Viiruseväline DNA adeno-seotud viirusvektori preparaatides kutsub esile TLR9-sõltuvad kaasasündinud immuunreaktsioonid inimese plasmatsütoid-dendriitrakkudes

Inimese päritolu HEK-rakkudes või Spodoptera frugiperda (Sf9) putukarakkudes toodetud adeno-seotud viiruse (AAV) vektori suspensioonid erinevad nii peremeesraku jääkkomponentide kui ka AAV kapsiidivalkudes kuvatavate liigispetsiifiliste translatsioonijärgsete modifikatsioonide poolest. . Siin analüüsisime nende erinevuste mõju vektori immunogeensetele omadustele. Stimuleerisime inimese plasmatsütoidseid dendriitrakke erinevatelt tootjatelt saadud HEK-rakkude poolt toodetud ja Sf9-rakkude poolt toodetud AAVCMV-eGFP vektoritega. Leidsime, et AAV8-CMV-eGFP ja AAV2-CMV-eGFP vektorid kutsusid esile partiispetsiifilised, kuid mitte tootmisplatvormispetsiifilised või tootjaspetsiifilised põletikulised tsütokiini vastused. Neid saab vähendada või kaotada, blokeerides tasulise retseptori 9 signaaliülekande või redutseerides DNA ensümaatiliselt vektori partiides, kasutades DNaasi. Edukas HEK-rakkude transduktsioon DNaasiga töödeldud AAV partiide ja DNA analüüsidega näitas, et DNaas ei mõjutanud vektori terviklikkust, vaid lagundas viirusevälist DNA-d. Me järeldame, et nii HEK- kui ka Sf9-rakkudest pärinevad AAV preparaadid võivad sisaldada immunogeenseid viiruseväliseid DNA komponente, mis võivad vallandada partiispetsiifilised põletikulised immuunvastused. See viitab sellele, et täiustatud strateegiad viiruseväliste DNA lisandite eemaldamiseks võivad olla olulised AAV vektori preparaatide immunogeensete omaduste vähendamisel.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Viimasel kümnendil on olnud tohutut huvi uute rekombinantse adenoassotsieerunud viirusega (AAV) põhinevate strateegiate väljatöötamise vastu nii alusuuringute kui ka kliiniliste rakenduste jaoks1–3. Peamine põhjus seisneb selles, et AAV-vektorid on olnud geeniteraapia valdkonnas äärmiselt mitmekülgsed tööriistad, arvestades nende võimet tõhusalt ja ohutult toimetada terapeutilisi geene sihtkudedesse4. Siiski teatab üha suurem hulk uurijaid sõltumatult leidudest, mis viitavad lokaalsele ja süsteemsele immuunvastusest pärast AAV kohaletoimetamist prekliinilistes ja kliinilistes uuringutes5–8.

On näidatud, et AAV-vektorid aktiveerivad kaasasündinud immuunsüsteemi tuvastamise retseptoreid, nagu teemaksutaoline retseptor (TLR)2 ja TLR9, mille tulemuseks on põletikuliste tsütokiinide ja I tüüpi interferoonide (IFN)9,10 vabanemine. AAV immunogeensed komponendid, mis võivad neid vastuseid stimuleerida, hõlmavad kapsiidivalke ja vektori genoomi9, 10. Immuunvastuseid pärast AAV rakendamist võivad vallandada ka lisandid vektori suspensioonis 5, 11. Need lisandid on määratletud kui mis tahes komponendid, mis sisalduvad puhastatud AAV vektori suspensioonis, välja arvatud soovitud saadus12 ja tulenevad vektori tootmisprotsessist. Kliiniliste rekombinantsete AAV-vektorite tootmise kaks peamist meetodit hõlmavad plasmiidse DNA transfektsiooni HEK-rakkudesse ja Spodoptera frugiperda (Sf9) putukarakkude nakatumist bakoluviirusega13. Seega võivad AAV vektori suspensioonides sisalduvad potentsiaalselt immunogeensed lisandid hõlmata endotoksiine, rakukultuurisöötme komponente, AAV puhastamiseks kasutatavaid reagente, peremeesrakkudest pärinevaid valke ja DNA-d ning bakuloviiruse jääk-DNA või plasmiidse DNA5. Täiendavad tegurid, mis võivad mõjutada AAV vektori suspensioonide immunogeensust, on translatsioonijärgsed modifikatsioonid (PTM), mis on kapsiidile trükitud erinevate vektori tootmisplatvormidega5. Oluline on see, et HEK-rakkudest ja Sf9-rakkudest pärinevad AAV-vektorid erinevad suuresti nende PTM-ide, peremeesraku valgu jääklisandite11 ja potentsiaalselt ka DNA lisandite poolest (HEK-raku DNA vs. Sf9 raku DNA ja jääk-plasmiid-DNA vs. bakuloviiruse DNA)14. Plasmatsütoidsed dendriitrakud (pCD-d) on spetsialiseerunud kaasasündinud immuunrakutüüp, mis sekreteerib viirusnakkuste korral suures koguses I tüüpi IFN-i ja põletikueelseid tsütokiine9, 15 ning mängib olulist rolli AAV vektorite tuvastamisel9. Sellest lähtuvalt, et analüüsida, kas erinevused HEK-rakkude ja Sf{26}}-rakkude poolt toodetud AAV-vektorite vahel põhjustavad erinevusi nende immunogeensetes omadustes, stimuleerisime inimese pDC-sid kahest tootmissüsteemist saadud sama AAV-vektori erinevate partiidega. ja erinevad tootjad. Leidsime, et pooled uuritud vektoripartiidest kutsusid esile partiispetsiifilised põletikueelsed immuunvastused, mis ei olnud seotud vektori tootmissüsteemi ega tootjaga. Neid vastuseid vahendas TLR9 signaalimine ja need olid vastuvõtlikud vektoripartiide töötlemisele DNaasiga. Edukas HEK-rakkude transduktsioon nii töötlemata kui ka DNaasiga töödeldud AAV-vektori partiide abil ning AAV-preparaatide DNA analüüsid näitasid, et DNaas ei mõjutanud AAV-osakeste terviklikkust, vaid oli suunatud kapseldamata viirusevälisele DNA-le. Kokkuvõttes viitab see sellele, et AAV-vektori preparaadid võivad sisaldada kapseldamata viirusevälist DNA-d, mis võib mõjutada AAV-vektori preparaatide immunogeenseid omadusi inimese pDC-des.

Cistanche tubulosa eelised- tugevdada immuunsüsteemi

Tulemused

AAV indutseerib inimese pDC-des partiispetsiifilisi kaasasündinud immuunvastuseid.

