Lilleekstraktid kui multifunktsionaalsed värvained kosmeetikatööstuses, 2. osa

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Traditsioonilistes meditsiinisüsteemides kasutatakse paljusid looduslikke tooteid valu ja põletiku sümptomite leevendamiseks, [61] seetõttu uuriti analüüsitud ekstraktide mõju lipoksügenaasi ja proteinaasi aktiivsuse inhibeerimisele. Analüüsitud kontsentratsioonide vahemikus (100-500 ug/mL) näitas CTE vesiekstrakt kõige tugevamat võimet inhibeerida proteinaasi (joonis 4) (kontsentratsiooni 500 ug/ml korral 57 protsenti). Seda aktiivsust võrreldi hästi tuntud proteinaasi inhibiitori diklofenakiga, mida kasutati kontrollina (umbes 89% inhibeerimine kõrgeima testitud kontsentratsiooni juures). Sarnased tulemused saadi aga GGE ja KTE ekstrakti puhul (kõrgeimate kontsentratsioonide puhul vastavalt umbes 56 protsenti ja 53 protsenti). PRE ja PGE ekstraktide puhul täheldati madalamat proteinaasi inhibeerimist. Järgmises testis, milles mõõdeti võimet inhibeerida lipoksügenaasi, näitasid KTE ja CTE vesiekstraktid suurimaid väärtusi (500 ug/ml kontsentratsiooni korral vastavalt ligikaudu 67% ja 64% inhibeerimine). Diklofenaki kasutati ka kontrollina. GGE, PGE ja PRE ekstraktidel on samuti märkimisväärselt kõrged väärtused (vastavalt 60%, 57% ja 54%). Samuti märgiti, et võime inhibeerida LOX-i ja proteinaasi ensüüme sõltub ekstrakti kontsentratsioonist (joonis 5).

Varasemad uuringud näitasid, et paljud polüfenoolsed ühendid aitasid oluliselt kaasa paljude taimeekstraktide põletikuvastasele toimele[62]. Uuringud on näidanud ROS-i osalust põletikulises protsessis ning fenoolsed ühendid, nagu gallus- ja kiinhape, võivad blokeerida arahhidoonhappe metabolismi, pärssides lipoksügenaasi aktiivsust, või toimida reaktiivsete vabade radikaalidena, mis tekivad arahhidoonhappe toimel. [63]. BenSaad et al. näitavad, et P. granatum'ist eraldatud ellagiinhape, gallushape ja punikalagiin A&B inhibeerisid lämmastikoksiidi (NO), prostaglandiini E2 (PGE2) ja interleukiin 6 (IL-6) tootmist lipopolüsahhariidide (LPS) poolt indutseeritud RAW 267,4 makrofaagi. See, kas need ühendid toimivad ainsa ainetena või neil on sünergistlik toime, jääb endiselt küsimuseks [64]. Kuna paljudel flavonoididel on põletikuvastased omadused, on nende antioksüdantse käitumise tõttu seostatud mitmesuguste põletikuliste häiretega.flavonoidide ekstraheerimise meetod pdf,Eelkõige on kvertsetiin kõige huvitavam molekul, kuna see häirib spetsiifilisi bioloogilisi radu. Lisaks näitavad uuringud, et see võib erinevate mehhanismide kaudu vähendada mitme mudeliga seotud põletikulist protsessi[65]. Eelkõige põhjustavad AMP-aktiveeritud proteiinkinaas ja histooni / valgu deatsetülaasi (AMPK / SIRT1) rada huvitavamat põletikujuhtimist. Seega võivad AMPK aktivaatorid vähendada makrofaagide põletikku. Kvertsetiin ja teised flavonoidid kui AMPK ja SIRT1 aktivaatorid võivad vähendada põletikku, segades seda rada [66]. Samuti on näidatud, et kvertsetiin ja kvertsetiin monoglükosiidid avaldavad suuremat LOX-i inhibeerimispotentsiaali [67] Nair et al. on näidanud KTE ekstrakti põletikuvastaseid omadusi, hinnates kvertsetiini osaga flavonoolide, nagu manghasliin Qu 3-[2G] ramnosüülrutinosiid, Qu 3-O-dirhamnosiid ja rutiin, olemasolu. Need molekulid on näidanud tugevat COX{11}} aktiivsuse pärssimist ja osalist ROS-i supressiooni. Üldiselt näitasid CTE-s esinevad polüfenoolid põletikuvastaseid omadusi LPS-i põhjustatud põletiku korral RAW 264.7 makrofaagirakkudes[68].

