Suukaudselt manustatud kaltsiumalginaadi aerogeeli hindamine Wistari rottide soolestiku mikrobiota ning maksa- ja neerufunktsiooni muutuste kohta

Kontakt:ali.ma@wecistanche.com

Mohammad AA Al-Najjar et al

Abstraktne

Käesolevas uuringus hinnatakse kaltsiumalginaadi aerogeeli kui potentsiaalse ravimikandja mõju maksale janeerufunktsioonidja Wistari rottide soolestiku mikrobiootas. Uuringutes valmistati alginaataerogeel nanoosakeste kujul, kasutades jugalõikamise tehnikat ning neid iseloomustati eripindade, välismorfoloogia ja osakeste suuruse jaotuse järgi. In vivo uuringu jaoks manustati suukaudselt kaltsiumalginaadi aerogeeli ning maksa- janeerufunktsioonidtestiti ühe nädala ja nelja nädala jooksul kahes erinevas uuringus. Lühiajalise in vivo uuringu käigus koguti väljaheidete proove bakteriaalse DNA ekstraheerimiseks, millele järgnes 16S rRNA geenijärjestuse analüüsid, et tuvastada muutusi soolestiku mikrobiotas. Tulemused näitasid, et valmistatud alginaataerogeeli keskmine BET-spetsiifiline pind on umbes 540 m2 / g, pooride maht on 7, 4 cm3 / g ja pooride laius 30–50 nm. In vivo uuring näitas, et tase uuritudneerudja maksaensüümid ei ületanud normi kõrgeimat taset. Soolestiku mikrobiota uuring näitas erinevaid mustreid; teatud bakterirühmad, nagu Clostridia ja Bacteriodia, suurenesid selle ajalaerogeelidrežiimi ja jätkas suurenemist pärast aerogeeli kasutamise lõpetamist. Samal ajal kui teised rühmad, nagu Erysipelotrichia ja Candidatus Sacha bakterid, suurenesidaerogeelidravi ja seejärel ühe kuu pärast uuesti vähenenud. Bacilli klassi liikmed näitasid ainulaadset suundumust, st pärast seda, kui nad olid hetkel 0 kõige rikkalikum rühm (63 protsenti), vähenes nende suhteline arvukus dramaatiliselt, kuni jõudis < 5="" protsendini;="" mis="" oli="" nii="" ka="" pärast="" aerogeeliravi="">

Cistanchetubulosa takistabneerudhaigus,cistanche'i kõrvaltoimed, klõpsake.

Sissejuhatus

AerogeelidTerminoloogia võttis esmakordselt kasutusele 1931. aastal Samuel Kistler, kes määratles need materjalidena, mis säilitavad pooride ja võrgustiku struktuuri puutumatuna pärast pooride vedeliku vahetamist gaasiga [1]. Pärast 60 aastat nende avastamist on orgaanilineaerogeelidpakuti välja biomeditsiinilisteks ja ravimite kohaletoimetamiseks nende suure sisepinna ja avatud pooride struktuuri tõttu [2]. Selle materjaliklassi silmapaistvad omadused ei võimalda mitte ainult tõsta laadimise efektiivsust, vaid ka parandada laaditud molekulide biosaadavust, stabiilsust ja vabanemise kineetikat.

Uurimine teemalaerogeelidsuukaudseks manustamiseks keskenduti esialgu ränidioksiidi kasutamiseleaerogeelidnende paindliku ja hästituntud sool-geeli keemia, aga ka derivatiseerimisvõimaluste tõttu [3]. Sellegipoolest tekitab ränidioksiidi aerogeelide kasutamine suukaudseks manustamiseks mõeldud ravimpreparaatides endiselt teatud muret nende piiratud biolagunevuse tõttu. Seetõttu tekib täiendav vajadus töötada välja aerogeeli kandja, mis on nii bioühilduv kui ka biolagunev. See võib olla võimalik, kasutades looduslikke orgaanilisi materjale või biolagunevaid polümeere, nagu alginaat [4] hüaluroonhape [5], kitosaan, tselluloos [6] ja valgud [7].

