Eksperimentaalne uuring Cistanche Deserticola spordiväsimusevastase toime mehhanismide kohta

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

YANG Hong-xin1, YANG Yong2, YAN Xiao-hong1 (1. Sise-Mongoolia meditsiinikolledži tsütobioloogia osakond, Hohhot 010059, Hiina; 2. onkoloogia osakond, Sise-Mongoolia autonoomse piirkonna haigla, Huhhot 010017, Hiina)

Abstraktne:Eesmärk Uurida mõjucistanche deserticolamaksa laktaatdehüdrogenaasi (LDH) isoensüümi, glükogeeni ja lämmastikoksiidi süntaasi 3 (NOS3) kohta hiirtel, kes koormavad ujumist ja uurivad asjakohaseid spordiväsimuse molekulaarseid mehhanisme. Meetodid Hiired jaotati normaalseks kontrollrühmaks, sportlikuks kontrollrühmaks jacistanche deserticolakatserühm. Igale suukaudse kontrollrühma ja spordiga kontrollrühma hiirele anti soolalahust 0,2 ml päevas. Igale cistanche deserticola katserühma hiirele anti veekeetmistcistanche deserticola0,2 ml (3 g/kg) päevas. Manustamine kestis 15 päeva. 90-minutiline koormusujumine viidi läbi spordi kontrollrühma ja katserühma cistanche deserticola hiirtel 1 tund pärast viimast manustamist. Hiirte maksad eemaldati pärast 10-tunnist ujumist. Üks osa maksast fikseeriti parafiinilõikude valmistamiseks neutraalses formaliini vedelikus ja teisi kasutati LDH aktiivsuse mõõtmiseks. Maksa struktuuri jälgiti HE värvimisega ja maksa glükogeeni mõõdeti glükogeeni värvimisega. NOS3 uuriti SP immunohistokeemilise meetodiga. Tulemused Spordi kontrollrühma maksa struktuur oli tõsiselt vigastatud, LDH4 ja LDH5 isoensüümid olid kõrgemad, maksa glükogeen kehv, NOS3 vähenes võrreldes normaalse kontrollrühmaga (P<0.05). the="" liver="" structure="" of="" the="" cistanche="" deserticola="" experimental="" group="" was="" good,="" ldh5="" isoenzyme="" was="" low,="" the="" glycogen="" was="" rich="" and="" expression="" of="" nos3="" was="" upregulated="" compared="" with="" the="" sport="" control="" group="" (p=""><0.05). conclusions="">Cistanche deserticolavõib vähendada LDH5, kaitsta hiirte maksa ujumiskoormust ja kiirendada glükogeeni akumulatsiooni, suurendades NOS3 ekspressiooni, et kaitsta maksa ja parandada füüsilise võime taastumist.

Võtmesõnad:cistanche deserticola;maksa glükogeen;lämmastikoksiidi süntaas 3;hiired.

Cistanche pilt

Cistanche,tuntud ka kui Dayun, on Ledanaceae kaheaastane parasiittaim. Sellel on kuivad lihavad varred koos soomustega. Seda toodetakse peamiselt liivastel muldadel ja poolliivastel rohumaadel Sise-Mongoolias, Gansus, Xinjiangis, Qinghais ja mujal. Sise-MongooliaCistancheon kõigi tootmispiirkondade seas parima kvaliteediga.Cistancheon oma olemuselt magus, soolane ja soe. See sisenebneerudja jämesoole meridiaan. Selle põhifunktsioonid on neerude toitmine ja yangi tugevdamine, essentsi ja vere toitmine ning soolte niisutamine. Seda kasutatakse sageli impotentsuse, viljatuse, nõrkade vöökohtade ja põlvede, lihaste ja luude nõrkuse, soolte kuivuse ja kõhukinnisuse raviks. Selle uuringu eesmärk on jälgida selle mõjuCistanchekandvate ujumishiirte maksa laktaadi dehüdrogenaasi (LDH), maksa glükogeeni ja lämmastikoksiidi süntaasi 3 (NOS3) kohta hiirte kandevõime ujumistesti abil ning uurida selle kaitsemehhanismi maksas. Seetõttu võib see anda teoreetilise aluse selle põhjalikuks uurimiseks, arendamiseks ja kasutamiseksCistanche spordi tervisetoidus.

1 Katsematerjalid

1.1 Loomad

3 0 isast Kunmingi rotti, puhas hinne, kehamass (20±0,5) g, tarninud Sise-Mongoolia ülikooli loomakeskus.