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

2.5.Tsütotoksilisuse hindamine

Uute kosmeetikatoorainete loomisel on üheks olulisemaks omaduseks nende kasutamise ohutus. Kosmeetikatoodetes kasutamiseks ettenähtud ained peavad olema mittetoksilised, eriti seoses naharakkudega, nagu keratinotsüüdid ja fibroblastid. HaCaT- ja BJ-rakkudele analüüsitud ekstraktide toksilisuse määramiseks on kasutatud kahte tüüpi teste.flavonoididEsimene uuring, milles kasutati neutraalse punase omastamise analüüsi, võimaldab meil hinnata analüüsitud ekstraktidega töödeldud rakkude elujõulisust. See värvaine siseneb elava raku lüsosoomidesse ja vabaneb surnud rakkude tsütoplasmasse. Täheldati (joonis 6), et CTE ekstraktil on suurim võime suurendada nii HaCaT kui ka BJ rakkude proliferatsiooni. Võrreldes kontrolliga saavutas see ekstrakt ligikaudu 20% ja 40% kõrgemaid väärtusi kui testitud parameeter vastavalt kontsentratsioonidel 250 μL/mL (HaCaT ja B】) ja 500 μL/mL (BJ rakud). GGE ekstrakti kontsentratsioonides 100 ja 250 µL/ml ning KTE ekstrakti kontsentratsioonis 500 µL/ml iseloomustas BJ rakkudele vähene toksiline toime. Teistel ekstraktidel oli positiivne mõju nende rakkude elujõulisusele. PRE ja PGE ekstraktid kontsentratsioonis 100 μL/mL ei erinenud oluliselt kontrollist ja suurendasid BJ rakkude proliferatsiooni ligikaudu 10-15 protsenti võrreldes kontrolliga kontsentratsioonidel 250 ja 500 μL/ ml. Keratinotsüütide puhul rakkude elujõulisuse vähenemist ei täheldatud. PGE, PRE ja CTE ekstraktide puhul täheldati proliferatsiooni suurenemist kontsentratsiooni suurenemisega, samas kui rakkude elujõulisuse vähenemist demonstreeriti KTE ja GGE ekstraktide kontsentratsiooni suurenemisega.

Teine katse, mis tehti testitud ekstraktide tsütotoksilisuse määramiseks, oli resasuriini test (Alamar Blue). On näidatud (joonis 7), et rakkude elujõulisus sõltub ekstrakti kontsentratsioonist, millega rakke inkubeeriti. Fibroblastide puhul põhjustavad PRE, PGE ja CTE ekstraktid suuremat rakkude proliferatsiooni koos nende kontsentratsiooni suurenemisega. Suurima analüüsitud kontsentratsiooni (500 μL/mL) korral täheldati umbes 20 protsenti suuremat proliferatsiooni võrreldes kontrollrühmaga.hesperidiini kasutamineKTE ja GGE ekstraktide puhul täheldati rakkude elujõulisuse vähenemist koos ekstraktide kontsentratsiooni suurenemisega. Need ekstraktid avaldasid kontsentratsioonides 250 ja 500 μL/ml vähest toksilist mõju BJ-le. Keratinotsüütide puhul täheldati analüüsitud ekstraktide sarnast mõju naharakkudele, kuid nende proliferatsioonivõime ei olnud nii tugev kui fibroblastide puhul. Suurimat võimet suurendada keratinotsüütide proliferatsiooni täheldati CTE ekstrakti puhul kogu analüüsitud kontsentratsioonide vahemikus. Sarnased väärtused saadi PRE ekstrakti puhul kontsentratsioonil 250 µl/mL ja PGE ekstrakti puhul kontsentratsioonil 500 µl/mL. KTE ekstrakt näitas HaCa rakkudele oluliselt suuremat toksilist toimet kui GGE ekstrakt.

Analüüsitud ekstrakte ei ole varem põhjalikult testitud nende mürgisuse suhtes naharakkudele. Ekstraktide või nende peamiste toimeainete tsütotoksilisuse uuringuid, eriti vähirakkude suhtes, on tehtud vaid üksikuid. Varasemate uuringute autorid märkisid, et neil ekstraktidel ei ole üldiselt naharakkudele toksilist toimet ning nende võimet suurendada rakkude proliferatsiooni on enamasti tingitud polüfenoolide, antotsüaniinide ja flavonoidide suurest sisaldusest [45,69-73 ]. Mõned autorid märkisid ka, et ekstraktides sisalduvad üksikud komponendid võivad avaldada naharakkudele toksilist toimet, samas kui ekstraktil tervikuna seda ei ole. Ali Hijazi jt. [69] näitas, et Punica granatum'ist ekstraheeritud alkaloidid on toksilised normaalsetele ja vähirakuliinidele, samas kui kogu ekstrakt on vähem toksiline. Nasiri et al. [70] näitab, et Punica granatum lille ekstrakt võib olla kasulik haavade paranemisprotsessi kiirendamisel, kuna see suudab suurendada naharakkude vohamist. Meie varasemates uuringutes [45] näidati, et analüüsitud taimedest saadud vesi-etanooliekstraktidele oli iseloomulik suurem võime suurendada BJ-rakkude proliferatsiooni ning KTE ja GGE ekstraktidel oli nendele rakkudele väiksem toksiline toime. .kadunud impeerium cistancheVesi-etanooli ekstraktide mõju HaCaT rakkudele oli sarnane puhaste vesiekstraktide omaga, kuid etanooliga saadud ekstraktide puhul täheldati veidi soodsamaid proliferatsiooniomadusi kui vesiekstraktide puhul. Mõlemat tüüpi analüüsitud ekstraktide koostise erinevused võivad põhjustada erinevusi nende toksilisuses. Nagu näidatud, pole veeekstraktid bioaktiivsete koostisosade poolest nii rikkad kui vee-etanooli ekstraktid. Suurimad erinevused on rutiini ja isokvertsitriini sisalduses.

Cistanche on vananemisvastane toime

2.6.Päikesekaitsefaktori määramine

UV-kiirguse ebasoodne mõju nahale võib ilmneda nii vahetult pärast kokkupuudet kui ka aastaid hiljem. Päikesekiirgusel on immunosupressiivne toime, mis kiirendab naha vananemisprotsessi koos kõigi sellega seotud tagajärgedega, sealhulgas suurenenud kantserogeneesiga[74]. Praegused suundumused viitavad kasvavale vajadusele välja töötada tooteid, mida ei iseloomusta mitte ainult väga kõrge kasutusohutuse tase, vaid ka multifunktsionaalsus selles mõttes, et toodetel on naha kiirgusvastane kaitse ning senisest laiem toimeulatus. Selles aspektis mängivad hindamatut rolli mõned taimsed ained, mis on võimelised lisaks päikesekaitsele ka neutraliseerima juba olemasolevaid päikesekiirguse negatiivseid mõjusid nahale [75-77]. Läbiviidud uuringud näitasid, et analüüsitud taimeekstrakte PRE, PGE, KTE, CTE ja GGE iseloomustavad kõrged SPF koefitsiendid.