Pruunvetikatest ekstraheeritud alginaat (Alg) on ​​lineaarne kopolümeer, mis koosneb ß-1,4-D-mannuroonhappe ja -L-guluroonhappe monomeeridest, mis on omavahel segatud homogeensete või heterogeensete plokitaoliste mustritega. . Alginaate on kasutatud toiduaine- ja farmaatsiatööstuses, kuna need on mittetoksilised, odavad, biolagunevad ja bioloogiliselt ühilduvad [8, 9]. Polüvalentsed katioonid, nagu Ca2 plus, Ba2 plus või Sr2 plus, võivad indutseerida Algi ioonset ristsidumist, muutes selle lahustuvast lahustumatuks (geeli) vormiks.

Algi on laialdaselt kasutatud toiduainetes ja farmatseutilise lisandina, näiteks tarretusainena ja tableti lagundajana [10, 11]. Seda on kasutatud ka biomeditsiinilistes rakendustes, sealhulgas ravimite kohaletoimetamises ja koetehnoloogias [12]. Nagu teisedki söödavad toidukiud, on Alg ja selle oligomeeri derivaadid resistentsed inimese endogeensete ensüümide poolt seedimisele. Kuid inimese soolestiku mikrobiota suudab seda märkimisväärselt seedida [13]. Hoolimata selle tähtsusest on Algi lagunemise eest vastutava soolestiku mikrobiota kohta vähe teada.

Euroopa Toiduohutusamet (EFSA) on deklareerinud algiinhappe ja selle soolade ning nende käärimisproduktide ohutuse. Algiinhappe ja selle soolade vesilahuste ja suspensioonide absorptsiooni ja eritumise in vivo katsed loomadel näitasid nende võimetust imenduda ega metaboliseerida seedetraktis esinevate ensüümide poolt, olenemata manustamise ajal kasutatud vormist. Kuid need lagunevad osaliselt kääritamise käigus, kui nad läbivad jämesoolt soole anaeroobse mikrobiota toimel, põhjustades pimesoole suurenemist, mida EFSA pidas kohanemisprotsessiks, mis on seotud toidu lisaainetena testitud suurte annustega [14]. . Sellegipoolest ei ole üheski varasemas in vivo uuringus uuritud kaltsiumalginaadi (Ca-Alg) mõju aerogeeli kujul.maks, neer,või bakterite kooslus soolestikus.

Soolestiku mikrobiota on inimese seedesüsteemi oluline komponent, kuna see aitab lagundada sissevõetud toitu, eriti seda, mille jaoks inimorganismil puuduvad vajalikud ensüümid [15, 16]. Soolestiku mikrobiota võib pärssida ka patogeensete mikroorganismide õitsemist, konkureerides nendega toitainete ressursside pärast või tootes keemilisi aineid nende kasvu pärssimiseks. Siiski on näidatud, et allaneelatud seeditavate kiudude, nagu Alg, lagunemine toimub peamiselt käärsoole kääritatud bakterite poolt [17]. Selle protsessi saadused on lühikese ahelaga rasvhapped (SCFA), mis on kasulikud käärsoolepõletike korral ja toimivad vähivastasena. Brownlee et al. teatas, et Alg-i ja inimese väljaheite mikrofloora inkubeerimine näitas, et enamiku Alg-i lagunemisega kaasneb muutus soolestiku mikrobiotas. Samuti põhjustab selline inkubeerimine 24 tunni pärast SCFA ja gaasi tootmist [17].

