Farnesüültransferaasi inhibiitor LNK{0}} nõrgendab aksonaalset düstroofiat ja vähendab amüloidpatoloogiat hiirtel, 1. osa

Abstraktne

Taust:

Amüloidnaastude ladestumine ja aksonite degeneratsioon on AD patogeneesi varajased sündmused. A lõhub mikrotuubuleid presünaptilistes düstroofsetes neuriitides, mille tulemuseks on kahjustatud endolüsosomaalsete ja autofaagiliste organellide kuhjumine, mis transpordivad amüloidi prekursorvalgu lõhustavat ensüümi (BACE1). Järelikult tekitavad düstroofsed neuriidid A42 ja aitavad oluliselt kaasa naastude ladestumisele.

Aksonite degeneratsioon on neuroloogiline häire, mis põhjustab neuronite aksonite kahjustusi, mõjutades seeläbi närvijuhtivust. Immuunsus on inimkeha jaoks oluline kaitseliin, et seista vastu võõraste mikroobide ja viiruste sissetungile. Niisiis, kas aksonite degeneratsiooni ja immuunsuse vahel on seos?

Esiteks ei ole aksonite degeneratsioon immuunsüsteemi põhjustatud haigus, mistõttu pole vaja karta, et immuunsus seda negatiivselt mõjutab. Kuigi aksonite degeneratsiooni konkreetne põhjus pole teada, näitavad mõned uuringud, et aksonite degeneratsioon võib olla seotud immuunsüsteemi põletikuliste reaktsioonidega. Põletikuline reaktsioon on immuunsüsteemi kaitsemehhanism võõraste patogeenide sissetungi eest. Kui see aga on üleaktiveeritud, põhjustab see neuronite põletikulisi kahjustusi ja soodustab aksonite degeneratsiooni.

Teiseks võib tugev immuunsüsteem parandada organismi vastupanuvõimet ning vähendada infektsioonide ja haiguste riski, mis on eriti oluline aksonite degeneratsiooniga patsientidele. Kuna aksonite degeneratsiooniga patsientide närvisüsteem on kahjustatud, on organismi enesereastumise võime suhteliselt nõrk. Kui nad põevad muid haigusi, halveneb seisund ja mõjutab veelgi nende elukvaliteeti. Seetõttu võib tervisliku toitumise ja eluviiside säilitamine ning immuunsuse tugevdamine aidata vähendada teiste haiguste riski. Samal ajal võib see parandada organismi immuunvastust ning soodustada aksonite paranemist ja närvijuhtivuse taastamist.

Kokkuvõttes võib öelda, et kuigi aksonite degeneratsiooni ja immuunsuse vahel puudub vajalik seos, võib terve immuunsüsteem pakkuda aksonite degeneratsiooniga patsientidele vajalikku kaitset ja tuge. Seetõttu peaksime pöörama tähelepanu immuunsüsteemi säilitamise olulisusele, alustades sellistest aspektidest nagu toitumine ja elamisharjumused ning keha immuuntaseme aktiivne parandamine, et panna alus tervisele ja pikaealisusele. On näha, et me peame parandama mälu ja Cistanche deserticola võib oluliselt parandada mälu, sest Cistanche deserticola on traditsiooniline Hiina ravimmaterjal, millel on palju ainulaadseid toimeid, millest üks on mälu parandamine. Hakkliha tõhusus tuleneb selles sisalduvatest erinevatest toimeainetest, sealhulgas hapetest, polüsahhariididest, flavonoididest jne. Need koostisosad võivad aju tervist mitmel viisil edendada.

Klõpsake nuppu Tea 10 võimalust mälu parandamiseks

Farnesüültransferaasi inhibiitoreid (FTI) on hiljuti uuritud nende ümberpositsioneerimiseks neurodegeneratiivsete häirete ravi suunas ja farnesüültransferaasi (FTase) toime blokeerimiseks, et katalüüsida farnesüülimist, mis on translatsioonijärgne modifikatsioon, mis reguleerib lüsosoomi funktsiooni ja mikrotuubulite stabiilsusega seotud valke. Postmortem AD ajus on FTase ja selle allavoolu signaalimine ülesreguleeritud. Siiski ei ole FTI-de mõju amüloidpatoloogiale ja düstroofsetele neuriitidele teada.

Meetodid:

Testisime FTIR LNK-754 ja lonafarniibi toimet amüloidpatoloogia 5XFAD hiiremudelis.