Koefitsientide (SPF) analüüs viidi läbi ülalnimetatud taimedest saadud vesiekstraktidele kontsentratsioonidel 10 ja 50 mg/ml. Iga uuritud taime puhul andis ekstrakti kõrgem kontsentratsioon oluliselt kõrgema SPF väärtuse.mikroniseeritud puhastatud flavonoidfraktsioon 1000 mg kasutusalasidEkstraktide võrdlus näitab, et SPF-i kõrgeimaid väärtusi täheldati KTE ekstrakti puhul, mis kehtib mõlema uuritud kontsentratsiooni puhul. Veel üks huvitav tähelepanek on see, et isegi madalamates uuritud kontsentratsioonides oli KTE ekstraktil endiselt kõrge SPF, samas kui teiste ekstraktide väärtused vähenesid märgatavalt. See on selge, kui analüüsime, kui palju oli KTE tulemus teistest ekstraktidest kõrgem. Kontsentratsiooni 50 mg/ml korral oli SPF teguri 1,2 võrra kõrgem (võrreldes PGE, CTE-ga) tegurini peaaegu 1,9 (võrreldes PRE, GE-ga). Sama arvutus kontsentratsiooni 10 mg/ml kohta annab tegurid alates 1,4 (võrreldes PGE-ga) kuni teguriteni vahemikus 2-3 (võrreldes CTE, GGE-ga), isegi kuni teguriteni nagu 10, kui võrrelda PRE. Kui keskenduda KTE ekstraktile, võib märgata, et ekstrakti kontsentratsiooni vähenemine teguri 5 võrra (väärtuselt 50 mg/mL väärtuseni 10 ml/mL) toob kaasa SPF väärtuse vähenemise teguri 3,4 võrra. , mis tähendab, et SPF väheneb aeglasemalt kui kontsentratsioon. Ülaltoodu näitab, et KTE ekstrakt võib olla tõhus isegi siis, kui seda kasutatakse väikestes kontsentratsioonides (joonis 8).

2.7. Transepidermaalse veekao (TEWL) ja naha hüdratsiooni mõõtmised

Taimse tooraine bioloogilise ja farmakoloogilise aktiivsuse laia ulatuse tõttu mõjutavad ekstraktides sisalduvad taimsed ained oluliselt naha seisundit. Eelkõige räägime siin sekundaarsete metaboliitide mõjust meie naha seisundile [78,79].

Uuringu järgmises etapis viidi läbi hüdratatsiooni ja TEWL analüüsid. Hinnati testitud ekstraktide mõju nahale. Mõõtmised viidi läbi kahe intervalliga 60 ja 360 minutit ekstrakti kontsentratsiooni 10 mg/ml jaoks. TEWL-i mõõtmisel ilmnes suurim protsentuaalne langus PGE ekstrakti puhul, kus kontrollväärtus 13,9 langes 8,71-ni, mille tulemuseks oli protsentuaalne langus 37 protsenti. Sellest vaatenurgast tasub analüüsida ka KTE ekstrakti, kuna see oli kõige kõrgemate SPF-väärtustega. KTE ekstrakti puhul vähenes TEWL-i kontrollväärtus väärtuseni 10,22, mis tähendab 26-protsendilist langust (joonis 9A).

Teise instrumendimõõtmise puhul aga selgus, et analüüsitud ekstraktid põhjustavad nii 60 kui ka 360 min pärast niisutuse suurenemist võrreldes kontrollprooviga.

Analüüside tulemusena selgus, et analüüsitud PRE, PGE, KTE, CTE ja GGE ekstraktid suurendavad naha hüdratatsiooni (joonis 9B). Täheldati niisutavate omaduste suurenemist koos ekstrakti kontsentratsiooni suurenemisega preparaatides. Tugevamaid niisutavaid omadusi on täheldatud PRE ja PGE ekstraktidel, mis on 32 protsenti ja 29 protsenti 60 minuti pärast ning 21 protsenti ja 22 protsenti 360 minuti pärast. Kõige madalam naha hüdratatsioonitase on aga leitud KTE ekstrakti puhul, mis on 18 protsenti 60 minuti pärast ja peaaegu 3 protsenti 360 minuti pärast.

2.8. Rakenduse analüüs

2.8.1. Ekstraktide värviparameetrite määramine

Taimsete lillede toimeaineid saab loodusliku värvuse tõttu kasutada looduslike värvainetena paljudes kaubanduslikes toodetes, näiteks kosmeetikas ja toidus. Saadud ekstraktide jaoks viidi läbi värvianalüüs (tabel 5).

Leiti, et PRE, KTE ja CTE ekstraktidel on looduslike kosmeetiliste pigmentidena suurim potentsiaal. Suurimaid kromaväärtusi (C*) täheldati siiski CTE puhul. H kraadi parameetri väärtuse põhjal leiti, et palja silmaga on vaadeldav ja nähtav selle ekstrakti kollane värvus. Vaatamata madalale C* väärtusele (2,8) on KTE ja PRE ekstraktide puhul nende ekstraktide värvus palja silmaga selgelt näha ja see määrati PRE puhul punakaslillaks ja KTE ekstrakti puhul sinakasvioletseks. PGE ja GGE vesiekstraktid olid punaka ja kergelt oranži värvusega ning saadud kromaväärtused olid tasemel 1,3. Selle värvi puhul ei olnud need väärtused palja silmaga märgatavad.