Uuringud on näidanud, et HEK-rakkudest ja Sf9-rakkudest pärinevad AAV-vektorid erinevad nende PTM-ide ja viirussuspensioonides sisalduvate lisandite poolest11. Me oletasime, et need tegurid võivad põhjustada erinevusi HEK-rakkude ja Sf9-rakkudest pärinevate vektoripartiide immunogeensetes omadustes. Selle hüpoteesi kontrollimiseks analüüsisime kokku kaheksat AAV serotüübi 8 (AAV8) vektori partiid, mis sisaldasid identset tsütomegaloviiruse promootori (CMV) DNA järjestust ja täiustatud rohelise fluorestsentsvalgu (eGFP) (AAV8-) identset transgeeni. CMV-eGFP; viis HEK- ja kolm Sf9 rakust pärinevat partiid) ja neli AAV{14}}CMV-eGFP partiid (kaks HEK- ja kaks Sf9 rakust pärinevat partiid) kolmelt erinevalt tootjalt [tootja A; Iowa ülikooli viirusvektori põhirajatis (Iowa, USA), tootja B; Virovek (CA, USA) ja tootja C; Vigene Biosciences (MD, USA)]. Partiide sarnasuste maksimeerimiseks valmistati tootja A ja tootja B seitse AAV8 partiid (tabel 1), kasutades sama algset plasmiidi. Lisaks viidi läbi AAV vektori partiide vektorgenoomide (vg) tilk-digitaalne PCR (ddPCR) registreerimine kõrvuti mõõtmisel, kasutades kahte erinevat sihtmärki: üks CMV järjestuses ja teine ​​eGFP järjestuses. vektorid. CMV sihtmärgi kvantifitseerimisega saadud tulemusi kasutati AAV vektori partiide tiitrimiseks järgmistes katsetes (tabel 1). pDC-d on spetsiaalsed viirusandurid, mis toodavad viirusinfektsiooni korral massiliselt I tüüpi IFN-e15, sealhulgas AAV vektoreid9. Uurimaks, kas HEK-rakkude ja Sf{28}}rakkude toodetud AAV-vektorid erinevad oma võime poolest kutsuda esile kaasasündinud immuunvastuseid immunokompetentsetes rakkudes, stimuleerisime inimese pDC-sid ülaltoodud AAV-vektori partiidega. Sel eesmärgil puhastati pDC-d üksikute tervete inimdoonorite perifeerse vere mononukleaarsetest rakkudest (PBMC-d) negatiivse selektsiooni teel, kasutades magnetiliselt aktiveeritud rakkude sorteerimist (MACS). Voolutsütomeetria analüüs kinnitas eraldatud pDC-de puhtust üle 90% (joonis S1). Kümme üksiku doonori pDC-d külvati ja stimuleeriti AAV8 ja AAV2 vektori partiidega MOI-ga 1:1 × 106 vg raku kohta 18 tundi. MOI 1:106 vg/raku kohta, mida rakendati kokku 12 500 rakule 50 ul/süvendis, tähendab tiitriks 2,5 × 1011 vg/ml. Me kasutasime seda tiitrit, kuna see jääb võrkkesta geeniteraapia uuringute vahemikku inimestel (nt 1 × 1012 vg/ml16 või 4 × 1011–1,3 × 1012 vg/ml17) ja ahvilistel (nt 5 × 17). 1011–5 × 1012 vg/ml6). Stimuleerimine sõidukiga toimis kontrollina. Inkubeerimine AAV8 ja AAV2 vektori partiidega ei andnud pDC-des tuvastatavat transgeeni ekspressiooni. Kuid kaheksast AAV8 osast neli (partiid A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf9-1) ja kaks neli AAV2 partiid (partiid B-Sf9-1, B-Sf9-2) kutsusid esile reaktiivse rakkude proliferatsiooni stimuleeritud pDC-des (joonis 1a). Sellega kaasnes põletikueelsete tsütokiinide (IP-10, MIP-1 ja TNF-) ja I tüüpi IFN-i (IFN-) vabanemine. Ja vastupidi, järelejäänud AAV8 (partiid A-Sf9-1, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK{{92}) ei indutseerinud ei rakkude proliferatsiooni ega tsütokiinide vabanemist. }) ja AAV2 partiid (partiid C-HEK-1, C-HEK-2). Need tulemused kinnitati kolme kuni nelja sõltumatu katsega, millest igaüks viidi läbi ühe doonori rakkudega (joonis 1a–c ja tabel S1). Partispetsiifilisi erinevusi tsütokiinide kontsentratsioonides nendes sõltumatutes katsetes analüüsiti statistiliselt, kasutades lineaarset segaefekti mudelit ja post hoc Dunnetti testi (Q{101}}.6), võrreldes erinevate AAV vektori partiide vähimruutude keskmisi sõiduki juhtseade (tabelid S2 ja S3). See näitas statistiliselt olulisi erinevusi tsütokiini vastustes "immunogeensete" AAV vektori partiide vahel (AAV8 partiid A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf{ {114}} või AAV2 partiid vastavalt B-Sf9-1, B-Sf9-2) ja kontroll, kuid olulisi erinevusi "mitteimmunogeensete" AAV vektori partiide vahel (AAV8 partiid A-Sf{{ 123}}, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK-1 või AAV2 partiid C-HEK-1, C-HEK-2 vastavalt) ja kontroll (tabel S3). Ülejäänud multipleksanalüüsis sisalduvate mõõdetud tsütokiinide kontsentratsioonid jäid alla testivahemiku (st IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 , IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, GM-CSF, IFN-) või ei ole "immunogeenne" ega "mitteimmunogeensed" vektoripartiid kutsusid esile nende vabanemise olulise suurenemise (st IL-7, IL-8, G-CSF, MCP-1) (joonis S2), mis viitab sellele, et AAV-vahendatud tsütokiini vastuse teatud spetsiifilisus. Et uurida tsütokiini vastuseid varasemal ajahetkel, stimuleeriti pDC-sid "immunogeense" AAV8 vektoripartiiga A-HEK-1. Me täheldasime TNF-kontsentratsiooni olulist suurenemist supernatandis juba 2 tundi pärast pDC stimuleerimist. Seda reaktsioonimustrit saab kinnitada kolmes katses, millest igaüks viidi läbi ühe doonori rakkudega (joonis S3). Et uurida, kas "mitteimmunogeense" AAV8 vektori partii suurem annus suutis käivitada immuunvastuse, stimuleerisime pDC-sid tehniliselt maksimaalse kohaldatava MOI-ga (1:4,61 × 106 vg). Huvitaval kombel ei tuvastatud selle suurenenud tiitriga stimuleerimisel ei reaktiivset rakkude proliferatsiooni ega tsütokiini vastuseid (joonis S4). Vastupidiselt meie hüpoteesile näitavad need tulemused, et kaasasündinud immuunvastused AAV-le pDC-des olid partiispetsiifilised ega olnud seotud konkreetse tootmissüsteemi ega tootja/puhastusmeetodiga.

Tabel 1. Selles uuringus kasutatud AAV8 ja AAV2 viirusvektorite erinevad partiid.

