Ferristatiin II pärsib tõhusalt SARS-CoV{1}} replikatsiooni Vero rakkudes

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktne

Raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus 2 (SARS-CoV-2) avaldab jätkuvalt märkimisväärset mõju ülemaailmsele rahvatervisele. Kirjeldatud on mitmeid SARS-CoV-2 rakkude sisenemise mehhanisme; Siiski on transferriini retseptori 1 (TfR1) rollile SARS-CoV-2 nakkuse puhul vähe tähelepanu pööratud. Kasutasime ferritiin II, et kutsuda esile TfR1 lagunemine Vero rakkude pinnal ja uurida sellise ravi tagajärgi rakkude elujõulisusele ja SARS-CoV -2 replikatsioonile. Näitasime, et ferritiin II ei ole Vero rakkudele toksiline kontsentratsioonis kuni 400 uM. Konfokaalse mikroskoopia andmete kohaselt mõjutab Spike valgu märgistatud transferriini ja retseptorit siduva domeeni (RBD) jaotumist märkimisväärselt 18-tunnine eeltöötlus 100 uM ferritiini II-ga söötmes. Ferritiin II-ga töötlemine pärsib RBD valgu omastamist peaaegu täielikult, kuigi see valk jääb raku pinnale seotuks. Tulemusi kinnitas hästi Vero rakkude SARS-CoV{15}} nakkuse märkimisväärne pärssimine ferritiin II poolt IC50 väärtustega 27 µM (Wuhan D614G viirus) ja 40 µM (Delta viirus). Omicron SARS-CoV-2 variandi nakkusliku tiitri olulist vähenemist täheldati ferritiin II kontsentratsioonil nii madalal kui 6,25 µM. Oletame, et ferritiin II blokeerib TfR1-vahendatud SARS-CoV-2 peremeesraku sisenemise; siiski on vaja täiendavaid uuringuid, et selgitada välja selle viiruse inhibeerimise täielikud mehhanismid, sealhulgas ferritiin II mõju teistele SARS-CoV-2 retseptoritele, nagu ACE2, neuropiliin-1 ja CD147. Viiruse sisenemise pärssimine, suunates peremeesrakkude retseptori, mitte viiruse mutatsioonile kalduva valgu, on paljulubav COVID{33}} ravistrateegia.

Märksõnad: SARS-CoV-2;transferriini retseptor 1; ferritiin II; retseptoriga seonduv domeen (RBD); Vero rakud

Aleksei Sokolov , Irina Isakova-Sivak *, Natalia Grudinina , Daria Mezhenskaja , Jelena Litasova , Valeria Kostevitš , Jekaterina Stepanova , Alexandra Rak , Ivan Sychev , Olga Kirik ja Larisa Rudenko

Eksperimentaalmeditsiini Instituut, 197376 Peterburi, Venemaa

1. Sissejuhatus

2019. aasta koroonaviiruse haiguse (COVID-19) pandeemia, mille põhjustas raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus 2 (SARS-CoV-2), tekitab maailma elanikkonnale jätkuvalt märkimisväärset sotsiaalmajanduslikku koormust. Angiotensiini konverteerivat ensüümi 2 (ACE2) peetakse peamiseks peremeesraku retseptoriks, mida SARS-CoV-2 kasutab rakkudesse sisenemiseks [1–4]; Siiski on tuvastatud mitmeid alternatiivseid retseptoreid ja kaasretseptoreid, mis on võimelised hõlbustama SARS-CoV-2 rakkude sisenemist ja nakkavust, nagu neuropiliin-1, CD147, türosiin-proteiinkinaasi retseptor UFO (AXL) ja teised [5–10]. Peale selle on SARS-CoV-2 tõhusaks sisenemiseks rakkudesse vaja kahte proteolüütilist lõhustamisetappi pärast peremeesraku retseptori seotust viiruse spike (S) valgu poolt. Esimene samm hõlmab S1-S2 piiri lõhustamist furiini proteaasi poolt nakatunud rakus, samas kui S20 saidi lõhustamine sõltub sihtraku proteaasidest, nagu TMPRSS2 ja katepsiin L, mis aktiveerivad S-valke plasmamembraanil ja rakus. vastavalt endolüsosoom (vaadatud punktis [11]).