2.8.2. Kosmeetikatoodete värviparameetrite määramine ekstraktide põhjal

Viimastel aastatel on olnud suur vajadus uute loodusliku päritoluga värvainete väljatöötamise järele, seda eriti toiduainetööstuses ja kosmeetikatööstuses. Võrreldes sünteetiliselt saadud värvainetega võib neil olla väiksem negatiivne mõju inimeste tervisele ja keskkonnale [80]. Saadud ekstrakte kasutati mitsellaarse meigieemaldusvedeliku valmistamisel. Igas preparaadis kasutati neid kontsentratsioonis 1 protsent. Mudelkosmeetika värviparameetrite tulemused on toodud tabelis 6.

Täheldati, et PRE, PGE, CTE ja GGE 1% veeekstraktide lisamine mõjutas oluliselt meigieemaldaja värvi. Iga proov oli värviliselt palja silmaga selgelt nähtav. PRE ekstrakt muutis kosmeetikavahendi värvi oranžiks ning PGE, CTE ja GGE ekstrakt muutis selle kollaseks.

Analüüsitud ekstraktide potentsiaalsete värvainetena kasutamise võimalust kinnitavad △Meigieemaldaja ekstraktiga/alusmeigieemaldajaga suhteliselt kõrged väärtused, mis viitab mudelikosmeetika olulisele värvimuutusele koos võrreldava ekstrakti lisamisega. alusproovile (ekstrakte lisamata). Kirjanduse andmed [73] näitavad, et kui AE väärtused on suuremad kui 5, tajub värv alasti eelõhtul ja tajub seda värviefektina. PRE, KTE ja CTE ekstrakte sisaldavate meigieemaldajate puhul saadi AE väärtused vastavalt 8,83, 9,17 ja 8,14. PGE ja GGE ekstrakte sisaldavate toodete puhul ei täheldatud ekstrakti olulist mõju preparaadi värvusele. AE väärtused jäävad vahemikku 2.{12}}.82. See tähendab, et värvierinevus on märgatav ainult kogenud vaatlejale [80,81].

3. Materjalid ja meetodid

3.1. Taimne materjal ja ekstraheerimisprotseduur

Uurimistöös kasutati taimse materjalina P. rhoeas L., P.granatum L., C.ternatea L., C.tinctorius L. ja G.globosa L. kuivanud lilli, mis saadi kohalikust ürdipoest. . Ekstraheerimisprotsess viidi läbi ultrahelivannis (Digital Mgtrasonic Cleaner, Berliin, Saksamaa), mis viidi läbi Yang jt [82] kirjeldatud meetodil. Katsetatud taimede vesiekstraktide valmistamiseks kasutati 10 grammi kuivi õisi ja 100 g vett. Protsess viidi läbi 20 minutit toatemperatuuril. Seejärel koguti saadud ekstraktid ja filtriti kolm korda läbi Whatman No. 1 filterpaberi. Pärast filtreerimist aurustati ekstraktid alandatud rõhul 40 °C juures. Kuivatatud ekstraktidest valmistati põhilahus kontsentratsiooniga 100 mg/ml ja seda hoiti kuni edasise analüüsini 4 kraadi juures pimedas. Kasutatakse järgmisi lühendeid: PRE – Papaver rhoeas ekstrakt, PGE – Punica granatum ekstrakt, GGE – Gomprena globosa ekstrakt, CTE – Carthamus tinctorius ekstrakt, KTE – Clitoria ternatea ekstrakt.

