Katse 3 Cistanche Deserticola fenüületanoolglükosiidi mõju roti menopausijärgsele mudelile Ⅲ

Katse 3 Cistanche deserticola fenüületanoolglükosiidi mõju roti perimenopausaalsele mudelile

1 Katsematerjalid

1.1 Katseloomad

Wistari rotid, SPF-klass, emased, pakub Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., selle partii roti sertifikaadi number: 0017216; labori sertifikaadi number SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Eksperimentaalsed ravimid

Cistanche deserticola fenüületanoolglükosiidvalmistati vastavalt katse 1 meetodile ja sisaldus saavutas 66,47%. Gengnian'an kapsel, koostisained: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, pojengikoor, Poria cocos, pärlmutter, kurkuligo, Schisandra chinensis, magnetiit, Polygonum wflorheum, vineating, multifloraum, multiflora . Funktsioonid ja näidustused:Toitke yini ja alistage yang, hädasid leevendadaja rahustada meelt. Kasutatakse menopausijärgsete kuumahoogude ja higistamise, pearingluse, tinnituse, ärrituvuse ja unetuse korral. Tehnilised andmed: 0,3 g kapsli kohta. Kasutamine ja annustamine: Suukaudselt, 3 kapslit korraga, 3 korda päevas. Tootja: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Tootmispartii number: 121104. Heakskiitmise number: National Drug Approval No Z14021848.

Sojaisoflavoonid ja E-vitamiini pehmekapslid, koostisainete loetelu: sojaisoflavoonide pulber, E-vitamiin, päevalilleõli, želatiin, glütseriin, vesi, tartrasiin, titaandioksiid. Ikoonilised koostisosad ja sisu: Iga 100 g sisaldab 55,2 mg soja isoflavooni (arvutatud genisteiiniks) ja 608,5 mg E-vitamiini. Tervislikud funktsioonid: luutiheduse suurendamine. Kasutusjuhend ja annustamine: 1 kapsel 2 korda päevas koos sooja veega. Tehnilised andmed: 500mg × 100 kapslit. Tootja: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Tootmispartii number: 13070302. Heakskiidu number: National Food Health G20080032.

KUI KAUA LÄBIB, ET CISTANCHE TÖÖTAB?

1.3 Eksperimentaalsed reaktiivid

Naatriumkarboksümetüültselluloos, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., partii number: 20120418; penitsilliini naatrium süstimiseks, North China Pharmaceutical Co., Ltd., spetsifikatsioon: 4 miljonit ühikut, tootmispartii number: c1206807;

Formaldehüüdi lahus (analüütiliselt puhas), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., tootmispartii number: 20130902; 0,9% naatriumkloriidi süstimine, Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd.; spetsifikatsioon: 250ml, tootmispartii number: 13082405B;

Kloraalhüdraat, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, partii number 20120827; Rat E2 ELISA tuvastuskomplekt, R&D Company, partii number: 20140101A; Rat T ELISA tuvastuskomplekt, R&D Company, partii number: 20140101A; Roti LH ELISA tuvastamise komplekt, R&D Company, partii number: 20140101A; Roti FSH ELISA tuvastuskomplekt, R&D Company, partii number: 20140101A;