Joonis 1. AAV vektori partii spetsiifiliste immuunvastuste indutseerimine inimese pDC-des. Inimese pDC-sid stimuleeriti erinevate AAV8-CMV-eGFP ja AAV2-CMV-eGFP partiidega (MOI: 1:1 × 106 vg) 18 tundi (a) PDC-de tüüpilised ereda väljaga kujutised, mida stimuleeriti sõiduki kontroll (ülemine pilt) või immunogeense AAV vektori partii (alumine pilt). Skaalariba on 100 μm. (b) IP-10, MIP-1, TNF- ja IFN- 2 tsütokiinide vabastamine AAV8-stimuleeritud pDC-de poolt. (C) Tsütokiini vabanemine AAV{16}}stimuleeritud pDC-de poolt. Tüüpilised graafikud ühest kolmest kuni neljast sõltumatust katsest. Kuna IFN- 2 mõõtmistes (b,c) ja TNF-mõõtmises (c) langesid mõned väärtused testivahemikust allapoole, lisati esitamiseks kõikidele mõõdetud IFN- 2 ja TNF-väärtustele konstant 1. poollogaritmilises graafikus. Näidatud on mediaanid ja kvartiilidevahelised vahemikud. Üksikute vektoripartiide etikettidel on kolm tootjat tähistatud tähtedega A, B ja C; HEK-rakkudest tuletatud ja Sf{24}}-rakkudest tuletatud vektorid on tähistatud tähtedega "HEK ja "Sf9" ning sama tootja ja sama tootmissüsteemi vastavad partiid on nummerdatud "1, 2, 3". Ring: HEK-st tuletatud vektorpartii; kolmnurk: Sf9-tuletatud vektorpartii; must: vektorpartii tootjalt A; oranž: vektorpartii tootjalt B; roheline: vektorpartii tootjalt C.

Immuunvastust AAV-stimulatsioonile pDC-des ei mõjuta kapsiidi / VG suhte erinevused.

Prekliinilised uuringud on näidanud, et erinevused täis- ja tühjade vektorosakeste arvus AAV-vektori suspensioonides võivad mõjutada immuunvastust18. Et hinnata, kas analüüsitud vektoripartiide immunogeensete omaduste erinevused olid tingitud erinevustest täis- ja tühjade vektoripartiklite vahekorras, määrasime AAV tiitrimise ELISA abil vektori kapsiidide tiitri kõigis AAV partiides ja arvutasime kapsiidi/VG. suhe. Huvitaval kombel leiti kõigi AAV partiide vahel suuri erinevusi kapsiidi/vg suhte vahel (joonis 2). AAV8-CMV-eGFP partiides A-HEK-1, A-HEK-3, A-Sf{{11} leiti ligikaudu kaks korda rohkem kapsiide kui vg (2:1). } ja AAV2-CMV-eGFP B-Sf9-1; ja neli korda rohkem (4:1) AAV8 partiis A-Sf{20}}. Ülejäänud partiide puhul täheldati suhet 1:1. Siiski ei leitud olulisi erinevusi "immunogeensete" ja "mitteimmunogeensete" AAV vektori partiide kapsiidi/vg suhete vahel ei AAV8 (P=0.27) ega AAV2 (P=0.37) puhul. vektorpartiid (joonis 2). See viitab sellele, et analüüsitud AAV vektori partiide immunogeensete omaduste erinevused ei olnud samuti seotud erinevustega täis- ja tühjade vektoriosakeste vahekorras.

Tistanche toidulisandi eelised - kuidas tugevdada immuunsüsteemi

"Immunogeensete" AAV8 vektori partiide äratundmine TLR9 poolt.

On näidatud, et AAV-i kaasasündinud immuuntuvastust hiire ja inimese pDC-de poolt vahendab DNA tuvastav TLR99. Sellest lähtuvalt hindasime, kas TLR9 osales ka meie "immunogeensete" AAV8 vektoripartiide äratundmises. Selleks külvati pDC-d nagu kirjeldatud ja kultiveeriti TLR9 antagonistiga H154 (50 uM), millele järgnes stimulatsioon "immunogeense" AAV8 vektori partiidega A-HEK-1, A-HEK-2, A. -HEK-3 ja A-Sf9-1 (MOI: 1:1 × 106 vg). 18 tunni pärast ei täheldatud rakkude proliferatsiooni märke (joonis 3a) ja mõõdeti IP-10, MIP-1, TNF- ja IFN- vabanemise olulist vähenemist (joonis fig. 3b). See näitab, et immuunvastuseid "immunogeensetele" AAV8 vektori partiidele inimese pDC-des vahendab TLR9 signaalimine.

Joonis 2. Kapsiidi/vg suhete võrdlus erinevate AAV8-CMV-eGFP ja AAV2-CMV-eGFP vektorpartiide vahel. Kapsiidi/vg suhted tulenevad (a) kaheksa AAV8 vektoripartii ja (b) nelja AAV2 vektoripartii neeldumismõõtmistest (ELISA) ja ddPCR tulemustest. Katkendjooned eraldavad "immunogeensed" ja "mitteimmunogeensed" AAV vektori partiid. Tulbad näitavad replikaatide keskmisi ja standardhälbeid. Statistiline olulisus määrati paaristamata Studenti t-testi abil.

Joonis 3. "Immunogeensete" AAV8-CMV-eGFP vektori partiide äratundmine pDC-de poolt sõltub TLR9-st. Inimese pDC-sid töödeldi TLR9 antagonistiga H154 (50 μM), millele järgnes stimuleerimine "immunogeense" AAV8 vektori partiidega (MOI: 1:1 × 106 vg) 18 tundi. (a) "immunogeensete" AAV vektori partiidega (ülemine pilt) või "immunogeensete" AAV vektori partiidega ja H154 (alumine pilt) töödeldud puhastatud pDC-de tüüpilised ereda väljaga kujutised. Skaalariba on 100 μm. (b) IP-10, MIP-1, TNF- ja IFN- 2 tsütokiinide vabanemine stimuleeritud pDC-de poolt. Kuna IFN- 2 mõõtmistes langesid mõned väärtused allapoole analüüsivahemikku, lisati poollogaritmilisel graafikul esitamiseks kõigile mõõdetud IFN- 2 väärtustele konstant 1. Näidatud on keskmised ja standardhälbed. Statistiline olulisus määrati ühesuunalise ANOVA ja Holm-Sidaki post hoc analüüsi abil. P väärtused: väiksem või võrdne 0,05: *; Väiksem või võrdne 0,01: **; Väiksem või võrdne 0,001: ***.

DNaas-ravi vähendab "immunogeensete" AAV8 ja AAV2 vektoripartiide immuunvastuseid.

