (Minitab Inc., State College, PA, USA) abil, et uurida kolme teguri lineaarset, ruutsuurust ja interaktsiooniefekte. Ainult muutujaid p-väärtusega < 0.05 peeti oluliseks ja kaasati mudelisse. Randomiseeritud katsete tulemuste põhjal saadi 3-mõõtmelised pinnagraafikud. Loodi optimeerimisgraafikud, mis näitavad soovitavuse funktsioone, ja hinnati sõltumatute muutujate kombinatsiooni, millel oli maksimaalne liitsoovitavus (D). D-väärtus saadi individuaalse soovi (d) geomeetrilise keskmisena, kasutades järgmist valemit:

kus d1 ja d2 tähistavad vastavalt hüdrosooli viskoossuse ja kuivamiskiiruse konstandi individuaalset soovitavust ning kaalutegurit ei kasutatud.

4.8. Viskoossuse ja kuivamiskiiruse mõõtmine

FA-AdP hüdrosooli viskoossust mõõdeti, kasutades LV-1 spindliga varustatud viskosimeetrit DV-II plus Pro (Ametek Brookfield, Middleborough, MA, USA). Mõõtmine tehti vahemikus 50–60 protsenti instrumendi pöördemomendi skaalast temperatuuril 25 ◦C. Kuivamiskiiruse hindamiseks laaditi väljatöötatud preparaatide alikvoodid (200 ui) teadaoleva kaaluga nõudesse (pindala: 63,6 mm2) ja inkubeeriti kuivas ahjus (32 °C). Nende kaalumuutusi jälgiti 0, 15, 30, 45 ja 60 minuti järel. Kuivatuskiiruse konstant (k; min-1 ) arvutati, kasutades esimest järku korrelatsiooni kuivamisel toimunud massimuutuse ja kulunud aja vahel. Regressioonijooned joonistati järgmise võrrandi järgi:

4.9. Naha kunstliku ladestumise hindamine lähi-infrapuna fluorestsentskujutise abil

Kunstliku naha sadestumise uuring viidi läbi NIR-kujutise abil. FA-AdP (4 mg) lahustati 0,1 M naatriumvesinikkarbonaatpuhvris (1 ml, pH 8,3) ja segati aeglaselt Alexa Fluor™ 647 NHS-estriga (50 µg). Segu inkubeeriti toatemperatuuril 2 tundi. Fluorestsentsmärgisega FA-AdP puhastati PD-10 soolatustamiskolonni (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) abil ja selle kontsentratsiooni mõõdeti bitsinhoniinhappe valguanalüüsi komplektiga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MS, USA) vastavalt tootja protokollile.

Fluorestsentsmärgistatud FA-AdP-ga laetud hüdrosool valmistati sama meetodi kohaselt, mis on kirjeldatud jaotises 4.6. Hüdrosooli koostis, mis näitas kõrgeimat komposiitsoovitust, valiti nahale manustamise uuringu optimeeritud koostiseks. Fluorestsentsmärgistatud FA-AdP kontsentratsioon hüdrosoolis oli 20 uM. DDW-s lahustatud märgistatud FA-AdP hüdrosooli või märgistatud FA-AdP (20 uM, kontrollrühm) alikvoot (1 ml) kanti STM-i ülemisele küljele, mis oli kinnitatud Keshary-Chieni difusiooniraku doonor- ja retseptorrakkude vahele. FCDV-15 difusioonelemendi ajami konsool; Labfine, Anyang, Korea). Difusiooniraku pindala oli 1,76 cm2 ja katse viidi läbi temperatuuril 32 ◦C pimedas. Pärast 8-tunnist inkubeerimist koguti STM ja pesti 5 korda liigse koguse DDW-ga. Kunstnaha proovide NIR-i intensiivsust mõõdeti seadmega VISQUE® InVivo Smart (Vieworks, Anyang, Korea).

4.10. Statistika

Statistiline analüüs (paaritu kaheosaline Studenti t-test) viidi läbi SPSS-i statistikatarkvara abil (versioon 21.0; IBM Corp, NY, USA). Kõik tulemused on esitatud kui keskmine ± standardhälve (SD) ja p-väärtust alla 0,05 peeti statistiliselt oluliseks.