2 Eksperimentaalsed meetodid

2.1 Modelleerimine ja ravimihaldus

Modelleerimismeetod: võtke 100 emast wistar rotti kehakaaluga 210–230 g, valige juhuslikult 12 rotti tühjaks rühmaks ja tehke näilikoperatsioon ning ülejäänud rotte kasutatakse menopausi loomiseks. mudelid. Pärast rottide kaalumist anesteseeriti rotid 10% kloraalhüdraadi intraperitoneaalse süstimisega (0,3 ml/100 g) ja kõhu asend fikseeriti. Seejärel lõigati rottidel selja viimase ribi alt kaenlaaluste keskjoone ristumiskohas ja umbes 2 cm kaugusel selgroo külgmisest küljest ning seejärel desinfitseeriti. Nahale ja seljalihastele tehakse sisselõige umbes 1cm ning sisselõike vaateväljas on näha piimvalge läikiv rasvamass, millesse on sisse kantud munasari. Kasutage väikeste pintsettide abil õrnalt rasvamassi kinni ja tõmmake see sisselõikest välja, eraldage rasvamass ja näete rühma õhukesi, ebakorrapäraseid, kollakaspunaseid munasarju. Lõikamisel ligeerige esmalt peenikese niidiga munajuha (kaasa arvatud rasv) munasarja all, eemaldage täielikult vasak munasari ja eemaldage 80% paremast munasarjast. Pärast operatsiooni pandi emakasarved tagasi kõhuõõnde, õmmeldi lihased ja nahk ning eemaldati samamoodi mõlemad munasarjad. Pärast operatsiooni tõsteti loomi ettevaatlikult üles ja süstiti intramuskulaarselt 200,000 u/kg penitsilliini (igaüks 0,1 ml), et vältida nakatumist, üks kord päevas 3 järjestikuse päeva jooksul. 5 päeva pärast operatsiooni alustati rottide tupeäigete uuringuga ükshaaval üks kord päevas 5 järjestikuse päeva jooksul. Rotid, kellel esines ägenemisreaktsioone, jäeti kõrvale. Valiti 72 täielikult kastreeritud rotti ja jagati juhuslikult 6 rühma. Eksperimentaalsetel eesmärkidel on need mudelrühm, Gengnianani rühm, soja isoflavoonirühm ja Cistanche deserticola fenüületanoolglükosiidide suurte, keskmise ja väikese annuse rühm.

Valmistamismeetod: Valmistamismeetod: {{0}},5% CMC Valmistamismeetod: Kaaluda 4 g naatriumkarboksümetüültselluloosi ja segada destilleeritud veega, et saada 800ml. Cistanche deserticola fenüületanoolglükosiidi rühma suurte, keskmiste ja väikeste annuste annused olid vastavalt 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg ja 33,33 mg/kg (manustamismaht 1 ml/100 g). Valmistamismeetod: kaaluge vastavalt 1333,3 mg, 666,7 mg ja 333,3 mg vaarika flavonoide, lahustage need väikese koguse 0,5% CMC-ga, reguleerige maht 100 ml-ni, segage hästi ja kõik. Gengniangani kapslid (450 mg/kg, segatud destilleeritud veega kuni 45 mg/ml, 1 ml/100 g, mis vastab 10-kordsele kliinilisele annusele); Valmistamismeetod: Võtke 15 Gengniangani kapslit, lahustage need esmalt väikeses koguses 0,5% CMC-s, seejärel reguleerige maht 100 ml-ni ja segage hästi, mis on Gengnianani kapslisuspensiooni annus (450 mg/kg). Sojaoa isoflavooni E-vitamiini pehmed kapslid (166,67 mg/kg, 16,67 mg/ml valmistamiseks kasutage destilleeritud vett, 1 ml/100 g, mis vastab 10-kordsele kliinilisele annusele); Valmistamismeetod: võtke 4 sojaoa isoflavooni E-vitamiini pehmekapslit, esmalt lahustage väikeses koguses 0,5% CMC-s, seejärel reguleerige maht 120 ml-ni ja segage korralikult, et saada soja isoflavooni E-vitamiini pehmekapsli suspensiooni annus (16,67 mg/kg). ).

Manustamisviis: iga rühma loomadele anti vastavaid ravimeid 1. päeval pärast operatsiooni. Tühjale rühmale ja mudelrühmale manustati sondiga sama ruumala 0,5% CMC lahust (sondi maht oli 1 ml/100 g) ja Gengnianani rühma sonditi Gengnianani kapslisuspensiooniga (450 mg/kg, mis vastab 10-kordsele kliinilisele annusele ). ), manustati sojaoa isoflavooni rühmale suukaudselt sojaoa isoflavooni E-vitamiini pehmekapsli suspensiooni (166,67 mg/kg, mis vastab 10-kordsele kliinilisele annusele) ning suurt, keskmist ja väikest annust.Cistanche deserticola fenüületanoolglükosiidrühmadele manustati suukaudselt vastavalt rühmale. Cistanche deserticola fenüületanoolglükosiidi suured, keskmised ja väikesed annused (annused on vastavalt 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg ja 33,33 mg/kg, annustamismaht 1 ml/100 g), manustatuna üks kord päevas, pidevalt intragastriliselt . ravimit 30 päeva.