1.2 Ravimid

Cistanche deserticolaYCMa, toodetud Sise-Mongoolias Ejina Banneris ja on tuvastatud. Algse ravimmaterjali järgi: vesi=100 g: 400 ml, esmalt leotada 30 min, kuumutada ja keeta ning seejärel keeta soojal tulel 30 min. Valage vedel ravim välja ja keetke uuesti vahekorras 100 g:200 ml. Need kaks keetmist segati kokku ja filtriti kahe kihiga marli ning seejärel kontsentreeriti 1 g algse ravimmaterjali ekvivalendini 1 milliliitri vee keetmise põhilahuse kohta, mida hoiti külmkapis 4 kraadi juures.

1.3 Reaktiivid ja instrumendid

NOS3 polüklonaalne antikeha osteti ettevõttelt Wuhan Boster Bioengineering Co., Ltd. SP komplekt osteti ettevõttelt Fujian Maixin Reagent Company. Laktaatdehüdrogenaasi isoensüümi komplekt osteti ettevõttelt Inner Mongolia Tongri Reagent Company (ainuomanduses Nissanile). Nanjing JD-80 värvilise pildi analüsaator. Ameerika UVP-geeli kujutise analüüsisüsteem.

2 Eksperimentaalne meetod

2.1 Rühmitamine ja doseerimine

Kunmingi hiired jagati juhuslikult normaalseks kontrollrühmaks, treeningu kontrollrühmaks jaCistanchekatserühm, kus igas rühmas oli 10 hiirt. Normaalsele kontrollrühmale ja treeningu kontrollrühmale anti tavalist soolalahust üks kord päevas, 0,2 ml/kord; aCistancheanti katserühmcistancheKeetmine (võtke 3 ml algset veekeetmist ja lisage vett 10 ml-ni). Üks kord päevas, 0,2 ml/kord, päevane annus on 3 g/kg ja 15 päeva järjest. Üks tund pärast viimast annustamist kasutasid treeningu kontrollrühma hiired jaCistanchekatserühma sabale lasti 1 g pliiraskust ning nad pandi 50 cm kõrgusesse, 50 cm pikkusesse ja 35 cm laiusse basseini, et ujuda temperatuuri (30±0,5) kraadi all. , Jälgige pidevalt hiiri, kui avastate, et nad lõpetavad ujumise, kasutage puupulka, et stimuleerida nende liikumist 90 minuti jooksul. Pärast treeningut sööge tavalist dieeti, puhkage 10 tundi ja seejärel eutaniseerige hiired tavaliste kontrollrühma hiirtega. Võtke maks välja, kinnitage osa 10-protsendilise neutraalse formaldehüüdiga ja muutke see pärast dehüdratsiooni, läbipaistvust, vahasse kastmist ja kinnistamist 4 µm paksuseks. Kasutage iga rühma maksakoe struktuuri jälgimiseks HE värvimismeetodit. Teine osa pesti tavalise soolalahusega ja säilitati külmutatult -20 kraadi juures ning sulatati mõõtmise ajal toatemperatuuril. Leotage filterpaberiga kuivaks ja kaaluge, seejärel valmistage maksahomogenaat tavalise soolalahusega, tsentrifuugige kiirusel 3 500 p/min 15 minutit. Võtke supernatant ja mõõtke laktaatdehüdrogenaasi isoensüümi aktiivsus elektroforeesiga.

2.2 Laktaatdehüdrogenaasi aktiivsuse määramine

Polüakrüülamiidgeelelektroforeesi abil eraldatakse LDH isoensüümid vastavalt nende elektroforeetilisele liikuvusele. Proovi eraldusgeeli kontsentratsioon on 7 protsenti, pH 8,9 ja kontsentreeritud geeli kontsentratsioon on 4 protsenti, pH 6,8. 10 µL proovi segatakse 1 tilga glütserooli ja bromofenoolsinise indikaatoriga. Elektroodipuhvriks on Tris-glütsiin (pH 8,7), hakake stabiliseerima pinget 100-150 V juures, lisage 30 minuti pärast 200-250 V-le ja elektroforees 4 tundi. Pärast elektroforeesi värviti see laktaatdehüdrogenaasi isoensüümi komplektiga ja värviti 37 kraadi juures 30 minutit, näidates sinist laktaatdehüdrogenaasi isoensüümi riba, seejärel loputati veega ja fikseeriti jää-äädikhappega. Lõpuks kasutage andmete analüüsimiseks UVP-geeli kujutise analüüsisüsteemi.

2.3 Glükogeeniga värvimine

4 µm paksused jadalõiked deparafiinitakse tavapäraselt veeks. pange 15 minutiks 37-kraadisesse 1-protsendilisse perioodilise happe lahusesse. loputa jooksva veega. pange 60 minutiks Schiffi lahusesse. loputatud jooksva veega, dehüdreeritud gradient-etanooliga, läbipaistva ksüleeniga ja paigaldatud neutraalse kummiga. Seejärel jälgige värvimistulemusi mikroskoobi all.