Autori kaastööd:

Kõik autorid on sellesse töösse olulise panuse andnud: kontseptualiseerimine, J.-YL ja MCP; metoodika, Y.-MH, T.-WK ja K.-RL; tarkvara, DHK; uurimine, J.-JL, Y.-MH, T.-WK, HSL, WJJ, JK ja SK; kirjutamine – algse eelnõu ettevalmistamine, J.-JL; kirjutamine – muudetud eelnõu ettevalmistamine, Y.-MH ja T.-WK; kirjutamine-retsenseerimine ja toimetamine, J.-YL ja MCP; järelevalve, D.-DK, SKK ja C.-WC; projektihaldus, J.-YL ja MCP; rahastamise omandamine, J.-YL

Rahastamine:

Seda tööd toetas Chungnam National University uurimisfond.

Huvide konfliktid:

Autorid ei kinnita huvide konflikti. Rahastajatel ei olnud uuringu kavandamisel mingit rolli; andmete kogumisel, analüüsimisel või tõlgendamisel; käsikirja kirjutamisel või tulemuste avaldamise otsuses.

Viited

1. Ganceviciene, R.; Liakou, AI; Theodoridis, A.; Makrantonaki, E.; Zouboulis, CC Naha vananemisvastased strateegiad. Dermato-endokrinoloogia 2012, 4, 308–319. [CrossRef]

2. Pena Ferreira, MR; Costa, arvuti; Bahia, FM Kortsudevastaste toodete tõhusus nahapinna väljanägemisel: võrdlev uuring, milles kasutati mitteinvasiivseid meetodeid. Nahk. Res. Technol. 2010, 16, 444–449. [CrossRef]

3. Hynes, RO Rakuväline maatriks: mitte ainult ilusad fibrillid. Teadus 2009, 326, 1216–1219. [CrossRef] [PubMed]

4. Frantz, C.; Stewart, KM; Weaver, VM Rakuväline maatriks lühidalt. J. Cell Sci. 2010, 123, 4195–4200. [CrossRef]

5. Klausel, KC; Barker, TH Ekstratsellulaarse maatriksi signaalimine morfogeneesis ja parandamises. Curr. Arvamus. Biotehnoloogia. 2013, 24, 830–833. [CrossRef]

6. Malerich, S.; Berson, D. Järgmise põlvkonna kosmeetikatooted: uusimad peptiidid, kasvufaktorid, tsütokiinid ja tüvirakud. Dermatol. Clin. 2014, 32, 13–21. [CrossRef] [PubMed]

7. Uitto, J. Elastiini ja kollageeni roll naha vananemises: sisemine vananemine versus fotosäritus. J. Drugs Dermatol. 2008, 7, s12–s16.

8. Fligiel, SE; Varani, J.; Datta, SC; Kang, S.; Fisher, GJ; Voorhees, JJ Kollageeni lagunemine vananenud/fotokahjustatud nahas in vivo ja pärast kokkupuudet maatriksi metalloproteinaasiga-1 in vitro. J. Uurimine. Dermatol. 2003, 120, 842–848. [CrossRef] [PubMed]

9. Varani, J.; Perone, P.; Fligiel, SE; Fisher, GJ; Voorhees, JJ I tüüpi prokollageeni tootmise pärssimine fotokahjustuses: korrelatsioon suure molekulmassiga kollageeni fragmentide olemasolu ja vähenenud prokollageeni sünteesi vahel. J. Invest. Dermatol. 2002, 119, 122–129. [CrossRef] [PubMed]

10. Carsberg, CJ; Warenius, HM; Friedmann, PS Ultraviolettkiirguse poolt indutseeritud melanogenees inimese melanotsüütides. Proteiinkinaasi moduleeriva toimed CJ Cell Sci. 1994, 107, 2591–2597.

11. Brenner, M.; Kuulmine, VJ Melaniini kaitsev roll UV-kahjustuste eest inimese nahas. Photochem. Photobiol. 2008, 84, 539–549. [CrossRef] [PubMed]

12. Lintner, K.; Mas-Chamberlin, C.; Mondon, P.; Peschard, O.; Lamy, L. Kosmeetikatooted ja toimeained. Clin. Dermatol. 2009, 27, 461–468. [CrossRef] [PubMed]

13. Kim, J.; Kang, S.; Kwon, H.; Moon, H.; Park, MC Kahe funktsionaalne bioaktiivne peptiid, AIMP1-tuletatud peptiid (AdP), vananemisvastane. J. Cosmet. Dermatol. 2019, 18, 251–257. [CrossRef]

14. Kim, S.; Sina, S.; Hwang, D. Aminoatsüül-tRNA süntetaasid ja tuumorigenees: rohkem kui majapidamine. Nat. Rev. Cancer 2011, 11, 708. [CrossRef] [PubMed]