müüa tsistanchejaoksimmuunvõime

Lisaks hästi uuritud SARS-CoV-2 peremeesrakku sisenemise sihtmärkidele on tõendeid selle kohta, et transferriini retseptor 1 (TfR1) võib olla alternatiivne kaasretseptor SARS-CoV-2 sisenemisel [12]. TfR1, 95 kDa homodimeerne II tüüpi membraani glükoproteiin, ekspresseerub rohkesti enamiku inimrakkude plasmamembraanil ja vahendab transferriini (Tf) sisenemist rakkudesse raua kohaletoimetamiseks [13]. Tõepoolest, on olemas suur hulk inimese ja zoonootilisi viiruseid, mis võivad tungida peremeesrakkudesse interaktsiooni kaudu TfR1-ga ja muude raua omastamise raja teguritega, sealhulgas Uue Maailma arenaviirused, inimese immuunpuudulikkuse viirus, parvoviirused, C-hepatiidi viirus, alfaviirused ja teised. [14]. Seetõttu on TfR{14}}-vahendatud viiruse sisenemisraja sihtimine paljulubav SARS-CoV{16}} nakkuse ravistrateegia. Varajased sõeluuringud tuvastasid kaks väikese suurusega ühendit (NCI11079 ja NCI306711), millel oli märkimisväärne pärssiv toime Tf-vahendatud raua omastamisele HeLa rakkudes. Ühend NCI306711 on suunatud TfR1-le, indutseerides selle internaliseerumist ja lagunemist, ning nimetati "ferritiiniks" selle ebatavalise omaduse tõttu pärssida raua transporti kolesteroolist sõltuva raja kaudu [15]. Teine väike molekul, ferritiin II (NSC8679), toimib sarnaselt ferritiiniga ja lagundab TfR1 nüstatiinitundliku lipiidiparve raja kaudu [16]. Nende andmete valguses püüdsime hinnata ferritiin II võimet inhibeerida SARS-CoV-2 replikatsiooni Vero-CCL81 rakkudes ja uurida selle inhibeerimise võimalikke mehhanisme.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Viirused, valgud ja keemilised ühendid

SARS-CoV-2 isoleerib hCoV-19/St_Peterburg-3524S/2020 (Wuhan D614G liini), hCoV-19 /Venemaa/SPE-RII-32759V/2021 (Delta sugupuu) ja hCoV-19/Russia/SPE RII-6086V/2021 (Omicroni sugupuu) saadi Smorodintsevi uurimisinstituudist Gripp (Sankt-Peterburg, Venemaa). Kogu töö nakkavate viirustega viidi läbi bioohutuse taseme 3 (BSL-3) laboris. SARS-CoV-2 S valgu retseptorit siduvale domeenile (RBD) vastavat rekombinantset valku ekspresseeris eukarüootsetes rakkudes BIOCAD JSC (St.Peterburg, Venemaa). Inimese rauaga küllastunud seerum TF (Fe2-TF) eraldati inimese vereseerumist ioonvahetuskromatograafia abil DEAE-Toyopearl, UNOsphere S ja geelfiltratsiooniga Sephadex G-75 Superfine'iga, nagu eelnevalt kirjeldatud. [17]. Ferristatiin II (joonis 1) osteti firmalt Sigma (C-1144, St. Louis, MO, USA). Ühend lahjendati 150 mM NaCl, 10 mM Na-fosfaatpuhvriga, pH 7,4 (PBS) lõppkontsentratsioonini 4 mm ja lahus filtriti läbi steriilse membraani poorisuurusega 0,22 µm (Sartorius, Saksamaa). .

2.2. SARS-CoV-2 viiruse levik ja Ferristatin II viiruse inhibeerimisvõime hindamine

Viirused paljundati Vero CCL81 rakkudel, kasutades DMEM-i, millele oli lisatud 1 × antibiootikumi-mükootilist ainet, 10 mM HEPES-i ja 2 protsenti FBS-i (kõik Capricorn, Ebsdorfergrund, Saksamaa) (DMEM / 2 protsenti FBS). Nakkuslikud tiitrid määrati 50-protsendilise koekultuuri nakatumise annuse (TCID50) testiga, nagu on kirjeldatud punktis [18], ja väljendati lgTCID50/ml.