2.4 Immunohistokeemiline värvimine

Viilud deparafiinitakse tavapäraselt veeks ja antigeen parandatakse tsitraatpuhvriga mikrolaineahjus. Toimige lahusega A 10 minutit, et eemaldada endogeenne peroksidaas, ja blokeerige lahusega B (lahjendatud kitseseerum) 10 minutit. Lisage primaarne antikeha üleöö niisutatud kasti temperatuuril 4 kraadi ja peske teisel päeval pH 7,4 PBS lahusega 5 min × 3 korda. Seejärel lisage biotiiniga märgistatud C lahus (sekundaarne antikeha töölahus) ja inkubeerige 10 minutit, peske PBS lahusega 5 min × 3 korda. Lisage mädarõika peroksidaasiga märgistatud D lahus ja inkubeerige 10 minutit, peske PBS lahusega 5 min × 3 korda. Lõpuks töötati see välja DAB lahuses 5 minutit, pesti kraaniveega, värviti HE vastu, dehüdreeriti gradient-etanooliga, oli ksüleeniga läbipaistev ja paigaldati neutraalse kummiga. Pärast filmi paigaldamist jälgige valgusmikroskoobi all. Igas katsepartiis kasutati primaarse antikeha asemel negatiivse kontrollina fosfaatpuhverdatud soolalahust (PBS).

2.5 Lämmastikoksiidi süntaasi 3 ekspressiooni analüüs

Esialgne vaatlus visuaalse poolkvantitatiivse meetodiga valgusmikroskoobi all, NOS3 positiivne toode on tumepruun või pruun. Positiivne toode asub hepatotsüütide või endoteelirakkude tsütoplasmas hepatotsüütide vahel ja sinine taust on negatiivne. Seejärel kasutage positiivse reagendi halli väärtuse mõõtmiseks värvilise kujutise analüüsisüsteemi. 40x objektiivi all mõõdetakse iga filmi puhul juhuslikult 4 vaatevälja parameetreid ja võetakse keskmine väärtus. Seda parameetrit kasutatakse NOS3 värvimise intensiivsuse muutuse kajastamiseks.

2.6 Statistilised meetodid

Kõik andmed on väljendatud x-±s ja SPSS11.0 t-testi jaoks kasutatakse statistilist tarkvarapaketti ja P<0.05 is="" considered="" as="" significant="">

3 tulemust

3.1 Kudede struktuuri jälgimine optilise mikroskoobi all

Maksasagarate struktuur normaalses rühmas on selge, rakujuhtmed on korralikult paigutatud, maksa sinusoidid on normaalsed, maksarakkudel pole ilmseid kahjustusi ja tuuma struktuur on selge. Treeningu kontrollrühma normaalne koestruktuur kadus, sagara piirid olid ebaselged ja rakujuhe oli korrast ära, enamus maksa sinusoididest kadus ning hepatotsüütide ulatuslik vakuolaarne degeneratsioon väljendub rakumahu suurenemises. Tsütoplasma on lahtine, kergelt määrdunud, isegi selge ja läbipaistev ning mõned maksarakud näitavad tüüpilist balloonimuutust, vähesel määral fokaalset või täpilist nekroosi. MaksarakudCistanchekatserühm olid kergelt hägused, kuid neid paigutati regulaarselt. Rakkudes ei olnud ilmseid vakuoole ja lõtvust, rakujuhtmed olid korralikult paigutatud ja tuuma struktuur oli selge.

3.2 Mõju maksa laktaatdehüdrogenaasi isoensüümide aktiivsusele koormuse all olevatel hiirtel (vt tabel 1)

3.3 Maksa glükogeeni värvumise jälgimine optilise mikroskoobi all

Kuigi glükogeeni sisaldus normaalses kontrollrühmas ei ole kõrge, on glükogeeni igas maksarakus, jaotus on ühtlane ja vakuoolinähtust ei esine. Treeningu kontrollrühmas oli glükogeeni vähem, see oli maksarakkudes laiali ja mõnes piirkonnas tekkisid vakuoolid; Cistanche'i katserühm oli rikas glükogeeni poolest, kuid kogunes palju raku ühele küljele.

3.4 Lämmastikoksiidi süntaasi 3 ekspressiooni jälgimine optilise mikroskoobi ja kvantitatiivse kujutise analüüsiga

Normaalse kontrollrühma hepatotsüütide tsütoplasmas on tugev positiivne ekspressioon, mis on difuusselt jaotunud, eriti binukleaarsetes rakkudes, ja positiivne ekspressioon endoteelirakkudes. Treeningu kontrollrühma hepatotsüütide ja endoteelirakkude ekspressioon tsütoplasmas oli nõrgenenud.Cistanchekatserühmal oli positiivne ekspressioon hepatotsüütide tsütoplasmas ja tugev positiivne ekspressioon endoteelirakkudes. Värvilise pildianalüsaatori analüüsitulemused on toodud tabelis 2.