15. Lee, SW; Kim, G.; Kim, S. Aminoatsüül-tRNA süntetaasiga interakteeruv multifunktsionaalne valk 1/p43: esilekerkiv terapeutiline valk, mis töötab süsteemi tasandil. Eksperdi arvamus. Drug Discov. 2008, 3, 945–957. [CrossRef]

16. Helfrich, YR; Sachs, DL; Voorhees, JJ Naha vananemise ja fotovananemise ülevaade. Dermatol. Õed. 2008, 20, 177–183. [PubMed]

17. Park, SG; Shin, H.; Shin, YK; Lee, Y.; Choi, EÜ; Park, BJ; Kim, S. Uudne tsütokiin p43 stimuleerib naha fibroblastide proliferatsiooni ja haavade paranemist. Olen. J. Pathol. 2005, 166, 387–398. [CrossRef]

18. Han, JM; Park, SG; Lee, Y.; Kim, S. Erinevate ekstratsellulaarsete tegevuste struktuurne eraldamine aminoatsüül-tRNA süntetaasiga interakteeruvas multifunktsionaalses valgus, p43/AIMP1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006, 342, 113–118. [CrossRef] [PubMed]

19. Witting, M.; Obst, K.; Friess, W.; Hedtrich, S. Hiljutised edusammud pehme aine nanokandjate poolt vahendatud valkude ja peptiidide paiksel manustamisel. Biotehnoloogia. Adv. 2015, 33, 1355–1369. [CrossRef]

20. Kang, NW; Kim, MH; Sohn, SY; Kim, KT; Park, JH; Lee, SY; Lee, JY; Kim, DD Kurkumiiniga koormatud lipiidhübridiseeritud tselluloosi nanokiudkile leevendab hiirtel imikvimood-indutseeritud psoriaasilaadset dermatiiti. Biomaterjalid 2018, 182, 245–258. [CrossRef]

21. Aufenvenne, K.; Larcher, F.; Hausser, I.; Duarte, B.; Oji, V.; Nikolenko, H.; Del Rio, M.; Dathe, M.; Traupe, H. Lokaalne ensüümasendusravi taastab transglutaminaasi 1 aktiivsuse ja korrigeerib transglutaminaasi -1-puudulike nahatransplantaatide arhitektuuri. Olen. J. Hum. Genet. 2013, 93, 620–630. [CrossRef] [PubMed]

22. Goebel, AS; Schmaus, G.; Neubert, RH; Wohlrab, J. Nahakaudne peptiidi kohaletoimetamine võimendajamolekulide ja kolloidsete kandesüsteemide abil – I osa: karnosiin. Skin Pharmacol. Physiol. 2012, 25, 281–287. [CrossRef] [PubMed]

23. Prausnitz, MR; Mitragotri, S.; Langer, R. Transdermaalsete ravimite kohaletoimetamise hetkeseis ja tulevane potentsiaal. Nat. Rev. Drug Discov. 2004, 3, 115–124. [CrossRef]

24. Denet, AR; Vanbever, R.; Preat, V. Naha elektroporatsioon transdermaalseks ja paikseks manustamiseks. Adv. Narkootikumide Deliv. Rev. 2004, 56, 659–674. [CrossRef]

25. Prausnitz, MR Mikronõelad ravimite transdermaalseks manustamiseks. Adv. Narkootikumide Deliv. Rev. 2004, 56, 581–587. [CrossRef]

26. Williams, AC; Barry, BW läbitungimise parandajad. Adv. Narkootikumide Deliv. Rev. 2004, 56, 603–618. [CrossRef]

27. Magnusson, BM; Runn, P. Läbitungimisvõimendajate mõju türeotropiini vabastava hormooni analoogi pGlu-3-metüül-His-Pro amiidi tungimisele läbi inimese epidermise. Int. J. Pharm. 1999, 178, 149–159. [CrossRef]

28. Butun, S.; Ince, FG; Erdugan, H.; Sahiner, N. Bioühilduvate karboksümetüültselluloosi polümeersete osakeste üheetapiline valmistamine ravimite manustamissüsteemide jaoks. Süsivesikud. Polym. 2011, 86, 636–643. [CrossRef]

29. Pushpamalar, V.; Langford, SJ; Ahmad, M.; Lim, YY Saagojäätmetest karboksümetüültselluloosi valmistamise reaktsioonitingimuste optimeerimine. Süsivesikud. Polym. 2006, 64, 312–318. [CrossRef]