Ferritiini viiruse neutraliseerimisvõime hindamiseks kasutasime modifitseeritud mikroneutralisatsiooni testi. Päev enne katseid külvati Vero rakud {{0}}süvendiga kultiveerimisplaatidele (3 × 104 rakku süvendi kohta) DMEM-is, millele oli lisatud 1x antibiootikumi-mükootilist ainet ja 10 protsenti FBS-i. Järgmisel päeval sööde eemaldati ja rakke nakatati 100 TCID50 SARS-CoV-2-ga, mis oli valmistatud DMEM/2% FBS-is, 2 tundi temperatuuril 37 °C, 5% CO2. Mitmed süvendid jäid negatiivseks kontrolliks nakatumata. Seejärel inokulaat eemaldati ja rakud kaeti 150 µl kahekordse ferritiin II lahjendusega, mis oli valmistatud DMEM/2% FBS-is, samas kui negatiivsed ja positiivsed kontrollaugud kaeti ainult söötmega. Iga ferritiin II lahjendust hinnati kolmes korduses. Plaate inkubeeriti 48 tundi (Wuhan G614D viirus) või 72 tundi (Delta ja Omicron viiruste puhul) temperatuuril 37 °C, 5% CO2, kuni positiivse kontrolli süvendites ilmnes selge tsütopaatiline toime. Supernatandid koguti viiruse tiitri kvantifitseerimiseks ettevaatlikult 0,2 ml tuubidesse ja rakud fikseeriti 10% formaldehüüdiga temperatuuril 4 °C 24 tundi.

Fikseeritud plaadid viidi rakupõhise ELISA protseduuri jaoks üle BSL{{0}} laborisse. See hõlmas pesemist PBST-ga (PBS koos 0,05% Tween 20-ga), rakkude läbilaskvust 0,1% Triton X-100-ga toatemperatuuril 15 minutit, blokeerimist 3% lõssiga temperatuuril 37 ◦C. 1 tund ja intensiivpesu PBST-ga. Seejärel lisati 1 tunni jooksul puhastatud polüklonaalne küüliku RBD-vastane antikeha (BIOCAD JSC, Peterburi, Venemaa) kontsentratsioonis 1,5 µg/ml, seejärel pesti PBST-ga ja lisati sekundaarne küülikuvastane IgG-vastane HRP- konjugeeritud antikeha (BioRad, Hercules, CA, USA) 1 tund temperatuuril 37 °C. Plaadid töötati välja, kasutades 1-Step Ultra TMB-ELISA substraadilahust (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Reaktsioon peatati 1 M H2SO4 lahusega ja tulemused loeti 450 nm juures, kasutades spektrofotomeetrit xMark Microplate (BioRad, Hercules, CA, USA). IC50 tiitri arvutamiseks kasutati neljaparameetrilist mittelineaarset regressioonianalüüsi, mis põhines viirusnegatiivsete ja viiruspositiivsete rakkude OD450 väärtustel, nagu on kirjeldatud punktis [18].

kust osta cistanche

SARS-CoV-2 tiitrid raku supernatantides arvutati kvantitatiivse reaalajas RT-PCR abil. RNA puhastati 100 µL rakukultuuri söötmest, samuti SARS-CoV-2-st, mille tiitrid olid testi standardkõverate loomiseks teada. RNA proovid puhastati RNA ekstraheerimiskomplektiga (Biolabmix, Novosibirsk, Venemaa) vastavalt tootja protokollile. RT-PCR reaktsioon viidi läbi kahekordselt edasisuunamispraimeriga 50 -CAATGGTTTAACAGGCACAGG-30 ja pöördpraimeriga 50 -CTCAAGTGTCTGTG GATCACG-30 [19], kasutades ühe toruga RT-PCR SYBR-i komplekt (Evrogen, Moskva, Venemaa) Quantstudio 1 reaalajas PCR-süsteemis (Thermofisher Scientific, Waltham, MA, USA), millele on võrdlusvärvina lisatud 50x Roxi.

Lävitsükkel (Ct) arvutati iga proovi jaoks QuantStudio Design and Analysis Software v1.5.1 abil ja standardkõver koostati igale reaktsiooniplaadile. Viiruse tiiter igas süvendis arvutati Ct väärtuste abil, mis olid normaliseeritud standardkõveratele, mis arvutati standardse viiruse tiitrimise alusel ja väljendati ühikutes lgTCID50/ml. Et teha kindlaks, kas ferritiin II võib pärssida viiruse rakkudega kinnitumise algetappe, segati 100 TCID50 SARS-CoV-2 ferritiin II lahjendustega ja pärast 1-tunnist inkubeerimist temperatuuril 37 ◦C lisati see segu Verole. rakke, millele järgneb täiendav 1-tunnine inkubeerimine temperatuuril 37 ◦C. Pärast viiruse imendumist inokulaat eemaldati ja rakud kaeti 150 µl värske DMEM/2% FBS söötmega. Pärast 48-tunnist inkubeerimist 37 °C, 5% CO2 ja nähtava CPE juures positiivsetes kontrollrakkudes fikseeriti plaadid ja neile viidi läbi rakupõhine ELISA, nagu eespool kirjeldatud.

