Peenosakesed 2.5 reguleerivad melanogeneesi inimese A375 melanoomirakkudes
Jul 19, 2023
Toimetajale: Epidemioloogilised uuringud on näidanud, et peente tahkete osakeste 2,5 (PM2,5) kokkupuude suurendab naha hüperpigmentatsiooni riski.[1] Hiljutine uuring tõestas, et PM2.5 võib indutseerida melanogeneesi, reguleerides türosinaasi (TYR) ja türosinaasiga seotud valgu 1 (TYRP1) ja 2 (TYRP2) ekspressiooni läbi arüülsüsivesinike retseptori (AhR)/mitogeeniga aktiveeritud proteiinkinaasi signaaliülekande. 2] AhR on naharakkudes laialt levinud ja selle ligeerimine kontrollib oksüdatsiooni/antioksüdatsiooni, epidermise barjääri funktsiooni, fotoindutseeritud vastust, kaasasündinud immuunsust ja melanogeneesi. Seda võivad aktiveerida dioksiinid ja polütsüklilised aromaatsed süsivesinikud (PM2.5 koostisosad) ning selle aktiveerimine kutsub esile geenide transkriptsiooni, mis kodeerivad nii I kui II faasi ksenobiootilise metabolismi ensüüme (tsütokroomid P450 [CYP] 1A1, CYP1A2 ja CYP1B1). [3,4] BaP ja ohtlikud dioksiinid aktiveerivad AhR-i tugeva reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tekkega, mida vähemalt osaliselt vahendab CYP1A1. Lisaks vastutab CYP1A1-vahendatud oksüdatiivne stress põletikueelsete tsütokiinide, näiteks interleukiini (IL)-1, IL-6 ja IL-8 tootmise eest keskkonnas. saasteainetega töödeldud inimese keratinotsüüdid.[3,5] Siiski on väga vähe uuringuid PM2,5 toksilise mõju kohta melanogeneetilistele rakkudele. Siin käsitlesime inimese melanoomirakke A375 erinevate PM2.5 kontsentratsioonidega, et uurida, kas PM2.5 võib soodustada melanogeneesi ja selle seost AhR signaaliülekande, oksüdatiivse stressi ja põletikulise vastusega.
Tistanche glükosiid võib samuti suurendada SOD aktiivsust südame- ja maksakudedes ning oluliselt vähendada lipofustsiini ja MDA sisaldust igas koes, eemaldades tõhusalt erinevaid reaktiivseid hapnikuradikaale (OH-, H2O₂ jne) ja kaitstes tekitatud DNA kahjustuste eest. OH-radikaalide poolt. Tsistanche fenüületanoidglükosiididel on tugev vabade radikaalide eemaldamisvõime, suurem redutseerimisvõime kui C-vitamiinil, nad parandavad SOD aktiivsust sperma suspensioonis, vähendavad MDA sisaldust ja omavad teatud kaitset sperma membraani funktsioonile. Tsistanche polüsahhariidid võivad suurendada SOD ja GSH-Px aktiivsust D-galaktoosi poolt põhjustatud eksperimentaalselt vananevate hiirte erütrotsüütides ja kopsukudedes, samuti vähendada MDA ja kollageeni sisaldust kopsudes ja plasmas ning suurendada elastiini sisaldust. hea puhastav toime DPPH-le, pikendab hüpoksia aega vananevatel hiirtel, parandab SOD aktiivsust seerumis ja aeglustab eksperimentaalselt vananevatel hiirtel kopsude füsioloogilist degeneratsiooni Raku morfoloogilise degeneratsiooniga on katsed näidanud, et Cistanche'il on hea antioksüdantne võime ja sellel on potentsiaal olla ravim naha vananemishaiguste ennetamiseks ja raviks. Samal ajal on Cistanche ehhinakosiidil märkimisväärne võime eemaldada DPPH vabu radikaale ja see suudab eemaldada reaktiivseid hapniku liike ja takistada vabade radikaalide poolt indutseeritud kollageeni lagunemist, samuti on sellel hea parandav toime tümiini vabade radikaalide anioonide kahjustustele.