3.2. Bioaktiivsete ühendite määramine HPLC-UV-ESI-MS abil

Saadud ekstrakte analüüsiti nende peamiste bioaktiivsete ühendite määramiseks HPLC (DionexUltiMate 300{{20}} RS Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA) abil. massispektromeetriga (4000 QTRAP, AB Sciex, Concord, ON, Kanada), mis on varustatud elektropihustus-ionisatsiooniallika (ESI) ja kolmekordse kvadrupool-iooni püüduri massiga analüsaator. Kromatograafiline eraldamine saavutati gradient-pöördfaasisüsteemiga. Lisaks osteti Phenomenexilt 100 × 4,6 mm kromatograafiline kolonn Kinetex 3,5 μm XB-C18 100 A isobutüülist külgahelate ja TMS-i otsakattega statsionaarse faasiga, mida kasutati koos sarnase koostisega kaitsekolonniga ja mida hoiti 30 kraadi juures. . Binaarset lahustisüsteemi, mis sisaldas lahustina A 0,1% (o/v) sipelghappe vesilahust ja lahustina B metanooli, kasutati gradiendi režiimis 19,1 minuti jooksul tööaja jooksul. Rakendatud elueerimistingimused olid järgmised: 0.0-15.0 min 25-100 protsenti B,15.0-17.0 min 100 protsenti B,17.0-17.1 min 100-25 protsenti B,17.1-19.1 min 25 protsenti B. Liikuva faasi voolukiirus oli 0,6 ml/min ja süstimismaht 10 μL. Eluenti jälgiti elektropihustusioonide massispektromeetriga (ESI-MS) negatiivse iooni režiimis ja skaneeriti m/z 20 kuni 1000 Da. Kvantifitseerimisanalüüsi jaoks töötas kolmekordne kvadrupoolne MS detektor mitme reaktsiooni jälgimise (MRM) skaneerimisrežiimis. Eksperimentaalselt määrati optimaalsed massianalüsaatori tingimused ja produktiioonide valik üksikute ühendite jaoks. Sel eesmärgil viidi sisse uuritud ühendite standardlahused (1 ng/ml) liikuva faasi koostises, kasutades infusioonipumpa, mis töötab pideval proovi kohaletoimetamisel. Pärast õige prekursoriooni valimise tagamist optimeeriti iga MRM-i ülemineku jaoks deklastrimispotentsiaal (DP), sisenemispotentsiaal (EP), põrkeelemendi väljumispotentsiaal (CXP) ja kokkupõrkeenergia (CE) (tabel S1). Jälgiti kahte MRM-i üleminekut, üks kvantifitseerimiseks ja teine ​​kinnitamiseks. MS parameetrid määrati järgmiselt: kapillaari temperatuur 600 C, kardingaas 35 psi juures, nebulisaatori gaas 60 psi juures ja kuivatusgaas 50 psi juures. Bioaktiivsete ühendite määramiseks kasutati negatiivset ionisatsioonirežiimi allika pinget -4500 V. Lämmastikku kasutati kardina ja kokkupõrkegaasina. Andmete analüüsi töödeldi tarkvaraga Analyst 1.5.1. Valitud ühendid identifitseeriti iga üksiku ühendi molekulmassi ja anioonide fragmendi järgi ning kinnitati MS2 fragmenteerimisega. Määrati üheksa ühendi identsused koos nende keemilise valemi, deprotoneeritud molekulaarsete ioonide ja iga üksiku piigi iseloomulike fragmendi ioonidega. Kuus ühendit kvantifitseeriti kalibreerimiskõvera põhjal, mis saadi analüütiliste standardite kõige intensiivsemate MRM-i üleminekute piikide pindalade põhjal. Kvantifitseeritud ühendite detektori vastuse lineaarsust demonstreeriti kalibreerimisstandardite süstimisega kaheksal kontsentratsioonitasemel vahemikus 0,01 ug/ml kuni 2 ug/ml. Kalibreerimiskõverad olid lineaarsed ja korrelatsioonikordaja (R) oli suurem kui 0,99. Kui proovid ei langenud CMS-detektori lineaarsesse vahemikku, proove lahjendati.

Kiniinhappe, gallushappe, kofeiinhappe, kofeoüülkiinhapete (CQA, kaks isomeeri: 3- ja 5-CQA) ja kvertsetiini analüütilised standardid osteti ettevõttest Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA ). Kõik kasutatud standardid olid analüütilise puhtusega (2 puhtusaste on suurem või võrdne sellega).

Standardsed põhilahused valmistati, kaaludes ja lahustades täpselt 20 mg iga standardit 10 ml LC-MS puhtusega metanoolis, et saada kontsentratsiooniks 2 mg/ml. Seerialahjendused 2.{{10}} ug/mL, 1,5 ug/mL, 1.0 ug/mL, 0,5 ug/mL,0 Seejärel valmistati LC-MS metanoolilahusega 0,1 ug/mL, 0,05 ug/mL, 0,02 ug/mL ja 0,01 ug/mL. Kvantitatsioonipiir (LOQ) määratleti kui 0,01 ug/ml.

LC-MS/MS test viidi läbi kolmes korduses. Saadud andmed esitati keskmistena ± standardhälbetena.

3.3. Antioksüdantsete omaduste määramine

3.3.1.ABTS· pluss puhastusanalüüs

Esiteks valmistati ABTS-i lahus, segades 19,5 mg ABTS-i ja 3,3 mg kaaliumpersulfaati 7 ml fosfaatpuhvriga (pH{5}},4) ja lahustati 16 tundi pimedas. Seejärel lahjendati lahust neeldumiseni umbes 1.0. Neeldumisi mõõdeti lainepikkusel 入=734 nm. Järgmisena segati 20 ml KTE, PGE, PRE, CTE ja GGE ekstrakte (10 100 250 500 ug/mL) 980 ml lahjendatud ABTSe ​​pluss lahusega ja inkubeeriti seejärel 10 minutit pimedas. Järgmises etapis mõõdeti ettevalmistatud proovide neeldumist lainepikkusel 入=734 nm, kasutades UV/VIS spektrofotomeetrit Aquamate Helion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Toorikuna kasutati destilleeritud vett. ABTS pluss puhastus arvutati võrrandist (1):

kus: As – proovi neeldumine; Ac – kontrollproovi neeldumine. Mõõtmised viidi läbi iga ekstraheeritud proovi puhul kolmes korduses. Protseduuri kirjeldasid Gawel-Beben et al. [83].

3.3.2. DPPH radikaali püüdmise test

Ekstraktide võime eemaldada vabu radikaale viidi läbi meetodil, mida on kirjeldanud Brand-Williams et al. [84]. See põhineb 1,1-difenüül-2-pikrüülhüdrasüül- (DPPH) radikaali kasutamisel. Esiteks segati 33 µl ekstraktide vesilahust kontsentratsiooniga 100 ug/ml DPPH (4 mM) 167 µl metanoolilahusega ja kanti 96- süvendiplaadile, seejärel segati loksutades. Seejärel mõõdeti proovide neeldumist lainepikkusel 517 nm. Mõõtmised viidi läbi iga 5 minuti järel 30 minuti jooksul UV-VIS Filter Max入=5 spektrofotomeetriga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Iga ekstrakti jaoks viidi läbi kolm sõltumatut kordust. Kontrollina kasutati vett DPPH lahusega. Antioksüdandi võimsust väljendati DPPH inhibeerimise protsendina, kasutades võrrandit (2):

kus: As – proovi neeldumine; Ac – kontrollproovi neeldumine. Mõõtmised viidi läbi iga ekstraheeritud proovi puhul kolmes korduses.