Kuigi "immunogeensed" AAV8 vektorid kutsusid pDC-des esile TLR9-sõltuva immuunvastuse, ei indutseeritud "mitteimmunogeensed" partiid selliseid vastuseid. TLR9 aktiveeritakse vastusena DNA-le, eriti DNA-le, mis sisaldab metüleerimata CpG motiive9. Oluline on see, et meie ddPCR mõõtmised kinnitasid, et samad viiruse DNA komponendid esinesid nii "immunogeensetes" kui ka "mitteimmunogeensetes" vektoripartiides. See viitas ühiselt sellele, et "immunogeensete" AAV vektori partiide suhtes täheldatud immuunvastuste põhjustajaks võib pigem pakkimata/vaba DNA viirussuspensioonis kui viirusesisese DNA. Seega, kui "immunogeensete" AAV8 vektoripartiide viirussuspensioonis esines vaba DNA jääk, peaks kaasasündinud immuunvastust DNaas nõrgendama. Selle hüpoteesi testimiseks töödeldi "immunogeenseid" AAV8 ja AAV2 vektori partiisid DNaas I-ga (100 ug/ml) 30 minutit enne AAV stimuleerimist. Et välistada DNaasiga töötlemise mittespetsiifilised mõjud pDC-dele või AAV-osakestele, töödeldi vektoreid ainult AAV-ga stimuleerimise korral enne pDC stimuleerimist DNasemockiga. Nendes ilma DNaasita töötlustes inkubeeriti AAV osakesi 37 kraadi juures identses DNaasi lagundamise söötmes sama kaua kui DNaasiga töödeldud AAV-sid. Kümme pDC-d külvati ja stimuleeriti DNaasiga eeltöödeldud või imiteeritud "immunogeense" AAV vektori partiidega (MOI: 1:1 × 106 vg). Kontrollidena kasutati pDC-sid, mida inkubeeriti ainult DNaasiga või töödeldi vehiikuliga. Huvitaval kombel vähendas "immunogeensete" AAV8 ja AAV2 vektoripartiide töötlemine DNaasiga reaktiivsete rakkude proliferatsiooni (joonis 4a) ja kas täielikult ära (AAV8 partiid A-HEK-2 ja A-Sf9-1; AAV2 partiid B-Sf9-1 ja B-Sf9-2) või oluliselt vähendanud (AAV8 partiid A-HEK-1 ja A-HEK-3) IP väljaandmist{{40} }, MIP-1, TNF- ja IFN- pärast AAV-stimulatsiooni (joonis 4b, c). Kinnitamaks, et täheldatud DNaasi efekti põhjustas tegelikult viirusevälise DNA seedimine, mitte DNaasi mõju vektori terviklikkusele, uurisime, kas AAV vektori partiide töötlemine DNaasiga mõjutas AAV transduktsioonivõimet. Kuna AAV-rakendus ei põhjustanud tuvastatavat pDC transduktsiooni, kasutati nendes analüüsides HEK-rakke, kuna HEK-rakud on hästi tuntud rakumudel, et analüüsida transduktsiooni efektiivsust AAV-i transduktsioonil19. Stimuleerisime HEK293T rakke DNaasiga töödeldud ja fiktiivselt töödeldud AAV8 ja AAV2 vektorpartiidega (MOI: 1:8 × 104 vg) ja hindasime transduktsiooni efektiivsust fluorestsentsmikroskoopia abil 3 päeva pärast vektori pealekandmist. Nagu kirjeldatud, näitasid AAV2 vektorid AAV8 vektoritega võrreldes kõrgemat transduktsioonivõimet. Lisaks ei vähendanud eeltöötlus DNaasiga transduktsiooni efektiivsust ei HEK-st ega Sf{61}}-rakkudest saadud AAV8 ja AAV2 vektori partiides (joonis S5a, b). Need tulemused annavad täiendavaid tõendeid selle kohta, et DNaasi mõju vektoripartiide immunogeensetele omadustele on tingitud viirusevälise DNA lagunemisest. Kuigi TLR9 antagonist H154 kaotas sisuliselt põletikueelsete tsütokiinide vabanemise kõigi nelja immunogeense AAV8 partii puhul (joonis 3), võib DNaasi eeltöötlus kõrvaldada ka põletikueelse tsütokiini vastuse AAV8 partiidele A-HEK{75} } ja A-Sf9-1, kuigi see ei eemaldanud seda täielikult AAV8 partiide A-HEK-1 ja A-HEK-3 puhul (joonis 4). Et testida, kas pikenenud DNaasi raviaeg võib selle tsütokiini vastuse tühistada, kordasime pDC-de simulatsioonikatseid pärast vastavate partiide (A-HEK{85}} ja A-HEK{{87}) DNaasi inkubatsiooniaja kümnekordset pikenemist. }). Täheldasime, et pärast vektorite 5-tunnist töötlemist DNaasiga vähenesid AAV-stimuleeritud rakkude supernatandis olevad keskmised tsütokiinide kontsentratsioonid veelgi, mis ei erine enam oluliselt vehiikli kontrolli omast. Seda reaktsioonimustrit saab kinnitada kolmes katses, millest igaüks viidi läbi ühe doonori rakkudega (joonis S6). See viitab sellele, et TLR{91}}sõltuva põletikueelse immuunvastuse keskne põhjus pDC-des on tõepoolest viiruseväline DNA. Testimaks, kas viirusesisese DNA vabanemine suurendab AAV vektorite immunostimuleerivat aktiivsust, avasime teadlikult "immunogeense" AAV8 partii A-HEK-1 viiruse kapsiidid kuumtöötlemise teel 95 kraadi juures 10 minuti jooksul. . Kuumtöödeldud vektori partii kasutati seejärel pDC-de stimuleerimiseks. Kuigi AAV8 partii A-HEK{103}} stimuleerimisel kuumtöötlemisega ja ilma selleta ei ilmnenud reaktiivsete rakkude proliferatsiooni erinevusi, suurenes oluliselt IP{104}}, MIP{105}} vabanemine. , TNF- ja IFN- kuumtöödeldud seisundis, mis näitab, et kapseldatud viiruse DNA vabanemine vektori suspensiooni võib kaasa aidata immuunvastuse esilekutsumisele (joonis 5). Need andmed näitavad koos, et AAV vektori preparaadid võivad sisaldada viiruseväliseid DNA saasteaineid, mis võivad pDC-des vallandada partii-spetsiifilisi immuunvastuseid. Neid vastuseid vahendab TLR9 signaalimine ja neid saab vähendada/kaotada vektoripartiide töötlemisel DNaasiga.