2.3. Ferristatiin II tsütotoksilise toime hindamine

Ferritiin II tsütotoksilisust Vero rakkudele hinnati {{0}}(4,5-dimetüültiasool- 2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiidiga ( MTT) redutseerimisanalüüs [20]. Ferritiin II kahekordsed lahjendused valmistati DMEM/2% FBS söötmes, alustades kontsentratsioonist 400 uM, ja lisati Vero raku monokihtidega 96-süvendiplaatide süvenditesse. Pärast 48-tunnist inkubeerimist sööde eemaldati ja rakke pesti õrnalt sooja PBS-ga. Igasse süvendisse lisati 0,5 mg/ml MTT reaktiivi mahus 100 µl ja plaati inkubeeriti veel 2 tundi temperatuuril 37 °C. Seejärel eemaldati reaktiiv ja rakke pesti PBS-ga ja kuivatati õhu käes, millele järgnes 100 µl 96-protsendilise etanooli lisamine, et lahustada formataani kristallid. Värvi intensiivsus registreeriti spektrofotomeetriga lainepikkusel 535 nm. Negatiivse kontrollina kasutati plaadi süvendeid, mis ei olnud külvatud Vero rakkudega. Rakkude elujõulisuse 50-protsendiline inhibeerimine (CC50) arvutati neljaparameetrilise mittelineaarse regressioonianalüüsiga, kasutades GraphPad Prizm tarkvara.

2.4. Inimese seerumi transferriini ja rekombinantse RBD valgu märgistamine

Märgistamisreaktsioon viidi läbi temperatuuril pluss 4 ◦C 12 tundi, lisades 5 mM NHS-estri 5-TAMRA (Lumiprobe, #47120) lahust dimetüülsulfoksiidis 30 µM Fe2-TF või RBD lahustele. 200 mM NaHCO3-s, säilitades suhte 5-TAMRA: valk=8:1 (mol/mol). Pärast liigse värvaine eemaldamist hinnati märgistuse astet A541 ja A280 suhtega, mis oli vastavalt 3,5 ja 3,2 mol TAMRA ühe mooli Fe2-TF ja RBD kohta.

2.5. Vero rakkude TF ja RBD omastamise ferristatiin II mõju uuring

Vero rakke kultiveeriti 18 tundi DMEM/2% FBS-is ilma ferritiini IIta ja 100 uM ferritiini Il lisamisega koos mikroskoopia jaoks mõeldud katteklaasidega, mis olid eelnevalt asetatud kultuuriplaatide põhjale. Seejärel asendati sööde 15 tunniks ilma FBS-ita söötmega, mis sisaldas 1,2 µM Fe2-TF-TAMRA (0,25 mg/mL) või 1,2 µM RBD-TAMRA (0,1 mg/mL). Pärast inkubeerimist pesti rakke õrnalt kaks korda PBS-ga, fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga (w/) PBS-s 10 minutit, pesti kaks korda PBS-iga 30 minutit. Seejärel värviti rakkude tuumad 360 nM DAPI-ga 5 minutit, pesti PBS-i ja katteklaasidega ning paigaldati slaididele, kasutades fluorestsentsmikroskoopia jaoks polümeriseerivat vaiku (DAKO, Glostrup, Taani). Pildid saadi Axio Observer.Z1/7 konfokaalse laserskaneeriva mikroskoobi (Carl Zeiss, Jena, Saksamaa) abil Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 objektiiviga. TAMRA fluorestsentsi ergutamiseks kasutati A561 nm laserit, a { Fluorestsentsi registreerimiseks kasutati {28}} nm filtrit, DAPI ergastamiseks kasutati 405 nm laserit. ja fluorestsentsi registreerimiseks kasutati 400-570 nm filtrit. Pildid saadi ja töödeldi mikroskoobiga kaasas oleva tarkvara abil.