3.3.3. Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) rakusisese taseme tuvastamine

Et määrata analüüsitud ekstraktide võime tekitada HaCaT ja BJ rakkudes reaktiivsete hapnikuliikide rakusisest tootmist, kasutati fluorogeenset H, DCFDA värvi. Sellel ühendil on võime siseneda rakkudesse passiivse difusiooni teel, kus see deatsetüülitakse intratsellulaarsete esteraaside toimel mittefluorestseeruvaks ühendiks. Kui rakus on reaktiivsed hapniku liigid, muundatakse see ühend tugevalt fluorestseeruvaks DCF-iks. ROS-i rakusisese taseme määramiseks HaCaT-des ja BJ-s külvati rakud 96-süvendiplaatidele. Seejärel kultiveeriti rakke inkubaatoris 24 tundi. DMEM sööde eemaldati ja asendati 10 µM H2DCFDA-ga (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), mis oli lahustatud seerumivabas DMEM söötmes. HaCaT ja BJ rakke inkubeeriti H, DCFDA-s 45 minutit ja seejärel inkubeeriti ekstraktidega kontsentratsioonides ∶ 100, 250 ja 500 ug/ml. Positiivse kontrollina kasutati rakke, mida töödeldi 1 mM vesinikperoksiidiga (H2O2). Kontrollproovid olid rakud, mida ei töödeldud testitud ekstraktidega. DCF fluorestsentsi mõõdeti iga 90 minuti järel, kasutades FilterMax F5 mikroplaadilugejat (Thermo Fisher Scientific) maksimaalse ergastuse lainepikkusel 485 nm ja emissioonispektritel 530 nm [85].

3.4. Maatriksi metallopeptidaaside inhibeerimise hindamine

3.4.1.Elastaasivastase aktiivsuse määramine

Maatriksi metalloproteinaasi, neutrofiilide elastaasi (NE) inhibeerimise võimaluse kindlakstegemiseks kasutati fluoromeetrilist komplekti (Abcam, ab118971). Katse viidi läbi vastavalt komplektile lisatud juhistele ja protseduurile, mida on kirjeldanud Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Analüüsid viidi läbi standardsel 96-kaevuplaadil, millel oli selge lame põhi. Analüüsiks kasutati taimeekstrakte kontsentratsioonis 100 ja 250 ug/ml. Algselt valmistati vastavalt juhistele NE ensüümi lahused, NE substraat ja inhibiitori kontroll (SPCK). Kõigisse süvenditesse lisati lahjendatud NE lahus ja seejärel lisati järgmistesse süvenditesse testitavad proovid, inhibiitori kontroll ja ensüümi kontroll (testipuhver). Seejärel segati proove ja inkubeeriti 37 kraadi juures 5 minutit. Vahepeal valmistati reaktsioonisegu analüüsipuhvri ja NE substraadi segamisega. Segu lisati igasse süvendisse ja segati hoolikalt. Fluorestsentsi mõõdeti kohe ergastuse lainepikkusel 入=400 nm ja emissioonil 入=505 nm, kasutades mikroplaadilugejat (FilterMax F5, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Analüüsitava NE aktiivsuse pärssimine proovid arvutati võrrandist (3):

Lõpptulemuseks saadi kolme sõltumatu mõõtmise aritmeetiline keskmine.

3.4.2. Kollagenaasivastase aktiivsuse määramine

Et hinnata saadud ekstraktide võimet inhibeerida kollagenaasi aktiivsust, kasutati fluoromeetrilist komplekti (Abcam, Cambridge, UK, ab211108). Katse viidi läbi vastavalt komplektile lisatud juhistele ja protseduurile, mida on kirjeldanud Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Analüüsid viidi läbi standardsel 96-kaevuplaadil, millel oli selge lame põhi. Analüüsiks kasutati taimeekstrakte kontsentratsioonis 100 ja 250 ug/ml. Esiteks lahustati kollagenaas (COL) kollagenaasi analüüsipuhvris (CAB). Seejärel lisati analüüsitud proovid COL-i ja CAB-i. Inhibiitori kontrollproovid valmistati kollagenaasi inhibiitori (1,10-fenantroliini (80 mM) segamisel kollagenaasi ja CAB puhvriga. Ensüümi kontrollsüvendid valmistati lahjendatud COL-i segamisel CAB-ga. CAB puhvrit kasutati taustakontrollina. Seejärel inkubeeriti proove toatemperatuuril 15 minutit. Reaktsioonisegu valmistati kollagenaasi substraadi segamisel CAB-ga. Sel viisil valmistatud reaktsioonisegu lisati kõikidele analüüsitud proovidele ja segati põhjalikult. Seejärel mõõdeti fluorestsentsi ergastuse lainepikkus 490 nm ja emissioon 520 nm. Mõõtmine viidi läbi kineetilises režiimis 60 minutit temperatuuril 37 C. Saadud ekstraktide COL aktiivsuse inhibeerimise võime arvutati võrrandi (4) abil:

3.5. Põletikuvastaste omaduste määramine

3.5.1. Valkude denaturatsiooni pärssimine

PRE, PGE, KTE, CTE ja GGE ekstraktide proteinaasi inhibeeriv toime viidi läbi vastavalt Sakat jt meetodile[87], mida modifitseerisid Gunathilake jt[88]. Lühidalt, reaktsioonilahus (2 ml) koosnes 1 ml 1% trüpsiinist 2{{10}} mM Tris-HCl puhvris (pH 7,4) ja 1 ml uuritavast proovist ({{17} },02 ml ekstrakt 0,980 ml vesi). Lahust inkubeeriti (37 kraadi 5 minutit) ja seejärel lisati 1 ml 0,8% (mass/maht) kaseiini ja segu inkubeeriti veel 20 minutit. Inkubeerimise lõpus lisati reaktsiooni lõpuleviimiseks 2 ml 70% perkloorhapet. Segu tsentrifuugiti ja supernatandi neeldumist mõõdeti 210 nm juures puhvri suhtes kui tühikatse. Kontrollina kasutati fosfaatpuhverlahust. Valkude denaturatsiooni inhibeerimise protsent arvutati järgmise valemi abil:

kus A1= kontrollproovi absorptsioon ja A2= testproovi neeldumine.