2.2 Vaatluselemendid ja tuvastamismeetodid

Iga rühma rottide horisontaalse-vertikaalse liikumise hinded mõõdeti 29 päeva pärast manustamist. 2 tundi pärast viimast mao manustamist (15 tundi tühja kõhuga) eemaldage silmamunad vere kogumiseks, seerumi eraldamiseks jaPlasmaja mõõta E2, T, LH, FSH, GnRH ja BGP sisaldust seerumis ning -EP sisaldust plasmas; rotid lõigati lahti. Eemaldage harknääre, põrn, emakas ja ülejäänud 20% munasarjakoest, kaaluge nende märgkaal ja arvutage harknääre, põrna ja emaka elundiindeks (organi indeks=organ märgkaal mg/roti kaal g) , ja seejärel eemaldada aju Hüpotalamuse ja ajuripatsi jaoks valmistati hüpotalamusest, hüpofüüsist ja 1/2-st emakast kudede homogenaadid ning östrogeeniretseptorite sisaldus hüpotalamuses, hüpofüüsis ja emakakoe homogenaadid ning androgeenid. määrati retseptori sisaldus hüpotalamuse koe homogenaatides. Harknääre, põrn, emakas ja munasarjad fikseeriti 10% formaldehüüdi lahuses, sisestati parafiini, lõigati ja värviti HE-ga. Thehistomorfoloogilised muutusedigas rühmas vaadeldi valgusmikroskoobi all.

2.2.1 Avatud välja meetodi test

Katseseade on kuubikujuline avatud kast, mille kõrgus on 40 cm ning pikkus ja laius 80 cm. Ümbritsevad seinad ja põhi on mustad. Põhi koosneb 25 võrdse pindalaga plokist, mis on jagatud valgete joontega. Katse ajal asetati rott avatud kasti keskel olevasse ruutu ja 5 minuti jooksul roti põhjas läbitud plokkide horisontaalse aktiivsuse skoor (saab loendada ruute, kus kõik neli käppa on sisestatud), ja mitu korda tagajäsemed püsti seisid (kaks esikäppa olid õhus). (või seina külge klammerdumine) vertikaalse aktiivsuse skoor. Väljaheited tuleb pärast iga katset täielikult eemaldada ja iga rotti mõõdetakse üks kord 2 tundi pärast manustamist. See katse viidi läbi vaikses ruumis.

2.2.2 Komplekti määramise meetod

Võtke seerumiproovid: kasutage katseklaase, mis on vabad pürogeenidest ja endotoksiinidest. Vältige rakkude stimuleerimist operatsiooni ajal. Pärast vere kogumist tsentrifuugige seda kiirusel 3000 p/min 10 minutit, et kiiresti ja ettevaatlikult eraldada seerum ja punased verelibled. Võtke plasmaproovid: antikoaguleeritud hepariini antikoagulanttuubidega. Tsentrifuugige kiirusel 3000 p/min 30 minutit ja võtke supernatant. Kudede homogenaadi proovide võtmine: lisage koele sobiv kogus füsioloogilist soolalahust ja purustage see. Tsentrifuugige kiirusel 3000 p/min 10 minutit ja võtke supernatant.

Roti (Rat) östradiooli (E2) ELISA komplekti määramismeetod on sama, mis katses 2. Standardite (S0-S5) kontsentratsioonid on 0, 4, 8, 16, 32 ja 64 pmol/l.