3. Tulemused

Kasutasime kahte antigeenselt kauget SARS-CoV-2 tüve, et hinnata ferritiin II võimet pärssida viiruse replikatsiooni Vero rakkudes. Esimeses etapis hindasime viiruse inhibeerimist ühendi pideva juuresolekul söötmes. Viiruse antigeeni tuvastamisel rakupõhises ELISA-s leiti, et ferritiin II IC50 väärtused olid Wuhan D614G ja Delta viiruste puhul vastavalt 26,5 ja 40,4 µM (joonis 2A). Viiruse tiitrite kvantifitseerimine söötmes kinnitas, et ferritiin II pärssis viiruse vabanemist nakatunud rakkudest söötmesse, alates kontsentratsioonist 25 µM, ja TCID50 tiitrite vähenemise põhjal arvutatud IC50 väärtused olid 24,0 ja 25,2. µM vastavalt Wuhan D614G ja Delta viiruste jaoks. Veelgi enam, kui ühend lisati kontsentratsioonis 100 uM, ei toimunud Vero rakkudes viiruse replikatsiooni (joonis 2B).

cistanche ja tongkat ali

Wuhani D614G ja Omicron SARS-CoV-2 variantide RBD valkude oluliste erinevuste tõttu ei saanud viimast tuvastada rakupõhises ELISA-s, kasutades saadaolevat RBD-vastast antikeha, kuna see tõsteti algse SARS-CoV-2 tüve RBD. Sellegipoolest oli nakkuslike viiruse tiitrite vähenemine ferritiin II juuresolekul Omicroni variandi puhul võrreldes kahe teise SARS-CoV-2 tüvega veelgi märgatavam: ferritiin II puhul täheldati viiruse tiitri kümnekordset langust. kontsentratsioon on nii madal kui 6,25 uM, ilma viiruse replikatsioonita kontsentratsioonidel 50 uM ja üle selle (joonis 3). Oluline on märkida, et see SARS-CoV-2 inhibeerimine toimus ainult siis, kui söötmes oli pidevalt ferritiin II, samas kui rakke eeltöödeldi ühendiga või kui viirus/ferritiin seda toimet ei täheldatud. Adsorptsioonietapis kasutati II segu, millele järgnes inkubeerimine ilma aineta (andmeid pole näidatud).

We further assessed the cytotoxic effect of ferritin II on Vero-CCL81 cells. The presence of this compound in the culture medium at a concentration up to 400 µM had no negative effect on the viability of the cells, suggesting that the inhibition of SARS-CoV-2 replication was not due to the cell's metabolic dysfunctions (Figure 4). Therefore, the selectivity indices (determined as a ratio of CC50 to IC50 values) for ferritin II were >10, >15, and >64 vastavalt Wuhan D614G, Delta ja Omicron SARS-CoV-2 tüvedele.

Ferritiin II poolt SARS-CoV-2 inhibeerimise võimalike mehhanismide uurimiseks uurisime aine mõju viiruse sisenemisele asendus-RBD omastamise testiga. Seega määrasime kindlaks, kuidas 100 µM ferritiin II mittetoksiline kontsentratsioon võib mõjutada tetrametüülrodamiiniga märgistatud (TAMRA) RBD omastamist Vero rakkudes. TfR1, ferritiin II toime sihtmärk, vahendab teadaolevalt Tf sisenemist; seetõttu kasutati positiivse kontrollina TAMRA-märgistatud TF-i. Vero rakkude kultiveerimine 100 uM ferritiini II juuresolekul 18 tundi ilma märgistatud valke lisamata ei avaldanud olulist mõju raku tuumade morfoloogiale (joonis 5, ülemine paneel (Mock)), mis näitab kaudselt raku nekroosi ja apoptoosi puudumist. Rakkude inkubeerimine TF-TAMRA-ga ilma ferritiin II töötlemiseta põhjustas märgistatud valkude akumuleerumist rakkude sees, mõjutamata DAPI-ga värvitud tuumapiirkonda (joonisel 5 kujutatud vasakpoolne keskmine kujutiste triaad (TF-TAMRA)). Rakkude töötlemine 100 uM ferritiin II-ga vähendas oluliselt märgistatud TF-i (joonisel 5 kujutatud parempoolne keskmine kujutiste triaad (TF-TAMRA)) kaasamist. Rakkude inkubeerimine RBD-TAMRA-ga ilma ferritiin II-ga töötlemata, nagu märgistatud TF-i puhul, põhjustas märgistatud valkude akumuleerumise raku tsütoplasmas, mõjutamata tuuma piirkonda (all vasak triaad (RBD-TAMRA) joonisel 5 ). Kui rakke töödeldi 100 uM ferritiin II-ga, toimus TAMRA signaali ümberjaotumine. Selle asemel, et lisada märgistatud RBD rakkudesse, jaotus TAMRA signaal ühtlaselt üle raku pinna, kusjuures ainult väike osa märgisest moodustas klastreid, mis osaliselt kattuvad tuumade DAPI värvimisega, mis näitab TAMRA märgise pinna lokaliseerumist (alumine parempoolne kolmkõla (RBD-TAMRA) joonisel 5). Joonisel 5 näidatud tulemused näitavad, et Vero rakkude töötlemine 100 uM ferritiin II-ga mõjutab märgistatud RBD inkorporeerimist rakkudesse. Arvestades, et praegu puuduvad andmed ferritiin II mõju kohta ACE2 retseptorile, ei saa välistada, et täheldatud toime on tingitud märgistatud RBD seondumisest rakupinnaga, kuid TfR1 puudumine rakkudel takistab inkorporeerimist. ferritiin II-ga töödeldud rakkudes.