materjalid ja meetodid

Materjalid

Algiinhappe naatriumsoola tarnis Saksamaalt BASF. Kaltsiumkloriid (CaCl2) osteti firmalt Th. Geyer GmbH & Co. KG, Saksamaa. Süsinikdioksiidi (puhtusaste 99,5 protsenti) tarnis Praxair (Saksamaa), etanool 99,8 protsenti saadi Carl Rothilt (Saksamaa). Kõiki kemikaale kasutati nii, nagu saadi. ALP mõõtmiseks kasutati kaubanduslikke diagnostikakomplekte ja kreatiniinikomplektid osteti ettevõttest Biostsystems SA, Hispaania. MO BIO PowerMax SoilDNA isolatsioonikomplekt osteti firmast MO BIO Laboratories, USA. Kogu uuringu vältel kasutati deioniseeritud vett.

meetodid

Aerogeeliosakeste valmistamine.

Esimene samm aerogeeliosakeste valmistamisel oli põhilahuse valmistamine; selleks lisati destilleeritud veele naatriumalginaadi pulber (Alg) kontsentratsioonis 1 massiprotsent ja segati magnetsegamisel üle öö toatemperatuuril. Hüdrogeeliosakeste valmistamiseks kasutati Preibisch et al. [18] järgiti, kasutades Jet Cutter Type S firmast genia Lab, Braunschweig (Saksamaa). Joaga lõikamise protsessis väljutati alginaadilahus läbi düüsi (läbimõõt 350 μm) suruõhuga (1–3 baari), et moodustada joa (massivoolukiirus 1 g/s). Joa lõigati pöörleva kettaga eraldi osakesteks (40 traati lõikeketaste traadi läbimõõduga 100 μm, silindrite suhe 5). Pärast ketta läbimist langes polümeerilahus allapoole 5 g/l CaCl2 lahusega geelistamisvanni. Geeliosakeste aglomeratsiooni vältimiseks oli geelistusvanni maht vähemalt neli korda suurem töödeldud biopolümeeri lahuse kogumahust ning vannide sisu segati magnetpulgaga (60 p/min). Düüsi ja geelistusvanni vaheline kaugus hoiti 50–70 cm. Pärast geeliosakeste kogumist jätkati segamist 60 minutit, et tagada täielik geelistumine ja vältida aglomeratsiooni. Seejärel eraldati geelistunud osakesed geelistumisvannist filtreerimise teel ja jätkati lahustivahetusega.

Lahusti vahetus (vesi etanooliks) viidi läbi kogutud osakestega järk-järgult (30, 60, 90, 100 mahuprotsenti etanooli). Täieliku vahetuse tagamiseks mõõdeti leotusvedeliku tihedust pärast viimast lahustivahetusetappi tihedusmõõturiga (DMA4500, Anton PaarCompany, Austria). Seejärel arvutati tihedus ümber etanoolisisalduseks. Saadud alkogeeli osakesed pakiti lõpuks filterpaberisse ja kuivatati superkriitilise CO2-ga autoklaavis konstantsel temperatuuril 50 ˚C ja rõhul 120 baari. CO2 pidev vool (20–80 g/min) määrati kuni etanooli täieliku ekstraheerimiseni (2–4 tundi). Seejärel viidi läbi autoklaavi aeglane rõhu vähendamine (1–3 baari/min). Kui ümbritseva õhu rõhk oli saavutatud, avati autoklaav ja kaltsiumalginaadi aerogeeli mikrosfäärid (edaspidi tähistatud Ca-Alg) koguti ja säilitati hästi suletud anumates kuivades tingimustes.

Aerogeeli osakeste iseloomustus

aerogeeli osakeste spetsiifilisi pindasid mõõdeti madala temperatuuriga lämmastiku adsorptsiooni/desorptsiooni (BET) abil (Quantachrome Nova 3000e, Odelzhausen, Saksamaa ja Micromeritics TriStar II 3020, Saksamaa). Enne mõõtmist kuivatati proove 20 °C vaakumis (< 1="" mpa)="" at="">

Valmistatud aerogeeliosakeste välismorfoloogiat uuriti skaneeriva elektronmikroskoobi (SEM) analüüsiga (Zeiss Supra VP55, Jena, Saksamaa) kiirenduspingel 3 kV ja töökaugusel 9.0–– 9,4 mm. Proovid pihustati enne pildistamist kullaga (paksus 10 nm), et minimeerida laadimist ja parandada pildi kontrasti.