3.5.2. Lipoksügenaasi aktiivsuse pärssimine

Saadud ekstraktide võime inhibeerida lipoksügenaasi aktiivsust määrati Sarvesvarani et al. 【89】. Kõigepealt segati 96-süvendiga plaadil 10 μl erineva kontsentratsiooniga taimeekstrakte (100, 250 ja 500 ug/mL) 160 μL 100 mM PBS ja 20 μL sojaoa lipoksügenaasi lahusega (167 U/). ml) Proove inkubeeriti 25 kraadi juures 10 minutit ja pärast seda lisati reaktsiooni käivitamiseks 10 μL naatriumlinoolhapet. Seejärel mõõdeti proovide neeldumist lainepikkusel 234 nm iga minuti jooksul 3 minuti jooksul, kasutades FilterMax F5 mikroplaadi lugejat (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Diklofenaki kasutati positiivse kontrollina. Lipoksügenaasi aktiivsuse inhibeerimise protsent arvutati võrrandist (6):

kus: Ac on testitava proovi neeldumine, Ac on negatiivse kontrolli neeldumine.

Lõpptulemuseks saadi kolme sõltumatu mõõtmise aritmeetiline keskmine.

3.6. Tsütotoksilisuse analüüs

3.6.1. Rakukultuur

Selles uuringus kasutati kahte naharakuliini: normaalsed inimese keratinotsüüdid (HaCaT) ja fibroblastid (BJ). HaCaT-d saadi ettevõttest CLSCell Lines Service (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Saksamaa) ja BJ-d Ameerika tüübikultuuride kollektsioonist (American Type Culture Collection). Manassas, VA, USA). Rakke kasvatati Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM, Biological Industries, Cromwell, CO, USA) naatriumpüruvaadi, L-glutamiini ja kõrge glükoosisisaldusega (4,5 g/l). Mikroobse saastumise vältimiseks rikastati söödet ka 10% veise loote seerumiga (Gibco, Waltham, MA, USA) ja 1% antibiootikumidega (100 U/mL penitsilliini ja 1000 ug/ml streptomütsiini, Gibco). Rakke kasvatati inkubaatoris temperatuuril 37 kraadi niisutatud atmosfääris, mis sisaldas 95 protsenti õhku ja 5 protsenti süsinikdioksiidi.

3.6.2. Alamar Blue test

Pärast seda, kui kultiveeritud rakud (HaCaT ja BJ) olid saavutanud soovitud konfluentsuse, aspireeriti DMEM sööde kultiveerimiskolbidesse. Põhjaga kinnitatud rakke pesti kaks korda steriilse fosfaatpuhverdatud soolalahusega. Rakukiht eraldati trüpsiiniga ja seejärel pandi rakud värskesse DMEM söötmesse. Rakud plaaditi 96-süvendiga lamedapõhjalistele plaatidele (VWR, Radnor, PE, USA) ja pärast plaatide põhja külge kinnitamist töödeldi rakke ekstraktidega (100, 250 ja 500 ug/mL). Rakke inkubeeriti 24 tundi.

Tsütotoksilisuse test viidi läbi Alamar Blue analüüsiga (Sigma, R7017, Life Technologies, Bleiswijk, Holland). Pärast inkubeerimist lisati süvenditesse resasuriini lahus kontsentratsiooniga 60 uM, seejärel asetati plaadid 2 tunniks inkubaatorisse temperatuuril 37 kraadi. Pärast seda aega on fluorestsentsi mõõdetud (入=570nm). Iga ekstrakti kontsentratsioon viidi läbi kolmes korduses.

3.6.3. Neutraalse punase omastamise test

Neutral Red Uptake Assay on teine ​​test, mida kasutatakse PRE, PGE, KTE, CTE ja GGE tsütotoksilisuse määramiseks. Esiteks valmistati96-kaevude lamedapõhjalised plaadid ette, nagu on kirjeldatud eelmises jaotises. Pärast 24-tunnist rakkude eksponeerimist ekstraktidega aspireeriti need ja asendati neutraalse punase värvainega (40 ug/ml) ja inkubeeriti 2 tundi. Pärast seda aega pesti rakke fosfaatpuhverdatud soolalahusega. Järgmises etapis lisati süvenditesse värvieemalduspuhver (150 μL). Seejärel määrati neutraalse punase dve omastamine optilise tiheduse (OD) mõõtmisega 540 nm juures. Iga ekstrakti kontsentratsioon viidi läbi kolmes korduses.