Tulemused:

2-kuu vanustel 5XFAD hiirtel, keda raviti krooniliselt 3 kuud, vähendas LNK-754 amüloidnaastude koormust ja tau hüperfosforüülimist ning nõrgendas BACE1 ja LAMP1 kuhjumist düstroofsetes neuriitides. 5-kuu vanustel 5XFAD hiirtel, keda raviti ägedalt 3 nädalat, vähendas LNK-754 düstroofsete neuriitide suurust ja LysoTracker-Greeni kogunemist, ilma et see mõjutas A ladestusi. Äge ravi LNK{13}}-ga parandas hAPP/PS1 amüloidhiirte mälu- ja õppimishäireid.

Erinevalt LNK{0}}-st oli lonafarniibravi naastude, tau hüperfosforüülimise ja düstroofsete neuriitide vähendamisel vähem efektiivne, mis võis tuleneda FTaasi vastase toime vähenemisest võrreldes LNK-754-ga. Uurisime FTI-de mõju endolüsosomaalsete organellide aksonite kaubitsemisele ja leidsime, et lonafarniib ja LNK{2}} suurendasid primaarsetes neuronites retrograadset aksonite transporti, mis näitab, et FTI-d võivad toetada aksonite hiliste endosoomide küpsemist lüsosoomideks. Lisaks suurendas FTI-ravi LAMP1 taset hiire primaarsetes neuronites ja 5XFAD hiirte ajus, näidates, et FTI-d stimuleerisid endolüsosomaalsete organellide biogeneesi.

Järeldused:

Näitame uusi andmeid, mis viitavad sellele, et LNK{0}} soodustas aksonite kaubitsemist ja endolüsosomaalsete sektsioonide funktsiooni, mis meie oletuse kohaselt vähendas aksonite düstroofiat, vähendas BACE1 akumulatsiooni ja pärssis amüloidi ladestumist 5XFAD hiirtel. Meie tulemused nõustuvad varasema tööga, milles tuvastati FTaasi kui terapeutilist sihtmärki proteinopaatiate ravimisel ja millel võib olla oluline terapeutiline mõju AD ravis.

Märksõnad:

Alzheimeri tõbi, düstroofsed neuriidid, farnesüültransferaasi inhibiitorid.

Taust

Alzheimeri tõbi (AD) on progresseeruv neurodegeneratiivne haigus, mis on kõige levinum dementsuse põhjus vananevas elanikkonnas ning mida iseloomustab märkimisväärne õppimise ja mälu halvenemine. Molekulaarsel tasandil on AD aju iseloomulikud tunnused amüloid- (A) naastude kogunemine ja hüperfosforüülitud tau lisandite olemasolu.

AD varases asümptomaatilises staadiumis koguneb A ajju üle kahe aastakümne või kauem enne mälukahjustuse tekkimist [1–3]. Järelikult on aju A taseme vähendamine olnud AD ravistrateegiate keskmes [4]. Praegu on ainus haigust modifitseeriv ravi, mille FDA on tinglikult heaks kiitnud, A-vastane antikeha, mis puhastab A agregeerunud vormid ajust [5], mis kinnitab, et A sihtimine ajus on paljutõotav lähenemine AD ravile.

Kuid enamik A-le keskendunud kliinilisi uuringuid on ohutuse või tõhususe probleemide tõttu ebaõnnestunud ning nüüd on rõhk pandud sihtmärkidele, mis põhinevad erinevatel AD hüpoteesidel, sealhulgas tau levik, põletik, kaltsiumi düshomeostaas ja neurovaskulaarsed tegurid [4, 6, 7 ]. Lisaks on kasvav huvi lüsosomaalsete lagunemisradade aktiveerimise terapeutilise potentsiaali vastu kui meetod patogeensete valkude vähendamiseks, mis on levinud neurodegeneratiivsete haiguste puhul [8–12].

Endolüsosomaalsete ja autofaagiliste radade ulatuslik düsfunktsioon on AD patogeneesi varajase sündmusena hästi dokumenteeritud. Paljud AD-tundlikkuse geneetilised lookused on seotud subtsellulaarse endolüsosomaalse transpordi ja lüsosoomi funktsiooniga [13] ning suurenenud düsfunktsionaalsed endolüsosomaalsed ja autofaagilised organellid akumuleeruvad AD ajus düstroofsete neuriitide sees [14, 15].