4 Arutelu

Inimkeha liikumine vajab energiat ja keha vajab energiat ka ainevahetuse protsessis. Rakkude ainevahetus kasutab otseselt adenosiintrifosfaadi (ATP) lagunemisel tekkivat energiat ning ATP sünteesiks vajaliku energia annab lõpuks peamiselt suhkru katabolism. . Uuringud on näidanud, et pärast rasket treeningut toodab keha suures koguses H pluss , vabu radikaale, piimhapet ja muid aineid, mis mõjutavad rakkude normaalset ainevahetust. Samal ajal põhjustab glükoosi puudus rakkudes treeningväsimust ja rakukahjustusi. Selle uuringu tulemused näitavad, et maksakoe struktuuri kahjustused on pärast rohket treeningut väga tõsised ning see mõjutab ka raku anabolismi, näiteks maksa glükogeeni sünteesi vähenemist. On täheldatud, et Cistanche’i võtvatel hiirtel väheneb maksakahjustus pärast suurt treeningut, peamiselt LDH5 vähenemise tõttu, ja maksa glükogeenisisaldus on oluliselt kõrgem kui treeningu kontrollrühmal.Cistanchevõib saavutada maksa kaitse ja säilitada normaalse füsioloogia, vähendades LDH5 funktsiooni. Glükogeeniga värvimise tulemuste põhjal on glükogeenisisaldusCistanchekatserühmas on kõrgem kui normaalsel kontrollrühmal. KasCistanchesuurendada maksa glükogeenivarusid enne treeningut või kiirendada glükogeeni sünteesi stressi korral pärast treeningut? Järeldust ei saa teha, sest pole olemas kontrollgruppi, kes trenni ei teeksCistancheeksperimendis. Seda tuleb järgmises etapis veel kinnitada, kuid Cistanche kaitsev toime maksale ja glükogeeni sünteesi soodustamine pärast palju treeningut on ilmne.

NO on väikese molekuliga aine, mida spordiringkond on viimastel aastatel kõrgelt hinnanud. NOS on NO tootmise peamine kiirust piirav tegur. On kinnitatud, et NOS-il on 3 tüüpi isoensüüme. NOS1 nimetatakse neuronaalseks lämmastikoksiidi süntaasiks. See eksisteerib neuronaalsetes rakkudes, skeletilihaste rakkudes jne ning osaleb peamiselt närvisüsteemi arengus, neurosekretsioonis, õppimis- ja mäluprotsessides. NOS2 on indutseeritav lämmastikoksiidi süntaas, mida leidub peamiselt silelihasrakkudes, makrofaagides ja lümfotsüütides. Kui see ensüüm on indutseeritud, võib see jätkata NO sünteesimist, kuni substraat on ammendatud või rakk sureb. Praegu arvatakse, et see on seotud rakukahjustusega; NOS3 on endoteeli lämmastikoksiidi süntaas, mis jaotub peamiselt endoteelirakkudes ja hepatotsüütides. Toodetud NO osaleb peamiselt füsioloogilistes funktsioonides. Selle uuringu tulemused näitavad, et NOS3 ekspressioon endoteelirakkudes ja hepatotsüütides nõrgeneb pärast rohket treeningut ning sellest tulenev NO väheneb, mistõttu ei saa veresooni tõhusalt laiendada, verevool väheneb ja nende jaoks on vaja toorainet. sünteetilist glükogeeni ei saa transportida maksarakkudesse, mistõttu glükogeeni süntees väheneb.

Cistanche väsimusevastane funktsioon

Cistanchevõib ülesreguleerida NOS3 ekspressiooni endoteelirakkudes ja maksarakkudes. Laiendage veresooni reaktiivselt. Suurendada verevoolu, kiirendada glükogeeni sünteesi tooraine transportimise võimet. Kiirendada glükogeeni sünteesi ja hoida keha normaalsel füsioloogilisel metaboolsel tasemel. Seetõttu võib LDH5 vähendamine maksa kaitsmiseks ja NOS3 ekspressiooni ülesreguleerimine piimhappe glükoneogeneesi soodustamiseks olla oluline mehhanismCistanchekaitsta maksa ja soodustada füüsilist taastumist. See uurimus annab teadusliku eksperimentaalse aluse selle edasiseks arendamiseks ja kasutamiseksCistanchespordimeditsiini valdkonnas ning paneb aluse ka arendamiseks ja puhastamiseksCistanche'i efektained.

Artiklid: YANG Hong-xin1 jne "Cistanche Deserticola spordiväsimuse vastaste mõjumehhanismide eksperimentaalne uuring".

-----Chinese Journal of Information on TCM Apr.2008 Vol.15 No.4