Klõpsake valikul Cistanche Tubulosa Supplement
【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
PM2,5 koguti talvel (detsembrist jaanuarini) Pekingis. Kvartsfiltri proovivõtuks kasutati HY-1000 intelligentset suure vooluhulgaga suspendeeritud osakeste (TSP) proovivõtturit (valikuline PM2,5 lõikur, Qingdao Hengyuan Technology Development Co., Ltd., Qingdao, Hiina). Kvartsmembraan kasteti 75% etanooli, millele järgnes ultraheli loksutamine. Kõrge kontsentratsiooniga põhilahuse valmistamiseks kasutati steriilset vett. Inimese melanoomirakke A375 kultiveeriti 5% CO2-s temperatuuril 37 kraadi tavalises Dulbecco Modified Eagle'i söötmes (Invitrogen Co., Ltd., Carlsbad, CA, USA), mis sisaldas veise loote seerumit (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). A375 rakke töödeldi PM2.5 erineva kontsentratsiooniga (0, 100, 200 ja 400 ug/ml) 24 tundi ning rakke kasutati järgmistes uuringutes. Statistiliseks analüüsiks kasutati paaritu Studenti t-testi ja ühesuunalist dispersioonanalüüsi ning statistiliselt oluliseks loeti P < 0,05.
Et uurida PM2.5 mõju A375 rakkudele, tuvastati rakkude proliferatsioon CCK-8 komplekti (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) abil ja raku apoptoos tuvastati anneksiin V fluorestseiini isotiotsüanaati/ propiidiumjodiidi (FITC/PI) apoptoosikomplekt (Multisciences, USA), tuginedes tootja juhistele. Tulemused näitasid, et PM2.5 avaldas A375 rakkudele kontsentratsioonist sõltuvat tsütotoksilisust, kuid ei mõjutanud apoptoosi [täiendav joonis 1, http://links.lww.com/CM9/A917].
Melaniinisisalduse määramiseks kasutati NaOH meetodit. PM2.{1}}töödeldud A375 rakke pesti fosfaatpuhversoolaga (PBS) ja lüüsiti veega. Lüsaate tsentrifuugiti kiirusel 12, 000 p/min 5 minutit, pesti 10 protsendilise trikloroäädikhappega (500 ml) (Sigma, St. Louis , MO, USA) ja 75% etanooliga (500 ml) ning seejärel puhastati uuesti. Seejärel lisati graanulitele 1 tunniks temperatuuril 80 °C 50 ml 1 mol/L NaOH, mis sisaldas 10 protsenti dimetüülsulfoksiidi. Neeldumist 490 nm juures (OD 490) mõõdeti mikroplaadilugejaga. Kuna TYR on kõige olulisem melanogeenne ensüüm, tuvastasime järgmisena TYR-i aktiivsuse, kasutades levodopa (L-DOPA) testi. Kuue süvendiga plaadid (Corning, USA) külvati A375 rakkudega tihedusega 3105 rakku süvendi kohta. Seejärel pesti rakke PBS-ga ja lüüsiti 0,5% naatriumdesoksükolaadiga (Sigma). Lüsaat jagati kolme rühma ja igale proovile lisati 0,1 protsenti L-DOPA-d (Sigma). 5 minuti pärast mõõdeti OD490 ja standardina kasutati 0,1% L-DOPA-d. Mõõtsime ka TYR-i mRNA ja valgu ekspressioonitasemeid. Kogu RNA ekstraheeriti RNeasy minikomplekti (Qiagen, Valencia, CA, USA) abil. Pöördtranskriptsioon viidi läbi, kasutades ReverTra Ace qPCR RT komplekti (TOYOBO, Jaapan). Seejärel viidi Bio-Rad CFX96 TouchTM Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Jaapan) abil läbi kvantitatiivne reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon (qRT-PCR). Invitrogeni praimerid on esitatud täiendavas tabelis 1, http://links. lww.com/CM9/A917 ja iga mRNA ekspressioonitase arvutati 2*DDCT meetodil. Valgu ekspressioonitasemeid analüüsiti Western blot analüüsiga. Rakke pesti PBS-ga ja lüüsiti RIPA puhvris (Beyotime, Hiina), mis sisaldas fenüülmetüülsulfonüülfluoriidi (proteaasi inhibiitori segu, 20:1, Sigma-Aldrich). Valgu kontsentratsioone mõõdeti BCA valguanalüüsi komplekti (Beyotime, Hiina) abil. Kogu valku keedeti 70 kraadi juures 10 minutit, eraldati 4-12-protsendilises geelis 200 V juures 40 minutit, kanti 4-kraadisele membraanile 120 mA vooluga 75-100 minutiks ja inkubeeriti seejärel 5 protsendiga. rasvavaba piim 1 tund. Seejärel sondeeriti membraane anti-TYR, anti-AhR, anti-CYP1A1 ja anti-CYP1B1 antikehadega (Abcam) öö läbi temperatuuril 4 °C. Sekundaarse antikehana kasutati mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud hiire IgG-vastast antikeha (Proteintech, USA). Tulemused näitasid, et PM2.5 suurendas melaniini sisaldust ja TYR aktiivsust annusest sõltuval viisil. Nii TYR-i mRNA kui ka valgu ekspressioonitasemed olid ülesreguleeritud [täiendav joonis 2 A–D, //links.lww.com/CM9/A917].