3.7. Päikesekaitsefaktori määramine (in vitro)

Päikesekaitsefaktor (SPF) määrati ekstraktide vesilahuse neeldumise mõõtmisel kontsentratsioonides 10 ug/mL ja 50 ug/mL lainepikkuste vahemikus 290–320 nm 5- nm intervalliga. Saadud tulemuste põhjal arvutati SPF Mansuri võrrandi [90] alusel: kus∶ EE（λ） — erüteemiefekti spekter, I（入） — päikese intensiivsuse spekter, ABS（入） — päikesekaitsetoote neeldumine, CF— paranduskoefitsient (=10), E (N) × I (λ) – kasutati Sayre'i määratud väärtusi [91].

3.8. Transepidermaalse veekaotuse (TEWL) ja naha niisutamise mõõtmised

TEWL-i ja naha hüdratatsiooni mõõtmised viidi läbi, kasutades TEWAmeter TM 300 sondi ja Corneometer CM 825 sondi, mis oli ühendatud MPA adapteriga (Courage plus Khazaka Electronic, Köln, Saksamaa). Uuringus osales viis vabatahtlikku. Nende küünarvarrel nahale märgiti kuus piirkonda (suurusega 2 × 2 cm) Viide kohta kanti 0,2 mL testitud taimeekstrakte, kuuendal kohal oli kontroll (ei töödeldud ühegi prooviga) Pärast 60 ja 360 min. Lõpptulemuseks saadi viie sõltumatu mõõtmise (naha hüdratatsioon) ja 20 mõõtmise (TEWL) aritmeetiline keskmine (iga vabatahtlikult).

3.9. Ekstrakte sisaldava mudelkosmeetika (meigieemaldaja) valmistamine

Valmistati näidiskosmeetika (meigieemaldaja). Kõik kasutatud komponendid vastasid EcoCerti ja COSMOSe nõuetele. Koostis on näidatud tabelis 7.

Toode valmistati koostisosade (punktidest 1 kuni 6) segamisel toatemperatuuril kuni homogeense vedeliku saamiseni. Viimases etapis reguleeriti preparaadi pH-d. Meigieemaldaja oli jagatud portsjoniteks. Igasse portsjonisse lisati 1% ekstrakti põhilahuseid ja segati hoolikalt.

3.10. Ekstraktide ja kosmeetikatoodete (meigieemaldajate) värviparameetrite määramine

Ekstraktide ja ekstraktidega kosmeetikatoodete proove testiti toatemperatuuril 48 tundi pärast valmistamist. Värviparameetrite (CIELAB-koordinaadid) hindamiseks kasutati CHROMA METER CR-400(Konica Minolta, Sensing Inc., Tokyo, Jaapan). CIELAB-süsteemi defineeris Rahvusvaheline valgustuskomisjon 1978. aastal. See põhineb kolmel värviatribuudil: L*, a*,b, kus L* on heleduse muutuja, mis on võrdeline Munselli süsteemi väärtusega ning a* ja b* on kromaatilised koordinaadid. A* ja b* koordinaadid näitavad asukohti vastavalt punasel/rohelisel ja kollasel/sinisel teljel (pluss a=punane, -a=roheline; pluss b=kollane, - b =sinine).

Saadud andmete: L*, a* ja b* põhjal arvutati välja järgmised värviparameetrid: kroma (C*) ja toon (h). Kasutati järgmisi võrrandeid:

4. Järeldused

Saadud tulemuste põhjal võib järeldada, et testitud taimeekstraktidel on mitmeid positiivseid omadusi, tänu millele saab neid ohutu ja bioaktiivse koostisosana kasutada kosmeetikatoodete valmistamisel. On näidatud, et need taimed on rikas polüfenoolide allikas, mis annab neile antioksüdantsed omadused. PRE näitas parimat võimet vabu radikaale eemaldada, mis on ilmselt tingitud sellest, et see sisaldab teiste taimedega võrreldes kõige rohkem polüfenoole. PGE ja PRE näitasid parimat võimet vähendada ROS-i tootmist rakkudes. Lisaks ei näita taimed tsütotoksilist toimet. Kõik testitud ekstraktid näitasid inhibeerivat toimet elastaasi ja kollagenaasi ensüümidele, kusjuures P. granatum ja GGE omasid suurimat inhibeerivat toimet. See võib viidata sellele, et neid taimi saab kasutada kosmeetikas vananemisprotsesse aeglustavate ainetena. Lisaks näitavad saadud tulemused, et neil taimedel on põletikuvastased omadused. Sel juhul näisid CTE ja KTE parimad. KTE ja PGE näitasid UV-kiirguse eest kaitsvat toimet isegi madalatel kontsentratsioonidel. Kõrgematel kontsentratsioonidel oli kõigil taimedel UV-kaitsev toime. Lisaks avaldasid taimed positiivset mõju naha hüdratatsioonile ja vähendasid transepidermaalset veekadu. PRE, KTE ja CTE ekstrakte võib kasutada tõhusate värvainetena kosmeetikatoodetes. Eespool nimetatud ekstrakte sisaldavat meigieemalduse mudelvedelikku iseloomustas aja jooksul intensiivne ja stabiilne värvus. PGE ja GGE ekstraktidega kosmeetikatoodete värvust saavad märgata vaid kogenud vaatlejad ning need ei erine oluliselt kosmeetikatoote tühiproovist ilma ekstrakti lisamata. Arvestades kõiki saadud tulemusi, võib järeldada, et papaver rhoeas, Clitoria ternatea ja Carthamus tinctorius saab edukalt kasutada kollase, oranži, sinise ja lilla värvaine allikana ohutute kosmeetikatoodete valmistamisel ning Veelgi enam, sellel on positiivne mõju nahale.

See artikkel on välja võetud ajakirjast Molecules 2022, 27, 922. https://doi.org/10.3390/molecules27030922 https://www.mdpi.com/journal/molecules