Roti (rottide) testosterooni (T) ELISA komplekti analüüsimeetod on sama, mis östradiooli ELISA komplekti analüüsimeetod. Standardite (S{{0}}S5) kontsentratsioonid on {{10}}, 2{{20}}, 40, 80, 160 ja 320 pg /mL. Roti (Rat) luteiniseeriva hormooni (LH) ELISA tuvastamiskomplekti määramismeetod on sama, mis östradiooli ELISA tuvastamiskomplekti määramismeetod. Standardite (S0-S5) kontsentratsioonid on 0, 3, 6, 12, 24 ja 48 ml/ml. Roti (Rott) folliikuleid stimuleeriva hormooni (FSH) ELISA komplekti analüüsimeetod on sama mis östradiooli ELISA komplekti analüüsimeetod. Standardite (S0-S5) kontsentratsioonid on 0, 0,75, 1,5, 3, 6 ja 12 IU/L. Roti (Rat) gonadotropiini vabastava hormooni (GnRH) ELISA tuvastamiskomplekti määramismeetod on sama, mis östradiooli ELISA tuvastamiskomplekti määramismeetod. Standardite (S0-S5) kontsentratsioonid on 0, 5, 10, 20, 40 ja 80 mlU/ml.

Roti (Rat) osteokaltsiini (BGP/OCN) ELISA tuvastamiskomplekti määramismeetod on sama, mis östradiooli ELISA tuvastamiskomplekti määramismeetod. Standardite (S{{0}}S5) kontsentratsioonid on 0, 0,75, 1,5, 3, 6 ja 12 ng/ml. Roti (Rat) -endorfiini (-EP) ELISA tuvastamiskomplekti määramismeetod on sama, mis östradiooli ELISA tuvastamiskomplekti määramismeetod. Standardite (S0-S5) kontsentratsioonid on 0, 3, 6, 12, 24 ja 48 pg/ml. Roti (Rat) östrogeeniretseptori (ER) ELISA tuvastamiskomplekti määramismeetod on sama, mis östradiooli ELISA tuvastamiskomplekti määramismeetod. Standardite (S{{20}}S5) kontsentratsioonid on 0, 4, 8, 16, 32 ja 64 pg/ml. Roti (Rat) androgeeniretseptori (AR) ELISA tuvastamiskomplekti määramismeetod on sama, mis östradiooli ELISA tuvastamiskomplekti määramismeetod. Standardite (S0-S5) kontsentratsioonid on 0, 25, 50, 100, 200 ja 400 pg/ml.

2.3 Statistilise töötlemise meetodid

Andmete analüüsiks kasutati andmete statistiliseks töötlemiseks meditsiinistatistika paketti SPSS17.{1}}. Mõõtmisandmed väljendati kui keskmine ± standardhälve (-x±s). Rühmadevaheliseks võrdlemiseks kasutati ühesuunalist dispersioonanalüüsi. Dispersioonide homogeensuse testimiseks kasutati LSD-meetodit. , kasutati ebaühtlaste dispersioonide jaoks Games-Howelli testi ja hindeandmete jaoks Riditi testi.

Tabelist 11 ja jooniselt 14 on näha, et võrreldes tühja rühmaga olid mudelrühma rottide harknääre indeks, põrna indeks ja emaka indeks oluliselt vähenenud (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Mõju vere biokeemilise indeksi tasemele perimenopausis mudelrottidel

Iga rühma rottide seerumi E2, T, LH, FSH, GnRH ja BGP sisaldus ning plasma-EP sisaldus on näidatud tabelites 12-13 ja joonistel 15-17.

Tabelitelt 12-13 ja joonistelt 15-18 on näha, et võrreldes tühirühmaga olid mudelrühma rottide seerumi E2- ja T-tasemed oluliselt langenud (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Tabel 14 Cistanche deserticola fenüületanoolglükosiidi mõju seerumi GnRH ja plasma -EP tasemele roti perimenopausis mudelis (-x±s)

Tabelist 14 ja joonistelt 19-20 on näha, et võrreldes tühirühmaga oli mudelrühma rottide seerumi GnRH tase oluliselt suurenenud ja plasma -EP tase oluliselt langenud (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Mõju ER- ja AR-sisaldusele perimenopausis mudelrottide kudedes

ER-i ja AR-i sisaldus iga rühma rottide asjakohastes kudedes on näidatud tabelites 16-17 ja joonistel 22-23.