Näib, et düstroofsed neuriidid tekivad neuronaalse kahjustuse korral ja AD puhul peetakse seda mikrotuubulite destabiliseerimiseks A poolt [16]. Selle tulemuseks on fokaalsed aksonite tursed, mis häirivad A tootmises osalevate peamiste valkude, sealhulgas BACE1 normaalset kaubitsemist ja lagunemist [16, 17]. Selle tulemusena tekitavad düstroofiad A 42 ja soodustavad oluliselt rakuvälise naastu ladestumist ja aksonite düstroofiat [18], käivitades edasisuunamise raja, mille tulemuseks on sünaptiline kadu, neurodegeneratsioon ja kognitiivsed häired [16].

Terapeutilised strateegiad, mis parandavad endolüsosomaalsete ja autofagiliste organellide transporti ja aktiivsust, võivad takistada neuriitilist düstroofiat, säilitada patogeensete valkude lagunemist ja olla kriitiliseks mehhanismiks BACE1 ja A taseme vähendamisel AD-s.

Kuna tõhusa AD-ravi otsimine jätkub, on AD kliinilistes uuringutes taaskasutatud ravimite arv oluliselt kasvanud, kuna kliiniliselt hinnatud ravimitel on teadaolevad ohutuse ja efektiivsuse probleemid, kiirendades seega ravimite väljatöötamise protsessi [7, 19]. Viimastel aastatel on uuringud tuvastanud, et FTI-d on ravimite klass, mida võib uuesti kasutada neurodegeneratiivsete haiguste raviks.

FTI-d inhibeerivad farnesüülimist, translatsioonijärgset modifikatsiooni, mis reguleerib valke, milles farnesüülpürofosfaat on kovalentselt modifitseeritud tsüsteiini jääkidega valkudes, mis sisaldavad CAAX-i motiivi [20]. FTI-d olid algselt kavandatud blokeerima onkogeenset Ras-i aktiivsust, inhibeerides selle prenüülimist, kuid nende kasutamine vähiravi kliinilistes uuringutes katkestati pärast alternatiivsete Ras-i prenüleerimise radade avastamist [21, 22].

Siiski on palju FTaasi substraate [23–25], mis viib FTI-de hindamiseni paljude häirete, sealhulgas südame-veresoonkonna haiguste, D-hepatiidi ja progeeria puhul [20, 26]. Lisaks on FTI-d näidanud lubadust neurodegeneratiivsete haiguste suhtes, mida iseloomustab valguagregaatide kuhjumine. Proteinopaatiate näriliste ja rakukultuuri mudelites indutseerivad FTI-d lüsosomaalset aktiivsust ja haigusspetsiifiliste toksiliste valkude proteolüüsi [8, 9, 27, 28].

Varem näitasime, et LNK{0}}, vähiuuringutes testitud FTI, suurendas lüsosomaalset hüdrolaasi kaubitsemist ja vähendas alfa-sünukleiini (-sünukleiini) agregaate Parkinsoni tõve (PD) patsientidest pärinevates neuronites ja PD hiiremudelites [8 ].

Teised uuringud on teatanud sarnastest FTI-de tulemustest valguagregaatide vähendamisel; PD rakukultuurimudelite ravi FTI{0}} vähendatud sünukleiiniga [28] ja lonafarniibiga, FDA poolt heaks kiidetud FTI-ga progeeria raviks [29], suurendas lüsosomaalset aktiivsust ja vähendas tau inklusioone tauopaatia hiiremudelis [28] 9]. Lisaks näitas hiljutine uuring, et neuronaalse FTaasi geneetiline väljalülitamine AD APP/PS1 hiiremudelis takistas A-põlvkonda [30]. Varasemates uuringutes, milles hinnati proteinopaatiate FTI-sid, on keskendutud FTaasi substraatide rollile lüsosoomide aktiivsuses ja autofagias.

Siiski on teada, et FTI-d soodustavad ka mikrotuubulite (MT) stabiilsust ja sünergiseerivad MT-d stabiliseerivate ravimitega, et suurendada tubuliini atsetüülimist Ras-sõltumatu raja kaudu [31–33]. MT stabiliseerimine inhibeerib AD patoloogiat APP/PS1 hiirtel [34] ja praegu uuritakse AD raviks kliiniliselt mitmeid MT stabiliseerivaid aineid [35]. Seetõttu näitavad olulised tõendid, et FTI-d võivad olla kasulikud haigustele, mida iseloomustavad düsfunktsionaalsed valgu homöostaasi mehhanismid, nagu AD. Siiski ei ole täielikult teada sihtmärgid ja teed, mis ühendavad valgu farnesüülimist vähenenud valguagregaatidega neurodegeneratiivsete haiguste korral.