Joonis 4. DNaasi eeltöötlus vähendab "immunogeensete" AAV8-CMV-eGFP ja AAV2-CMV-eGFP vektori partiide poolt indutseeritud immuunvastuseid. Inimese pDC-sid stimuleeriti DNaasiga töödeldud "immunogeense" AAV8 vektori partiidega 18 tundi (MOI: 1:1 × 106 vg). (a) Tüüpilised eredad pildid puhastatud pDC-dest, mida on stimuleeritud "immunogeensete" AAV vektori partiidega (ülemine pilt) ja "immunogeensete" AAV vektori partiidega, mida on eelnevalt töödeldud 1{{30}}0 ug/ml DNaasiga I (alumine pilt). Skaalariba on 500 μm. (b) IP-10, MIP-1, TNF- ja IFN- 2 tsütokiinide vabastamine AAV8-stimuleeritud pDC-de poolt. (c) Tsütokiini vabanemine AAV{20}}stimuleeritud pDC-de poolt. Kuna IFN- 2 mõõtmistes (b ja c) ja TNF-mõõtmises (b) langesid mõned väärtused allapoole testi vahemikku, lisati konstant 1 kõikidele mõõdetud IFN- 2 ja TNF-väärtustele. esitlus poollogaritmilises graafikus. Näidatud on keskmised ja standardhälbed. Statistiline olulisus määrati ühesuunalise ANOVA ja Holm-Sidaki post hoc analüüsi abil. P väärtused: väiksem või võrdne 0,05: *; Väiksem või võrdne 0,01: **; Väiksem või võrdne 0,001: ***.

Viiruseväliste DNA saasteainete uurimuslik analüüs AAV8 vektori preparaatides.

Viiruseväliste DNA komponentide esmaseks uurivaks iseloomustamiseks AAV vektori partiides on esindatud "immunogeenne" (A-HEK-1) ja "mitteimmunogeenne" (B-HEK-1) Analüüsiti HEK rakkudest pärinevat vektori partiid. Neid partiisid töödeldi kas pDC söötmes DNaasiga 30 minutit temperatuuril 37 kraadi, nagu ülalpool kirjeldatud, või tehti proovitöödeldud ja ultrafiltreeriti 100 kDa filtrimisseadmega või tehti ainult imitatsioon (joonis S7a –). g). Puhastatud DNA järjestikune Bioanalyzer LabChip eraldamine ja hindamine näitas võrreldavates kogustes vektor-DNA (joonis S7b–g) iga partii töödeldud ja imiteeritud proovides, mis kinnitas, et ei ultrafiltreerimine ega DNaasiga töötlemine ei mõjutanud DNA sisaldust. kapsiidi sees. Lisaks näitas see, et ainult "immunogeenne" (joonis S7a–d), kuid mitte "mitteimmunogeenne" vektori partii (joonis S7a, e-g) sisaldas täiendavaid DNA molekule suurusega 100 kuni 450 aluspaari (joonis fig. S7c, d ja h). Oluline on see, et neid täiendavaid DNA molekule saab tuvastada imiteeritud töödeldud proovis ja ultrafiltreeritud proovis, kuid DNaasiga töödeldud proovis need praktiliselt puudusid (joonis S7a-d). See näitab, et need DNA molekulid esindavad viiruseväliseid DNA saasteaineid, mida DNaas võib lagundada, kuid mida ei saa eemaldada vektori suspensioonist ultrafiltrimisega. Rahastamine, et neid saasteaineid saab tuvastada ainult "immunogeenses", kuid mitte "mitteimmunogeenses" vektoripartiis, tõestab, et nende viiruseväliste DNA molekulide esinemine on partiispetsiifiline ja võib lisaks oletada, et need molekulid indutseerivad või aitavad kaasa. vektori immunostimuleerivatele omadustele. Et hinnata saastava DNA potentsiaalset allikat HEK-i "immunogeensete" (A-HEK-1) ja "mitteimmunogeensete" (B-HEK-1) partiide kvantitatiivses (q)PCR analüüsis viidi läbi raku DNA, plasmiidne DNA ja AAV vektori DNA. Iga partii DNaasiga töödeldud, imiteeritud ja ultrafiltreeritud ning ainult imitatsiooniga töödeldud proovide malli DNA-d kasutati Alu korduse, tuumagenoomi mitmekoopialise NPIP geeni ja HEK-raku päritolu mitokondriaalse 16S rRNA geenijärjestuse (mt16S) amplifitseerimiseks. , AAV8 ümberpööratud terminaalse kordusamplikoni (ITR2; vektori ja transgeeni plasmiidse DNA päritolu) amplifitseerimiseks ja blah (ampitsilliiniresistentsuse) geeni (Amp; plasmiidse DNA päritolu) amplikoni amplifitseerimiseks (tabel S4). HEK raku DNA-spetsiifilise amplikoni ja ITR2 amplikoni (st Alu vs. ITR2, NPIP vs. ITR2 ja mt16S vs. ITR2) ja plasmiidse DNA-spetsiifilise amplikoni ja ITR2 amplikoni (Amp) ΔCt väärtuste suhete võrdlus vs. ITR2), näitab vastavalt, et need kaks partiid sisaldavad ebaolulises koguses HEK-rakkude tuuma- ja mitokondriaalset DNA-d. Seevastu analüüs näitas korralikku kogust plasmiidset DNA-d nii "immunogeenses" kui ka "mitteimmunogeenses" vektori partiis (vastavalt umbes 1/32 ja 1/50 koopiate arvu poolest AAV DNA suhtes), proportsioon, mis jääb hästi teiste AAV-vektorite12 väärtuste vahemikku (joonis S7). Sellegipoolest ei ilmnenud selgeid erinevusi vektori DNA suhtelises proportsioonis plasmiidi ja HEK raku DNA vahel mõlema vektoripartii DNaasiga töödeldud ja proovitud või ultrafiltreeritud ja imiteeritud proovide vahel (joonis S8). See võib viidata sellele, et pakendamata saaste-DNA on sihtjärjestuse koostiselt sarnane pakitud DNA omaga. Kuid qPCR analüüsi piirang on saasteaine DNA suurus (100–450 aluspaari), mis sisaldab korralikku fraktsiooni mittetäieliku sihtjärjestusega fragmente.

Joonis 5. Viirusesisese DNA vabanemine vektorite kuumtöötlemisel suurendab põletikueelseid tsütokiini vastuseid pDC-des. IP-10, MIP-1, TNF- ja IFN- 2 tsütokiinide vabastamine pDC-de poolt 18 tundi pärast stimuleerimist kuumtöödeldud AAV8 partiiga A-HEK-1 (MOI: 1:1 × 106 vg). Horisontaalsed jooned näitavad keskmisi ja standardhälbeid. Statistiliselt olulised erinevused termiliselt töödeldud ja töötlemata vektorite poolt indutseeritud tsütokiini vastuste vahel määrati Studenti t-testi abil. P väärtus: väiksem või võrdne 0.01: **; Väiksem või võrdne 0,001: ***.