Tabelist 17 ja jooniselt 23 on näha, et võrreldes tühja rühmaga oli AR tase mudelrühma hüpotalamuses oluliselt madalam (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Mõju elundi kudede morfoloogiale perimenopausis mudelrottidel

Iga katserühma rottide emaka, harknääre ja põrna patoloogilised ja histoloogilised vaatlustulemused on järgmised. Patoloogilised fotod on näidatud 1. lisas perimenopausaalsete mudelrottide patoloogiliste fotode jaoks.

5.1 Mõju emakakoe morfoloogiale perimenopausis mudelrottidel

Vastavalt iga katserühma rottide endomeetriumi, näärmete ja müomeetriumi erineva astme muutustele kasutati poolkvantitatiivseid standardeid, et jagada koe patoloogiline morfoloogia neljaks tasemeks ning iga katserühma rottide emakad määrati. mõõdetud. Vaatlustulemused on toodud tabelis 18.

"-" Endomeetriumi epiteelirakud, näärmed, müomeetrium ja seroos on kõik normaalsed; "+" endomeetriumi epiteelirakud ja näärmed on atroofeerunud ning müomeetrium ja seroos on normaalsed; "++" endomeetriumi epiteel Rakud ja näärmed on osaliselt atroofeerunud, lihaskiht on veidi atroofeerunud ja seroos on normaalne; "+++" endomeetriumi epiteelirakud ja näärmed on oluliselt atroofeerunud ning seroos on normaalne.

Pärast Riditi testi on tabelist 18 näha, et võrreldes tühja rühmaga ilmnes mudelrühma rottide emakas olulisi patoloogilisi koekahjustusi (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 Mõju munasarjakoe morfoloogiale perimenopausis mudelrottidel

Vastavalt erinevatele muutustele folliikulites, kollaskehas, granuloosrakkudes ja veresoontes rottide munasarjades igas katserühmas kasutati poolkvantitatiivseid standardeid, et jagada koe patoloogiline morfoloogia neljaks tasemeks. Igas katserühmas mõõdeti ja vaadeldi rottide munasarju. Tulemused on toodud tabelis 19.

Tabel 19 Cistanche deserticola fenüületanoolglükosiidi mõju munasarjade patoloogilistele muutustele perimenopausis mudelrottidel Ühik: ainult

"-" võib näidata kasvavaid folliikuleid, küpseid folliikuleid ja kollaskeha kõigil tasanditel. Kollane keha on hästi arenenud, rohkete granuloosrakkude kihtidega, rikkaliku follikulaarse vedeliku ja rikkalike veresoontega; "+" võib näidata kasvavaid folliikuleid, küpseid folliikuleid ja kollaskeha, kuid küpsete folliikulite ja kollaskeha arv on väike. , folliikulid on väiksemad ja granuloosrakud on vähem kihilised; "++" võib näidata küpseid folliikuleid ja kollaskeha, kus on rohkem kollaskeha, vähem granuloosrakke ja vähem veresooni; "+++" ei sisalda folliikuleid, rohkem kollaskeha ja munasarja Atroofiline, avaskulaarne.

Pärast Riditi testi on tabelist 19 näha, et võrreldes tühja rühmaga ilmnes mudelrühma rottide munasarjades olulisi patoloogilisi koekahjustusi (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Toime harknääre ja põrna koe morfoloogiale perimenopausis mudelrottidel

Mõõtke mikromeetri abil iga katserühma iga roti tüümuse koore kõige paksemate ja kitsamate osade paksus, et saada keskmine; kasutage põrnasõlmedele langemiseks mikromeetri baasjoont, mõõtke põrna sõlmede paksus mõlemal küljel. mille keskmeks on keskarter, ja arvutage keskmine. Mõõdetud tulemused on toodud tabelis 20 ja joonisel 24.

Tabelist 20 ja jooniselt 24 on näha, et võrreldes tühja rühmaga oli mudelrühmas harknääre koore paksus ja põrnasõlmede maht oluliselt vähenenud (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).