PM2.5 võib TYR-i aktiivsust ülesreguleerida, aktiveerides AhR-raja. Et teha kindlaks, kas PM2.5 mõjutab AhR signaaliülekannet, tuvastasime qRT-PCR ja Western blot analüüsiga AhR ja selle klassikaliste allavoolu geenide CYP1A1 ja CYP1B1 transkriptsioonitasemed. Tulemused näitasid, et PM2.5 reguleeris üles AhR ja CYP1A1 mRNA ekspressioonitasemeid, samuti CYP1A1 valgu ekspressiooni [täiendav joonis 2 E–G, http://links.lww.com/CM9/A917].
AhR-i aktiveerimine põhjustab ROS-i teket, mis võib samuti suurendada TYR-i aktiivsust.[5] Seetõttu hindasime ROS-i tootmist 20,70 -diklorofluorestseiindiatsetaati (DCFHDA) ja voolutsütomeetria abil. Pärast 24-tunnist töötlemist PM2.5-ga inkubeeriti A375 rakke DCFH-DA-ga (5 mmol/l) 30 minutit 37 kraadi juures pimedas. Rakke pesti kaks korda PBS-is ja fluorestsentsi mõõdeti voolutsütomeetriga. Keskmine fluorestsentsi intensiivsus määrati FACS Diva 6.0 tarkvara abil (BD Bioscience, New York, NY, USA). Kuna arvatakse, et CYP1A1-indutseeritud ROS-i tootmine vastutab põletikulise vastuse eest,[5] on põletikueelsete tsütokiinide (IL-1a, IL-6, IL{) mRNA ekspressioonitasemed. mõõdeti {19}} ja kasvaja nekroosifaktorit [TNF]-a). Leiti, et PM2.5 suurendas A375 rakkudes ROS-i tootmist, aga ka IL-1a, IL-6 ja IL-8 mRNA taset [täiendav joonis 2 H ja I, http :// lingid. lww.com/CM9/A917].
Selle uuringu tulemused näitasid, et PM2.5 soodustas melanogeneesi ja suurendas nii TYR aktiivsust kui ka ekspressiooni A375 rakkudes. Lisaks võib PM2.5 aktiveerida AhR signaaliülekannet ja indutseerida oksüdatiivset stressi ja põletikulist vastust, mis võib olla melanogeenne signaaliülekandekaskaad, mis vastutab hüperpigmentatsiooni eest.
Tänuavaldused
Avaldame siirast tänu: prof dr Masutaka Furue ja prof dr Tsuji Gaku Kyushu ülikooli haiglast, kes parandasid käsikirja ja aitasid AhR-iga seotud teabega. Oleme tänulikud ka ingliskeelse toimetuse eest, mida pakub prof dr Robert Schwartz Rutgers New Jersey meditsiinikoolist.
Rahastamine
Seda uuringut toetas Hiina riikliku loodusteaduste fondi toetus (nr 2101000271).
Huvide konfliktid
Mitte ühtegi.
Viited
Peng F, Xue CH, Hwang SK, Li WH, Chen Z, Zhang JZ. Hiina naiste seniilse lentiigoga seotud peente tahkete osakeste kokkupuude: ristlõikeuuring. J Eur Acad Dermatol Venereol 2016;31:355–360. doi: 10.1111/jdv.13834.
Shi Y, Zeng Z, Liu J, Pi Z, Zou P, Deng Q jt. Tahked osakesed soodustavad hüperpigmentatsiooni AhR / MAPK signaali aktiveerimise ja keratinotsüütide a-MSH parakriini taseme tõstmise kaudu. Environ Pollut 2021;278:116850. doi: 10.1016/j.envpol.2021. 116850.
Peng F, Tsuji G, Zhang JZ, Chen Z, Furue M. PM2.5 potentsiaalne roll melanogeneesis. Environ Int 2019;132:105063. doi 10.1016/j. envint.2019.105063.
Napolitano M, Patruno C. Arüülsüsivesinike retseptor (AhR) on nahahaiguste ravi võimalik sihtmärk. Med Hypotheses 2018;116:96–100. doi: 10.1016/j.mehy.2018.05.001.
Dijkhoff IM, Drasler B, Karakocak BB, Petri-Fink A, Valacchi G, Eeman M jt. Õhus lenduvate tahkete osakeste mõju nahale: süstemaatiline ülevaade epidemioloogiast in vitro uuringuteni. Osa Fiber Toxicol 2020;17:35. doi 10,1186/s12989-020-00366-a.
【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