Osakeste suuruse jaotuse mõõtmised viidi läbi kolm korda iga proovi puhul, mis koosnes ligikaudu 10,000 osakestest. Dünaamiline kujutise analüüs viidi läbi, kasutades X-Jet mooduliga aCamsizer XT (Retsch GmbH, Saksamaa) õhurõhuga 50 kPa.

Maksa- ja neerufunktsiooni ning soolestiku mikrobiota uuringud

Katseuuring viidi läbi väikese arvu loomadega, kes olid jagatud erinevatesse rühmadesse, et hõlmata raviainete nelja doositaset. See viidi läbi lühikese aja jooksul (1 nädal), et näha Ca-Alg aerogeelide maksimaalset võimalikku annust, millel ei ole olulist mõju neeru- või maksafunktsioonile ning mis ei näita haigestumuse ega suremuse märke. Annused valiti läbimõeldult, võttes arvesse alginaadi teatatud suukaudset LD50 (üle 5,000 mg/kg kehakaalu kohta) [19]. Siiski oli maksimaalne võimalik annus, mis saavutati loomade minimaalsel segamisel, 2,000mg/kg kehakaalu kohta.

Uuringu teises osas eksponeeriti loomi kahe nädala jooksul fikseeritud annusega. Seoses vanuse ja kaalu kõikumiste ning kasvatustingimustega selle uuringu ajal järgiti Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsiooni (OECD) juhiseid (kood nr 206). Kõik katseprotokollid kiitis heaks Jordaania Rakendusteaduste Eraülikooli (ASU) eetikakomitee (IRB, kinnitusnumber: 2019-PHA-12, lisatud S1-faili). Kõik ASU loomamaja töötajad on hästi koolitatud jälgima mis tahes muutusi, mis võivad loomal sekkumise tagajärjel tekkida. Täpsemalt jälgivad nad selliseid parameetreid nagu kaalumuutused, ebanormaalne käitumine, sassis karusnahk, piiratud liikuvus, kehahoiak või spetsiifiliste kehavedelike markerite väljendus. Tõsiste ebanormaalsete muutuste korral looma seisundis on neil lubatud kasutada humaanse lõpp-punkti protokolli, mille on heaks kiitnud ASU eetikakomitee. Katsete lõpus surmati rotid veretustamise teel üldnarkoosis, kasutades intravenoosselt 2,5% tiopentaalnaatriumi (Abbott Laboratories, North Point, Hong Kong) annuses 20 mg/kg.

Loom

Nii lühi- kui ka pikaajalistes in vivo uuringutes peeti kümnenädalasi terveid Wistar rotte keskmise kaaluga 240 ± 37 g temperatuuril 21–23 ˚C ja õhuniiskusel 35–70 protsenti. kontrollitud ruumides, 12 h valguse – 12 h pimeduse tsüklitega. Rotid identifitseeriti ja paigutati üksikult selgete külgedega puuridesse, et neid oleks lihtne jälgida ilma nende käitumist häirimata. Allapanuna kasutati puitlaastu. Rottidele toideti kaubanduslikult saadavat dieeti (Local Sup plier, Jordaania) ja neile pakuti vabalt magevett.

Rottide arv rühma kohta erinevates katsetes valiti vastavalt varem avaldatud tööle (näited; [20–22]) ning olenevalt rangetest riiklikest ja rahvusvahelistest "loomade hooldamise ja kasutamise" eeskirjadest, mis rõhutavad loomade hooldamise ja kasutamise minimeerimist. uuringutes kasutatud loomade arv. Nende hulka kuuluvad, kuid mitte ainult, "Loomade hooldamise ja kasutamise programm" California ülikoolis Berkeleys (https://acuc.berkeley.edu/about.html) ja Norra loomade kasutamise juhend (https:// www.forskningsetikk.no/en/guidelines/ science-and-technology/ethical-guidelines-for-the-use-of-animals-in-research/).