Selles uuringus hindasime, kas farmakoloogiline ravi FTI-dega võib parandada A-ga seotud AD patoloogiat. Hindasime LNK-754 ja lonafarniibi, kahe FTI, mis teadaolevalt vähendavad valguagregaate neurodegeneratiivsete häirete korral, mõju naastudele ja düstroofsetele neuriitidele amüloidpatoloogia 5XFAD hiiremudelis. Meie tulemused annavad ülevaate FTaasi inhibeerimisest mõjutatud radadest ja toetavad tugevalt edasist uurimist FTI-de ümberehitamiseks AD ja muude neurodegeneratiivsete haiguste raviks, mida iseloomustab valkude agregatsiooni kogunemine.

materjalid ja meetodid

Loomad ja ravimite ravi

Kogu loomadega tehtav töö tehti Northwesterni ülikooli institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee (IACUC) heakskiidul. Hiirtele toideti tavalist näriliste toidutoitu ja vett ad libitum ning neid peeti standardse 12-tunnise valguse/pimeduse tsükliga. 5XFAD hiiri C57BL6 taustal (Jackson Laboratories) säilitati transgeenpositiivsete hemisügootsete isaste C57BL6 hiirte ristamise teel transgeennegatiivsete emaste C57BL6 hiirtega (Jackson Laboratories).

Meie kroonilise ravi protokollis alustati ravimiravi 2 kuu vanuselt, vanuses, mil naastude ladestumine algab [36, 37]. Ägeda ravi protokollis alustati ravimiravi 5 kuu vanuselt, pärast mida on naastude ladestumine ja aksonite degeneratsioon laialt levinud [38, 39].

LNK{{0}} sünteesis Link Medicine (Massachusetts, USA) ja lonafarniib saadi ettevõttest Cayman Chemical Company (Ann Harbor, MI). Loomade ravimiseks valmistati LNK-745 ja lonafarniib kuumutatud 0,5% karboksümetüültselluloosi (Sigma-Aldrich) lahuses vehiiklina kontsentratsiooniga 0,10 mg/ml kuni lahustumiseni ja lahuse valmistamiseni. selge.

Süstimiseks mõeldud alikvoodid külmutati -20 kraadi juures, seejärel sulatati ja säilitati 4 kraadi juures iga ravinädala jooksul. Hiiri raviti vastavalt kehtestatud protokollile, mis teadaolevalt suurendab lüsosoomi aktiivsust [8]. Kroonilise raviprotokolli kohaselt süstiti 2-kuustele 5XFAD hiirtele intraperitoneaalselt (ip) kas vehiikulit LNK754 või lonafarniibi iga päev, kasutades 29-mõõturiga insuliinisüstalt 12 nädala jooksul, kuni hiired said 5-aastaseks. kuud vana. Ägeda raviskeemi korral süstiti 5-kuusele 5XFAD hiiri iga päev 3 nädala jooksul.

Pärast ravi lõppu hiired tuimastati ja perfuseeriti ning ajud koguti edasiseks analüüsiks (vt allpool jaotisi). Rakukultuurikatsete jaoks lahustati LNK{0}} ja lonafarniib DMSO-s ja lisati hiire primaarsetele neuronikultuuridele kontsentratsioonis 10 nM 48 tunniks. Vehiikli töötlemine oli samaväärne kogus DMSO-d. Rakud koguti ja analüüsiti allpool kirjeldatud viisil.

Antikehad

Immunofluorestsentskatsetes kasutatud antikehad olid roti anti-LAMP1 (#1D4B, DSHB), küüliku anti-A 42 (#700254, Invitrogen), küüliku anti-BACE1 (#ab108394, Abcam), küüliku anti-III tubuliin (#ab18207, Abcam). Immunoblotimisel kasutati küüliku anti-aktiini (#926–42 210, LI-COR), küüliku antip44/42 MAPK (pErk1/2) (#CS9101, Cell Signaling Technology), küüliku anti--44/42. (Erk1/2) (#CS137F5, raku signaalimistehnoloogia), küüliku anti-LAMP1 (#CS3234, rakusignaalitehnoloogia), hiire anti-BACE (3D5; Zhao et al., 2007), hiire anti-APP (6E10) ( #803001, BioLegend), küüliku anti-p-tau (ser404) (#CS20194, rakusignaalitehnoloogia), hiire anti-Tau1 (#MAB3420, Millipore Sigma), prelamin-A, (#MABPT858, Millipore Sigma) ja hiire anti-Tau -HDJ-2 (#sc-59,554, Santa Cruz). Immunoblotideks kasutati küüliku- või hiirevastaseid sekundaarseid antikehi Vector Laboratories'ist.