Arutelu

AAV-vektorid on geeniteraapias üks paljutõotavamaid vahendeid. Kuid kogunevad tõendid seavad kahtluse alla seisukoha, et AAV immunogeensus on tühine5. Selle valguses on muutunud üha olulisemaks paremini mõista mehhanisme, mille kaudu immuunvastused AAV-le tekivad. Selles uuringus demonstreerime, et (1) AAV8 ja AAV2 indutseerivad inimese pDC-des partiispetsiifilisi kaasasündinud immuunvastuseid, mis ei ole spetsiifilised kapsiidi/vg suhte ega tootmisplatvormi ega tootja/puhastusmeetodi suhtes; (2) pDC-de kaasasündinud immuunvastused sõltuvad TLR9 signaaliülekandest ja neid saab vähendada eeltöötlemisega DNaasiga; (3) DNaasiga töötlemine ei mõjuta vektoriosakeste terviklikkust, kuna see ei vähenda AAV8 ja AAV2 vektoripartiide transduktsioonikiirust HEK293T rakkudes; ja (4) AAV vektori partiid võivad sisaldada viiruseväliseid DNA molekule, mida saab eemaldada vektori partii töötlemisel DNaasiga. See viitab sellele, et nii HEK- kui ka Sf{15}}-rakkudest pärinevad AAV-preparaadid võivad sisaldada viiruseväliseid DNA lisandeid, mis stimuleerivad kaasasündinud immuunvastust. Hiljutises uuringus viidi läbi võrdlev analüüs, kasutades AAV vektoreid erinevatest peremeesrakuliikidest (HEK rakud ja Sf9 rakud)11. Autorid leidsid, et HEK- ja Sf{21}}tuletatud vektorid erinevad PTM-ide ja peremeesraku valgu jääklisandite poolest kõigi testitud AAV serotüüpide ja tootjate lõikes. Lisaks analüüsisid nad inimese primaarsete fibroblastide tsütokiinide vastust AAV transduktsioonile ja leidsid, et HEK- ja Sf{23}}tuletatud vektorid võivad oma immunogeensete omaduste poolest erineda. Meie uuringus võrdlesime ka neid kahte peamist tootmissüsteemi, kasutades erinevate tootjate sama AAV konstruktsiooni erinevaid partiisid ja kahte erinevat serotüüpi. Kuid vektori poolt indutseeritud immuunvastused, mida me oma inimese pDC mudelis täheldasime, ei olnud konkreetselt seotud antud tootmissüsteemi, tootja või serotüübiga, selle asemel olid need partiispetsiifilised. Varasemad võrkkesta geeniteraapia prekliinilised ja kliinilised uuringud on teatanud, et immuunvastuseid AAV-vektoritele, nagu silmapõletik või immuunrakkude infiltratsioon, võivad mõjutada erinevused kapsiidi / vg suhetes18 või annuste erinevustes5. Timmers et al.18 näitasid, et tühjade AAV kapsiidide eemaldamine viirussuspensioonist vähendas põletikku ja parandas viiruse transduktsiooni prekliinilises uuringus ahvilistega. Kuid meie tulemused näitasid, et nii "immunogeensete" kui ka "mitteimmunogeensete" AAV vektori partiide hulgas esines kõrgenenud kapsiidi/vg suhe, mis tähendab, et suurem arv kapsiidide (tühjad kapsiidid) viirussuspensioonis ei olnud vastutav viiruse indutseerimise eest. vektori partii spetsiifilised immuunvastused meie inimese pDC mudelis. Lisaks oleme varem näidanud, et AAV8 indutseerib immuunvastuseid annusest sõltuval viisil ahvilistel 6, 8. Kuid "mitteimmunogeensete" AAV vektorite annuse suurendamine selles uuringus ei olnud piisav immuunvastuse vallandamiseks inimese pDC-des. Seetõttu uurisime vektorite immunogeensete omaduste erinevuste põhjuste mõistmiseks mehhanismi, mis on seotud "immunogeensete" AAV partiide äratundmisega. In vitro immunokompetentsete rakumudelite kasutamine on võimaldanud teadlastel täpsemalt uurida TLR-radade rolli AAV-vektorite tekitatud kaasasündinud immuunvastustes9,10. Zhu jt kirjeldasid esmalt, et pDC-d, kuid mitte tavapärased DC-d või mitte-pDC-d, vabastavad vastusena AAV-stimulatsioonile suures koguses I tüüpi IFN-i ja põletikueelseid tsütokiine ning näitasid TLR9 raja osalust AAV8 ja AAV2 äratundmisel. kasutades hiire pDC-sid. Autorid täheldasid ka, et AAV2 indutseeris inimese pDC-des TLR{49}}sõltuvaid immuunvastuseid. Oma uuringus näitasime ühe spetsiifilisema TLR9 antagonisti H1549,21–24 kasutamisega kaudselt, et mitte ainult AAV2, vaid ka AAV8 vektorid kutsuvad esile TLR{56}}sõltuvad kaasasündinud immuunvastused inimese pDC-des, kuid partiipõhiselt. Kuna TLR9 on DNA retseptor, viitas see sellele, et immuunreaktsioonid "immunogeense" AAV vektori partiidele indutseerisid DNA komponendid. Kuigi meie ddPCR mõõtmised kinnitasid, et samad pakitud DNA komponendid esinesid nii "immunogeensetes" kui ka "mitteimmunogeensetes" vektoripartiides, ei vallandanud "mitteimmunogeensed" partiid pDC-des immuunvastuseid. Lisaks vähendas või kaotas ravi DNaasiga "immunogeensete" AAV vektori partiide immunostimuleerivaid omadusi, kuid ei vähendanud nende vektorite transduktsioonivõimet HEK-rakkudes, mis viitab sellele, et AAV-ravi DNaasiga oli suunatud kapseldamata viirusevälisele DNA-le. vektori suspensiooni, kuid ei mõjutanud vektori genoomi terviklikkust intaktse kapsiidi sees. Seda kinnitasid ka DNaasiga töödeldud ja imiteeritud "immunogeensete" ja "mitteimmunogeensete" vektoripartiide võrdlevad DNA analüüsid.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Kõik need katsed näitavad ühiselt, et immuunvastust "immunogeensetele" vektoripartiidele pDC-des ei korraldanud AAV osakestes sisalduv DNA (st vektori genoom või AAV kapsiididesse pakitud potentsiaalsed DNA lisandid), vaid ligipääsetav viiruseväline DNA. viirussuspensioonis sisalduvad komponendid (st DNA väljaspool või viiruse kapsiidi poolt kaitsmata). Samuti täheldasime, et kui "immunogeense" vektoripartii viiruskapsiidides sisalduv DNA eksponeeriti rakkudega vektori kuumtöötlemisel, suurenes immuunvastus. Ei ole selge, kas immunostimuleeriva aktiivsuse suurenemine pärast kapsiidide avamist oli tingitud vektori üheahelalisest DNA-st või AAV kapsiididesse pakitud potentsiaalsetest lisanditest, nagu peremeesraku jääknukleiinhapped, abistaja DNA jääkjärjestused, karkassi järjestus fragmendid, mis on pakitud koos kassetiga, või vastupidine praimimine ITR-idest, mille tulemuseks on väikesed selgroogfragmendid, mis on pakitud AAV-sse12,25. Viirusevälise DNA omastamise täpne mehhanism pDC-de poolt jääb teadmata. PDC-de reageerimine CpG oligonukleotiididele näitab, et pDC-d võivad reageerida vabale DNA-le26. See viitab sellele, et immuunvastuse pDC-des võib vallandada vektori suspensioonis sisalduva vaba saastava DNA omastamine. Lisaks on näidatud, et pDC-d võivad vastu võtta AAV-vektoreid27, mis viitab sellele, et potentsiaalset kapsiidiga seotud DNA-d võib AAV-osakeste omastamise ajal rakku transportida. Viirusevälise DNA saastumine AAV vektori preparaatides võib olla kas vastava vektoripartii olemuslik omadus, mis tuleneb vektorite tootmis- ja puhastamisprotsessist, või võib see olla tingitud kapseldatud DNA vabanemisest sobimatute säilitustingimuste tõttu. . Kõik nendes katsetes uuritud vektoripartiid saadi sama aja jooksul (8 uuritud AAV8 vektori partiist 5, millest kaks olid "immunogeensed" (A-HEK-2; A-HEK-3) ja kolm olid "mitteimmunogeensed" (A-Sf9-2; B-Sf9-1; B-Sf9-2) toodeti isegi paralleelselt spetsiaalselt selle uuringu jaoks), partiid alates iga tootja tarniti samades transpordikastides ja pärast kättesaamist hoiti kõiki partiisid kõrvuti temperatuurialarmiga kaitstud –80 kraadise sügavkülmiku sahtlis, enne kui kõikide partiide alikvoodid sulatati üheaegselt ja kanti pDC-dele. kõrvutikatsetes. See viitab tugevalt sellele, et nende partiide viirusevälise DNA sisalduse ja immunostimuleerivate omaduste erinevuste eest vastutas pigem AAV tootmis- ja puhastamisprotsess, mitte sobimatu säilitamine. Varem ei antud geeniteraapia jaoks toodetud kliinilise astme AAV-vektori partiisid (alipogene tiparvovec, Glybera) enam lubatud lisandite, sealhulgas potentsiaalselt immunogeense peremeesraku jääk-DNA28 tõttu. DNA lisandid eemaldatakse viirussuspensioonidest tavaliselt tootmisprotsessi käigus. Siin rakendatakse rutiinselt benzonaasi29 või DNase30-ga töötlemist, et eemaldada lõplikust viirussuspensioonist jääk-DNA. See töötlemine, olenevalt protokollist, kestab 30 minutit kuni 3 tundi ja seejärel inaktiveeritakse ensüüm kemikaalidega, nagu tseesiumkloriidi soolad30. Meie katsetes leiti, et neli viiest Iowa ülikooli viirusvektori tuumarajatist saadud AAV8 partiist ja mõlemad Viroveki AAV2 vektoripartiid olid pDC-des immunogeensed. Nagu on kirjeldatud jaotises "Materjalid ja meetodid", hõlmab mõlema tootja vektoripartiide puhastamise protsess mitmeid puhastamisetappe, millest mõned erinevad üksteisest oluliselt. Seega hõlmab Iowa tuumajaama puhastusprotsess turbonukleaasiga töötlemist, millele järgneb ultratsentrifuugimine jodiksanooli gradiendiga, anioonvahetuskolonnkromatograafia, värelemisega steriliseerimine ja puhvri vahetus tsentrifugaalfiltrite abil. Seevastu Virovek rakendab benzonaasi töötlemist, ultratsentrifuugimist CsCl-s, millele järgneb soolatustamine ja filtriga steriliseerimine. Teisest küljest ei hõlma Vigene puhastusprotsess DNaasi töötlemist, kuid nagu seda kasutab Core Facility Iowas, sisaldab jodiksanooli gradiendiga ultratsentrifuugimist. Üllataval kombel ei indutseerinud ükski Vigene'ist saadud kolmest vektoripartiist (AAV8: C-HEK-1; AAV2: C-HEK-1 ja 2) immuunvastuseid pDC-des, mis viitab sellele, et "mitteimmunogeenne" Vektorpartiisid saab genereerida ka tootmisprotsessidega, mis ei hõlma DNaasi töötlemist.