4. Arutelu

SARS-CoV-2 kasutab peremeesrakkudesse tungimiseks ja eduka viirusinfektsiooni tekitamiseks mitmeid mehhanisme ning praegu hinnatakse COVID{2}} ravistrateegiatena suurt hulka peremeesrakku sisenemise inhibiitoreid [21]. Käesolevas uuringus esitame esialgsed tulemused SARS-CoV-2 in vitro replikatsiooni pärssimise kohta sihtrakkude töötlemisel ferritiin II-ga, väikese suurusega molekuliga, mis võib selektiivselt lagundada transferriini retseptorit 1. Rauaga küllastunud transferriin (Fe2-Tf või holo-Tf) omab kõrget afiinsust oma retseptorite suhtes, mis ekspresseerub enamiku inimrakkude pindadel ja internateeritakse kompleksis holo-Tf-ga retseptori vahendatud endotsütoosi kaudu. Raua ja Tf-i, samuti holo-Tf-i ja TfR-i vahelise kompleksi moodustumine sõltub pH-st ja tagab raua vabanemise Tf-st ja Tf-st TfR-st endosoomi happelises keskkonnas. Endosoomi ringlussevõtt toob kaasa selle, et TfR naaseb plasmamembraanile ja vabastab Tf apo-vormi raua edasiseks tarnimiseks rakku. Raua omastamine imetajate rakkudes on oluline protsess selliste vähirakkude kasvu reguleerimiseks, millel puuduvad teadaoleva toimemehhanismiga farmakoloogilised ained. Riikliku Vähiinstituudi mitmekesisuse kogumi raamatukogu 2000 väikese ühendi sõelumisel tuvastati 10 raua transpordi inhibiitorit, mille IC50 väärtused olid vahemikus 5 kuni 30 µM [22]. Ferristatiin II on kasutatud TfR1 blokaatorina C-hepatiidi viiruse [23, 24], transmissiivse gastroenteriidi viiruse [25] ja reoviiruse [26] rakkude nakatumise uuringutes TfR1 kaudu (tabel 1). Tuleb märkida, et TfR1 lagunemise katsed ferritiin II-ga viiakse peaaegu alati läbi aine püsiva juuresolekul söötmes.

Sarnases testi seadistuses leidsime, et ferritiin II oli Vero rakkudele praktiliselt mittetoksiline 48-tunnise kokkupuute ajal kontsentratsiooniga 400 uM. See kontsentratsioon on piisav TfR1 täielikuks lagunemiseks kultiveeritud rakkude pinnal [16]. Ühest küljest kinnitas seda efekti märgistatud Fe2-Tf vähenenud omastamine Vero rakkudes, mida oli eeltöödeldud 100 µM ferritiin II-ga 18 tundi. Märgistatud Tf omastamise mittetäielikku blokeerimist saab sel juhul seletada ferritiin II puudumisega märgistatud valkude lisamise ajal. Teisest küljest muutis Vero rakkude töötlemine ferritiin II-ga dramaatiliselt Spike'i valkude RBD omastamist. Selles eeluuringus ei hinnanud me teiste SARS-CoV-2 retseptorite ekspressioonitaset ferritiin II ravi ajal ega kutsunud esile nende teadaolevate retseptorite väljalülitamist, et tõestada TfR-i sõltumatut rolli SARS-i vahendamisel. -CoV-2 lahtri sisestamine, mis on meie edasise uurimistöö valdkond.