Käitumise testimine

Loomad ja uimastiravi

Käitumisanalüüsid viis läbi ettevõte reMYND, Inc., kasutades hAPP/PS1 hiiremudelit inimese amüloidi prekursorvalgu kliinilise mutandi neuronispetsiifilise ekspressiooniga koos inimese preseniliini 1 kliinilise mutandiga [40]. See topelttransgeenne hiir näitab A spontaanset, progresseeruvat akumuleerumist ajus, mille tulemuseks on 6 kuu vanuselt amüloidnaastud subikulumis, hipokampuses ja ajukoores. Selles uuringus kasutati 48 6 kuu vanust emast hAPP/PS1 hiirt FVB x C57Bl/6J taustal koos 12 vanusega sobiva emase metsiktüüpi kontrolliga FVB x C57Bl/6J taustal. LNK-754 manustati 0,9 mg/kg/päevas suukaudse sondiga üks kord päevas 12 järjestikuse päeva jooksul. Loomad surmati 2 tundi pärast lõplikku annustamist.

Kõik hiired genotüüpiti polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) abil 3 nädala vanuselt ja said kordumatu identifitseerimisnumbri, kui PCR tulemused olid teada. Kõiki hiiri kontrolliti enne uuringu algust teise PCR-iga. Kõik hiired olid pimedad randomiseeritud ja sobitatud vanusega. Hiirtele anti arvuti abil juhuslik arv ja need jaotati juhuslikult ravile. Ravirühm paigutas loomad uuesti puuri 15 päeva enne uuringu algust, et võimaldada neil tutvuda uue puuri kontekstiga. Hiirtel oli vaba juurdepääs eelfiltreeritud ja steriilsele veele ning standardsele hiiretoidule (Snif® Ms-H, Snif Spezialdiäten GmbH, Soest, Saksamaa). Toitu hoiti kuivas ja jahedas hästi ventileeritavas laoruumis. Vee ja toidu kogust kontrolliti iga päev, vajadusel tarniti ja standardvärskendati kord nädalas. Hiiri hoiti algselt ümberpööratud päeva-öö rütmis (14 tundi valgust / 10 tundi pimedust) alates kell 19.00 standardsetes metallpuurides tüüp RVS T2 (pindala 540 cm2).

Puurid on varustatud tugeva põranda ja allapanu kihtidega. Hiirte arvu puuris piirasid kohalikud loomade heaolu käsitlevad õigusaktid. 15 päeva enne ravi algust paigutati hiired uuesti üksikutesse ventileeritavatesse makrolon T2 puuridesse ja transporditi ravi ettevalmistamiseks laborisse laborikeskkonnaga kohanemiseks. Laboris muudeti päeva-öö rütm 12 tundi valgust/12 tundi pimedust alates kell 19.00.

Morrise veelabürint

Morrise veelabürint viidi läbi 8.–12. ravipäeval ja loomad ohverdati vahetult pärast sondikatset. Bassein (valge, ümmargune 1 m läbimõõduga anum) sisaldas 20-kraadist vett koos titaandioksiidiga kui lõhnatu, mittetoksilise lisandiga, et varjata evakuatsiooniplatvormi (1 cm veepinnast allpool). Iga hiire ujumine võeti videosse ja analüüsiti (Ethovision, Noldus Information Technology, Wageningen, Holland). Enne treenimist asetati iga hiir 15 sekundiks platvormi peale. Kohades navigeerimise testide jaoks koolitati hiiri peidetud platvormi leidmiseks nelja järjestikuse päeva jooksul kolmest katsest koosneva seitsme plokiga.