Tistanche toidulisandi eelised - kuidas tugevdada immuunsüsteemi

Üldiselt raskendavad kolme tootja kasutatud osaliselt sarnased ja osaliselt erinevad puhastamisetapid pDC-s täheldatud vektorite immunogeensete omaduste sidumist tootmisprotsessi ühe etapiga. Kliinilistes uuringutes kasutatakse hea tootmistava (GMP) klassi vektoreid, mis on allutatud rangele kvaliteedikontrollile. Ükski selles uuringus kasutatud kolme tootja vektorist ei ole hea laboritava (GLP) klass ja võib seetõttu olla madalama puhtusega kui kliinilise astme vektorid. Seega on oluline tunnistada, et inimestel läbiviidud kliinilistes uuringutes kasutatud GMP vektorid võivad, kuid ei pruugi avaldada erinevusi, mida me käesolevas uuringus täheldasime, ja et meie leidude asjakohasus geeniteraapiate kliinilise kasutamise jaoks ei ole selge. Kuid meie enda kogemuse kohaselt võivad saastavate komponentide, nagu peremeesraku valgud, kontsentratsioonides esineda märkimisväärseid partiispetsiifilisi erinevusi isegi GMP-klassi vektorite puhul ja isegi GMP-klassi vektorite puhul ei ole ühtselt kokkulepitud spetsifikatsioone selle kohta, millised tasemed on vastuvõetav5. Ühiselt on AAV vektorite tootmisprotsessi parandamine võtmetähtsusega, et vältida jääklisandite esinemist viirussuspensioonides, et minimeerida soovimatute immuunvastuste potentsiaali. Kokkuvõtteks näitasime, et viirusevälised DNA lisandid võivad mõjutada AAV vektorite immunogeenseid omadusi inimese pDC-des. Täiendavad uuringud on vajalikud, et uurida nende leidude mõju AAV-vahendatud geeniteraapia ohutusele loommudelitel või inimpatsientidel.

Viited

1. Gaj, T., Epstein, BE & Schafer, DV Genoomitehnoloogia kasutades adeno-assotsieerunud viirust: põhi- ja kliiniliste uuringute rakendused. Mol. Ter. 24, 458–464 (2016).

2. Garita-Hernandez, M. et al. AAV-vahendatud geeni kohaletoimetamine 3D võrkkesta organoididesse, mis on saadud inimese indutseeritud pluripotentsetest tüvirakkudest. Int. J. Mol. Sci. 21, 994 (2020).

3. Russell, S. et al. Voretigeenneparvoveki (AAV2-hRPE65v2) efektiivsus ja ohutus RPE65-vahendatud päriliku võrkkesta düstroofiaga patsientidel: randomiseeritud, kontrollitud, avatud, 3. faasi uuring. Lancet 390, 849–860 (2017).