Sellegipoolest võib RBD suhteliselt ühtlane seondumine ferritiin II-ga töödeldud rakkude pinnaga viidata sellele, et mõned Vero rakkude SARS-CoV-2 retseptorid jäävad funktsioneerima ja seovad viirust, kuid TfR1 puudumisel viirus ei saa rakku siseneda. See retseptor on tõenäoliselt ACE2, kuna Prabhakara et al. näitas märgistatud RBD omastamise suurenemist koos märgistatud transferriiniga ACE2 üleekspresseerivate rakkude poolt, mis viitab sellele, et ACE2 soodustab RBD omastamist klatriini poolt vahendatud endotsütoosi kaudu, mida kasutab ära TfR1 [28]. Lisaks on tõendeid selle kohta, et SARS-CoV{10}} võib nakatada ACE2-negatiivseid rakke, kasutades alternatiivseid sisenemisradu [29]; seetõttu on SARS-CoV-2 nakkuse puhul lubatud ferritiin II toime sügavam analüüs erinevatele rakutüüpidele, mis heidab valgust TfR1 rollile viiruse elutsüklis. Et mõista, kui paljulubav see aine on SARS-CoV{17}} nakkuse tulevaseks raviks, on oluline teada, kuidas see ühend in vivo metaboliseerub. Ferritiin II-ga ravitud rottidel oli maksas madalam TfR1 tase ning seerumi raua- ja Tf-küllastus vähenes, ilma et muutused maksa mitteheemse raua sisalduses [16].

Lisaks indutseeris ferritiin II heptsidiini ekspressiooni [16, 30]. Teises uuringus hinnati geeniekspressiooni pärast ferritiin II (maisiõlis) manustamist Wistari rottide makku annuses 146 mg/kg/päevas 7 päeva jooksul. Rauda reguleerivate valkude geenide hulgas täheldati pärast ferritiin II manustamist HFE vähenenud ekspressiooni ning CP, GDF15 ja HAMP suurenenud ekspressiooni [31]. Märkimist väärib see, et ferritiin II mõju p53-sõltuvale signaaliülekanderajale oli tõenäoliselt barjäär, mis piiras selle kasutamist ainult TfR1 inhibiitorina rakukultuurides [31].

Ferristatiin II on tuntud ka kui otsene must 38, klorasoolmust E, CI 30235 või CAS 1937- 37-7 ja seda kasutatakse tavaliselt värvainena granulotsüütide ja onühhomükoosi värvimiseks [32, 33]. Oluline on see, et seda värvainet tootnud väikesemahulise üksuse töötajate uriiniproovides täheldati otsese musta 38 bensidiini metaboliite, millel on potentsiaalne põievähi oht [34]. Kuigi ferritiin II ei saa inimestel otseselt kasutada, on sel põhjusel väide, et SARS-CoV{10}} rakku sisenemise pärssimise strateegia TfR1 blokeerimisega on paljutõotav, kuna see lähenemisviis on suunatud peremeesorganismi retseptorile. viiruse mutatsioonidele kalduva valgu asemel. Lisaks on õigustatud täiendavad uuringud, et tuvastada keemilised ühendid, mis toimivad nagu ferritiin II molekul, kuid ilma potentsiaalsete terviseriskidega metaboliitide moodustumiseta.

cistanche erektsioonihäired

Viited

1 Scialo, F.; Daniele, A.; Amato, F.; Pastore, L.; Matera, MG; Cazzola, M.; Castaldo, G.; Bianco, A. ACE2: SARS-CoV peamine rakkude sisenemise retseptor-2. Lung 2020, 198, 867–877. [CrossRef] [PubMed]

2. Ni, W.; Yang, X.; Yang, D.; Bao, J.; Li, R.; Xiao, Y.; Hou, C.; Wang, H.; Liu, J.; Yang, D.; et al. Angiotensiini konverteeriva ensüümi 2 (ACE2) roll COVID-is-19. Crit. Care 2020, 24, 422. [CrossRef] [PubMed]

3. Shang, J.; Jah, G.; Shi, K.; Wan, Y.; Luo, C.; Aihara, H.; Geng, Q.; Auerbach, A.; Li, F. SARS-CoV-2 retseptori tuvastamise struktuurne alus. Loodus 2020, 581, 221–224. [CrossRef] [PubMed]