Iga katse koosneb maksimaalselt 120 sekundi pikkusest sunnitud ujumistestist, millele järgneb 10 minutit puhkust. Mõõdeti iga hiire aeg, mis kulus platvormi leidmiseks. Seitse järjestikust plokki annavad tulemuseks õppimiskõvera. 24 tundi pärast viimast treeningut tehti igal loomal sond, mille platvorm oli eemaldatud. Hiirtel lasti otsida 60 sekundit ning mõõdeti kvadrandi otsinguaega ja platvormi algse asukoha ristumisi. Viimase sondikatse ajal lasti hiirtel pärast platvormi eemaldamist 60 sekundi jooksul otsida platvormi eelmist asukohta.

Primaarne neuronikultuur

E15.5 tiinetel metsiktüüpi C57BL6 hiirtel (Jackson) lõigati primaarsete neuronite saamiseks Hanksi tasakaalustatud soolalahuses (HBSS) (Thermo Fisher #14185–052) eesajud. Tükeldatud eesaju seediti 2,5% trüpsiiniga 37 kraadi juures 20 minutit. HBSS-i neuronite eraldamiseks kasutati tulega poleeritud Pasteuri pipetti. Seejärel kanti neuronid polü-L-lüsiiniga kaetud kuue süvendiga plaadile, 2 × 106 neuronit süvendi kohta neurobasaalses söötmes, millele oli lisatud 2% B-27, 500 μM glutamiini, 10% hobuse seerumit ja 2,5 μM. glutamaat (kõik Thermo Fisherilt).

Sööde vahetati 2 tundi hiljem Neurobasali vastu, milles oli 2% B-27, 500 μM glutamiini ja 2,5 μM glutamaadi. 24 tundi hiljem vahetati sööde Neurobasali pluss 2% B-27 ja 500 µM glutamiini vastu. Pool meediat muudeti iga 2–3 päeva järel. Primaarseid neuroneid kultiveeriti 7 päeva ja töödeldi vehiikuliga (DMSO) või 10 nM kontsentratsiooniga LNK-754 või lonafarniibiga 48 tundi. Seejärel fikseeriti neuronid või pildistati reaalajas, nagu allpool kirjeldatud.

Fikseerimiseks inkubeeriti neuroneid 20 minutit 4% paraformaldehüüdis, 0.12M sahharoosis 1XPBS-s, permeabiliseeriti 0,5% Triton X-100 lahuses ja inkubeeriti primaarsete antikehadega üleöö, millele järgnes eesli hiirevastased Alexafuor-konjugeeritud sekundaarsed antikehad (Molecular Probes, 1:1000) ja värviti koos 300 nM DAPI-ga. Katteklaasid paigaldati Prolong Goldi (Molecular Probes) abil ja pildid saadi Nikon A1 konfokaalse mikroskoobiga, millel oli 60X objektiiv (NA 1.4) ja NIS Elements tarkvara.

Neuronite reaalajas pildistamine

Reaalajas kujutise katsete jaoks valmistati neuronid ülaltoodud viisil ja plaaditi 35 mm klaaspõhjaga nõudesse (MatTek # P35G-1.5-14C) 7 päevaks kultuuris. Seejärel lisati konditsioneeritud söötmele 10 nM LNK-754 või lonafarniibi, kontrollkultuure töödeldi kandjana DMSO-ga. Pärast 48-tunnist töötlemist asendati sööde töötlemata paralleelsete neuronite plaatide konditsioneeritud söötmega. Konditsioneeritud söötmele lisati 25 nM LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) ja neuroneid inkubeeriti 30 minutit 37 kraadi juures.

Neuronite ajavahemikku kujutamine viidi läbi Ti2 laivälja mikroskoobi abil. Pildistamine algas kohe 30 minuti pärast ja kestis mitte kauem kui 30 minutit. 1- säritust tehti iga minut ja 30 minuti jooksul pildistati 20–30 eraldi ala tassi kohta. LysoTrackeri osakeste kauguse ja kiiruse kvantifitseerimine ning kümograafiaanalüüsid viidi läbi tarkvara NIS Elements abil ja neid kirjeldatakse üksikasjalikult allpool. Eraldi katsetes lisati konditsioneeritud kandjale 1 μM Lysosensor-Green DND{10}} (#L7535, Invitrogen) ja elavatest neuronitest jäädvustatud pilte tehti kuni 15 minuti jooksul Nikon A1 konfokaalse mikroskoobiga 60-kordse objektiiviga. (NA 1.4) ja NIS Elements tarkvara.

For more information:1950477648nn@gmail.com