In vivo pilootuuring (7 päeva korduvad annused)

Viidi läbi korduv suukaudne annus ühe nädala jooksul, et määrata kindlaks aerogeelide maksimaalne võimalik annus, mis näitab ohutust Wistari rottidel. Ca-Alg aerogeeli manustati suukaudselt neljas annuses 50, 100, 250 ja 500 mg, mis vastas keskmisele annusele vastavalt 200, 400, 1000 ja 2000 mg/kg (kehakaal). Tulemusi võrreldi kahe positiivse kontrollrühmaga, kellele manustati 50 ja 500 mg puutumatut naatriumalginaati (Na-Alg), mis vastas keskmisele doositasemele vastavalt 200 ja 2000 mg/kg kehakaalu kohta. Lõpuks viidati kõik varasemad Ca-Alg aerogeeli ja Na-Alg ravi rühmad kontrollrühmale (platseebo). Viimane rühm sai fosfaatpuhvrit annuses, mis on võrdne maksimaalse annusega, kui seda manustati testainete vehiikulina. Pilootuuringu kontroll- ja ravirühmad koosnesid 4 rotist rühma kohta (kaks emast ja kaks isast rotti rühma kohta). Ca-Alg aerogeeli ja Na-Alg tahked pulbrid suspendeeriti vastavalt fosfaatpuhvris (pH 7, 4) ja segati hästi vahetult enne suukaudset manustamist, kuna rotid keeldusid neid kuivas olekus söömast. Kõigi rühmade puhul alustati manustamist rottidele iga päev samal kellaajal, kasutades suukaudset sondi.

Pikaajaline in vivo kokkupuuteuuring (15-päevane korduvannuse uuring)

Eelmises jaotises saadud tulemuste põhjal valiti 250 mg Ca-Alg aerogeeli annus, mida edasi hinnata pikaajalise (15 päeva) kokkupuute uuringu jaoks. mõjud, mis võivad ilmneda kokkupuutel Ca-Alg aerogeeliga või Na-Alg-ga. kohta. Iga testitud aine puhul kasutati kolme loomarühma, mis hõlmasid kontroll-, ravi- ja satelliitrühma. Kontrollrühm koosnes 6 Wistari rotist rühma kohta (3 isast ja 3 emast), ravi- ja satelliitrühma aga 10 Wistari rotti rühma kohta (5 isast ja 5 emast). Ravirühmades olevad Wistari rotid said 15 päeva jooksul 250 mg testitavaid aineid (Ca-Alg aerogeel või Na-Alg) ja nad surmati 16. päeval. Samal ajal kui satelliitrühmi raviti sama kaua nagu ravirühmade puhul, kuid pigem hoiti neid jälgimise all veel 15 päeva pärast ravi ja nad surmati 30. päeval.

Tasub mainida, et kahte Ca-Alg aerogeeli ja Na-Alg uuringut ei olnud võimalik paralleelselt läbi viia. Sel põhjusel ei olnud mugav kasutada ühte kontrollrühma mõlema jaoks. Need kontrollrühmad said suukaudset fosfaatpuhvrit ainult 15 päeva ja seejärel jälgiti neid veel 14 päeva. Lühiajalise katsena suspendeeriti Ca-Alg aerogeeli ja Na-Alg tahked pulbrid samuti fosfaatpuhvris (pH 7,4) ja segati vahetult enne suukaudset manustamist hästi. Kõigi rühmade puhul alustati manustamist rottidele iga päev samal kellaajal, kasutades suukaudset sondi.