4. He, X., Urip, BA, Zhang, Z., Ngan, CC & Feng, B. Evolving AAV-deliveredtherapys to ultimate cures. J. Mol. Med. 99, 1–25. https://doi.org/10.1007/s00109-020-02034-2 (2021).

5. Bucher, K., Rodríguez-Bocanegra, E., Dauletbekov, D. & Fischer, MD Immuunvastused võrkkesta geeniteraapiale, kasutades adenoga seotud viirusvektoreid – ravi edukuse ja ohutuse tagajärjed. Prog. Retin. Eye Res. 83, 100915 (2020).

6. Reichel, FF et al. AAV8 võib indutseerida primaadi silmas kaasasündinud ja adaptiivseid immuunvastuseid. Mol. Ter. 25, 2648–2660 (2017).

7. Boyd, RF et al. Vähendatud võrkkesta transduktsioon ja suurenenud transgeenidele suunatud immunogeensus rAAV intravitreaalse manustamise korral pärast tagumist vitrektoomiat koertel. Gene Ter. 23, 548–556 (2016).

8. Rodríguez-Bocanegra, E. et al. Võrkkesta hüperrefektiivsete fookuste pikisuunaline hindamine pärast adenoga seotud viiruse subretinaalset manustamist ahvilistele. Tõlk. Vis. Sci. Technol. 10, 15 (2021).

9. Zhu, J., Huang, X. & Yang, Y. Te TLR9-MyD88 rada on ülioluline adaptiivse immuunvastuse jaoks adenoassotsieerunud viiruse geeniteraapia vektoritele hiirtel. J. Clin. Uurige. 119, 2388–2398 (2009).

10. Hösel, M. et al. Toll-like retseptorite 2-vahendatud kaasasündinud immuunvastus inimese mitteparenhümaalsetes maksarakkudes adenoga seotud viirusvektorite suhtes. Hepatology, 55, 287–297 (2012).

11. Rumachik, NG jt. Meetodid on olulised: rekombinantse AAV standardsed tootmisplatvormid toodavad keemiliselt ja funktsionaalselt erinevaid vektoreid. Mol. Ter. Meetodid Clin. Dev. 18, 98–118 (2020).

12. Wright, JF Tootega seotud lisandid kliinilise astme rekombinantsetes AAV-vektorites: iseloomustus ja riskihindamine. Biomedicines 2, 80–97 (2014).

13. Clément, N. & Grieger, JC Rekombinantsete adenoga seotud viirusvektorite tootmine kliinilisteks uuringuteks. Mol. Ter. Meetodid Clin. Dev. 3, 16002 (2016).

14. Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N. & Ayuso, E. Rekombinantse adenoga seotud viiruse tootmise farmakoloogia. Mol. Ter. Meetodid Clin. Dev. 8, 166–180 (2018).

15. Ye, Y., Gaugler, B., Mohty, M. & Malard, F. Plasmacytoid dendritic cell biology ja selle roll immuunvahendatud haigustes. Clin. Tõlk. Immunol. 9, e1139 (2020).

16. Fischer, MD et al. Võrkkesta geeniteraapia efektiivsus ja ohutus, kasutades adeno-seotud viirusvektorit koroideemiaga patsientidel: randomiseeritud kliiniline uuring. JAMA Oftalmol. 137, 1247–1254 (2019).

17. Weleber, RG et al. Tulemused 2 aastat pärast geeniteraapiat RPE65-puuduliku Leberi kaasasündinud amauroosi ja raske varases lapsepõlves alguse saanud võrkkesta düstroofia korral. Oftalmology 123, 1606–1620 (2016).

18. Timmers, AM et al. Silma põletikuline reaktsioon adeno-seotud viirusvektori intravitreaalsele süstimisele: genoomi ja kapsiidi suhteline panus. Humm. Gene Ter. 31, 80–89 (2020).

19. Ran, G. et al. Kohtsuunatud mutagenees parandab kapsiidi raamatukogust pärinevate rekombinantsete AAV vektorite transduktsiooni efektiivsust. Mol. Ter. Meetodid Clin. Dev. 17, 545–555 (2020).

20. Ellis, BL et al. Uuring imetajate primaarsete rakkude ja rakuliinide ex vivo/in vitro transduktsiooni efektiivsuse kohta üheksa loodusliku adeno-assotsieerunud viirusega (AAV1-9) ja ühe adeno-seotud viiruse serotüübiga. Virol. J. 10, 1–10 (2013).

21. Yamada, H. et al. Supressiivse DNA mõju CpG-indutseeritud immuunaktivatsioonile. J. Immunol. 169, 5590–5594 (2002).

22. Zhang, P. et al. Toll-like retseptori 9 antagonist pärsib humoraalset immuunsust eksperimentaalse autoimmuunse myasthenia gravis'e korral. Mol. Immunol. 94, 200–208 (2018).

23. Chan, YK et al. Adeno-seotud viirusvektorite projekteerimine, et vältida kaasasündinud immuun- ja põletikulisi reaktsioone. Sci. Tõlk. Med. 13, eabd3438 (2021).

24. Bayik, D., Gursel, I. & Klinman, DM Immunosupressiivsete oligonukleotiidide struktuur, mehhanism ja terapeutiline kasulikkus. Pharmacol. Res. 105, 216–225 (2016).

25. Brimble, MA et al. 547. AAV preparaadid sisaldavad otse väljaspool ITR-e asuvate tootmisplasmiidide DNA järjestuste saastumist. Mol. Ter. 24, S218–S219 (2016).

26. Latz, E. et al. TLR9 signaalid pärast translokatsiooni ER-st CpG DNA-sse lüsosoomis. Nat. Immunol. 5, 190–198 (2004).

27. Veron, P. et al. Inimese dendriitrakkude peamised alamrühmad transdutseeritakse tõhusalt isekomplementaarsete adeno-assotsieerunud viirusvektorite 1 ja 2 abil. J. Virol. 81, 5385–5394 (2007).

28. Hindamisaruanne: Glybera. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/glybera-epar-public-assessment report_en.pdf. Kasutatud 03. märtsil 2022 (2012)

29. Arden, E. & Metzger, J. Odav, serotüübist sõltumatu protokoll natiivse ja biokonstrueeritud rekombinantse adeno-assotsieerunud viiruse puhastamiseks. J. Biol. Meetodid 3, e38 (2016).

30. Grieger, JC, Choi, VW & Samulski, RJ. Adeno-seotud viirusvektorite tootmine ja iseloomustamine. Nat. Protoc. 1, 1412–1428 (2006).

31. Kimura, T. et al. Adenoassotsieerunud viirusvektorite tootmine in vitro ja in vivo rakendusteks. Sci. Rep. 9, 13601 (2019).

32. Ayuso, E. et al. Kõrge AAV vektori puhtus suurendab serotüübist ja koest sõltumatut transduktsiooni efektiivsust. Gene Ter. 17, 503–510 (2010).