4. Wan, Y.; Shang, J.; Graham, R.; Baric, RS; Li, F. Uue koroonaviiruse retseptori äratundmine Wuhanist: SARS-i koroonaviiruse kümnendi pikkustel struktuuriuuringutel põhinev analüüs. J. Virol. 2020, 94, e00127-20. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhang, Q.; Chen, CZ; Swaroop, M.; Xu, M.; Wang, L.; Lee, J.; Wang, AQ; Pradhan, M.; Hagen, N.; Chen, L.; et al. Heparaansulfaat aitab SARS-CoV-2-l rakku siseneda ja seda saab sihtida heakskiidetud ravimitega in vitro. Cell Discov. 2020, 6, 80. [CrossRef]

6. Wang, K.; Chen, W.; Zhang, Z.; Deng, Y.; Lian, JQ; Du, P.; Wei, D.; Zhang, Y.; P, XX; Gong, L.; et al. CD147-spike-valk on uus viis SARS-CoV-2 nakatumiseks peremeesrakkudesse. Signaali ülekanne. Sihtmärk. Seal. 2020, 5, 283. [CrossRef]

7. Wei, C.; Wan, L.; Yan, Q.; Wang, X.; Zhang, J.; Yang, X.; Zhang, Y.; Fan, C.; Li, D.; Deng, Y.; et al. HDL-püüdja ​​retseptor B tüüp 1 hõlbustab SARS-CoV-2 sisenemist. Nat. Metab. 2020, 2, 1391–1400. [CrossRef]

8. Daly, JL; Simonetti, B.; Klein, K.; Chen, KE; Williamson, MK; Anton-Plagaro, C.; Shoemark, DK; Simon-Gracia, L.; Bauer, M.; Holland, R.; et al. Neuropiliin-1 on SARS-CoV-2 nakkuse peremeesfaktor. Teadus 2020, 370, 861–865. [CrossRef]

9. Wang, S.; Qiu, Z.; Hou, Y.; Deng, X.; Xu, W.; Zheng, T.; Wu, P.; Xie, S.; Bian, W.; Zhang, C.; et al. AXL on SARS-CoV-2 kandidaatretseptor, mis soodustab kopsu- ja bronhideepiteelirakkude nakatumist. Cell Res. 2021, 31, 126–140. [CrossRef]

10. Cantuti-Castelvetri, L.; Ojha, R.; Pedro, LD; Djannatian, M.; Franz, J.; Kuivanen, S.; van der Meer, F.; Kallio, K.; Kaya, T.; Anastasia, M.; et al. Neuropiliin-1 hõlbustab SARS-CoV-2 rakkude sisenemist ja nakkavust. Teadus 2020, 370, 856–860. [CrossRef]

11. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. SARS-CoV-2 rakkudesse sisenemise mehhanismid. Nat. Rev Mol. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef] [PubMed]

12. Tang, X.; Yang, M.; Duan, Z.; Liao, Z.; Liu, L.; Cheng, R.; Fang, M.; Wang, G.; Liu, H.; Xu, J.; et al. Transferriini retseptor on teine ​​SARS-CoV-2 sisenemise retseptor. bioRxiv 2020. [CrossRef]

13. Hentze, MW; Muckenhaler, MU; Andrews, NC Tasakaalustusaktid: imetajate raua metabolismi molekulaarne kontroll. Cell 2004, 117, 285–297. [CrossRef] 14. Wessling-Resnick, M. Raudvärava ületamine: miks ja kuidas transferriini retseptorid vahendavad viiruse sisenemist. Annu. Rev. Nutr. 2018, 38, 431–458. [CrossRef] [PubMed]

15. Horonchik, L.; Wessling-Resnick, M. Väikemolekulaarne raua transpordi inhibiitor ferritin/NSC306711 soodustab transferriini retseptori lagunemist. Chem. Biol. 2008, 15, 647–653. [CrossRef]

16. Byrne, SL; Buckett, PD; Kim, J.; Luo, F.; Sanford, J.; Chen, J.; Enns, C.; Wessling-Resnick, M. Ferristatiin II soodustab transferriini retseptori -1 lagunemist in vitro ja in vivo. PLoS ONE 2013, 8, e70199. [CrossRef]

17. Sokolov, AV; Voynova, IV; Kostevitš, VA; Vlasenko, AY; Zakharova, ET; Vassiljev, VB. Tseruloplasmiini ja laktoferriini/transferriini koostoime võrdlus: siduda või mitte siduda. Biochem. Biokhimiia 2017, 82, 1073–1078. [CrossRef]