Kliiniline ja käitumuslik vaatlus

Vastavalt OECD juhistele 407 jälgiti loomi iga päev kõigi ebanormaalsete kliiniliste tunnuste või käitumise muutuste suhtes kogu uuringuperioodi vältel, pöörates erilist tähelepanu esimese nelja tunni jooksul pärast uuritava aine manustamist. Satelliidi- ja kontrollrühma loomi jälgiti täiendavalt 15 päeva ilma ravita. Satelliidirühm võimaldab leeliselise fosfataasi (ALP) ja kreatiniini taseme mõõtmise abil tuvastada mis tahes hilinenud kliinilisi tunnuseid, mis viitavad maksa- ja/või neerukahjustusele.

Seerumi biokeemia ja väljaheidete analüüsid

Hispaania. Vereproovid koguti Wistari rottide orbitaalsetest siinuse veenidest, mida seejärel kasutati seerumi jagamiseks. See proovidest kogutud seerum viidi seejärel steriilsetesse Eppendorfi tuubidesse ja säilitati sügavkülmikus biokeemiliste parameetrite edasiseks testimiseks. Igal teisel päeval koguti väljaheidete proove, et uurida muutusi mikroobikoosluse struktuuris. Väljaheited koguti puhastesse steriilsetesse 15 ml keeratava korgiga tuubidesse ja neid hoiti kuni kõigi proovide kogumiseni temperatuuril -20˚C. 15-päevase korduvannuse uuringu jaoks koguti iganädalaselt ainult vereproove, et mõõta aluselise fosfataasi (ALP) ja kreatiniini taset, st päeval 0, 7. päeval, 14. päeval, päev 21 ja päev 30 (päev 21 ja päev 30 kehtivad ainult kontroll- ja satelliitrühmadele).

Soolestiku mikroobikoosluse analüüs

DNA ekstraheerimine kogutud väljaheiteproovidest viidi läbi, kasutades MO BIO PowerMaxSoil DNA isolatsioonikomplekti (MO BIO Laboratories, USA), järgides tootja juhiseid. Seejärel viidi läbi polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) puhastamine ja genoomse DNA (gDNA) sekveneerimine, kasutades Mr. DNA Labi (Molecular Research LP, USA). 16S rRNA geeni PCR amplifikatsioon ja selle järgnev sekveneerimine viidi läbi Illumina abil. 16SrRNA geeni V4 varieeruva piirkonna PCR praimereid ill27F mod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG)/ill519R ja mod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) koos vöötkoodiga pärimise praimeril kasutati 30 tsüklis, kasutades HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, USA). Pärast amplifikatsiooni kontrolliti PCR-produkte 2-protsendilises agaroosgeelis, et määrata amplifikatsiooni edukust ja ribade suhtelist intensiivsust.

Seejärel kasutati ühendatud ja puhastatud PCR produkti Illumina DNA raamatukogu valmistamiseks. Sekveneerimine viidi läbi MR DNA-ga mikrobioomi sekveneerimisel (MiSeq), järgides tootja juhiseid. Järjestatud andmeid töödeldi MR DNA analüüsi torujuhtme abil. Lühidalt, järjestused ühendati, seejärel eemaldati vöötkoodid, pärast seda eemaldati järjestused < 150="" bpas="" ja="" mitmetähenduslike="" baaskutsega="" järjestused.="" järjestused="" eemaldati="" mürast="" ja="" genereeriti="" operatiivsed="" taksonoomilised="" üksused="" (out)="" ja="" kimäärid="" eemaldati.="" otu-d="" määratleti="" rühmitamise="" teel="" 3-protsendilise="" erinevusega="" (sarnasus="" 97="" protsenti).="" lõplikud="" otu-d="" klassifitseeriti="" taksonoomiliselt,="" kasutades="" blastn-i="" rdp-ii-st="" ja="" ncbi-st="" tuletatud="" kureeritud="" andmebaasi="" suhtes.="" hierarhiliseks="" rühmitamiseks="" kasutati="" "r"="" tarkvaras="" sisalduvat="" erinevate="" statistiliste="" analüüside="" paketti="" (versioon="" 3.5.1,="" vegan="">