30. Kim, J.-S.; Kim, K.-T.; Park, J.-H.; Lee, J.-Y.; Kim, M.; min, HG; Moon, I.-H.; Choi, C.-Y.; Kim, BH; Kim, D.-D. U-vitamiini koacerveeritud mikrokapslid, mis on optimeeritud keskse komposiitdisaini (CCD) abil. J. Pharm. Uurige. 2018. [CrossRef]

31. Ahmed, ZZ; Khan, FN; Shaikh, DA Olopatadiinvesinikkloriidi oftalmilise lahuse pöördprojekteerimine ja formuleerimine QBD abil. J. Pharm. Uurige. 2018, 48, 279–293. [CrossRef]

32. Navamanisubramanian, R.; Nerella, R.; Duraipandian, C.; Seetharaman, S. Kvaliteedipõhine lähenemine repagliniidi bukaaltablettide optimeerimiseks Box-Behnken Designi abil. Tulevik J. Pharm. Sci. 2018, 4, 265–272. [CrossRef]

33. Prabhakaran, D.; Basha, CA; kannadasan, T.; Aravinthan, P. Hüdrokinooni eemaldamine veest elektrokoagulatsiooni abil vooluelemendi abil ja optimeerimine vastuse pinna metoodika abil. J. Environ. Sci. Tervis A 2010, 45, 400–412. [CrossRef] [PubMed]

34. Natrella, M. NIST/SEMATECH statistiliste meetodite e-käsiraamat; NIST: Gaithersburg, MA, USA, 2010.

35. Amir, AI; van Rosmalen, M.; Mayer, G.; Lebendiker, M.; Danieli, T.; Friedler, A. Väga homoloogsed valgud avaldavad vastupidist bioloogilist aktiivsust, kasutades erinevaid interaktsiooniliideseid. Sci. Rep. 2015, 5, 11629. [CrossRef] [PubMed]

36. Megrab, NA; Williams, AC; Barry, BW Östradiooli läbitungimine läbi inimese naha, silast- ja maonaha membraanide: etanooli/vee kaaslahustisüsteemide mõju. Int. J. Pharm. 1995, 116, 101–112. [CrossRef]

37. Morimoto, H.; Wada, Y.; Seki, T.; Sugibayashi, K. Morfiinvesinikkloriidi in vitro naha läbitungimine vett, etanooli ja l-mentooli sisaldava läbitungimist suurendava süsteemi piiratud rakendamisel. Biol. Pharm. Bull. 2002, 25, 134–136. [CrossRef]

38. Löffler, H.; Kampf, G.; Schmermund, D.; Maibach, H. Kui ärritav on alkohol? Br. J. Dermatol. 2007, 157, 74–81. [CrossRef]

39. Maibach, HI; Lodén, M. Kuiv nahk ja niisutajad: keemia ja funktsioon; CRC Press: Boca Raton, FL, USA, 2000.

40. Chang, R.-K.; Raw, A.; Lionberger, R.; Yu, L. Paiksete dermatoloogiliste toodete üldine väljatöötamine: ravimvormide väljatöötamine, protsesside arendamine ja paiksete dermatoloogiliste toodete testimine. AAPS J. 2012, 15, 41–52. [CrossRef]

41. Lu, W.; Luo, H.; Zhu, Z.; Wu, Y.; Luo, J.; Wang, H. Deksketoprofeeni mõõdetud annusega transdermaalse pihusti ettevalmistamine ja biofarmatseutiline hindamine. J. Drug Deliv. 2014, 2014. [CrossRef]

42. Adler, S.; Basketter, D.; Creton, S.; Pelkonen, O.; van Benthem, J.; Zuang, V.; Andersen, KE; Angers-Loustau, A.; Aptula, A.; Bal-Price, A.; et al. Alternatiivsed (mitteloomade) meetodid kosmeetikatoodete testimiseks: hetkeseis ja väljavaated – 2010. Arch. Toksikool. 2011, 85, 367–485. [CrossRef]

43. Haq, A.; Goodyear, B.; Ameen, D.; Joshi, V.; Michniak-Kohn, B. Strat-M® sünteetiline membraan: läbilaskvuse võrdlus inimese surnukeha nahaga. Int. J. Pharm. 2018, 547, 432–437. [CrossRef]

Näidiste saadavus:

Autoritelt on saadaval ühendite FA-AdP ja MI-AdP proovid.

For more information:1950477648nn@gmail.com